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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung eines
Sensors zum Nachweisen des Vorliegens oder der Menge eines Analyten
in einer biologischen Flüssigkeit.
Insbesondere betrifft die Offenbarung einen Sensor, der besonders
als Verweil- oder implantierter Sensor geeignet ist. Analytenkonzentrationen werden
elektrochemisch in einem zurückgehaltenen
Nachweisretentionsvolumen eines analyten-permeablen Mediums, das
wahlweise von der biologischen Flüssigkeit durch eine semipermeable
Membran getrennt ist, gemessen.
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Hintergrund
und Zusammenfassung der Erfindung Der Entwicklung von elektrochemischen
Sensoren, die das Vorliegen und/oder die Menge von biologisch bedeutsamen
Analyten nachweisen können,
wurden erhebliche Forschungs- und Entwicklungsbemühungen gewidmet.
Viele, wenn nicht sogar die meisten dieser Analytenmessvorrichtungen
liegen in Form eines Teststreifens vor, der einen mit einer analytenabhängigen Nachweiszusammensetzung
vorbehandelten Zurückhalteraum
für eine
Testflüssigkeit
und Elektroden für
den Kontakt mit der Testflüssigkeit,
die in den Rückhalteraum
für Testflüssigkeit
abgegeben wird, umfasst. Elektrische Leiter erstrecken sich von
den Elektroden bis zu einem Bereich auf dem Teststreifen zur Verbindung
mit einer vorprogrammierten Hand- oder Tisch-Sensormessvorrichtung.
In der Regel wird eine biologische Flüssigkeit in den Probenflüssigkeits-Rückhalteraum
oder -Volumen abgegeben und die Sensormessvorrichtung wird so programmiert,
dass sie nach einem vorbestimmten Zeitraum nach der Abgabe der Flüssigkeitsprobe in
den Probenrückhalteraum
ein vorbestimmtes Potential an die Elektroden anlegt. Der Stromfluss
wird dann als Reaktion auf das angelegte Potential gemessen, um
einen Hinweis auf das Vorliegen und/oder die Konzentration des Zielanalyten
zu erhalten.
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Einige
elektrochemische Sensoren sind so konstruiert, dass sie direkten
Kontakt der Probenflüssigkeit mit
den Elektroden vermeiden, indem die Elektroden mit einer semipermeablen
Membran oder einem Gelmatrixmaterial bedeckt sind, das im Testmedium
unlöslich
und zumindest für
den interessierenden Analyten bei Kontakt mit dem Testmedium permeabel
ist.
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Es
besteht nach wie vor die Notwendigkeit zur Entwicklung von kommerziell
machbaren Sensoren für mehrfachen/kontinuierlichen
Gebrauch für
biologisch bedeutsame Analyten. Insbesondere müssen biologische Sensoren entwickelt
werden, die für
Zeiträume
zwischen mehreren Stunden bis mehrere Wochen, Monate oder Jahre
in einen Patienten implantiert oder injiziert werden können und
genaue Ergebnisse liefern, ohne zur Kompensierung von Veränderungen
der Diffusionseigenschaften von Membrankomponenten oder von Verlusten
der Enzymaktivität
und/oder Elektronenvermittlerelementen entfernt oder rekalibriert
werden zu müssen.
Solche Sensoren würden
als Komponenten von künstlichen
Organen, wie zum Beispiel einer künstlichen Bauchspeicheldrüse, bei
der der Blutzuckerspiegel des Patienten kontinuierlich und/oder
regelmäßig überwacht
werden muss, Anwendung finden. Solche Vorrichtungen können auch
als wiederverwendbare Sensoren zur Messung der Analytenkonzentrationen
in Körperflüssigkeiten
in vitro verwendet werden, wie z. B. in den analytischen Situationen,
die in kommerziellen Labors, die Analysen an Flüssigkeitsproben von Patienten durchführen, anzutreffen
sind.
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Design
und Konstruktion von biologischen Sensoren zur wiederholten Verwendung
in vitro und/oder zur kontinuierlichen Verwendung in vivo verursachen einzigartige
Probleme. Diese funktionale Anforderung birgt in der Tat die Bedingung,
dass die funktionale chemische Komponente des Sensors beschränkt wird,
d. h. dass sie bei wiederholtem und/oder kontinuierlichem Gebrauch
nicht aus dem Sensor in die Probenflüssigkeit freigesetzt wird.
Die Rückhaltung
der „aktiven" chemischen/elektrochemischen
Komponenten des Biosensors kann mit einer beliebigen von mehreren
Techniken allein oder in Kombination erfolgen. So können die
aktiven Komponenten beispielsweise durch kovalente Bindung an nicht-auswaschbare
Komponenten des Biosensors oder durch Zurückhalten der biologisch/elektrisch
aktiven Komponenten in einer Testzone oder einem Testvolumen durch
eine Membran, die zumindest für
den Analyten, aber nicht für
die zurückgehaltenen,
wahlweise kovalent gebundenen Enzyme, Coenzyme und/oder Elektronenvermittler
permeabel ist, immobilisiert werden.
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Die
implantierbaren und/oder wiederverwendbaren Biosensoren sind so
konstruiert, dass sie die aktiven sensorabhängigen chemischen Komponenten
in der Regel in einer hydrophilen Matrix in einem Analytenretentionsvolumen
zurückhalten.
Die aktiven elektrochemischen Spezies, die im Sensor als Reaktion
auf ein angelegtes Potential zusammenarbeiten, um ein Stromflusssignal
bereitzustellen, das proportional zur Konzentration des in das Retentionsvolumen
diffundierten Analyten ist, können
wahlweise kovalent an nicht-auswaschbare Komponenten des Retentionsvolumens
gebunden werden, einschließlich
aber ohne Einschränkung
einer Elektrode eines Elektrodensystems, einer Wand des Gehäuseabschnitts
des Sensors zumindest zur teilweisen Definierung des Retentionsvolumens,
Mikrokügelchen
oder anderen mikroteilchenförmigen Feststoffen,
die im Retentionsvolumen gehalten werden, des mit der Seite einer
Membran in Berührung
kommenden Retentionsvolumens oder Polymerkomponenten der Retentionsvolumenmatrix.
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Alternativ
können
die Enzyme, Enzymkofaktoren und Elektronenvermittler so ausgewählt werden, dass
sie ein Molekulargewicht aufweisen, das ausreichend hoch ist, um
eine wesentliche Diffusion dieser Komponenten aus dem Retentionsvolumen
in die untersuchte biologische Flüssigkeit zu vermeiden.
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In
einem Aspekt dieser Offenbarung ist das Retentionsvolumenmedium,
das alternativ auch als „Depletionsvolumenmedium" bezeichnet wird,
mit dem Elektrodensystem in Kontakt, das eine Elektrode umfasst, die
Elektronen von den oder Elektronen an die Enzyme(n) über den
bzw. die Elektronenvermittler empfangen bzw. abgeben kann. Leitelemente
erstrecken sich von der Elektrode bis zu einem Punkt auf der Vorrichtung, um
elektrische Kommunikation der Elektrode mit einem programmierbaren
Regler zu ermöglichen.
Der Regler kann so programmiert werden, dass er eine vorbestimmte
Potentialsequenz an das Elektrodensystem anlegt, einschließlich eines
variablen Potentials mit einem einen Vermittler oxidierenden Potential
oder einem einen Vermittler reduzierenden Potential, variabler Pulsbreite
und variablen Pulsintervallen. Der Regler kann auch Stromfluss als
Reaktion auf die an das Elektrodensystem angelegten Potentiale messen
und diese Daten mit Kontrolldaten vergleichen, die zuvor für das System
erhalten wurden, um Analytenkonzentrationen in der untersuchten
biologischen Probe zu berechnen und zu berichten und wahlweise diese
Daten zum Messen des Leistungsstatus der Vorrichtung und zur Modifizierung
des dann existierenden Potentialsequenzprotokolls zur Optimierung
der Funktion der Vorrichtung zu verwenden. So kann der Sensorregler
beispielsweise in regelmäßigen Abständen modifiziert
werden, um Unterschiede in der Analytendiffusionseffizienz über die
Membran und/oder Veränderungen
der Konzentration des aktiven Elektronenvermittlers und/oder der
Enzymkomponenten der Vorrichtung ohne klassische Rekalibrierungstechniken
aufzunehmen.
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In
einer Ausführungsform
der Offenbarung wird das Retentionsvolumen zumindest teilweise von
einer analytenpermeablen Membran definiert oder umschlossen und
das Verhältnis
zwischen dem Retentionsvolumen und der Oberfläche der das Volumen definierenden
semipermeablen Membran ist zumindest teilweise weniger als 2 mm,
insbesondere weniger als 1 mm. Die niedrigen Volumen/Oberflächen-Verhältnisse
sind bevorzugt, weil sie die Rate des Diffusionsgleichgewichts zwischen
der Testflüssigkeit
und dem Retentionsvolumenmedium verbessern und so die Refraktionszeit
(Erholungszeit) des Sensors minimieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Enzymkomponente so ausgewählt, dass sie im Wesentlichen
nicht in der Lage ist, Elektronen zu oder von einer endogenen Substanz
außer
dem Analyten weiterzuleiten. Unter diesen Bedingungen kann die für die Bereitstellung
eines Signals der Analytenkonzentration verantwortliche Enzymreaktion
nicht stattfinden, ohne dass ein vorbestimmtes Schwellpotential
an das Elektrodensystem angelegt wird. Der Sensor kann deshalb abgeschaltet
werden, um die Enzymaktivität
nach einem Puls des reduzierenden Potentials zur „Deaktivierung" des Vermittlers
zu stoppen und zu gestatten, dass eine vorhersehbare Diffusion auf
Konzentration/Gradienten-Basis
die Analytenkonzentration in dem Analytennachweis-/-retentionsvolumen
für die
nächste
programmierte gepulste Potentialnachweissequenz schnell „zurücksetzt".
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Die
vorliegende Erfindung, die in den beiliegenden Ansprüchen beschrieben
ist, stellt ein Verfahren zur Überwachung
der Analytenkonzentration mit dem erfindungsgemäßen Sensor bereit, bei dem
der Sensor mit der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit
in Kontakt gebracht wird. Zunächst
wird in vorbestimmten Abständen
ein Potential intermittierend an das Elektrodensystem angelegt,
das ausreicht, um den Elektronenvermittler im Retentionsvolumen
zu oxidieren, und der Stromfluss durch die Elektrode wird in Abhängigkeit
von der Dauer des angelegten Potentials gemessen. Das angelegte
vermittler-oxidierende Potential wird zumindest für einen
ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten, um die Rate der Veränderung
des Stroms durch die Elektrode in Abhängigkeit von der Dauer des
angelegten Potentials zu bestimmen. Werte für den gemessenen Strom werden
mit Werten des Stromflusses für
bekannte Konzentrationen des Analyten korreliert. Alternativ kann
das Messprotokoll die Anpassung des Potentials zur Etablierung eines
vorbestimmten Stromflusses und anschließend die Messung der Rate der
erforderlichen Veränderung
des Potentials, um den Stromfluss über einen vorbestimmten Zeitraum
aufrechtzuerhalten, umfassen.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird die Analytenkonzentration in einer biologischen Probe in Abhängigkeit
von der zeitabhängigen
Konzentration des Analyten im Retentionsvolumen nach Analytendepletionspotentialpulsen
gemessen. Die Rate der Konzentrationserholung im Retentions-/Depletionsvolumen
kann problemlos mit der Analytenkonzentration in der mit dem Sensor
in Kontakt stehenden biologischen Flüssigkeit korreliert werden.
Der „Diffusionsstatus" der Membran kann
mit einer vorprogrammierten Sequenz von Zeit zu Zeit während der
Verwendung des Sensors überprüft werden
und numerische Werte im Zusammenhang mit dem gemessenen Status können als
Eingabe zur Modifizierung der vorprogrammierten Pulssequenzalgorithmen
für den
anschließenden
Sensorbetrieb verwendet werden.
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Diese
und andere Merkmale der Erfindung werden hiernach mit Bezug auf
die Zeichnungen und den besten bekannten Modus zur Durchführung der
Erfindung beschrieben.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Draufsicht auf einen Sensor.
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2 ist
eine Querschnittsansicht des Sensors entlang Linie 2-2 in 1.
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3 zeigt
eine ähnliche
Querschnittsansicht wie 2, aber die Elektrode ist anders
aufkonstruiert.
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4 ähnelt 2 und
zeigt eine Querschnittsansicht eines Sensors mit einer diffusionsbegrenzenden
Membran mit großen
Poren.
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5 ähnelt 4 und
zeigt eine Querschnittsansicht eines Sensors, bei dem die Diffusion
in das Retentionsvolumen über
die Poren auf dem Umfang einer ansonsten nicht-permeablen Membrankomponente
erfolgt.
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6 ist
eine grafische Darstellung einer Pulssequenz, bei der zwei Impulse
des oxidativen Potentials unterschiedlicher Dauer an den Sensor
angelegt werden, unterbrochen von Erholungsintervallen mit reduzierendem
Potential.
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7 ist
eine grafische Darstellung einer Pulssequenz, bei der die Dauer
der Intervalle zwischen den Pulsen verändert wird.
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8–9 sind
grafische Darstellungen von Messprotokollen, die Veränderungen
des Pulsintervalls mit Veränderungen
der Pulsbreite kombinieren.
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10 ähnelt 1 und
ist eine Draufsicht auf einen Sensor.
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11 ist
eine grafische Darstellung des gemessenen Ansprechens für den Pyrrol-3-Essigsäure/Vermittler/Glucosedehydrogenase-(GDH)-Sensor.
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12 ist
eine grafische Darstellung des gemessenen Ansprechens für den Pyrrol-3-Carbonsäure/Vermittler/GDH-Sensor.
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13 ist
eine grafische Darstellung des gemessenen Ansprechens für den Pyrrol-3-Essigsäure/Vermittler/GDH- und den Pyrrol-3-Carbonsäure/Vermittler/GDH-Sensor.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Der
elektrochemische Sensor der vorliegenden Offenbarung soll Signale
liefern, die auf die Analytenkonzentration in einer biologischen
Flüssigkeit
hinweisen. Der Sensor umfasst eine Elektrode, die mit einem geringen
Volumen eines hydrophilen Mediums in Kontakt ist, um eine zur Konzentration
des Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die mit dem Sensor
in Kontakt ist, proportionale Analytenmenge zurückzuhalten. Das Medium wird
so ausgewählt,
dass es die Diffusion des Analyten durch das Medium allein oder
nach Hydrierung des Mediums vor oder nach Gebrauch des Sensors erleichtert.
Der Sensor umfasst ein Gehäuse
für das
Volumen des hydrophilen Mediums. Das Gehäuse ist so geformt, dass es
das hydrophile Medium der biologischen Flüssigkeit aussetzt, so dass
der Analyt in der biologischen Flüssigkeit in das hydrophile
Medium diffundiert, bis die Konzentration des Analyten im Medium
der Konzentration des Analyten in der biologischen Flüssigkeit
entspricht. Die Rate der Massediffusion des Analyten in das Retentionsvolumen
hängt vom
Gradienten der Analytenkonzentration ab. Die Konzentration des Analyten
im Retentions-/Depletionsvolumen kann elektrochemisch durch Zusammenwirken
eines Elektronenvermittlers und eines für den Analyten spezifischen
Redoxenzyms gemessen werden, wobei beide Teil des hydrophilen Mediums
sind oder damit in Kontakt sind.
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Das
hydrophile Medium kann eine Wasserkonzentration aufweisen, die kleiner,
gleich oder größer als der
Wassergehalt der biologischen Flüssigkeit
ist. Somit können
die Komponenten des hydrophilen Mediums, einschließlich der
Enzym- und Elektronenvermittlerkomponenten und eines hydrophilen
Polymers bei der Konstruktion des Sensors in einem im Wesentlichen
dehydrierten Zustand, bereit für
die Rehydration vor Gebrauch oder bei Kontakt des Sensors mit einer
biologischen Flüssigkeit
verwendet werden. Es ist für
die Sensorfunktion wichtig, dass der interessierende Analyt leicht
durch das hydrophile Medium diffundierbar ist, um eine im Wesentlichen
homogene Konzentration des Analyten im Analytenretentionsvolumen
und eine Konzentration zu ermöglichen,
die der Analytenkonzentration in der biologischen Flüssigkeit,
die mit dem Sensor in Kontakt ist, eng entspricht.
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Der
Sensor ist so konstruiert, dass er ein Gehäuse oder Kompartiment zum Halten
des Analytenretentionsvolumens des hydrophilen Mediums aufweist.
Das Gehäusefach
ist so geformt, dass das hydrophile Medium der biologischen Flüssigkeit
bei Gebrauch des Sensors ausgesetzt wird. In einer Ausführungsform
wird das Gehäusefach
zumindest teilweise von einer Wand definiert, die einen Bereich
einer vom Analyten permeablen Membran mit einer ersten Seite, die
mit dem hydrophilen Medium in Kontakt ist, und einer gegenüberliegenden
Seite für
den Kontakt mit der biologischen Flüssigkeit bei Gebrauch des Sensors
aufweist. Der interessierende Analyt, Wasser und andere membran-permeable
Komponenten der biologischen Flüssigkeit
diffundieren durch die Membran und in das Retentionsvolumen des
hydrophilen Mediums, bis die Konzentration des Analyten im Medium
proportional zur Konzentration des Analyten in der biologischen
Flüssigkeit
ist, die mit der analytenpermeablen Membrankomponente des Sensors
in Kontakt ist.
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Der
Sensor ist so konstruiert, dass er eine Elektrode liefert, die mit
dem hydrophilen Medium in elektrischem Kontakt steht. Die Elektrode
besteht typischerweise aus einem leitfähigen Element, wie z. B. Kohlenstoff,
Silber, Gold, Platin, Palladium und dergleichen und erstreckt sich
typischerweise bis in die oder formt Teil der Wände des Behälters oder der Kammer für das Analytenretentionsvolumen
des hydrophilen Mediums. In einer Ausführungsform besteht die Elektrode
aus Platin und das Retentionsvolumen ist als der Raum über der Elektrode
definiert. In einer anderen Ausführungsform
kann die Elektrode aus einem Graphitpulver bestehen und das Retentionsvolumen
wird durch die Räume
zwischen den Teilchen und in zumindest einer Ausführungsform
durch eine darüber
liegende analytenpermeable Membran definiert. In einer anderen Ausführungsform
ist die Elektrode eine Komponente eines Elektrodensystems aus einer
Referenzelektrode und wahlweise einer Hilfselektrode, die von der
Referenzelektrode verschieden oder mit dieser identisch sein kann.
Das Elektrodensystem kann auch Leiterelemente für eine elektrische Kommunikation
zwischen den Elektrodenkomponenten des Systems und einem programmierbaren
Regler aufweisen, um die elektrischen Potentiale im Elektrodensystem
zu steuern und um den Stromfluss durch mindestens eine der Elektroden
als Reaktion auf die elektrischen Potentiale zu messen. In der Regel
ist der programmierbare Regler als separates Gerät mit elektrischen Leitern
konstruiert, die besonders für
die elektrische Kommunikation zwischen dem Regler und dem Elektrodensystem
des Sensors geeignet sind. Der Regler ist in der Regel ein Hand- oder Tischgerät, das reversibel
mit ein oder mehr Biosensoren verbunden werden kann und Datenspeicher- und Datenanzeigeelemente
aufweist.
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Der
erfindungsgemäße Sensor
für die
elektrochemische Analyse umfasst ferner ein Redoxsystem und einen
Elektronenvermittler, die mit dem hydrophilen Medium in Kontakt
sind. Das Enzym wird für
seine Fähigkeit
zur Oxidation oder Reduzierung des interessierenden Analyten ausgewählt. Das
Enzym wird vorzugsweise auch wegen seiner fehlenden Fähigkeit
zur Weiterleitung von Elektronen zu oder von anderen Substanzen als
dem Analyten ausgewählt,
die aus der biologischen Flüssigkeit
in das Analytenretentionsvolumen diffundieren können. Nicht einschränkende Beispiele
geeigneter Enzyme sind Pyrrolochinolinchinon-(PQQ)-abhängige Glucosedehydrogenase
(GDH) (EC 1.1.99.17) oder Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH) (EC 1.1.1.30).
Dehydrogenase-Enzyme für
andere diffundierbare Analyten sind im Stand der Technik bekannt
und können
je nach interessierendem Analyten substituiert werden.
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Der
Elektronenvermittler kann aus einer großen Vielzahl von Elektronenvermittlern
ausgewählt
werden, die den Elektronentransfer zwischen dem Redoxsystem und
einer Sensorelektrode, die mit dem das Enzym und den Vermittler
enthaltenden oder damit in Kontakt stehenden Medium in Kontakt ist,
erleichtert. Ein nicht einschränkendes
Beispiel eines geeigneten Vermittlers ist Osmium(bis-bipyridyl)pyridiniumchlorid.
Es versteht sich jedoch, dass eine Anzahl handelsüblicher
Vermittler, von denen nicht einschränkende Beispiele in
U.S. Patent Nr. 5.589.326 beschrieben
sind, verwendet werden können.
Das Enzym und der Elektronenvermittler können in einer Polymermatrix
auf der Elektrode gefangen sein. Wahlweise können das Enzym und der Elektronenvermittler
so ausgewählt
werden, dass ihre Diffusion durch eine analytenpermeable Membran
bei Gebrauch des Sensors minimiert wird oder dass sie kovalent an
die Wände
des Gehäuses
oder an die hydrophilen Polymerkomponenten des Retentionsmediums
gebunden werden können,
um ihre Diffusion aus dem Retentionsmediumvolumen durch die Membran
und in die biologische Flüssigkeit
bei Gebrauch des Sensors zu minimieren oder sogar ganz zu verhindern.
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Als
Träger
oder Trägermatrix
als Teil der hydrophilen Mediumkomponente des Sensors kann jedes
beliebige einer Vielzahl von hydrophilen Polymeren, in der Regel
mit einem Molekulargewicht über
5000 Dalton und mit polyanionischen, polykationischen oder mehrwertigen
Funktionalitäten
verwendet werden. Beispiele für
solche Polymere sind Cellulosepolymer, wie z. B. Celluloseacetat,
Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglykole, synthetische oder natürliche Gummis,
wie z. B. Guar oder Xanthangummis, Alginsäure, Poly(meth)acrylsäuren und
Copolymere von Acrylsäuren
und Acrylestern, Glycosaminoglycane, und ähnliche Polymere. Darüber hinaus
können
elektrisch polymerisierte Matrizen von Monomeren wie z. B. Pyrrol-3-Essigsäure und
Pyrrol-3-Carbonsäure
als hydrophile Matrix und/oder enzymfangende Matrix verwendet werden.
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Diese
hydrophilen Polymere können
allein oder in Kombination verwendet werden, um eine hydrierte oder
hydrierbare Matrix zu liefern, durch die der Zielanalyt leicht diffundieren
kann. Ferner können
solche polyfunktionalen hydrophilen Polymere zur „Verankerung" oder anderweitigen
Behinderung der Diffusion der Enzym- oder Elektronenvermittlerkomponenten
des Mediums verwendet werden, um den Verlust dieser Komponenten
aus dem Retentionsvolumen bei Gebrauch des Sensors zu minimieren.
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Somit
können
aus dem Stand der Technik bekannte Elektronenvermittler, beispielsweise
mit Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-Funktionalität, wie z. B. Ferrocencarbonsäure, mit
aus dem Stand der Technik bekannten esterbildenden oder amidbildenden
Kupplungsmethoden gekoppelt werden, um das hydrophile Medium zur
Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Sensoren zu bilden. Weitere
nicht einschränkende
Beispiele von Vermittlerverbindungen sind osmiumhaltige Redoxkatalysatoren,
wie sie z. B. in
U.S. Patent Nr.
5.589.326 beschrieben sind, oder Vermittlerkomponenten,
die an eine Polymermatrix gebunden werden können und die redoxreversible
Imidazol-Osmium-Komplexe enthalten. Nicht einschränkende Beispiele
solcher Komplexe sind Osmium-bipyridyl-Konjugate,
wie z. B. Bis(bipyridyl)-imidazolylhalogenosmium-Komplexe,
die durch schnelle Vermittlungskinetik und ein niedriges Redoxpotential
(+150 mV vs. Ag/AgCl) gekennzeichnet sind. Eine andere Gruppe von
osmiumhaltigen Vermittlern umfasst mit Tris(bipyridyl)-Osmium-Komplex
markierte elektrochemische nachweisbare Konjugate. Das Redoxenzym
und ein Elektronenvermittler können
so inhärent
nichtdiffundiert sein oder mit den hochmolekularen Komponenten des
Mediums chemisch gekuppelt sein, damit die Enzym- und Elektronenvermittlerkomponenten
im Wesentlichen nicht in der Lage sind, durch die analytenpermeable
Membran bei Gebrauch des Sensors, der mit einer biologischen Flüssigkeit in
Kontakt ist, zu diffundieren.
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Die
Enzymkomponente des Sensors besitzt in der Regel ein Molekulargewicht,
das ausreicht, damit der Diffusionsverlust der Komponente durch
die semipermeable Membran nur grenzwertig über dem typischen Anwendungszeitraum
des Sensors liegt. Solche Enzyme können bei der Herstellung der
Vorrichtung in das hydrophile Medium eingearbeitet werden, beispielsweise
ein Enzymlyophilisat, das durch Gefriertrocknung einer Enzymlösung in
Anwesenheit eines hydrophilen Monomers, z. B. Maltose oder Trehalose
oder eine andere enzymstabilisierende hydrophile Zusammensetzung.
Das lyophilisierte Enzym kann während
der Herstellung des Sensors und der Aufbewahrung in einem dehydrierten
Zustand im Medium gehalten werden, bis zur Rehydrierung vor oder
während
dem ersten Gebrauch des Sensors, wodurch die Haltbarkeit des Sensors
verlängert
wird.
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Elektronenvermittlerkomponenten
des Sensors der vorliegenden Offenbarung sind nicht kritisch, außer in Bezug
auf die Tatsache, dass sie so ausgewählt oder beispielsweise durch
kovalente Bindung von Polymerkomponenten der hydrophilen Matrix
oder des hydrophilen Mediums modifiziert werden sollten, dass sie Diffusionsverlust
der Elektronenvermittlerkomponenten aus dem Analytenretentionsvolumenmedium
im Verlauf der Anwendung des Sensors verhindern oder minimieren.
Der Stand der Technik ist übersättigt mit
einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Metallchelaten und anderer
Metallkomplexe, wie z. B. Ferrocen, und insbesondere Carboxyferrocen,
die problemlos an nichtdiffundierbare Komponenten des hydrophilen
Medium gekuppelt werden können.
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Die
Membrankomponenten der Sensorkonstrukte der vorliegenden Offenbarung
können
beliebige biokompatible analytenpermeable Membranen sein, einschließlich beispielsweise
Celluloseacetat, Polyurethan und Polycarbonat. Andere biokompatible
Polymermembranen, die bei der Herstellung von Biosensoren verwendet
werden können,
sind im Stand der Technik wohlbekannt und diese im Stand der Technik
bekannten analytenpermeablen Membranen/Membranmaterialien können bei
der Herstellung der vorliegenden Sensoren verwendet werden. Beispiele
für analytenpermeable
Membranen sowie Elektronenvermittler und Redoxenzyme sind in
U.S. Patent Nr. 5.264.105 beschrieben.
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In
einer Ausführungsform
der Offenbarung ist die hydrophile Matrix an die Oberfläche zumindest
einer der Elektroden des Elektrodensystems gebunden. Die hydrophile
Matrix umfasst einen Elektronenvermittler, der kovalent an eine
nicht-diffundierbare oder schwer diffundierbare hydrophile Polymerkomponente
der Matrix gebunden ist. Das Redoxenzym ist ebenfalls an eine Polymerkomponente
der hydrophilen Matrix gebunden. Ein Sensor der vorliegenden Offenbarung
enthält
vorzugsweise bereits den Elektronenvermittler und das Redoxenzym,
die dem im Retentionsvolumen des Sensors vorliegenden Analyten ausgesetzt
werden. Anfangs wird in vorbestimmten Abständen ein Potential intermittierend
an das Elektrodensystem angelegt, das ausreicht, um den Elektronenvermittler
zu oxidieren, und der Stromfluss durch die Elektrode wird in Abhängigkeit
von der Dauer des angelegten Potentials gemessen. Das angelegte
vermittler-oxidierende Potential wird mindestens für einen
ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten, um die Rate der Veränderung
des Stromflusses durch die Elektrode in Abhängigkeit von der Dauer des
angelegten Potentials zu bestimmen. Werte für den gemessenen Strom werden
mit den Werten für
den Stromfluss für
bekannte Analytenkonzentrationen korreliert.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst das hydrophile Medium entweder einen Polymer-Elektronenvermittler
oder einen Elektronenvermittler, der kovalent an eine nichtdiffundierbare
oder schwer diffundierbare hydrophile Polymerkomponente des Mediums
gebunden ist. Das Redoxenzym ist als stabilisiertes Lyophilisat
enthalten oder ist selbst kovalent an eine Polymerkomponente des
hydrophilen Mediums gebunden. Das hydrophile Medium umfasst auch
polyfunktionale Komponenten, die mit difunktionalen Vernetzungsmitteln
umgesetzt werden können,
die mit der Oberfläche
des hydrophilen Mediums in Kontakt sind, um in situ eine analytenpermeable
Membran auf der Oberfläche
des hydrophilen Mediums zu bilden. So kann beispielsweise ein mehrwertiges
Polymer oder eine zwei- oder dreiwertige, vorzugsweise hochmolekulare
Monomerkomponente des hydrophilen Mediums beispielsweise mit einem
Polyisocyanat, z. B. einem Diisocyanat in der Dampfphase, umgesetzt
werden, um eine Polymerhaut oder Membran auf der Oberfläche des
hydrophilen Mediums zu bilden. Die Permeabilität der Membran kann durch die
Expositionsdauer der mehrwertigen Mediumoberfläche mit dem multifunktionalen
Vernetzungsmittel gesteuert werden. Somit kann beispielsweise 1,4-Benzoldiisocyanat
in einer Kammer verdampft werden. Sensorkonstrukte, die das hydrophile
Medium umfassen und vorzugsweise bereits die Elektronenvermittler-
und Redoxenzymkomponenten aufweisen, mit einer freiliegenden Oberfläche werden
für einen
ausreichend langen Zeitraum in die Kammer gelegt, um eine biokompatible
Membran auf der Oberfläche
des hydrophilen Mediums zu bilden, um zusammen mit anderen Sensorkomponenten,
beispielsweise ein einfaches planares nicht-leitendes Substrat,
das Gehäuse
für das
Analytenretentionsvolumen des Sensors zu bilden.
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Bezug
nehmend auf 1 ist eine Ausführungsform
eines Sensors 10 bereitgestellt, der eine Dünnfilm-Goldelektrode 12 auf
einem inerten Substrat 14 verwendet. Im Querschnitt (siehe 2)
weist ein Messteil 16 eine Goldelektrode 12 auf
einer Oberfläche 13 des
inerten Substrats 14, Abstandsschichten 18 und
eine diffusionsbegrenzende Membran 20 mit kleinen oder
gar keinen Poren auf. Die Membran 20 kann als separate Platte
geformt und so auf die Abstandsschichten 18 aufgelegt werden,
dass sie auf der Goldelektrode 12 und dem inerten Substrat 14 ruht,
um die Definition eines Gehäuses
für ein
Depletionsvolumen 22, das mit einem hydrophilen Medium 24 gefüllt ist,
zu vollenden. Enzym und Vermittler können beispielsweise durch Einfangen in
einer hydrophilen Matrix auf der Goldelektrode 12 immobilisiert
werden. Darüber
hinaus ist vorgesehen, dass das Enzym und der Vermittler durch kovalente
Bindung an einer Wand 26 des Gehäuses 22 oder an der darüber liegenden
Membran 20 immobilisiert werden kann oder dass diese Komponenten
frei diffundieren können
und mit minimaler Membranpermeabilität ausgewählt werden. Die diffusionsbegrenzende
Membran 20 kann unter den im Stand der Technik bekannten
analytenpermeablen Membranen ausgewählt und auf eine Oberfläche 28 der Abstandsschicht 18 befestigt
werden, um das Gehäuse 22 für das Analytenretentions-/-depletionsvolumen
fertigzustellen. Alternativ kann die analytenpermeable Membran in
situ durch Vernetzung von polyfunktionalen hydrophilen Polymer-
und/oder Monomerkomponenten der Enzym-/Vermittlerreagenzschicht geformt
werden. Es versteht sich, dass gleiche Bezugsziffern in dieser Offenbarung
gleiche Komponenten bezeichnen.
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Bezug
nehmend auf
3 ist ein Sensor
110 gemäß der vorliegenden
Offenbarung bereitgestellt. Der Sensor
110 weist eine Elektrode
aus einer porösen/teilchenförmigen Kohlenstoffschicht
auf, worin das Depletionsvolumen durch die Zwischenräume zwischen
den Kohlenstoff/Grafitteilchen (nicht gezeigt) definiert wird. So
kann eine Kohlenstoff/Enzym-Vermittler-Reagenzschicht
122 geformt
werden, beispielsweise durch Siebdruck einer Kohlenstoff/Grafit-Suspension,
die ein Redoxenzym enthält,
und eines nicht-diffundierbaren oder schwer diffundierbaren, beispielsweise
Polymer-, Elektronenvermittlers in Kombination mit ein oder mehr
fakultativ nicht-elektronenvermittelnden polyfunktionalen Polymeren.
Die Suspension wird in der Regel auf einem Leiterelement (nicht
gezeigt) auf einem inerten Substrat abgeschieden. Die diffusionsbegrenzende
analytenpermeable Membran
20 kann ähnlich wie oben beschrieben
als vorgeformte Polymerplatte geformt werden, die auf eine Oberfläche
123 der
Kohlenstoffelektrode aufgelegt und abgedichtet wird, oder die Membran
20 kann
durch Beschichtung der freiliegenden bedruckten Elektrode mit einer
polyfunktionalen Polymermatrix zwischen den Teilchen mit einem Polymer
in Lösung
hergestellt werden. Siehe beispielsweise die internationale Patentanmeldung
Nr.
WO 98/17995 , die
nicht-einschränkende
Beispiele von Polymermembranen zur Beschichtung von Biosensoren
zeigt.
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Bezug
nehmend auf 4, die 1 ähnelt, weist
der Sensor 210 eine diffusionsbegrenzende Membran 220 auf, die
mit großen
Poren 223 für
eine verbesserte Glucosediffusion geformt ist. Die Enzym- und Vermittlerkomponenten
sind vorzugsweise durch Einfangen in einer hydrophilen Matrix auf
der Elektrode 12 durch kovalente Bindung an nicht-diffundierbare
Polymerkomponenten des hydrophilen Mediums 24 oder an Oberflächen 26 des
Sensorgehäuses 22 für das Retentionsvolumen
immobilisiert.
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Bezug
nehmend auf 5 ist eine andere Ausführungsform
der Offenbarung gezeigt. Der Sensor 310 ähnelt dem
in 1 und 4, mit der Ausnahme, dass die
Membran 320, die über
dem hydrophilen Medium 24 liegt, selbst nicht permeabel
ist. Die Membran 320 ist mit peripheren Poren versehen,
um die Diffusion von Glucose oder anderer Analyten in das Retentions/Depletionsvolumen
ermöglichen.
-
Der
biochemische Sensor kann in jeder für den vorgesehenen Verwendungszweck
geeigneten Form konstruiert werden. So können Sensoren für wiederholten
Laborgebrauch in Form einer länglichen
Sonde konstruiert werden, wobei das eigentliche Sensorelement an
einem Ende angeordnet ist und elektrische Leiter die Elektrodenkomponente
des Messelements mit elektrischen Befestigungspunkten des Sondensensors
mit einem programmierbaren Sensorregler verbinden. Alternativ kann
der erfindungsgemäße elektrochemische Sensor
mit aus dem Stand der Technik bekannten Mikroherstellungstechniken
konstruiert werden, um nadelartige Sensoren herzustellen, die in
einen Situs für
Verweilanwendungen des Sensors implantiert oder injiziert werden
können.
-
Der
elektrochemische Sensor der vorliegenden Offenbarung kann zur Überwachung
der Analytenkonzentrationen in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden.
Das Verfahren umfasst die Schritte des Inberührungbringens der biologischen
Flüssigkeit mit
dem Sensor und des intermittierenden Anlegens, an zunächst vorbestimmten
Intervallen, eines Potentials an die Elektrode, das ausreicht, um
den Elektronenvermittler zu oxidieren. Der durch die Elektrode fließende Strom
wird dann in Abhängigkeit
von der Dauer des angelegten Potentials gemessen. Das angelegte
vermittler-oxidierende Potential wird zumindest für einen
ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten, um die Rate der Veränderung
des Stroms im Zeitverlauf durch die Elektrode zu bestimmen. Der
gemessene Stromfluss wird dann mit dem Stromfluss korreliert, der
für bekannte
Konzentrationen des Analyten im Retentions-/Detektionsmedium bekannt
ist. Alternativ kann der Sensor so konstruiert werden, dass er zumindest
eine Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode und fakultativ
eine Hilfselektrode aufweist, die mit der Referenzelektrode identisch
sein kann. In vorbestimmten Abständen
wird ein Potential angelegt, das ausreicht, um eine vorbestimmte
Menge an Stromfluss zwischen der Arbeitselektrode und der Hilfselektrode
herzustellen. Und das Potentialgefälle zwischen den Arbeits- und
Referenzelektroden, das zur Herstellung der Stromflussmenge notwendig
ist, wird gemessen und über
einen ausreichend langen Zeitraum aufrechterhalten, um die Rate
der Veränderung
des Potentials zu bestimmen, die notwendig ist, um den Stromfluss
durch die Elektrode aufrechtzuerhalten. Die Potentialmessungen werden
dann mit Potentialmessungen korreliert, die für bekannte Konzentrationen
des Analyten in der biologischen Flüssigkeit aufgezeichnet wurden.
-
Die
angelegten Potentiale, die Dauer der Potentialpulse und die Intervalle
zwischen den Potentialpulsen werden in einen programmierbaren Regler
eingegeben, der in Verbindung mit dem Sensor für die Analytenmessungen verwendet
wird. In einer Ausführungsform
sind die Intervalle zwischen den intermittierend angelegten Potentialen
kleiner als die Zeit, die notwendig ist, damit sich die Konzentration
des Analyten im Retentionsvolumen an die in der biologischen Flüssigkeit,
die mit der analytenpermeablen Membran in Kontakt ist, angleichen
kann. In einer anderen Ausführungsform
werden die Intervalle stufenweise für eine Reihe von angelegten
Potentialen erhöht
und die Konzentration des Analyten und der biologischen Flüssigkeit
wird in Abhängigkeit
von der Rate der Zunahme der Analytenkonzentration im Retentionsvolumen
bestimmt. Die Intervalle zwischen angelegten Potentialpulsen können auf
Basis von früheren
Messungen modifiziert werden, um Schwankungen der Sensorleistung
durch Verlust oder Abbau des Redoxenzyms und der Elektronenvermittlerkomponenten
und/oder Veränderung
der Diffusionseigenschaften der analytenpermeablen Membran oder
des Retentionsvolumenmediums auszugleichen. Alternativ wird die
Dauer des angelegten Potentialpulses auf Basis früherer Messungen
des Sensorleistungsstatus modifiziert. In einer anderen Ausführungsform
des Sensorbetriebs sind die Intervalle zwischen den Messungen im
Wesentlichen gleich oder größer als
die erforderliche Zeit, in der sich die Analytenkonzentration im
Retentionsvolumen an die in der biologischen Flüssigkeit angleichen kann.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist in den anhängenden
Ansprüchen
spezifiziert.
-
6–9 zeigen
grafische Darstellungen von Probenmessalgorithmen, bei denen das
Potential der Elektrode über
einen Zeitraum kontrolliert wird, um zwischen einem Potential, bei
dem keine Oxidation des Vermittlers erfolgt (E0),
zu einem vermittleroxidierenden Potential (E1) und einem Potential,
bei dem es zur Reduktion des Vermittlers kommt (E-1), abzuwechseln.
Das in einer beliebigen Situation anzuwendende Potentialprotokoll
hängt vom
Sensorstatus, der Form des Sensors und der Art des Elektronenvermittlers
und des Redoxenzyms ab. Das Protokoll für den Sensorbetrieb kann durch
empirische Messung und Beobachtungen des Fachmanns optimiert werden.
-
Insbesondere
zeigt 6 eine Pulssequenz, bei der zwei Pulse des oxidativen
Potentials unterschiedler Dauer an den Sensor angelegt werden, mit
dazwischenliegenden Erholungsintervallen mit reduzierendem Potential.
Durch Vergleich des Stromprofils des ersten Pulses mit dem Profil
des zweiten Pulses können
Informationen über
die Rate des enzymatischen Umsatzes des Substrats und die Rate der
Elektronendiffusion im Sensor erhalten werden. Zwischen den angelegten
oxidativen Potentialen stellt das reduzierende Potential sicher,
dass der gesamte Vermittler vor Anlegen des nächsten oxidierenden Potentials
wieder in den Anfangszustand zurückgebracht
wird.
-
7 zeigt
eine Sequenz, bei der die Dauer der Intervalle zwischen den Pulsen
verändert
wird. Durch Vergleich des beobachteten Stroms des zweiten Pulses
mit dem des ersten können
Informationen über
die Erholungszeit des Sensors erhalten werden. Die Erholungszeit
liefert Informationen über
die Analytenkonzentration und über
die Diffusion in die hydrophile Matrix. Die Messung des Ruhepotentials
des Sensors zwischen den potentiostatischen Pulsen liefert auch
Informationen über
die Erholung des Sensors.
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8–9 zeigen
Messprotokolle, die Veränderungen
des Pulsintervalls mit Veränderungen
der Pulsbreite kombinieren. Der Regler kann aus einer Vielzahl von
Sequenzen und Dauern der amperometrischen Messintervalle und Erholungsintervalle
wählen,
um nicht nur die Analytenkonzentration zu bestimmen, sondern auch
den Zustand des Sensors für
die Enzymaktivität,
die Diffusion des Substrats und des Vermittlers im Sensor und die
Diffusion des Substrats in den Sensor zu messen.
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Art
und Konstruktion des Reglers, der mit dem vorliegenden elektrochemischen
Sensor verwendet wird, sind nicht von kritischer Bedeutung, vorausgesetzt,
der Regler kann so programmiert werden, dass er die entsprechenden
Potentialpulsprofile an die Sensorelektrode oder das Elektrodensystem
anlegt und den Stromfluss in Abhängigkeit
vom Potential mit der Zeit misst. Ein separates Protokoll zur Beurteilung
des Sensorstatus kann umgesetzt werden, bei dem der Regler ein Protokoll
umsetzt, das die Berechnung der Diffusionseigenschaften des Depletionsvolumens
und der Membran aus aktuellen Daten ermöglicht. Der Regler kann so
programmiert werden, dass er die Messintervalle und Pulsbreiten
auf Basis der berechneten Diffusionszeiten und der bestimmten Substratkonzentration
anpasst. Zur Bestimmung des Sensorstatus und der Substratkonzentration
können
Chronoamperometrie und Chronocolometrie verwendet werden. Im Idealfall
sollte der Regler auch in der Lage sein, ein reduzierendes Potential
an die Elektrode anzulegen, um den Vermittler zu reduzieren und
somit den Analytenverbrauch zwischen Messungen zu verringern.
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BEISPIEL 1:
-
Ein
Sensor wird analog Sensor 10 in 1–2 geformt,
mit der Ausnahme, dass er keine Membran 20 aufweist. Das
Enzym und der Elektronenvermittler sind in einer Polymermatrix auf
der Elektrode festgehalten. Diese Polymermatrix wurde durch Elektropolymerisation
von Pyrrol und Pyrrol-Vermittler-Derivaten hergestellt. Durch dieses
Verfahren wird das Enzym in einer Polymermatrix auf der Elektrode
gefangen und durch Einbau des vermittler-derivatisierten Pyrrols
in das Polymer erhält
man einen immobilisierten Vermittler für den Transfer von Elektronen
im Sensor.
-
Platinscheibenelektroden
eigneten sich zur Herstellung von Sensoren nach diesem Verfahren.
Ein Vermittler, der für
die Copolymerisation in einer Matrix geeignet war, wurde mit der
folgenden Reaktionsfolge hergestellt:
-
Synthese vor pyrrol-modifiziertem Osmium(bispyridyl)pyridiniumchlorid
-
Pyrrol-modifiziertes
Osmium(bisbipyridyl)pyridiniumchlorid wurde mit folgender Reaktionsfolge
hergestellt:
-
Reinigungsverfahren für Platinelektroden
-
Die
Platinscheibenelektroden wurden mit Al2O3-Paste abnehmender Rauhigkeit (3 μm, 1 μm, 0,1 μm) auf einem
Poliertuch poliert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden
die Elektroden jeweils 10 Minuten zunächst in 10 M NaOH und dann
in 5 M H2SO4 in
einem Ultraschallbad gereinigt.
-
Die
Elektroden wurden einem elektrochemischen Zyklus in sauerstofffreien
0,5 M H2SO4 unterzogen:
- 1. Scan: –610
bis +1000 mV vs. Hg/HgSO4 (100 mV/s, 10 μA)
- 2. Scan: –810
bis +1600 mV vs. Hg/HgSO4 (100 mV/s, 10 μA)
- 3. Scan: –610
bis +1000 mV vs. Hg/HgSO4 (100 mV/s, 10 μA)
-
Der
dritte Scan wurde wiederholt, bis das zyklische Voltagramm eine
saubere Platinoberfläche
zeigte und konstant blieb.
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Der
letzte Schritt war die Polarisation bei –210 mV für fünf Minuten.
-
Platinierung
-
Darüber hinaus
wurden 4 ml sauerstofffreie 2 mM H2PtCl6-Lösung unter
Argon in einer entgasten elektrochemischen Zelle hergestellt. Drei
voltammetrische Zyklen von +500 bis –400 mV vs. Ag/AgCl mit einer Scan-Rate
von 10 mV/s wurden angelegt. Dann wurde die Elektrode unter Argon
mit sauerstofffreiem destilliertem Wasser gewaschen und bis zum
Gebrauch unter Argon gewaschen.
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Polymerisation von Pyrrol/Vermittler
-
Ein
Pyrrolfilm wurde wie folgt polymerisiert, um aktives Osmium(bisbipyridyl)pyridiniumchlorid
zu enthalten:
Die Copolymerisation erfolgte mit einem Gemisch
aus 2 mM Pyrrol, 8 mM (9) und 25 mM Tetramethylammoniumperchlorat
(als Elektrolyt) in einem 1:1-Gemisch aus Acetonitril:Wasser. Es
erfolgten 100 Pulse mit Potential/Zeit von 0 V für 5 Sek/1,5 V 1 Sek. Die Polymerisation
wurde in Abwesenheit von Sauerstoff durchgeführt.
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Polymerisation von Pyrrol-3-Essigsäure/GDH
-
In
einer Lösung
von 50 mM Pyrrol-3-Essigsäure,
0,05 mM PQQ und 50 mM KCl in 0,1 M HEPES-Puffer wurden 5 mg/ml GDH
gelöst.
Nach einer 30-minütigen
Inkubation zur Rekonstitution des Apoenzyms wurde die Lösung mit
einem Potentialpulsprofil aus 20 Pulsen von 0 V für 5 Sek/1,2
V für 1
Sekunde polymerisiert.
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Polymerisation von Pyrrol-3-Carbonsäure/GDH
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In
einer Lösung
von 50 mM Pyrrol-3-Carbonsäure
und 50 mM KCl in 0,1 M HEPES-Puffer wurden 5 mg/ml sGDH gelöst. Die
Lösung
wurde mit einem Potentialpulsprofil aus 20 Pulsen von 0 V für 5 Sek/1,2
V für 1
Sekunde oder alternativ von 0 V für 5 Sek/1,4 V für 1 Sekunde
oder auch 0 V für
5 Sek/1,6 V für
1 Sekunde polymerisiert. Das Potential hatte einen erheblichen Einfluss
auf die Leistung des Sensors, was auf eine Abhängigkeit von den Eigenschaften
des Polypyrrolfilms hinweist.
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Polymerisation von Pyrrol-3-Essigsäure/Vermittler/GDH
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In
einer Lösung
von 50 mM Pyrrol-3-Essigsäure,
10 mM Osmium-modifiziertem Pyrrolderivat 10, 0,05 mM PQQ und 50
mM KCl in 0,1 M HEPES-Puffer wurden 5 mg/ml sGDH gelöst. Die
Lösung
wurde mit einem Potentialpulsprofil von 20 Pulsen von 0 V für Sek/1,4
V für 1
Sekunde polymerisiert.
-
Polymerisation von Pyrrol-3-Carbonsäure/Vermittler/GDH
-
In
einer Lösung
von 50 mM Pyrrol-3-Carbonsäure,
10 mM Osmium-modifiziertes Pyrrolderivat 10, 0,05 mM PQQ und 50
mM KCl in 0,1 M HEPES-Puffer wurden 5 mg/ml sGDH gelöst. Die
Lösung
wurde mit einem Potentialpulsprofil aus 20 Pulsen von 0 V für 5 Sek/1,4
V für 1
Sekunde polymerisiert.
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Enzymelektroden
wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen. Es versteht sich jedoch,
dass die Enzymelektroden auch mit einer Pufferlösung oder wenn nötig mit
3 M KCl-Lösung
gewaschen werden können, um
adsorbiertes GDH zu entfernen, und dass sie anschließend in
0,1 M Phosphatpuffer von pH 7 aufbewahrt werden. Wenn die Elektroden über Nacht aufbewahrt
werden, werden sie bei 4°C
gehalten, ansonsten bei Raumtemperatur.
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Bewertung des Ansprechens
des Sensors auf Glucose
-
Das
Ansprechen des Sensors wurde gemessen, indem der Sensor zusammen
mit einer Referenzelektrode und einer Gegenelektrode in einen gerührten PBS
(phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
Puffer gelegt wurde. Ein zur Oxidation des immobilisierten Vermittlers
ausreichendes Potential (E) wurde angelegt und die Lösung wurde
für eine
Zeit (t) gerührt,
bis der Strom (I) sich auf einen niedrigen Wert stabilisierte. Siehe 11.
Aliquote Anteile von 1 M Glucose-Lösung in PBS wurden dem PBS-Puffer
schrittweise zugefügt,
wie durch die Pfeile in 12 gezeigt,
um die Glucosekonzentration in der gerührten PBS-Pufferlösung zu
erhöhen
und der Strom (I) wurde auf dem Plateauregion der Ansprechkurve
gemessen.
-
In 13 wurde
dann das Ansprechen für
die Pyrrol-3-Essigsäure/Vermittler/GDH-
und Pyrrol-3-Carbonsdure/Vermittler-GDH-Sensoren
gemessen. Das Ansprechen zeigt einen guten Elektronentransfer durch den
immobilisierten Vermittler im Polypyrrolfilm.
-
BEISPIEL 2:
-
Ein
Sensor
410 besteht aus Leitern
12,
15 und
Reagenzien, die auf einem flachen Polymersubstrat
14 abgeschieden
sind. Materialien für
die Verkapselung der Leiter
12,
15 und Reagenzien
zur Bildung einer semipermeablen biokompatiblen Schicht über dem
das Reagenz enthaltenden Messbereich
16 werden bereitgestellt.
Siehe
10. Verfahren
und Materialien:
| Substrat: | Polyimid
(wie z. B. Kapton® Polyimid- |
| | Folie,
die im Handel von E. I. DuPont de |
| | Nemours,
Wilmington, Delaware, |
| | erhältlich ist,
und Upilex® Polyimid- |
| | Folie
von UBE Industries Ltd., Japan) |
| | mit
einer Stärke
von 0,005 Zoll (0,127 |
| | mm)
und mit Goldelektroden und |
| | Leiterbahnen. |
| | |
| Aufbereitung: | Das
Material wird mit Wasser, Aceton und |
| | Methylenchlorid
gewaschen und dann 20 |
| | Stunden
bei 180°C
getrocknet. Das |
| | Material
wird in eine Vakuumkammer |
| | gelegt
und mit 50 Å Chrom
und |
| | anschließend mit
500 Å Gold |
| | metallisiert.
Das metallisierte Material |
| | wird
entfernt. Ein laminierter Fotolack |
| | wird
aufgelegt. Der Lack wird belichtet |
| | und
in einer wässrigen
Salzlösung |
| | entwickelt.
Dann wird das Metallmuster |
| | in
einer Metall-Ätzlösung (in
der Regel |
| | HNO3_HCl) entwickelt. Das gemusterte |
| | Material
wird mit Wasser abgespült
und |
| | die
verbleibende Fotomaske wird mit |
| | einem
Lösungsmittel
(in der Regel N- |
| | Methylpyrrolidon
(NMP)) entfernt. Eine 2 |
| | μm dicke fotodefinierbare
Polyimid- |
| | Schicht
wird mit einem Spin Coater |
| | aufgebracht
und durch Brennen bei 80°C |
| | 20
Minuten verfestigt. Sie wird |
| | belichtet
und dann mit einem |
| | Lösungsmittel
(NMP) entwickelt. |
| | Anschließend wird
sie 30 Minuten bei |
| | 200°C gebrannt,
um das verbleibende |
| | Polymer
zu härten. |
| | |
| Referenz/ | |
| Gegenelek.: | Eine
Silber/Silberchlorid- |
| | Tintenzubereitung
aus einer Suspension |
| | aus
Silberteilchen, die auf ihren |
| | Oberflächen teilweise
in Silberchlorid |
| | umgewandelt
sind, in einem organischen |
| | Lösungsmittel,
d. h. Cyclohexanon, mit |
| | einem
Polymer-Suspendierungsmittel, wie |
| | z.
B. Alginat. |
| | |
| Aufbereitung: | Das
Tintengemisch wird auf die Öffnung |
| | im
Polyimid aufgebracht und 30 Minuten |
| | bei
80°C getrocknet,
um das gesamte |
| | Lösungsmittel
zu entfernen. |
| | |
| Sensorbereich: | Die Öffnung durch
das Polyimid zur |
| | Goldelektrode
wird mit einem |
| | mehrschichtigen
Reagenzbereich |
| | abgedeckt,
der folgende Reagenzien |
| | umfasst. |
| | |
| Aktive | |
| Enzymschicht: | Eine
Lösung
aus Glucosedehydrogenase/ |
| | Pyrrolochinolinchinon
(PQQ) (Enzyme |
| | Commission
Nr. 1.1.99.17) und einem |
| | Redoxpolymer
aus Polyvinylimidazol mit |
| | Bis(bipyridyl)chlor-Osmium
in |
| | Phosphatpuffer,
fakultativ mit einem |
| | mehrwertigen
synthetischen, natürlichen |
| | oder
halbsynthetischen Polymer, wird auf |
| | eine
Elektrodenöffnung
aufgebracht und |
| | getrocknet.
Eine Lösung
von |
| | Polyethylenglykoldiglycidylether
in |
| | wässrigem
Puffer (d. h. 10 mM NaPO4, 150 |
| | mM
NaCl) wird auf den Bereich |
| | aufgebracht
und über
Nacht bei |
| | Raumtemperatur
getrocknet. Die |
| | Elektroden
werden dann in |
| | physiologischer
Kochsalzlösung
gespült |
| | und
getrocknet. |
| | |
| Biokompatibilitäts | |
| schicht: | Die
gesamte Konstruktion wird in eine |
| | Vakuumkammer
gelegt. Ein Diglym-Plasma |
| | wird
in der Kammer erzeugt, indem ein |
| | Niederdruckdampf
eingeführt
und ein HF- |
| | Feld
angelegt wird, um das Diglym zu |
| | dissoziieren
und Polymerisation |
| | auszulösen. Nach
5 Minuten wird die |
| | Diglym-Addition
gestoppt und das Plasma |
| | wird
weitere 5 Minuten fortgesetzt. Dann |
| | wird
das Vakuumunterbrochen und die |
| | Platte
aus der Kammer entfernt. |
| | |
| Nach | |
| bearbeitung: | Die
Sensoren 410 wurden aus der Platte |
| | ausgestanzt
und in kleinen Polycarbonat- |
| | Halternbefestigt,
die den Messbereich |
| | schützen und
als Einführhilfe
dienen. |
| | Die
verpackten Sensoren werden in |
| | Polyethylenbeuteln
versiegelt. Die |
| | verpackten
Sensoren werden mit Strahlung |
| | sterilisiert.
Zehn sterilisierte |
| | Sensoren
werden in eine größere |
| | Plastikbox
gepackt, die ein |
| | Trocknungsmittel
im Deckel enthält.
Die |
| | Box
wird verschlossen und in einen |
| | Umkartongepackt,
der als Endverpackung |
| | für den Verbraucher
dient. |
-
Dieses
Verfahren zur Herstellung von Sensoren, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Offenbarung geeignet sind, arbeitet mit der sogenannten „Draht-Enzym"-Technologie zur Immobilisierung von
Enzym und Vermittler in aktiver Beziehung in einem Sensorfilm. GDH/PQQ
reagiert nicht erheblich mit einem endogenen Substrat außer mit
dem interessierenden Analyten. Dadurch kann der Sensor inaktiv oder „aus" bleiben, solange
die Elektrode den Vermittler nicht regeneriert und weitere Aktivität gestattet.
Mit diesem Verfahren hergestellte Sensoren zeigen sehr hohe Empfindlichkeit
für Glucose
und sehr hohe Stromdichte.
