ES2350507T3 - Método colorimétrico y reactivo que se utiliza para el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un reactivo para su uso en un análisis colorimétrico de un analito que comprende: una oxidoreductasa; un mediador; y un reactivo colorante para producir color por reducción, siendo el reactivo colorante una sal de tetrazolio y comprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio y un complejo de rutenio, y en el que al menos un átomo coordinador de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico, y un ligando que comprende un anillo aromático.
Description
[0001] La presente invención se refiere a un método colorimétrico y a un reactivo que se utiliza para el mismo.[0002] En el campo de los exámenes clínicos o bioquímicos, se emplean los análisis colorimétricos como método para analizar componentes como la glucosa, el colesterol o similares en una muestra. Por ejemplo, un análisis colorimétrico para glucosa consiste por lo general en lo siguiente: se hace reaccionar glucosa oxidasa con glucosa (sustrato) para generar gluconolactona y peróxido de hidrógeno; y se detecta el peróxido de hidrógeno con un reactivo colorante, como por ejemplo un reactivo de Trinder, en presencia de peroxidasa. Este método, en el que se mide la concentración de un sustrato indirectamente a través de peróxido de hidrógeno, no se ha limitado solamente a la glucosa, sino que se ha utilizado también para colesterol o similares. En EP-A0100217 se describe un método similar en el que se utiliza una oxidasa para su reacción con el analito para producir un ión superóxido y, a continuación, una segunda enzima (una peroxidasa) para facilitar la reducción de un reactivo colorante, midiendo así la cantidad del superóxido producido.[0003] No obstante, el análisis colorimétrico convencional implica los siguientes problemas. En primer lugar, se requiere un tiempo para medir prolongado, ya que no se mide el analito directamente, sino indirectamente a través del peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, se tardan entre 30 y 60 segundos en medir la glucosa. En segundo lugar, resulta difícil ajustar las condiciones ya que han de estabilizarse simultáneamente dos sistemas de reacción de enzima. Finalmente, el análisis colorimétrico convencional requiere oxígeno y la falta de oxígeno puede llevar a una reacción insuficiente. [0004] En US-A-4.701.420 se describe un método alternativo en el que se miden los reductantes de analitos por transferencia de un electrón desde un ión férrico para producir iones ferrosos que forman complejo con un ligando de coordinación para producir un complejo con color. En EP 0.513.594 se describen reactivos para análisis colorimétrico de analitos que son capaces de interactuar con una enzima oxidasa o que son capaces de presentar actividad de oxidasa.[0005] Oyama y cols. (J. Electroanal Chem., 199 (1986) 467470) se describe el uso de arcillas coloidales que comprenden complejos de metales de transición para catalizar reacciones como por ejemplo reducción de peróxido de hidrógeno en las superficies de electrodo. El mecanismo de reducción de ión bromato mediante complejos de ciano(bipiridil)hierro(II) se describe en Birk y cols. (Inorganic Chemistry, Vol. 17, Nº 5, 1978).[0006] Otros métodos de análisis conocidos incluyen los métodos electroquímicos que se describen en WO 96/25514, EPA-0602488, WO 99/17715 y patente EE.UU. Nº 5.938.917. En estos métodos, se mide la transferencia de electrones empleando un electrodo, en lugar de un reactivo colorante.[0007] Teniendo todo esto en cuenta, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método colorimétrico con el que se pueda conseguir un análisis en poco tiempo obteniendo valores fiables con el análisis. [0008] Un método colorimétrico de la presente invención incluye la transferencia de un electrón desde un analito a un reactivo colorante que es una sal de tetrazolio que produce color por reducción a través de un mediador utilizando una oxidoreductasa; y la realización de un análisis cualitativo o cuantitativo del analito midiendo el color producido en el reactivo colorante. El mediador comprende al menos un complejo seleccionado entre un complejo de rutenio, un complejo de osmio y un complejo de cobre, y al menos un átomo de coordinación de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico y un ligando que comprende un anillo aromático.[0009] Este método tiene solamente una reacción de enzima. Por lo tanto, el sistema de reacción es simple y tiene una buena estabilidad. Por otra parte, el tiempo comprendido entre la reacción de enzima y la reacción de producción de color es muy corto, ya que el sistema de reacción de enzima es simple y se utiliza un mediador para reducir el reactivo colorante. Esto tiene como resultado un tiempo de medición más corto. Por ejemplo, cuando se utiliza glucosa como sustrato en un método colorimétrico según la presente invención, se puede llevar a cabo la medida en un período de tiempo corto (aproximadamente 5 segundos o menos). Por otra parte, una reacción rápida hasta que se produzca el color puede salvar la enzima, de manera que el método colorimétrico resulta ventajoso desde el punto de vista económico. Este método permite que el reactivo colorante produzca color sin depender de peróxido de hidrógeno y no requiere oxígeno, lo que asegura que se pueden obtener con el análisis valores altamente fiables. [0010] El reactivo de la presente invención se utiliza para el método colorimétrico mencionado. El reactivo incluye una oxidoreductasa, un mediador como el que se ha descrito, y un reactivo colorante que es una sal de tetrazolio para producir color por reducción. Una pieza de ensayo de la presente invención incluye este reactivo. En comparación con una pieza de ensayo convencional para análisis colorimétrico que genera peróxido de hidrógeno, la pieza de ensayo de la presente invención puede conseguir un análisis en muy poco tiempo y con valores altamente fiables del análisis.
Breve descripción de los gráficos[0011] La figura 1 es un gráfico en el que se muestra la relación entre una concentración de glucosa y la producción de color del ejemplo 1 de la presente invención, en el que [OsCl(Him)(dmpby)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (Him = imidazol; dmbpy = dimetilbipiridilo).
La figura 2 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 2 de la presente invención, en el que [OsCl(Him)(dmpby)2] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.
La figura 3 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 3 de la presente invención, en el que [Ru(NH3)6] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.
La figura 4 es un gráfico en el que se muestra la relación entre la concentración de glucosa y la producción de color según el ejemplo 4 de la presente invención, en el que [Cu(bpy)2] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante (bpy = bipiridilo).
La figura 5 es un gráfico en el que se muestra el color producido en un reactivo colorante según el ejemplo 10 de la presente invención, en el que la glucosa es el analito, [Ru(NH3)6] es el mediador y WST-5 es el reactivo colorante.
Las figuras 6A y 6B son gráficos en los que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 11, en el que la glucosa es el analito, los mediadores son [Cu(1,10-fenantrolina)2] y [Fe(batofenantrolina)3] respectivamente y MTT es el reactivo colorante.
Las figuras 7A y 7B son gráficos en los que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 12 de la presente invención, en el que la glucosa es el analito, los mediadores son [Fe(2,2’-bipiridilo)3] y [Fe(4,4’-diamino-2,2’-bipiridil)3] respectivamente y MTT es el reactivo colorante.
La figura 8 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 13, en el que la glucosa es el analito, [Fe(TPTZ)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (TPTZ = 2,4,6tripiridil-S-triazina).
La figura 9 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 14, en el que la glucosa es el analito [Cu(cuproína)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (cuproína = 2,2’biquinolina).
La figura 10 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 15 en el que la glucosa es el analito, [Fe(nitro-PAPS)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante (nitro-PAPS = (2(5-nitro-2-piridilazo)-5-[N-n-propil-N-(3sulfopropil)amino]fenol).
La figura 11 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 16, en el que la glucosa es el analito, [Fe(1-nitroso-2naftol)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante.
La figura 12 es un gráfico en el que se muestra el coloreado según el ejemplo 17, en el que la glucosa es el analito, [Fe(ácido 2-amino-4-triazolacético)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante.
La figura 13 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 18 en el que glucosa es el analito, [Fe(ácido 1,2naftoquinona-4-sulfónico)3] es el mediador y MTT es el reactivo colorante.
Las figuras 14A y 14B son gráficos que muestran el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 19 , en el que glucosa es el analito, los mediadores son [OsCl(Him)(dmbpy)2] y [Os(Him)2(dmbpy)2] y el reactivo colorante es MTT.
La figura 15 es un gráfico en el que se muestra el coloreado producido en un reactivo colorante según el ejemplo 20, en el que ácido pirúvico es el analito, [OsCl(Him)(dmbpy)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante.
Las figuras 16A y 16B son gráficos en los que se muestra el color producido en un reactivo colorante en el ejemplo 21 en el que el analito es glucosa, [OsCl(Him)(dmbpy)2] es el mediador y MTT es el reactivo colorante. La figura 16A presenta la traza cuando se utilizan 1000 U/mL de enzima PQQGDH y en la figura 16B se muestran las trazas cuando se utilizan 5000 U/mL de enzima PQQ-GDH.
Mejor modo de realización de la presente invención[0012] En un método colorimétrico, el reactivo y la pieza de ensayo de la presente invención, el mediador consiste en un complejo de rutenio, un complejo de osmio, un complejo de cobre, o una mezcla que contiene al menos dos de estos complejos. Un átomo coordinador de un ligando en el complejo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El ligando consiste en al menos uno seleccionado del grupo que consiste en amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico y un ligando que comprende un anillo aromático. El complejo puede tener dos o más tipos de ligandos, es decir, puede consistir en un complejo de ligandos mixto. Al menos un átomo de hidrógeno que ocupa una posición distinta a la posición de coordinación del ligando puede reemplazarse por un sustituyente. Entre los ejemplos de sustituyentes se incluyen un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido y un grupo halógeno.[0013] En un método colorimétrico, el reactivo y la pieza de ensayo de la presente invención, la oxidoreductasa es preferiblemente una dehidrogenasa o una oxidasa. El analito es preferiblemente, v.g., glucosa, colesterol, ácido láctico, ácido úrico, ácido pirúvico, creatina o creatinina. En este caso, es adecuada una dehidrogenasa o una oxidasa que se corresponda con cada uno de los analitos para la oxidoreductasa. La velocidad de reacción aumenta con la cantidad de enzima. El reactivo colorante es una sal de tetrazolio. Es preferible que la sal de tetrazolio tenga al menos un grupo seleccionado entre un grupo nitrofenilo, un grupo tiazolilo y un grupo benzotiazolilo. Específicamente, entre los ejemplos de sal de tetrazolio se incluyen MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3,5-difeniltetrazolio, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio, cloruro de 2,3-bis(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio, perclorato de 2,3-di(4-nitrofenil)-tetrazolio, cloruro de 3(3-nitrofenil)-5-metil-2-feniltetrazolio y cloruro de 3-(4nitrofenil)-5-metil-2-feniltetrazolio.[0014] La pieza de ensayo de la presente invención incluye preferiblemente un gel inorgánico, además del reactivo. El gel inorgánico sirve para bloquear el oxígeno, evitando así la oxidación del reactivo colorante y desvaneciendo el color producido en el reactivo colorante como consecuencia de la reoxidación. [0015] Tal como se ha descrito antes, es adecuado un complejo de rutenio, un complejo de osmio, o un complejo de cobre para el mediador de la presente invención, siendo particularmente adecuado el complejo de osmio.
Complejo de rutenio
[0016] Entre los ejemplos de ligando en el complejo de rutenio se incluyen amoníaco, un compuesto bipiridilo, un compuesto de imidazol, un compuesto de fenantrolina, un compuesto de triazina, un compuesto de biquinolina, un compuesto de piridilazo, un compuesto benzotiazol, un compuesto antraquinona, un compuesto xanteno, ácido oxálico y un derivado de estos compuestos. Se puede utilizar un ligando mixto con dos o más tipos de estos ligandos.[0017] Para el compuesto de bipiridilo, el índice de coordinación es 6. El compuesto de bipiridilo puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 4,4’ y la posición 5,5’-. Entre los ejemplos de dicho sustituyente se incluyen un grupo alquilo (como por ejemplo un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como bromo, cloro o yodo).[0018] Entre los ejemplos de complejo de rutenio de bipiridilo se incluyen [Ru(piridilo)3], [Ru(4,4’-dimetil2,2’-bipiridilo)3], [Ru(4,4’-difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(4,4’-diamino-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(4,4’dihidroxi-2,2’bipiridilo)3], [Ru(4,4’-dicarboxi-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(4,4’-dibromo-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(5,5’-dimetil2,2’bipiridilo)3], [Ru(5,5’-difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(5,5’-diamino-2,2’-bipiridilo)3], [Ru(5,5’-dihidroxi-2,2’bipiridilo)3], [Ru(5,5’-dicarboxi-2,2’bipiridilo)3], y [Ru(5,5’-dibromo-2,2’-bipiridilo)3].[0019] Para el compuesto de imidazol, el índice de coordinación es 6. El compuesto de imidazol puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 2-, la posición 4-y la posición 5-. Entre los ejemplos de sustituyente se incluyen un grupo alquilo (v.g., un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como por ejemplo bromo, cloro, o yodo).[0020] Entre los ejemplos de complejo de rutenio de imidazol se incluyen [Ru(imidazol)6], [Ru(4-metil-imidazol)6], [Ru(4fenil-imidazol)6], [Ru(4-amino-imidazol)6], [Ru(4-hidroxiimidazol)6], [Ru(4-carboxi-imidazol)6] y [Ru(4bromoimidazol)6].[0021] El aminoácido incluye, v.g., arginina (L-Arg). Un complejo de rutenio de arginina tiene generalmente la ventaja de una alta solubilidad. El ligando mixto puede consistir en una combinación de los compuestos bipiridilo y los compuestos imidazol o una combinación de los compuestos bipiridilo y aminoácido, como [Ru(imidazol)2(bipiridilo)2] o [Ru(L-Arg)2(bipiridilo)2]. El uso del ligando mixto puede impartir diversas propiedades al complejo, v.g., la arginina mejora la solubilidad del complejo.
Complejo de osmio
[0022] Entre los ejemplos de ligando en el complejo de osmio se incluyen amoníaco, un compuesto bipiridilo, un compuesto de imidazol, un compuesto de fenantrolina, amonoácido, un compuesto de triazina, un compuesto de biquinolina, un compuesto de piridilazo, un compuesto de benzotiazol, un compuesto de antraquinona, un compuesto de xanteno, ácido oxálico y un derivado de cada uno de los compuestos. Se puede utilizar un ligando mixto con dos o más tipos de estos ligandos.
[0023] Para el compuesto de bipiridilo, el índice de coordinación es 6. El compuesto de bipiridilo puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 4,4’ y la posición 5,5’-. Entre los ejemplos de dicho sustituyente se incluyen un grupo alquilo (como por ejemplo un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como bromo, cloro o yodo).[0024] Entre los ejemplos de complejo de osmio de bipiridilo se incluyen [Os(piridilo)3], [Os(4,4’-dimetil-2,2’bipiridilo)3], [Os(4,4’-difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Os(4,4’diamino-2,2’-bipiridilo)3], [Os(4,4’dihidroxi-2,2’bipiridilo)3], [Os(4,4’-dicarboxi-2,2’-bipiridilo)3], [Os(4,4’-dibromo-2,2’-bipiridilo)3], [Os(5,5’-dimetil2,2’bipiridilo)3], [Os(5,5’-difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Os(5,5’-diamino-2,2’-bipiridilo)3], [Os(5,5’-dihidroxi-2,2’bipiridilo)3], [Os(5,5’-dicarboxi-2,2’bipiridilo)3], y [Os(5,5’-dibromo-2,2’-bipiridilo)3].[0025] Para el compuesto de imidazol, el índice de coordinación es 6. El compuesto de imidazol puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 2-, la posición 4-y la posición 5-. Entre los ejemplos de sustituyente se incluyen un grupo alquilo (v.g., un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como por ejemplo bromo, cloro, o yodo).[0026] Entre los ejemplos de complejo de osmio de imidazol se incluyen [Os(imidazol)6], [Os(4-metil-imidazol)6], [Os(4fenil-imidazol)6], [Os(4-amino-imidazol)6], [Os(4-hidroxiimidazol)6], [Os(4-carboxiimidazol)6], [Os(4-bromoimidazol)6].[0027] El aminoácido incluye v.g., arginina (L-Arg). Un complejo de osmio de arginina presenta generalmente la ventaja de una alta solubilidad. El ligando mixto puede consistir en una combinación de los compuestos bipiridilo y los compuestos imidazol o una combinación de los compuestos bipiridilo y aminoácido, como [Os(imidazol)2(bipiridilo)2] o [Os(L-Arg)2-(bipiridilo)2]. El uso del ligando mixto puede impartir diversas propiedades al complejo, v.g., la arginina mejora la solubilidad del complejo.
Complejo de cobre
[0028] Entre los ejemplos de ligando en el complejo de cobre se incluyen amoníaco, un compuesto bipiridilo, un compuesto de imidazol, un compuesto de fenantrolina, aminoácido, un compuesto de triazina, un compuesto de biquinolina, un compuesto de piridilazo, un compuesto de benzotiazol, un compuesto de antroquinona, un compuesto de xanteno, ácido oxálico y un derivado de cada uno de estos compuestos. Se puede utilizar un ligando mixto con dos o más tipos de estos ligandos.[0029] Para el compuesto de bipiridilo, el índice de coordinación es 4 ó 6. En aras de la estabilidad, el compuesto de bipiridilo deberá estar coordinado en dos posiciones del complejo. El compuesto de bipiridilo puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 4,4’ y la posición 5,5’-. Entre los ejemplos de dicho sustituyente se incluyen un grupo alquilo (como por ejemplo un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como bromo, cloro o yodo).[0030] Entre los ejemplos de complejo de cobre de bipiridilo se incluyen [Cu(piridilo)2], [Cu(4,4’-dimetil-2,2’bipiridilo)2], [Cu(4,4’-difenil-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(4,4’diamino-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(4,4’dihidroxi-2,2’bipiridilo)2], [Cu(4,4’-dicarboxi-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(4,4’-dibromo-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(5,5’-dimetil2,2’bipiridilo)2], [Cu(5,5’-difenil-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(5,5’-diamino-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(5,5’-dihidroxi-2,2’bipiridilo)2], [Cu(5,5’-dicarboxi-2,2’bipiridilo)2], [Cu(5,5’-dibromo-2,2’-bipiridilo)2], [Cu(bipiridilo)3], [Cu(4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(4,4’-difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(4,4’-diamino-2,2’bipiridilo)3], [Cu(4,4’dihidroxi-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(4,4’-dicarboxi-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(4,4’-dibromo-2,2’bipiridilo)3], [Cu(5,5’-dimetil-2,2’bipiridilo)3], [Cu(5,5’difenil-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(5,5’-diamino-2,2’bipiridilo)3], [Cu(5,5’-dihidroxi-2,2’-bipiridilo)3], [Cu(5,5’-dicarboxi-2,2’bipiridilo)3], y [Cu(5,5’-dibromo2,2’-bipiridilo)3].[0031] Para el compuesto de imidazol, el índice de coordinación es 4. El compuesto de imidazol puede estar sustituido o sin sustituir. La introducción de un sustituyente hace posible controlar, v.g., la solubilidad y la posibilidad de oxidación-reducción del complejo. Entre los ejemplos de posición del sustituyente se incluyen la posición 2-, la posición 4-y la posición 5-. Entre los ejemplos de sustituyente se incluyen un grupo alquilo (v.g., un grupo metilo, un grupo etilo o un grupo propilo), un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi (como por ejemplo un grupo metoxi o un grupo etoxi), un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido, y un grupo halógeno (como por ejemplo bromo, cloro, o yodo).[0032] Entre los ejemplos de complejo de cobre de imidazol se incluyen [Cu(imidazol)4], [Cu(4-metil-imidazol)4], [Cu(4fenil-imidazol)4], [Cu(4-amino-imidazol)4], [Cu(4-hidroxiimidazol)4], [Cu(4-carboxiimidazol)4], [Cu(4-bromoimidazol)4].[0033] El aminoácido incluye v.g., arginina (L-Arg). Un complejo de cobre de arginina generalmente presenta la ventaja de una alta solubilidad. El ligando mixto puede consistir en una combinación de los compuestos bipiridilo y los compuestos imidazol o una combinación de los compuestos bipiridilo y aminoácido, como [Cu(imidazol)2(bipiridilo)] o [Cu(L-Arg)2-(bipiridilo)]. El uso del ligando mixto puede impartir diversas propiedades al complejo, v.g., la arginina mejora la solubilidad del complejo.[0034] La explicación expuesta hasta aquí sobre los complejos de metal de transición se basa en el tipo de metal de transición. En adelante, se describirán los complejos de metal de transición en función de sus ligandos.[0035] Un ligando contiene átomos de coordinación N, O y S, tiene grupos como =N-OH, -COOH, -OH, -SH, >C=O en la molécula. Entre los ejemplos de complejos de metal que incluyen este tipo de ligando se pueden mencionar quelato de NN, quelato de NO, quelato de NS, quelato de OO, quelato de OS, quelato de SS (bidentado), quelato de N (unidentado), y quelato NNN (tridentado). Las combinaciones son diversas. Cuando el ligando tiene un enlace doble, Cu, Fe, Ru y Os del complejo tienden a tener la función de transferir/recibir electrones. El ligando tiene preferiblemente un anillo aromático. Tal como se ha descrito anteriormente, se pueden introducir varios sustituyentes en el ligando. Por ejemplo, la introducción de un grupo sulfona puede mejorar la solubilidad del complejo de metal. El complejo de metal puede formarse mezclando dos o más tipos de ligandos y se puede utilizar como un complejo de ligando mixto. Por ejemplo, cuando uno de los ligandos es una aminoácido, el complejo de metal puede tener una buena afinidad con una enzima. Por otra parte, se pueden unir varios átomos de halógeno (como Cl, F, Br e I) a parte del sitio del metal central. A continuación, se da un ejemplo de los complejos de metal de transición que se clasifican según el tipo de coordinación.
Forma de coordinación NN
Derivado de fenantrolina Cu + 1,10-fenantrolina Cu + batofenantrolina Cu + ácido batofenantroína sulfónico Derivado de bipiridilo Cu + 2,2’-bipiridilo Ru + 4,4’-diamino-2,2’-bipiridilo Derivado de triazina Cu + TPTZ (2,4,6-tripiridil-S-triazina) Derivado de biquinolina Cu + cuproína (2,2’-biquinolina) Derivado de piridilazo
Forma de coordinación NO Forma de coordinación NS Forma de coordinación OO Forma de ligando mixto
Os + Cl, imidazol, 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo Os + imidazol, 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo Cu + L-arginina, 2,2’-bipiridilo Cu + etilendiamina, 2,2’-bipiridilo Cu + imidazol, 2,2’-bipiridilo[0037] El reactivo colorante de la presente invención es una sal de tetrazolio que puede consistir en Cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2Htetrazolio (INT), Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2Htetrazolio (MTT), Cloruro de 3,3’-(1,1-bifenil-4,4’-diiol)-bis(2,5-difenil-2Htetrazolio) (Neo-TB) Cloruro de 3,3’-[3,3’-dimetoxi-(1,1’-bifenil)_4,4’-diil]bis][2-(4-nitrofenil)-5-fenil-2-H-tetrazolio (Nitro TB) Cloruro de 3,3’-[3,3’-dimetoxi-(1,1’-bifenil)-4,4’-diil]bis(2,5-difenil-2H-tetrazolio) (TB), Sal monosódica de 2-(4-yodofenil)3-(4-nitrofenil)-5-(2,4disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-1), Sal monosódica de 2-(4-yodofenil)_3-(2,4-dinitrofenil)-5(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-3), 2-benzotiazol-3-(4-carboxi-2-metoxifenil)-5-[4-(2sulfoetilcarbamoíl)fenil]-2H-tetrazolio (WST-4). Sal disódica de 2,2’-dibenzotiazolil-5,5’-bis[4-di(2sulfoetil)carbamoílfenil]-3,3-(3,3’-dimetoxi-4,4’bifenilen)ditetrazolio (WST-5), Sal monosódica de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-8), Bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3,5-difeniltetrazolio, Bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4-nitrofenil)-5feniltetrazolio, Cloruro de 2,3-bis(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio, Perclorato de 2,3-di(4-nitrofenil)tetrazolio, Cloruro de 3-(3-nitrofenil)-5-metil-2-feniltetrazolio o Cloruro de 3-(4-nitrofenil)-5-metil-2-feniltetrazolio.[0038] A continuación, se aplica el método colorimétrico de la presente invención a una pieza en ensayo. En este caso, se utiliza complejo de osmio como mediador, se utiliza MTT como reactivo colorante, y se utiliza glucosa como analito. Se analizan otros analitos, como colesterol, básicamente de la misma manera a excepción de que se cambia la oxidoreductasa con arreglo a cada uno de los analitos.[0039] En primer lugar, se prepara un complejo de osmio. El complejo de osmio puede ser un producto comercial. Alternativamente, se puede producir a través de cualquiera de los métodos que se describen en los ejemplos a continuación. Se disuelve el complejo de osmio en una solución de tampón, y a continuación, se disuelven MTT, los aditivos (v.g., un aglutinante) y glucosa dehidrogenasa (GDH) en la solución, con el resultado de una solución de reactivo. La solución de tampón puede ser un tampón fosfato, un tampón de Good, o similar. La concentración del complejo de osmio en relación con el total de la solución de tampón oscila v.g. entre 1 y 10% en peso. Entre los ejemplos de aglutinante se incluyen hidroxipropil celulosa (HPC), polialcohol vinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), poliacrilamida y albúmina de suero bovino (BSA), prefiriéndose HPC. Las concentraciones del aglutinante están comprendidas v.g., entre 0,5 y 5% en peso. La concentración de GDH oscila, v.g., entre 1000 y 50000 U/mL. La concentración de MTT no está limitada en particular. Se impregna una lámina porosa (v.g., un papel de filtro) con la solución de reactivo y se seca, produciendo así una pieza de ensayo para el análisis de glucosa. Antes de la impregnación de la solución de reactivo, es preferible impregnar la lámina porosa con una solución de gel inorgánico y secarla. El gel inorgánico puede consistir en esmectita o similar. La concentración de gel inorgánico en la solución está comprendida v.g., entre 1 y 5% en peso, preferiblemente entre 1 y 3% en peso, y más preferiblemente entre 1,5 y 2% en peso. La solución de gel inorgánico puede incluir un agente tensioactivo anfótero como, por ejemplo, CHAPS. La concentración de agente tensioactivo anfótero en relación con el total de la solución de gel inorgánico oscila, v.g., entre 0,1 y 2% en peso, preferiblemente entre 0,1 y 1% en peso, y más preferiblemente entre 0,2 y 0,4% en peso. La cantidad de gel inorgánico impregnado en la lámina porosa está comprendida v.g., entre 1 y 50 mg/cm3, preferiblemente entre 10 y 30 mg/cm3 y más preferiblemente entre 15 y 20 mg/cm3, cuando se mide en función del volumen de vacíos en la lámina porosa. La lámina porosa puede ser una película porosa asimétrica en la que el tamaño del poro varía en la dirección del grosor y en la dirección de la superficie de la lámina. Cuando se vierte una muestra que contiene glucosa (v.g., sangre) sobre la pieza de ensayo, MTT produce color con arreglo a la concentración de glucosa. Por lo tanto, se puede llevar a cabo el análisis cuantitativo o cualitativo midiendo el grado de producción de color. El tiempo necesario para el análisis es de aproximadamente 1 a 3 segundos tras el vertido de la muestra. Si se impregna la pieza de ensayo con un gel inorgánico, el color puede ser más uniforme y estable.[0040] El gel inorgánico consiste preferiblemente en minerales de arcilla hinchables. Entre los minerales de arcilla que se pueden hinchar se prefieren sobre todo bentonita, esmectita, vermiculita o mica de fluorina sintética. En particular, es preferible la esmectita sintética, como hectorita sintética o saponita sintética, o mica sintética (la mica natural generalmente es un mineral de arcilla no hinchable), como mica sintética hinchable (o mica Na) tipificada por mica de fluorina sintética.[0041] A continuación, se aplica el método colorimétrico de la presente invención a un análisis de sistema líquido. En este caso, se utiliza un complejo de osmio como mediador, se utiliza MTT como reactivo colorante y se utiliza glucosa como analito. Se analizan otros analitos como colesterol, básicamente de la misma manera con la excepción de que se cambia la oxidoreductasa con arreglo a cada uno de los analitos. [0042] Se prepara una solución de reactivo disolviendo el complejo de osmio, GDH y MTT en una solución de tampón. Si bien se pueden disolver en agua, es preferible la solución de tampón. El pH de la solución de tampón oscila v.g., entre 6 y 8, preferiblemente entre 6,5 y 7. La concentración del complejo de osmio oscila v.g., entre 0,1 y 60 mM, preferiblemente entre 0,2 y 10 mM, y más preferiblemente entre 0,3 y 0,6 mM. La concentración de GDH oscila v.g., entre 10 y 1000 U/mL, preferiblemente entre 50 y 500 U/ml, más preferiblemente entre 100 y 200 U/ml. La concentración de MTT no está limitada en particular. Cuando se añade una muestra que contiene glucosa (v.g., sangre) a la solución de reactivo, la solución de reactivo produce color con arreglo a la concentración de glucosa en un breve período de tiempo, v.g., 5 segundos o menos. Este cambio se puede observar a simple vista o se puede medir con un dispositivo de medición óptico como, por ejemplo, un espectrofotómetro. La cantidad de muestra añadida oscila, v.g., entre 1 y 100 µl, preferiblemente entre 3 y 10 µl, más preferiblemente entre 5 y 10 µl, por cada 1 ml de solución de reactivo.
Ejemplos[0043] A continuación, se describen ejemplos de la presente invención. Los ejemplos que implican complejos de hierro no forman parte de la invención, pero se incluyen no obstante para ilustrar los métodos útiles para su uso en la invención. En cada uno de los ejemplos, PQQ representa pirrolquinolina quinona y los demás reactivos se explican en detalle en la siguiente tabla.
- Reactivo
- Fabricante Nota (nombre, etc.)
- PQQGDH
- TOYOBO Co, Ltd. PQQ-Glucosa dehidrogenasa
- GOD
- Sigma Glucosa oxidasa Tipo X-S
- Piruvato oxidasa
- BoehringerMannheim
- MTT
- DOJINDO LABORATORIES Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2tiazolil)-2,5-difenil-2Htetrazolio
- WST-4
- DOJINDO LABORATORIES 2-benzotiazolil-3-(4-carboxi-2metoxifenil)-5-[4-(2sulfoetilcarbamoíl)fenil]-2Htetrazolio
- WST-5
- DOJINDO LABORATORIES Sal disódica de 2,2’dibenzotiazolil-5,5’-bis[4di(2-sulfoetil)carbamoílfenil]3,3’-(3,3’-dimetoxi-4,4’bifenilen)ditetrazolio
- Glucosa
- Wako Pure Chemical Industries Ltd. D(+)-Glucosa
- Ácido pirúvico
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Piruvato monohidrato de litio
Ejemplo 1
[0044] Se sintetizó un complejo de osmio [OsCl(Him)(dmbpy)2]. En primer lugar, se sometieron a reflujo 2,00 g (4,56 mmoles) 5 de (NH4)2[OsCl6] y 1,68 g (9,11 mmoles) de dimetil bipiridilo (dmbpy) en etilen glicol (60 ml) durante 1 hora bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución 1M de hidrosulfito sódico (120 ml) durante 30 minutos, seguido de enfriado en un baño 10 con hielo durante 30 minutos. Se filtraron los precipitados así producidos a presión reducido y se lavó suficientemente con agua (500 a 1000 ml). Asimismo, se lavaron los precipitados dos veces con éter dietílico y después se secó a presión reducida. De este modo, se obtuvieron 1,5 a 1,7 g de
[OsCl2(dmbpy)2]. A continuación, se sometieron a reflujo 1,56 g (2,60 mmoles) del [OsCl2(dmbpy)2] resultante y 0,36 g (5,2 mmoles) de imidazol (Him) en un disolvente mixto de agua/metanol (50 ml) durante 2 horas bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución de NaCl saturada (300 ml). Se filtraron los precipitados así producidos a presión reducida, se lavaron con una solución saturada de NaCl, y se secaron a presión reducida. De este modo se obtuvo [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2. Se disolvió [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 en la cantidad mínima posible de acetonitrilo/metanol (1:1 v/v) y se purificó por cromatografía de columna (absorbente: alúmina activada; disolvente de revelado: acetonitrilo/metanol). Se evaporó el disolvente, se disolvió el residuo en una cantidad reducida de acetona y se hizo volver a precipitar con éter dietílico. Se filtró el precipitado así producido y se secó a presión reducida, con el resultado de [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2. [0045] Se preparó la siguiente solución de reactivo que incluía el complejo de osmio. En primer lugar, se colocaron 5 µl de solución de glucosa (GLU) con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 mg/100 ml) en una microcélula (hecha de polimetacrilato) que tenía una longitud de trayectoria óptica de 10 mm. A continuación, se añadieron 1000 µl de solución de reactivo, y se midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. En la figura 1 se muestran los resultados. El gráfico indica que se produjo color con arreglo a la concentración de glucosa. Dado que se llevó a cabo la reacción de forma rápida, se tardaron sustancialmente solamente 2 segundos en que el sustrato se consumiera completamente.
Composición de solución de reactivo MTT (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0,1 mM PIPES (pH 7,0) 40 mM PQQGDH 200 U/ml
Ejemplo 2
[0046] Se preparó la siguiente solución de reactivo que incluía un complejo de osmio. En primer lugar, se colocaron 5 µl de solución de glucosa (GLU) con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 mg/100ml) en una microcélula (hecha de polimetacrilato) que tenía una longitud de trayectoria óptica de 10 mm. A continuación, se añadieron 1000 µl de la solución de reactivo, y se midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. En la figura 2 se muestran los resultados. En el gráfico se indica que se produjo color de acuerdo con la concentración de glucosa. Dado que se llevó a cabo la reacción de manera rápida, se tardo sustancialmente sólo un segundo en consumirse completamente el sustrato.
Composición de solución de reactivo WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 0,1 mM PIPES (pH 7,0) 40 mM PQQGDH 200 U/ml
Ejemplo 3
[0047] Se preparó la siguiente solución de reactivo que incluía un complejo de rutenio. En primer lugar, se colocaron 5 µl de solución de glucosa (GLU) con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 mg/100ml) en una microcélula (hecha de polimetacrilato) que tenía una longitud de trayectoria óptica de 10 mm. A continuación, se añadieron 1000 µl de la solución de reactivo, y se midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. En la figura 3 se muestran los resultados. En el gráfico se indica que se produjo color de acuerdo con la concentración de glucosa. Dado que se llevó a cabo la reacción de manera rápida, se tardo sustancialmente sólo 2 segundos en consumirse completamente el sustrato.
Composición de solución de reactivo WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM [Ru(NH3)6)Cl3 (Aldrich) 10 mM PIPES (pH 7,0) 40 mM PQQGDH 200 U/ml
Ejemplo 4
[0048] Se mezclaron CuCl2 y 2,2’-bipiridil (bpy) a una relación molar de 1:2 en un baño con agua a aproximadamente 80ºC y se sintetizó en [Cu(bpy)2]Cl2. Se preparó la siguiente solución de reactivo que incluía este complejo. En primer lugar, se colocaron 5 µl de solución de glucosa (GLU) con diferentes concentraciones (0, 200, 400, 600 mg/100ml) en una microcélula (hecha de polimetacrilato) que tenía una longitud de trayectoria óptica de 10 mm. A continuación, se añadieron 1000 µl de la solución de reactivo, y se midió inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm. En la figura 4 se muestran los resultados. En el gráfico se indica que se produjo color de acuerdo con la concentración de glucosa. Dado que se llevó a cabo la reacción de manera rápida, se tardo sustancialmente sólo dos segundos en consumirse completamente el sustrato. Composición de solución de reactivo
WST-5 (DOJINDO LABORATORIES) 0,5 mM [Cu(bpy)2]Cl2 1 mM PIPES (pH 7,0) 40 mM PQQGDH 200 U/ml
Ejemplo 5
[0050] Se preparó un complejo de cobre utilizando varios ligandos. Se mezclaron el cloruro de cobre (II) y cada uno de los siguientes ligandos en una relación molar de 1:2, se disolvió en agua purificada y se incubó durante 10 minutos en un baño de agua a aproximadamente 80ºC para que se coordinaran los ligandos con el metal del complejo. De esta manera se obtuvo una solución de complejo.
- Ligando
- Fabricante Complejo
- 1,10-fenantrolina
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd [Cu(1,10-fenantrolina)2]
- batofenantrolina
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Cu(batofenantrolina)2]
- sal disódica de ácido batofenantrolina sulfónico
- Nacalai Tesque, Inc. [Cu(ácido batofenantrolina sulfónico)2]
- 2,2’-bipiridilo
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Cu(2,2’-piridilo)2]
- TPTZ
- DOJINDO LABORATORIES [Cu(TPTZ)2]
- Cuproína
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Cu(cuproín)2]
10
Ejemplo 6
[0051] Se preparó un complejo de ligando mixto de cobre utilizando cada uno de los siguientes ligandos y los compuestos de bipiridilo. Se mezclaron cobre, cada uno de los 15 ligandos indicados, y los compuestos de bipiridilo en una relación molar de 1:2:1, se disolvió en agua purificada y se incubó durante 10 minutos en un baño de agua a aproximadamente 80ºC para que se coordinaran los ligandos y los compuestos de bipiridilo con el metal. De esta manera se
20 obtuvo una solución de complejo.
- Ligando
- Fabricante Complejo
- L-arginina
- Nacalai Tesque, Inc. [Cu(L-Arg)(bpy)]
- Etilendiamina
- Nacalai Tesque, Inc. [Cu(en)(bpy)]
- Imidazol
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Cu(Him)(bpy)]
Ejemplo 7
[0052] Se preparó un complejo de cobre utilizando diferentes ligandos. Se mezclaron cloruro de hierro (III) y cada uno de
5 los ligandos indicados en una relación molar de 1:3, se disolvieron en agua purificada y se incubaron durante 10 minutos en un baño de agua a aproximadamente 80ºC para que se coordinaran los ligandos con el metal. De esta manera se obtuvo una solución de complejo.
10
- Ligando
- Fabricante Complejo
- 1,10-fenantrolina
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Fe(1,10fenantrolina)3]
- Batofenantrolina
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Fe(batofenantrolina)3]
- Sal disódica de ácido batofenantrolina sulfónico
- Nacalai Tesque, Inc. [Fe(ácido batofenantrolin sulfonico)3]
- 2,2’-bipiridilo
- Wako Pure Chemical Industries, Ltd. [Fe(2,2’-bipiridil)3]
- 4,4’-diamino-2,2’bipiridilo
- Arkray, Inc. [Fe(4,4’-diamino-2,2’bipiridil)3]
- TPTZ
- DOJINDO LABORATORIES [Fe(TPTZ)3]
- PDTS
- DOJINDO LABORATORIES [fe(PDTS)3]
- nitro-PAPS
- DOJINDO LABORATORIES [Fe(nitroso-PAPS)3]
- nitroso-ESAP
- DOJINDO LABORATORIES [Fe(nitroso-ESAP)3]
- 1-nitroso-2-naftol
- KANTO KAGAKU [Fe(1-nitroso-2naftol)3]
- Ácido 2-amino-4tiazol acético
- Lancaster [Fe(ácido 2-amino-4tiazol acético)3]
- Ácido 1,2naftoquinona-4sulfónico
- Nacalai Tesque, Inc. [Fe(ácido naftoquinona4-sulfónico)3]
- nitroso-PSAP
- DOJINDO LABORATORIES [Fe(nitrosol-PSAP)3]
Ejemplo 8
[0053] Se prepararon los dos tipos de complejos de rutenio de la siguiente manera.
5 [Ru(NH3)6][0054] Se disolvió un complejo de rutenio comercial (fabricado por Aldrich, Cloruro de hexaminerutenio (III)) en agua para obtener una solución de complejo de [Ru(NH3)6][Ru(4,4’-diamino-2,2’-bipiridil)3]
10 Ligando[0055] En primer lugar, se disolvieron 11,8 g (63,0 mmoles) de 2,2’-bipiridil-N,N’-dióxido (fabricado por Aldrich) lentamente en 120 ml de ácido sulfúrico concentrado enfriado en un baño de hielo y se calentó la solución resultante a
15 100ºC. A continuación, se añadió lentamente, gota a gota solución de ácido sulfúrico concentrado (100 ml) que contenía 64,0 g (630 mmoles) de nitrato potásico y se agitó durante 1 hora al mismo tiempo que se calentaba. Tras la reacción, se enfrió la solución a temperatura ambiente, se vertió en hielo
20 triturado y se filtró. De esta manera, se obtuvo un sólido de 4,4’-dinitro-2,2’-bipiridil-N,N’-óxido. A continuación, se suspendieron 7,0 g (25 mM) de 4,4’-dinitro-2,2’-bipiridilN,N’-óxido y 6,0 g de paladio sobre carbono al 10% en etanol (23 ml) bajo una corriente de argon. Se añadió a esta solución, gota a gota, una solución de etanol (47 ml) que contenía 6,3 g (126 mmoles) de monohidrato de hidrazina, seguido de reflujo durante 8 horas. Se enfrió la solución resultante y se filtró. Se concentró el filtrado y se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice. De esta manera se obtuvo 4,4’-diamino-2,2’-bipiridilo.
Síntesis [0057] Se colocó etilen glicol (10 mL) en un matraz de dos bocas de 50 mL, en el que se habían disuelto DA-pby (4,4’diamino-2,2’-bipiridina) (0,2 g) y RuCl3 (0,1 g) sucesivamente con agitación. Se calentó la solución con un calentador con manguito al mismo tiempo que se agitaba vigorosamente bajo una corriente de N2, seguido de reflujo durante aproximadamente 4 horas.
Purificación [0057] Después de agitar bajo una corriente de N2 y enfriado, se transfirió la solución a 100 mL de un matraz de forma de berenjena de 100 mL y se lavó con acetona (5 mL) + éter dietílico (20 mL). Se repitió este lavado de la solución con acetona (5 mL) + éter dietílico (20 mL) hasta que se eliminó suficientemente el disolvente (etilen glicol). De este modo, se lavó la sustancia objetivo en etanol y se hizo precipitar por adición de éter dietílico. Se filtró la sustancia objetivo al mismo tiempo que se lavaba con éter dietílico y se secaba a presión reducida. De este modo, se obtuvo un sólido [Ru(4,4’-diamino-2,2’-bipiridil)3]. Se disolvió este sólido en agua para obtener una solución de complejo.
Ejemplo 9
[0058] Se prepararon dos tipos de complejos de osmio del siguiente modo [OsCl(Him)(dmbpy)2] Síntesis [0059] En primer lugar, se sometieron a reflujo 2,00 g (4,56 mmoles) de (NH4)2[OsCl6] (fabricado por Aldrich) y 1,68 g (9,11 mmoles) de 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridil (dmbpy, fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en etilen glicol (60 ml) durante 1 hora bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución 1M de hidrosulfito sódico (120 ml) durante 30 minutos, seguido de enfriado en un baño con hielo durante 30 minutos. Se filtró el precipitado así producido a presión reducida, y se lavó suficientemente con agua (500 a 1000 ml). Asimismo, se lavaron los precipitados dos veces con éter dietílico, y después se secaron a presión reducida. De esta forma, se obtuvieron 1,5 a 1,7 g de [OsCl2(dmbpy)2]. A continuación, se sometieron a reflujo 1,56 g (2,60 mmoles) del [OsCl2(dmbpy)2] resultante y 0,36 g (5,2 mmoles) de imidazol (Him), en un disolvente mixto de agua/metanol (50 ml) durante 2 horas bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución saturada de NaCl (300 ml). Se filtraron los precipitados así producidos a presión reducida, se lavaron con solución de NaCl saturada y se secaron a presión reducida. De esta manera, se obtuvo [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2.
Purificación [0060] Se disolvió el [OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2 en la cantidad mínima posible de acetonitrilo/metanol (1:1 v/v) y se purificó por cromatografía de columna (absorbente: alúmina activa; disolvente de revelado: acetonitrilo/metanol). Se evaporó el disolvente, se disolvió el residuo en una pequeña cantidad de acetona y se hizo precipitar de nuevo con éter dietílico. Se filtraron los precipitados así producidos y se secaron a presión reducida y después se disolvieron en agua. De esta manera, se obtuvo una solución de complejo.
[Os(Him)2(dmbpy)2]
Síntesis [0061] En primer lugar, se sometieron a reflujo 2,00 g (4,56 mmoles) de (NH4)2[OsCl6] y 1,68 g (9,11 mmoles) de dmbpy en etilen glicol (60 ml) durante 1 hora bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución 1M de hidrosulfito sódico (120 ml) durante 30 minutos, seguido de enfriado en un baño con hielo durante 30 minutos. Se filtraron los precipitados así producidos a presión reducida y se lavaron suficientemente con agua (500 a 1000 ml). Asimismo, se lavaron los precipitados dos veces con éter dietílico y después se secaron a presión reducida. De esta manera se obtuvieron de 1,5 a 1,7 g de [OsCl2(dmbpy)2]. A continuación, se sometieron a reflujo 1,56 g (2,60 mmoles) del [OsCl2(dmbpy)2] resultante y 0,36 g (5,2 mmoles) de imidazol (Him) en un disolvente de 1,2-etanoditiol (50 ml) durante 2 horas bajo una corriente de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió una solución de NaCl saturada (300 ml). Se filtraron los precipitados así formados a presión reducida, se lavaron con solución de NaCl saturada, y se secaron a presión reducida. De este modo se obtuvo [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2.
Purificación
[0062] Se disolvió [Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2 en la cantidad mínima posible de acetonitrilo/metanol (1:1 v/v) y se purificó por cromatografía de columna (absorbente: alúmina activada; disolvente de revelado: acetonitrilo/metanol). Se evaporó el disolvente, se disolvió el residuo en una pequeña cantidad de acetona, y se hizo volver a precipitar con éter dietílico. Se filtraron los precipitados así producidos y se secaron a presión reducida, y después se disolvieron en agua. De este modo, se obtuvo una solución de complejo.
Ejemplo 10
[0063] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante y una solución de tampón con la siguiente composición. El complejo fue el mismo que el sintetizado en los ejemplos anteriores. Esto se aplica a los siguientes ejemplos. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo, a la solución de reactivo, y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 5 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de WST-5, ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones reduciendo el WST-5.
- Composición de solución de reactivo[0064]
- PQQ-GDH
- 50 U/mL
- [Ru(NH3)6]
- 0,8 mM
- WST-5
- 0,2 mM
- PIPES (pH 7)
- 50 mM
- Triton® X-100
- 0,5%
- Ejemplo 11
[0065] Se prepararon soluciones de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante y una solución de tampón con las siguientes composiciones. Se midió el espectro de cada una de las soluciones de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a cada una de las soluciones de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En las figuras 6A y 6B se muestran los resultados. Ambos gráficos indican el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo 1 (figura 6A).
PQQ-GDH 50 U/mL [Cu(1,10-fenantrolina)2] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Composición de solución de reactivo 2 (figura 6B)
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(batofenantrolina)3] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5% (batofenantrolina = 4,7 difenil fenentrolina)
Ejemplo 12
[0068] Se prepararon soluciones de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con las siguientes composiciones. Se midió el espectro de cada uno de los reactivos y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a cada una de las soluciones de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En las figuras 7A y 7B se muestran los resultados. Ambos gráficos indican el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo 1 (figura 7A)
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(2,2’-bipiridil)3] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Composición de solución de reactivo 2 (figura 7B)
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(4,4’-diamino-2,2’-bipiridilo)3] 0,1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Ejemplo 13
[0071] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con la siguiente composición. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a la solución de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 8 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(TPTZ)3] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5% (TPTZ = 2,4,6-tripiridil-s-triazina)
Ejemplo 14
[0073] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con las siguientes composiciones. Se midió el espectro de cada uno de los reactivos y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a cada una de las soluciones de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 9 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Cu(Cuproína)2] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5% (Cuproína = 2,2-biquinolina)
Ejemplo 15
[0075] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con la siguiente composición. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a la solución de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 10 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(nitro-PAPS)3] 0,02 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Ejemplo 16
[0077] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con la siguiente composición. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a la solución de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 11 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(1-nitroso-2-naftol)3] 0,1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Ejemplo 17
[0079] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con la siguiente composición. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a la solución de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 12 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(ácido 2-amino-4-triazolacético)3] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Ejemplo 18
[0081] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con la siguiente composición. Se midió el espectro de la solución de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a la solución de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 13 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT.
Composición de solución de reactivo
PQQ-GDH 50 U/mL [Fe(ácido 1,2-naftoquinona-4-sulfónico)3] 1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5%
Ejemplo 19
[0083] Se prepararon soluciones de reactivo mezclando un complejo, una enzima, un reactivo colorante, y una solución de tampón con las siguientes composiciones 1 y 2. Se midió el espectro de cada una de las soluciones de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a cada una de las soluciones de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En las figuras 14A y 14B se muestran los resultados. Ambos gráficos indican el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de electrones para reducir el MTT. Composición de solución de reactivo 1 (Fig. 4A)
PQQ-GDH 50 U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0,1 mM
MTT 1 mM
PIPES (pH 7) 50 mM
Triton® X-100 0,5%
(Him = imidazol)
(dmbpy = 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo)
Composición de solución de reactivo 2 (Fig. 14B)
PQQ-GDH 50 U/mL [Os(Him)2(dmbpy)2] 0,1 mM MTT 1 mM PIPES (pH 7) 50 mM Triton® X-100 0,5% (Him = imidazol) (dmbpy = 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo)
Ejemplo 20
[0086] Se preparó una solución de reactivo mezclando un complejo, una enzima (piruvato oxidasa), un reactivo colorante, y una solución de tampón con las siguientes composiciones. Se midió el espectro de cada una de las soluciones de reactivo y se identificó como la muestra en blanco. Asimismo, se añadió glucosa en una cantidad equivalente a la del complejo a cada una de las soluciones de reactivo y se midió el espectro tras el cambio de color. En la figura 15 se muestran los resultados. El gráfico indica el espectro en particular para una reducción de MTT ya que el complejo de metal actuó como agente de transferencia de
- electrones para reducir el MTT.
- Composición de solución de reactivo[0087]
- Pirurvato oxidasa
- 100 U/mL
- [OsCl(Him)(dmbpy)2]
- 0,2 mM
- MTT
- 1 mM
- PIPES (pH 7)
- 50 mM
- Triton® X-100
- 0,5%
- (Him = imidazol)
- (dmbpy = 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridilo)
- Ejemplo 21
[0088] En este ejemplo se demostró que la velocidad de reacción de un reactivo puede mejorarse al aumentar la cantidad de enzima. Se impregnaron dos telas de malla (10 cm x 10 cm) respectivamente con soluciones de reactivo (1 ml) que tenían las siguientes composiciones 1, 2 y se secaron con aire caliente. Se unieron estas telas a películas de politereftalato de etileno (PET) y se cortaron en una forma determinada previamente, produciendo así dos piezas de ensayo con diferentes cantidades de enzima. Se utilizaron soluciones de referencia de glucosa a base de suero (0, 200, 400, 600 mg/dl) como muestras y se vertió cada una de las muestras en piezas de ensayo para observar el cambio K/S durante 30 segundos con un aparato de medición de la reflectancia (LED/longitud de onda 660 nm). Se prepararon soluciones de referencia de glucosa a base de suero del siguiente modo. Se glucolizó completamente el plasma de sangre humana, se congeló y se fundió para producir suero. A continuación, se añadió una solución de glucosa a este suero. En las figuras 16A y 16B se muestran los resultados. Tal como se indica en los gráficos, la solución de reactivo que incluye 5000 U/mL de enzima mejora la velocidad de reacción en comparación con la solución de reactivo que incluye 1000 U/mL de enzima, y la reacción llega a su término al cabo de aproximadamente 5 segundos. El muestreo de señales cercanas a los 5 segundos, en los cuales la reacción parece llegar a su fin, hace posible determinar cuantitativamente la glucosa. La pendiente del gráfico desde el comienzo hasta el final de la reacción, puede utilizarse también para determinar cuantitativamente la glucosa.
Composición de solución de reactivo 1 (Fig. 16A)
PQQ-GDH 1000 U/mL
[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1 mM
MTT 30 mM
PIPES (pH 6,5) 80 mM
MEGA-8 (DOJINDO LABORATORIES) 1%
Poliacrilamida 0,1%
BSA 1%
Composición de solución de reactivo 2 (Fig. 16BA)
PQQ-GDH 5000 U/mL [OsCl(Him)(dmbpy)2] 1 mM MTT 30 mM PIPES (pH 6,5) 80 mM MEGA-8 (DOJINDO LABORATORIES) 1% Poliacrilamida 0,1% BSA 1%
Aplicación industrial[0091] Tal como se ha descrito anteriormente, el método colorimétrico de la presente invención puede aplicarse para realizar un análisis de forma fiable y sencilla en un breve 5 período de tiempo.
10
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25
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Claims (13)
- Reivindicaciones1. Un reactivo para su uso en un análisis colorimétricode un analito que comprende: una oxidoreductasa; un mediador; y un reactivo colorante para producir color por reducción, siendo el reactivo colorante una sal de tetrazolio ycomprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio y un complejo de rutenio, yen el que al menos un átomo coordinador de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y el complejo comprende al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico, y un ligando que comprende un anillo aromático.
-
- 2.
- El reactivo según la reivindicación 1, en el que se reemplaza al menos un átomo de hidrógeno que ocupa una posición distinta a la posición de coordinación del ligando por un sustituyente, y en el que el sustituyente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido y un grupo halógeno.
-
- 3.
- El reactivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el complejo incluye al menos dos
o más tipos de ligandos. -
- 4.
- El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa.
-
- 5.
- El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sal de tetrazolio comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo nitrofenilo, un grupo tiazolilo y un grupo benzotiazolilo y preferiblemente comprende al menos un reactivo colorante seleccionado del grupo que consiste en MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1, WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)3,5-difeniltetrazolio, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, cloruro de 2,3-bis(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, perclorato de 2,3-di(4nitrofenil)tetrazolio, cloruro de 3-(3-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio y cloruro de 3-(4-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio.
-
- 6.
- El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el analito es glucosa, colesterol, ácido úrico, ácido pirúvico, ácido láctico, creatina, o creatinina, y la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa que se corresponde a cada uno de los analitos.
-
- 7.
- Un método colorimétrico que comprende: la transferencia de un electrón desde un analito a un mediador mediante el uso de una oxidoreductasa; la transferencia del electrón desde el mediador a un reactivo colorante que produce color por reducción;
la realización de un análisis cuantitativo o cualitativo del analito midiendo el color producido en el reactivo colorante;consistiendo el reactivo colorante en una sal de tetrazolio y comprendiendo el mediador al menos un complejo seleccionado entre un complejo de cobre, un complejo de osmio, y un complejo de rutenio; yen el que al menos un átomo de coordinación de un ligando en el complejo se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y comprendiendo el complejo al menos un ligando seleccionado entre amoníaco, un aminoácido, ácido oxálico y un ligando que comprende un anillo aromático. -
- 8.
- El método colorimétrico según la reivindicación 7, en el que está reemplazado al menos un átomo de hidrógeno que ocupa una posición distinta a la posición de coordinación del ligando por un sustituyente y
en el que el sustituyente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo alilo, un grupo fenilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo carboxi, un grupo carbonilo, un grupo sulfona, un grupo sulfonilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria, un grupo amino, un grupo acilo, un grupo amido y un grupo halógeno. -
- 9.
- El método colorimétrico según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el complejo incluye dos o más tipos de ligandos.
-
- 10.
- El método colorimétrico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa.
-
- 11.
- El método colorimétrico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la sal de tetrazolio comprende al menos un grupo seleccionado entre un grupo nitrofenilo, un grupo tiazolilo y un benzotiazolilo, y comprende preferiblemente al menos un reactivo colorante seleccionado entre MTT, INT, Neo-TB, Nitro-TB, TB, WST-1,
WST-3, WST-4, WST-5, WST-8, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)3,5-difeniltetrazolio, bromuro de 2-(2-benzotiazolil)-3-(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, cloruro de 2,3-bis(4nitrofenil)-5-feniltetrazolio, perclorato de 2,3-di(45 nitrofenil)tetrazolio, cloruro de 3-(3-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio y cloruro de 3-(4-nitrofenil)-5-metil-2feniltetrazolio. - 12. El método colorimétrico según cualquiera de las10 reivindicaciones 7 a 11, en el que el analito es glucosa, colesterol, ácido úrico, ácido pirúvico, ácido láctico, creatina o creatinina y la oxidoreductasa es una dehidrogenasa o una oxidasa que corresponde a cada uno de los analitos.15
- 13. Una pieza de ensayo para análisis colorimétrico que comprende el reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.20 14. La pieza de ensayo según la reivindicación 13, que comprende además un gel inorgánico.25
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