ES2227796T3 - Metodos y reactivos para determinar cuantitativamente acido ascorbico. - Google Patents
Metodos y reactivos para determinar cuantitativamente acido ascorbico.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE ACIDO ASCORBICO EN UNA MUESTRA UTILIZANDO OXIDASA DE ASCORBATO QUE CATALIZA LA REACCION DE LA FORMA REDUCIDA DE ACIDO ASCORBICO CON OXIGENO PARA FORMAR ACIDO ASCORBICO OXIDADO Y PEROXIDO DE HIDROGENO (DENOMINANDOSE DE AHORA EN ADELANTE LA ENZIMA ASOD), SEGUN EL CUAL LA REACCION DE ACIDO ASCORBICO REDUCIDO CON OXIGENO EN PRESENCIA DE ASOD PARA FORMAR ACIDO ASCORBICO OXIDADO Y PEROXIDO DE HIDROGENO Y LA REACCION DEL PEROXIDO DE HIDROGENO FORMADO CON UN CROMOGENO EN PRESENCIA DE PEROXIDASA PARA FORMAR UN PIGMENTO SE LLEVAN A CABO EN UN MEDIO ACUOSO EN EL MISMO SISTEMA DE REACCION Y A CONTINUACION SE DETERMINA EL PIGMENTO FORMADO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE ACIDO ASCORBICO TOTAL, SEGUN EL CUAL LAS REACCIONES ENZIMATICAS SE LLEVAN A CABO EN PRESENCIA DE UN AGENTE REDUCTOR CAPAZ DE CONVERTIR EL ACIDO ASCORBICO OXIDADO EN UN ACIDO ASCORBICO REDUCIDO ENDICHO MEDIO ACUOSO. CON EL PROCEDIMIENTO SE PUEDE DETERMINAR EL ACIDO ASCORBICO TOTAL A UNA BAJA CONCENTRACION. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL ACIDO ASCORBICO TOTAL SEGUN EL CUAL EL ACIDO ASCORBICO OXIDADO PRESENTE EN LA MUESTRA ANTEDICHA SE REDUCE UTILIZANDO UN AGENTE REDUCTOR QUE SEA CAPAZ DE CONVERTIR EL ACIDO ASCORBICO OXIDADO EN UN ACIDO ASCORBICO REDUCIDO Y A CONTINUACION LAS REACCIONES ENZIMATICAS SE LLEVAN A CABO EN PRESENCIA DE UN COMPUESTO CAPAZ DE DESACTIVAR EL AGENTE REDUCTOR. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN REACTIVO Y A UN KIT PARA LA DETERMINACION DE UN ACIDO ASCORBICO ADECUADO PARA SU USO EN LOS PROCEDIMIENTOS ANTEDICHOS. EL PROCEDIMIENTO DE LA PRESENTE INVENCION ES UN PROCEDIMIENTO SENCILLO PARA LA DETERMINACION DE UN ACIDO ASCORBICO APLICABLE A UNA SELECCION EN ENSAYOS CLINICOS Y CAPAZ DE ANALIZAR UN GRAN NUMERO DE MUESTRAS AL MISMO TIEMPO.
Description
Métodos y reactivos para determinar
cuantitativamente ácido ascórbico.
La presente invención se refiere a un método, a
un reactivo y a un kit para la determinación cuantitativa de ácido
ascórbico.
El ácido ascórbico, también llamado vitamina C,
constituye una vitamina importante dado que su carencia in
vivo causa escorbuto, etc., y en los últimos años se ha
observado la relación existente entre el ácido ascórbico y la
senilidad. Por lo tanto, se considera importante la determinación
del ácido ascórbico.
Los métodos anteriores para la determinación
cuantitativa de ácido ascórbico incluyen métodos químicos tales
como el método hidracina y métodos instrumentales tales como la
cromatografía líquida de alto rendimiento. Sin embargo, estos
métodos conocidos presentan la desventaja de involucrar
procedimientos complicados y de requerir muchas horas para lograr la
determinación.
Recientemente, se ha descubierto la
ascorbato-oxidasa (de aquí en adelante denominada
ASOD), la cual cataliza la reacción de oxidación de ácido ascórbico
reducido en presencia de oxígeno para formar el ácido ascórbico
oxidado y peróxido de hidrógeno. El ácido ascórbico en una muestra
se determina midiendo la cantidad de oxígeno consumido o la
cantidad de peróxido de hidrógeno formado por esta reacción
enzimática [JP-A-209770/94,
JP-A-23971/96
(EP-A-682116)].
El documento
JP-A-209770/94 describe un método
químico como el método específico para la determinación de peróxido
de hidrógeno, pero no describe un método para usar la peroxidasa.
El documento JP-A-23971/96
(EP-A-682116) describe un método
para la determinación de peróxido de hidrógeno el cual comprende
hacer reaccionar peróxido de hidrógeno, en presencia de peroxidasa,
con un cromógeno que comprende un donante de hidrógeno como ser
fenol o un reactivo Trinder y un acoplador tal como
4-aminoantipirina para formar un pigmento, y después
medir la absorbancia de la solución de reacción coloreada por el
pigmento formado. Éste es un método para la determinación de
peróxido de hidrógeno formado que se lleva a cabo después de que la
reacción para formar peróxido de hidrógeno se ha completado y el
ácido ascórbico reducido se ha convertido por completo en ácido
ascórbico oxidado.
En general, se sabe que la presencia de
sustancias reductoras tales como el ácido ascórbico y el
ditiotreitol altera una reacción para formar un pigmento mediante
el uso de peroxidasa. En consecuencia, resulta necesario practicar
la reacción para formar un pigmento sólo después de que el ácido
ascórbico reducido en una muestra se haya oxidado completamente
mediante la acción de ASOD y de que la formación de peróxido de
hidrógeno se haya completado. En este método, a pesar de la
utilización de una reacción enzimática, se debe acumular peróxido de
hidrógeno químicamente inestable una vez en la solución de
reacción.
Las muestras biológicas contienen sustancias
reductoras tales como ácido úrico, catalasa, bilirrubina y
hemoglobina las cuales consumen el peróxido de hidrógeno formado.
Por lo tanto, el método precedente en el cual se acumula peróxido de
hidrógeno no puede proporcionar datos precisos que tengan capacidad
de reproducción. Además, el método involucra procedimientos
complicados y requiere muchas horas para lograr la
determinación.
En un organismo vivo, el ácido ascórbico oxidado
existe junto con el ácido ascórbico reducido, y la determinación
del ácido ascórbico total compuesto por ácido ascórbico reducido y
ácido ascórbico oxidado también resulta clínicamente importante.
El ácido ascórbico total puede determinarse
convirtiendo ácido ascórbico oxidado en ácido ascórbico reducido
con un agente reductor tal como el ditiotreitol y midiendo el ácido
ascórbico reducido utilizando ASOD. Sin embargo, el método en el
cual el peróxido de hidrógeno formado se reacciona con un cromógeno
en presencia de peroxidasa y se determina el pigmento formado
presenta la desventaja de que la formación del pigmento se ve
alterada debido a que el cromógeno recibe la influencia de un
agente reductor coexistente. A fin de resolver este problema,
resulta necesaria la eliminación del agente reductor remanente de
la solución de reacción antes de la determinación del peróxido de
hidrógeno, lo cual complica los procedimientos.
En los documentos
JP-A-29297/82 (Patente de EE.UU. Nº
4.384.042) y JP-A-218069/85 se
describen métodos para la determinación de un analito en una
muestra en la cual la reacción de la muestra con oxidasa actúa sobre
el analito como el sustrato para formar peróxido de hidrógeno (de
aquí en adelante la reacción se denomina reacción de formación de
peróxido de hidrógeno) y la reacción del peróxido de hidrógeno con
un cromógeno para formar un pigmento (de aquí en adelante esta
reacción se denomina reacción de formación de pigmento) se llevan a
cabo en el mismo sistema de reacción. No obstante, en estas
publicaciones, no se describe un método en el que la oxidación del
ácido ascórbico reducido con ASOD y la reacción del peróxido de
hidrógeno formado con un cromógeno para formar un pigmento se lleven
a cabo en el mismo sistema de reacción.
Como se describe en lo precedente, la formación
de un pigmento se inhibe en presencia de una sustancia reductora
tal como el ácido ascórbico y, por ello, se ha considerado
imposible llevar a cabo la reacción de formación de peróxido de
hidrógeno y la reacción de formación de pigmento en el mismo sistema
de reacción. Sin embargo, se ha descubierto que existen cromógenos
que no se ven afectados por una sustancia reductora bajo
condiciones específicas en el proceso de determinación; y la
presente invención se ha completado sobre la base de este
hallazgo.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método más simple para la determinación de ácido
ascórbico el cual es aplicable a cribado en ensayos clínicos y el
cual es capaz de analizar un gran número de muestras al mismo
tiempo y también de proporcionar un reactivo y un kit para la
determinación de ácido ascórbico adecuado para ser utilizado en
dicho método.
De acuerdo con la presente invención, el ácido
ascórbico puede determinarse por un método para la determinación de
ácido ascórbico en una muestra empleando
ascorbato-oxidasa la cual cataliza la reacción del
ácido ascórbico reducido con oxígeno para formar el ácido ascórbico
oxidado y peróxido de hidrógeno (de aquí en adelante la enzima se
denomina ASOD), en el que la reacción del ácido ascórbico reducido
con oxígeno en presencia de ASOD para formar el ácido ascórbico
oxidado y peróxido de hidrógeno y la reacción del peróxido de
hidrógeno formado con un cromógeno en presencia de peroxidasa para
formar un pigmento se llevan a cabo en un medio acuoso en el mismo
sistema de reacción y luego se determina el pigmento formado (de
aquí en adelante este método se denomina Método A).
El ácido ascórbico total en una muestra puede
determinarse llevando a la práctica el Método A precedente en
presencia de un agente reductor que pueda convertir ácido ascórbico
oxidado en ácido ascórbico reducido. En este método, la oxidación y
la reducción se repiten debido a que el ácido ascórbico oxidado
formado por la reacción enzimática se convierte nuevamente en ácido
ascórbico reducido con el agente reductor. Por lo tanto, el ácido
ascórbico total a una concentración relativamente baja puede
determinarse fácilmente por este método (de aquí en adelante este
método se denomina Método B).
El ácido ascórbico total en una muestra también
puede determinarse por el Método A precedente que además comprende
la etapa de reducir el ácido ascórbico oxidado en la muestra con un
agente reductor y la etapa de desactivar el agente reductor
remanente (de aquí en adelante este método se denomina Método
C).
La presente invención proporciona un reactivo
para la determinación de ácido ascórbico que comprende ASOD, un
cromógeno y peroxidasa (de aquí en adelante denominado Reactivo
A).
La presente invención también proporciona un
reactivo para la determinación de ácido ascórbico que comprende los
componentes del Reactivo A y un agente reductor que es capaz de
convertir el ácido ascórbico oxidado en el ácido ascórbico reducido
(de aquí en adelante denominado Reactivo B).
Asimismo, la presente invención proporciona un
reactivo para la determinación de ácido ascórbico que comprende los
componentes del Reactivo B y un compuesto que es capaz de
desactivar el agente reductor (de aquí en adelante denominado
Reactivo C).
En los Reactivos A, B y C precedentes, dos o más
de los componentes, cualesquiera sean, pueden contenerse en la
forma de una composición.
La presente invención también proporciona un kit
que es conveniente para la determinación de ácido ascórbico.
El reactivo para la determinación de la presente
invención puede utilizarse sólo en la forma de un único reactivo
pero también en la forma de un kit compuesto por múltiples
reactivos de acuerdo con la estabilidad de almacenamiento,
operabilidad y forma de suministro de los reactivos. El kit puede
prepararse seleccionando los componentes necesarios de los
componentes precedentes y las composiciones comprenden dos o más de
los componentes, cualesquiera sean. Se debe evitar una combinación
que no resulte adecuada como composición, tal como una combinación
de un agente reductor y un compuesto que desactiva el agente
reductor. A continuación se muestran ejemplos de kits.
Un kit para el Reactivo A se compone de un
reactivo que comprende ASOD y peroxidasa y un reactivo que
comprende un cromógeno (de aquí en adelante denominado Kit A).
Un kit para el Reactivo B se compone de un
reactivo que comprende un cromógeno y un agente reductor y un
reactivo que comprende ASOD y peroxidasa (de aquí en adelante
denominado Kit B).
Un kit para el Reactivo C se compone de un
reactivo que comprende un cromógeno y un agente reductor y un
reactivo que comprende ASOD, peroxidasa y un compuesto capaz de
desactivar el agente reductor (de aquí en adelante denominado Kit
C).
El reactivo para determinación y los reactivos
que componen el kit para determinación pueden estar en la forma de
un producto seco, pero pueden prepararse en la forma de un reactivo
líquido mediante la adición de un medio acuoso a fin de omitir el
proceso de preparación de los reactivos antes de cada uso.
Cualquiera de los reactivos precedentes para
determinación y de los reactivos del kit puede comprender además un
agente tampón, un agente activador de enzimas, un conservante, un
estabilizador, un tensioactivo, etc, si fuera necesario. Estos
componentes pueden agregarse a una solución de reacción en el
proceso de determinación.
Los métodos para la determinación de ácido
ascórbico reducido de la presente invención se describen en detalle
más adelante.
En el Método A, una muestra que contiene ácido
ascórbico reducido, ASOD, un cromógeno y peroxidasa se agrega a un
medio acuoso como ser una solución tampón, y la mezcla se somete a
reacción a 20-50ºC durante 1-15
minutos. El cambio en la absorbancia de la solución de reacción
coloreada por el pigmento formado se mide para determinar la
cantidad de ácido ascórbico de la curva de calibración previamente
confeccionada utilizando soluciones que contienen ácido ascórbico
reducido a concentraciones conocidas.
La ASOD requiere oxígeno como un sustrato, pero
no es necesario el suministro de oxígeno ya que el oxígeno suele
estar presente en el medio acuoso. No obstante, resulta deseable
batir o agitar la solución de reacción que contiene ácido ascórbico
reducido, un cromógeno, ASOD y peroxidasa antes de la reacción.
En el Método B, un agente reductor capaz de
convertir el ácido ascórbico oxidado en el ácido ascórbico reducido
se agrega a una muestra que contiene ácido ascórbico, y luego la
mezcla de reacción resultante se somete a las etapas del Método A
para determinar la cantidad total de ácido ascórbico reducido y de
ácido ascórbico oxidado en la muestra.
La determinación de acuerdo con el Método B puede
llevarse a cabo en forma más simple agregando el Reactivo B o el
Kit B a una muestra que contiene ácido ascórbico, sometiendo la
mezcla resultante a reacción en un medio acuoso a
20-50ºC durante 3-30 minutos y
midiendo el cambio en la absorbancia de la solución de reacción
coloreada por el pigmento formado a fin de determinar la cantidad
de ácido ascórbico de la curva de calibración previamente
confeccionada.
En el Método B, el ácido ascórbico oxidado se
convierte en ácido ascórbico reducido con el agente reductor en el
curso de la reacción, el cual luego de convierte en ácido ascórbico
oxidado mediante la reacción enzimática. Por lo tanto, la
determinación de ácido ascórbico puede llevarse a cabo con una mayor
sensibilidad a través de oxidaciones y reducciones repetidas. Por
el uso de este método, es posible determinar el ácido ascórbico
total contenido en una muestra a una concentración baja.
En el Método C, un agente reductor capaz de
convertir ácido ascórbico oxidado en ácido ascórbico reducido se
agrega a una muestra que contiene ácido ascórbico y la mezcla se
somete a reacción a 20-50ºC durante
1-15 minutos para convertir ácido ascórbico oxidado
en ácido ascórbico reducido. A continuación, se agrega un compuesto
capaz de desactivar el agente reductor y la mezcla se somete a
reacción a 20-50ºC durante 1-15
minutos para desactivar el agente reductor remanente. La mezcla de
reacción resultante se somete a las etapas del Método A para
determinar la cantidad total de ácido ascórbico reducido y de ácido
ascórbico oxidado presentes en la muestra.
Al llevar a cabo la determinación de acuerdo con
este método, la reacción para desactivar el agente reductor y la
reacción para la determinación de ácido ascórbico reducido por el
Método A pueden ejecutarse en el mismo sistema de reacción. Es
decir, el ácido ascórbico total puede determinarse mediante la
adición del reactivo que comprende un cromógeno y un agente reductor
del Kit C a una muestra que contiene ácido ascórbico para convertir
ácido ascórbico oxidado en ácido ascórbico reducido, agregando el
otro reactivo del Kit C para ejecutar la reacción enzimática y
luego midiendo el cambio en la absorbancia de la solución de
reacción.
La determinación del pigmento formado por la
reacción de coloración se lleva a cabo midiendo el cambio en la
absorbancia, usualmente el aumento de la absorbancia, por ejemplo,
mediante el uso de un espectrofotómetro comercialmente disponible a
una longitud de onda de 400-750 nm, preferiblemente
a la longitud de onda de absorción máxima del cromógeno con un
blanco de reactivo como control. Una solución que contiene ácido
ascórbico reducido a una concentración conocida se somete a la
misma reacción que se describe en lo precedente y se mide el cambio
en la absorbancia a fin de preparar una curva de calibración.
Utilizando esta curva de calibración es posible determinar una
cantidad desconocida de ácido ascórbico reducido y una cantidad
total desconocida de ácido ascórbico reducido y de ácido ascórbico
oxidado.
Los componentes de una solución de reacción se
utilizan a las concentraciones que se muestran a continuación.
El cromógeno se emplea en una cantidad equimolar
con ácido ascórbico reducido en la solución de reacción o, más
preferiblemente, 1-10000 equivalentes molares, más
preferiblemente 10-1000 equivalentes molares. Es
decir, el cromógeno se emplea usualmente a una concentración de
0,01-100 mM, preferiblemente 0,1-10
mM.
La ascorbato-oxidasa (ASOD) y la
peroxidasa se emplean a una concentración de
0,1-100 U/ml, preferiblemente 0,2-50
U/ml.
El agente reductor se emplea en una cantidad
equimolar con ácido ascórbico oxidado o, más preferiblemente,
1-1000 equivalentes molares, más preferiblemente
10-100 equivalentes molares. Es decir, el agente
reductor se emplea usualmente a una concentración de
0,01-100 mM, preferiblemente 1-10
mM.
El agente tampón se emplea a una concentración de
1-2000 mM, preferiblemente 5-1000
mM. El pH de la solución tampón se determina de acuerdo con la
estabilidad de las enzimas y los reactivos y las condiciones de
reacción, la cual suele oscilar entre 2 y 10, preferiblemente entre
3 y 9.
El compuesto que es capaz de desactivar el agente
reductor se emplea a una concentración de 1-10
veces, preferiblemente a una concentración de 2-5
veces sobre la base del agente reductor utilizado para reducir el
ácido ascórbico oxidado.
El contenido o la concentración de cada
componente del reactivo para la determinación y los reactivos que
constituyen el kit pueden variar de acuerdo con su composición y
uso. La concentración de cada componente puede ajustarse cuando el
componente se agrega a un medio acuoso para preparar una solución de
reacción o cuando el reactivo mismo se prepara como una solución de
reacción.
La cantidad de ácido ascórbico oxidado en una
muestra puede obtenerse sustrayendo la cantidad de ácido ascórbico
reducido de la cantidad total de ácido ascórbico reducido y de
ácido ascórbico oxidado.
En la presente invención, se puede utilizar
cualquier cromógeno que esté afectado en gran medida por las
sustancias reductoras en una reacción para la determinación de
peróxido de hidrógeno. Los ejemplos preferidos son compuestos
representados por las fórmulas generales (I) y (II) que se muestran
a continuación.
Fórmula general (I)
Fórmula general (II)
(En las fórmula generales (I) y (II) precedentes,
Y representa un átomo de hidrógeno o un grupo representado por la
fórmula general (III):
(III)---
\delm{C}{\delm{\para}{X}} \biequalZ
(en la que Z representa oxígeno o azufre; y X
representa hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, amino
mono-sustituido o amino no sustituido); R^{1}
representa hidroxi, amino mono- o di-sustituido o
amino no sustituido; R^{2} representa hidrógeno, hidroxi,
alquilo, alcoxi, arilo, alquenilo, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, que pueden ser iguales o diferentes,
representa cada uno hidrógeno, alquilo, alquenilo, alcanoílo,
aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo, carboxi, hidroxi, alcoxi o
un grupo representado por la fórmula general (IV), (V), (VI), (VII)
u (VIII):
[en las que A^{1} representa alquileno; A^{2}
representa hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, arilo, alquenilo,
alquilo alicíclico, amino mono- o disustituido o no sustituido; y
B^{1}, B^{2}, B^{3}, B^{4}, B^{5} y B^{6}, que pueden
ser iguales o diferentes, representa cada uno hidrógeno, alquilo,
alquenilo, alcanoílo, aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo,
carboxi, hidroxi, alcoxi o alquilo sustituido con hidroxi]; o
R^{3} y R^{4}, o R^{5} y R^{6} se consideran juntos
formando alquenileno; y J representa oxígeno, azufre o un grupo
representado por la fórmula general (IX) u (XI):
[en las que R^{7} y R^{8}, que pueden ser
iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno, alquilo o
alquenilo].
En las definiciones de los grupos precedentes, el
alquilo y el resto alquilo del alcoxi y del alquilo sustituido con
hidroxi incluyen grupos alquilo de cadena lineal o ramificada que
poseen de 1 a 6 átomos de carbono tales como metilo, etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, pentilo, 2-pentilo,
3-pentilo, isoamilo y hexilo. El alquilo sustituido
con hidroxi posee de 1 a 2 sustituyentes hidroxi.
El alcanoílo incluye grupos alcanoílo que poseen
de 1 a 6 átomos de carbono tales como formilo, acetilo, propionilo,
butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo y pivaloílo.
El alquilo alicíclico incluye grupos alquilo
alicíclicos que poseen de 3 a 8 átomos de carbono tales como
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo
y ciclooctilo. El alquenilo incluye grupos alquenilo de cadena
lineal o ramificada que poseen de 2 a 6 átomos de carbono tales como
vinilo, propenilo, butenilo, pentenilo y hexenilo. Ejemplos del
arilo y del resto arilo del aroílo son fenilo y naftilo.
El halógeno incluye átomos de flúor, cloro, bromo
y yodo.
El alquileno incluye grupos alquileno que poseen
de 1 a 6 átomos de carbono tales como metileno, etileno,
metilmetileno, propileno, metiletileno, etilmetileno, butileno,
1-metilpropileno, 2-metilpropileno,
etiletileno, propilmetileno, pentileno, metilbutileno, etilbutileno,
butilmetileno y hexileno.
El alquenileno incluye grupos alquenileno que
poseen de 3 a 4 átomos de carbono tales como
-CH=CH-CH_{2}- y
-CH=CH-CH=CH-.
Ejemplos de los sustituyentes en el amino mono- o
di-sustituido en las definiciones de R^{1},
R^{2} y A^{2} son alquilo, arilo, alquilo alicíclico, alcanoílo,
aroílo, alquenilo, alcoxicarbonilo, alcoxi, alcoxisulfonilo y
carbamoílo sustituidos o no sustituidos.
El alquilo, el alcanoílo, el alcoxi, el arilo, el
aroílo, el alquilo alicíclico y el alquenilo poseen los mismos
significados que los que se definen en lo precedente. El resto
alquilo del alcoxicarbonilo y del alcoxisulfonilo posee el mismo
significado que el indicado para el alquilo en lo precedente.
El alquilo sustituido tiene de 1 a 3
sustituyentes los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los
sustituyentes son hidroxi, sulfo, arilo, alcanoílo y aroílo.
El arilo, el alcanoílo y el aroílo tienen los
mismos significados que se definen en lo precedente.
Ejemplos de los sustituyentes en el amino
mono-sustituido en la definición de X son alquilo
alicíclico, alquilo sustituido o no sustituido, y arilo sustituido o
no sustituido. El alquilo alicíclico, el alquilo y el arilo poseen
los mismos significados que los definidos en lo precedente.
El alquilo sustituido tiene de 1 a 2
sustituyentes los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los
sustituyentes son alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino,
alcoxicarbonilaminofenilo y alcoxicarbonilaminoalquilfenilo. El
resto alquilo del alcoxi en dichos sustituyentes tiene el mismo
significado que el definido en lo precedente, y el resto alquilo del
alcoxicarbonilaminoalquilfenilo tiene el mismo significado que el
del alquileno en lo precedente.
El arilo sustituido posee de 1 a 2 sustituyentes
los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los sustituyentes
son halógeno, amino, sulfo, alquilo, alcoxi, alcanoílo,
alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino y alcoxicarbonilaminoalquilo.
El alquilo, el alcoxi, el alcanoílo, el alcoxicarbonilo, el
alcoxicarbonilamino, el alcoxicarbonilaminoalquilo y el halógeno
tienen los mismos significados que los definidos en lo
precedente.
Ejemplos específicos de los compuestos
representados por las fórmulas generales (I) y (II) incluyen los
compuestos descritos en los documentos
JP-A-29297/82 (Patente de los
EE.UU. Nº 4.384.042), JP-A-218069/85
y JP-A-128799/89,
JP-A- 145352/81 (Patente de los EE.UU. Nº 4.851.353)
y JP-A-182361/84 (Patente de los
EE.UU. Nº 4.916.058).
Los ejemplos particularmente preferidos de los
compuestos representados por la fórmula general (I) son
10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(de aquí en adelante abreviada como CCAP) y
10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(de aquí en adelante abreviada como MCDP). Los ejemplos
particularmente preferidos por la fórmula general (II) son sal de
sodio de
N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina
(de aquí en adelante abreviada como DA-64),
4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina y
bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-
dimetilaminofenil]amina (de aquí en adelante abreviada como
BCMA). Estos cromógenos pueden sintetizarse, por ejemplo, de
acuerdo con el método descrito en el documento
JP-A-29297/82 (Patente de los EE.UU.
Nº 4.384.042).
Se pueden emplear plantas o microorganismos
obtenidos por técnicas de ADN recombinante como la ASOD,
ascorbato-oxidasa derivada de microorganismos que
pertenecen al género Eupenicillium
(JP-A-23971/96), Trichoderma
o Mortierella
(JP-A-209770/94), o Pleurotus
[J. Biol. Chem., 271, 3105 (1996)]. También se pueden
emplear los comercialmente disponibles (por ejemplo, un producto de
Amano Pharmaceutical Co., Ltd.).
Se pueden emplear los comercialmente disponibles,
como la peroxidasa, así como también los extraídos de
microorganismos, animales y plantas.
El agente reductor capaz de convertir ácido
ascórbico oxidado en ácido ascórbico reducido incluye compuestos
que contienen grupo SH, fosfinas, difosfanos, sulfitos, ditionitos,
sales ferrosas y borohidruros.
Los compuestos que contienen grupo SH incluyen
ácidos amino o péptidos tales como
N-acetilcisteína, cisteína reducida y glutation
reducido, alcoholes tales como ditiotreitol (DTT), ditioeritritol,
mercaptoetanol y tioglicerol, ácidos carboxílicos tales como ácido
tioglicólico, sacáridos tales como tioglucosa y sales de tiouronio
como bromuro de 2-aminoetilisotiouronio.
Las fosfinas incluyen fosfinas sustituidas o no
sustituidas. La fosfina no sustituida significa PH_{3}
(fosfina).
La fosfina sustituida posee de 1 a 3
sustituyentes los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los
sustituyentes son alquilo sustituido o no sustituido, arilo
sustituido o no sustituido, un grupo heterocíclico aromático
sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido,
carbamoílo sustituido o no sustituido, alcoxi sustituido o no
sustituido, alcanoílo sustituido o no sustituido, aroílo sustituido
o no sustituido y sulfo sustituido o no sustituido.
Las fosfinas que poseen un sustituyente, las que
poseen 2 sustituyentes y las que poseen 3 sustituyentes se
denominan fosfinas primarias, fosfinas secundarias y fosfinas
terciarias, respectivamente.
Los difosfanos incluyen difosfanos sustituidos y
no sustituidos. El difosfano no sustituido significa P_{2}H_{4}
(difosfano).
El difosfano sustituido posee de 1 a 4
sustituyentes los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los
sustituyentes son alquilo sustituido o no sustituido, arilo
sustituido o no sustituido, un grupo heterocíclico aromático
sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido,
carbamoílo sustituido o no sustituido, alcoxi sustituido o no
sustituido, alcanoílo sustituido o no sustituido, aroílo sustituido
o no sustituido y sulfo sustituido o no sustituido.
El alquilo sustituido o no sustituido y el resto
alquilo del alcoxi sustituido o no sustituido y del alcanoílo
sustituido o no sustituido, y el arilo sustituido o no sustituido y
el resto arilo del aroílo sustituido o no sustituido mencionados en
lo precedente como los sustituyentes en fosfinas y difosfanos
poseen los mismos significados que el alquilo y el arilo
precedentes.
Ejemplos de los grupos heterocíclicos aromáticos
de los grupos heterocíclicos aromáticos sustituidos o no
sustituidos mencionados en lo precedente como los sustituyentes en
fosfinas y difosfanos son piridilo, pirimidinilo, naftiridinilo,
furilo, tienilo, pirazolinilo, imidazolilo, benzofurilo y
dibenzofurilo.
El alquilo sustituido posee de 1 a 3
sustituyentes los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los
sustituyentes son arilo, un grupo heterocíclico aromático, alcoxi,
alcanoílo, aroílo, amino, hidroxi, carboxi, sulfo, fosfo, ciano y
halógeno. El arilo, el grupo heterocíclico aromático, el alcoxi, el
alcanoílo, el aroílo y el halógeno poseen los mismos significados
que los definidos en lo precedente.
El arilo sustituido posee de 1 a 5 sustituyentes
los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los sustituyentes
son alquilo, alcoxi, alcanoílo, aroílo, carboxi, alcoxicarbonilo,
ciano, amino, sulfo, fosfo y halógeno. El alquilo, el alcoxi, el
alcanoílo, el aroílo, el alcoxicarbonilo y el halógeno poseen los
mismos significados que los definidos en lo precedente. El grupo
heterocíclico aromático sustituido posee de 1 a 3 sustituyentes los
cuales son iguales o diferentes, y dichos sustituyentes incluyen los
mismos sustituyentes que en el arilo sustituido precedente.
El amino sustituido y el carbamoílo sustituido
respectivamente poseen de 1 a 2 sustituyentes los cuales son
iguales o diferentes. Los sustituyentes incluyen el mismo alquilo
sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, grupo
heterocíclico aromático sustituido o no sustituido, alcanoílo,
aroílo y alcoxicarbonilo como se definen en lo precedente.
El alcoxi sustituido posee de 1 a 2 sustituyentes
los cuales son iguales o diferentes. Ejemplos de los sustituyentes
son amino, hidroxi, sulfo, fosfo, ciano y el halógeno
precedente.
Los sustituyentes en el sulfo sustituido incluyen
el mismo alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no
sustituido y grupo heterocíclico aromático sustituido o no
sustituido como se define en lo precedente.
Ejemplos de las fosfinas primarias son
metilfosfina, etilfosfina, propilfosfina, isobutilfosfina,
fenilfosfina, 2-naftilfosfina,
2-benzofuranilfosfina,
2-fosfinaetilamina, 4-(fosfinametil)imidazol,
1,2,4-butanotriiltris(fosfina),
(fenilsulfonil)fosfina y carbamoilfosfina.
Ejemplos de las fosfinas secundarias son
dimetilfosfina, dietilfosfina, diisopropilfosfina,
diisoamilfosfina, difenilfosfina, ácido
3,3'-fosfinodiildipropiónico y ácido
4,4'-fosfinadiildibenzoico.
Ejemplos de las fosfinas terciarias son
trimetilfosfina, trietilfosfina,
tri-n-butilfosfina,
tri-n-hexilfosfina, trifenilfosfina,
metildifenilfosfina, dimetilfenilfosfina,
fosfinatriiltridimetilamina, fosfinatriiltridietilamina,
tris(2-metilfenil)fosfina,
tris(3-metilfenil)fosfina,
tris(4-metilfenil)fosfina,
tris(4-metoxifenil)fosfina, ácido
fosfinatriiltriacético, ácido
3,3',3''-fosfinatriiltripropiónico, ácido
4,4',4''-fosfinatriiltribenzoico,
tris(hidroximetil)fosfina,
2,2',2''-fosfinatriiltrietilcianuro,
etil(fenil)propilfosfina y acetildietilfosfina.
\newpage
Los sulfitos y ditionitos incluyen aquellos de
metales álcali tales como litio, potasio y sodio, y aquellos de
metales alcalinotérreos tales como magnesio y calcio.
Las sales ferrosas incluyen haluro ferroso,
sulfato ferroso y nitrato ferroso. El halógeno posee el mismo
significado que el definido en lo precedente.
Los agentes reductores preferidos son compuestos
que contienen grupo SH.
El compuesto capaz de desactivar el agente
reductor incluye reactivos SH y óxidos, los cuales se seleccionan
de acuerdo con el tipo de agente reductor que ha de utilizarse. En
los casos en los que se emplea un compuesto que contiene grupo SH
como el agente reductor, se prefiere el uso de los reactivos SH
tales como un agente oxidante, un agente formador de mercapto y un
agente alquilante. Se prefiere particularmente un agente
alquilante.
Ejemplos de los agentes oxidantes son
5,5'-ditiobis(ácido
2-nitrobenzoico),
2,2'-dipiridildisulfuro, ácido tetratiónico,
2,6-diclorofenolindofenol y glutation oxidado.
Ejemplos de los agentes formadores de mercapto son ácido
p-mercuribenzoico y ácido
p-mercuribencenosulfónico, y ejemplos de los agentes
alquilantes son ácido yodoacético, yodoacetamida y
N-etilmaleimida. Ejemplos de los óxidos son yodatos
tales como el yodato de potasio.
Ejemplos de los agentes tampón son lactato,
citrato, acetato, succinato, sal de glicina,
3,3-dimetilglutarato, ftalato, fosfato, sal de
trietanolamina, sal de dietanolamina, borato, barbiturato, sal de
tris(hidroximetil)aminometano,
imidazol-acetato, malato, oxalato, carbonato y
agente tampón de Good.
Un ejemplo del agente activador de enzimas es
ácido deshidroacético. Ejemplos de los conservantes son azida de
sodio y sulfato de estreptomicina. Ejemplos de los estabilizantes
son agentes quelantes de metales tales como ácido
etilenodiaminotetraacético (de aquí en adelante abreviado como
EDTA), y ejemplos de otros estabilizantes para enzimas son
polisacáridos como almidón soluble y sus derivados, proteínas tales
como albúmina y globulina, y compuestos de alto peso molecular
solubles en agua tales como polietilen glicol. Un ejemplo del
tensioactivo es Triton x-100.
Como el medio acuoso, se pueden usar líquidos que
contengan agua tales como una solución tampón, solución salina
fisiológica y agua destilada; se prefiere una solución tampón.
Los compuestos y las enzimas descritos en lo
precedente están enumerados en los catálogos de reactivos
publicados por Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd, Dojin Kagaku Institute,
Daito Kagaku Co., Ltd., Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Seishin
Co., Ltd., Nacalai Tesque, Inc., Aldrich, Pierce, etc., y se
encuentran comercialmente disponibles.
A continuación se muestran los ejemplos de
prueba.
Ejemplo de prueba
1
En la prueba, se utilizó sodio
N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina
(de aquí en adelante abreviada como HSDA) y
4-aminoantipirina (de aquí en adelante abreviada
como 4-AA), y
N-etil-N-(3-metilfenil)-N'succiniletileno-
diamina (de aquí en adelante abreviada como EMSE) y 4-AA como los reactivos Trinder, y CCAP y BCMA se utilizaron como leuco-cromógenos.
diamina (de aquí en adelante abreviada como EMSE) y 4-AA como los reactivos Trinder, y CCAP y BCMA se utilizaron como leuco-cromógenos.
Una solución tampón (10,0 mM, pH 6,0) de
piperazina-N,N'-bis(ácido
2-etanosulfónico) (de aquí en adelante abreviada
como PIPES) que contenía ácido ascórbico reducido a una
concentración mostrada en la Tabla 1, 6,25 U/ml de peroxidasa y uno
de los cromógenos precedentes (0,086 mM) se calentó a 37ºC durante
5 minutos. A la solución resultante se agregó peróxido de hidrógeno
a una concentración de 225 \muM para iniciar la reacción. Después
de que la reacción alcanzó el equilibrio, se midió la absorbancia de
la solución de reacción en la longitud de onda de absorción máxima
del cromógeno utilizado. El cambio en la absorbancia que fue
resultado de la reacción se muestra en la Tabla 1.
Como se muestra en la Tabla 1, la reacción de
coloración que utiliza cualquiera de estos compuestos -EMSE y
4-AA, y HSDA y 4-AA, que son
reactivos Trinder, y CCAP y BCMA, que son
leuco-cromógenos- se inhibe ante la presencia de
ácido ascórbico reducido.
Ejemplo de prueba
2
Se repitió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo de prueba 1, excepto que se utilizó ditiotreitol en lugar
del ácido ascórbico reducido.
El cambio en la absorbancia que fue resultado de
la reacción se muestra en la Tabla 2.
Como se muestra en la Tabla 2, la reacción de
coloración que utiliza cualquiera de estos compuestos -EMSE y
4-AA, y HSDA y 4-AA, que son
reactivos Trinder, y CCAP y BCMA, que son
leuco-cromógenos- se inhibe ante la presencia de
ditiotreitol.
Ejemplo de prueba
3
Una solución tampón PIPES 10,0 mM (pH 6,0) que
contenía 6,25 U/ml de peroxidasa y uno de los cromógenos mostrados
en la Tabla 3 (0,086 mM) se calentó en forma preliminar a 37ºC
durante 5 minutos, y se le agregó peróxido de hidrógeno a una
concentración de 15 \muM para iniciar la reacción (Sistema de
reacción 1).
Por separado, una solución tampón PIPES 10 mM (pH
6,0) que contiene 2,76 U/ml de ASOD
(ascorbato-oxidasa, Amano Pharmaceutical CO., Ltd.,
Tipo III), 6,25 U/ml de peroxidasa y uno de los cromógenos (0,086
mM) se calentó a 37ºC durante 5 minutos, y se le agregó ácido
ascórbico reducido a una concentración de 15 \muM para iniciar la
reacción (Sistema de reacción 2).
En cada sistema de reacción, se midió la
absorbancia de la solución de reacción a la longitud de onda de
absorción máxima del cromógeno utilizado, en el inicio de la
reacción y después de que la reacción hubiera alcanzado el
equilibrio. El cambio en la absorbancia que fue resultado de la
reacción de cada sistema de reacción se muestra en la Tabla 3.
Como se muestra en la Tabla 3, cuando se utilizó
EMSE y 4-AA, o HSDA y 4-AA como el
cromógeno, la coloración de la solución de reacción por la reacción
del peróxido de hidrógeno formado por la reacción enzimática usando
ASOD con dicho cromógeno apenas pudo detectarse. Por el contrario,
cuando se utilizó leuco-cromógeno CCAP o BCMA, la
formación de un pigmento por la reacción del peróxido de hidrógeno
formado por la reacción enzimática con dicho cromógeno se reconoció
satisfactoriamente, lo cual muestra que el presente sistema de
reacción permite la determinación de ácido ascórbico reducido.
Ejemplo de muestra
4
Una solución tampón PIPES 10,0 mM (pH 6,0) que
contenía 2,76 U/ml de ASOD (ascorbato-oxidasa,
Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Tipo III), 6,25 U/ml de peroxidasa
y 0,086 mM CCAP se calentó a 37ºC durante 5 minutos, y se le agregó
ácido ascórbico reducido a una concentración de 7,5 \muM para
iniciar la reacción (sistema sin adición de DTT).
Por separado, una solución tampón PIPES 10 mM (pH
6,0) que contenía 2,75 U/ml de ASOD, 6,25 U/ml de peroxidasa, 0,086
mM CCAP y 2,16 mg/dl de ditiotreitol se calentó a 37ºC durante 5
minutos, y se le agregó ácido ascórbico a una concentración de 7,5
\muM para iniciar la reacción (sistema con adición de DTT).
En cada sistema de reacción, se midió la
absorbancia de la solución de reacción a 660 nm en el inicio de la
reacción y después de que la reacción hubiera alcanzado el
equilibrio. El cambio en la absorbancia que fue resultado de la
reacción de cada sistema de reacción se muestra en la Tabla 4.
- Adición de DTT: 2,2 mM
\newpage
Como se muestra en la Tabla 4, el grado de
desarrollo de color de la presente reacción mejora en gran medida
mediante la adición de ditiotreitol, lo que sugiere que el presente
método permite la determinación de ácido ascórbico reducido con
alta sensibilidad.
La Fig. 1 es una curva de calibración que muestra
la correlación existente entre la concentración de ácido ascórbico
reducido y la absorbancia en la determinación utilizando la
Solución reactiva A-1.
La Fig. 2 es una curva de calibración que muestra
la correlación entre la concentración de ácido ascórbico reducido y
la absorbancia en la determinación utilizando la Solución reactiva
A-2.
La Fig. 3 es una curva de calibración que muestra
la correlación entre la concentración de ácido ascórbico reducido y
la absorbancia en la determinación utilizando la Solución reactiva
B-1.
En los siguientes Ejemplos se ilustran algunas
realizaciones de la presente invención.
Las siguientes soluciones reactivas se prepararon
para ser utilizadas en los Ejemplos.
* Soluciones reactivas para la determinación de
ácido ascórbico reducido
| CCAP | 0,089 mM |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 97,4 mM |
| Peroxidasa | 6,5 U/ml |
| ASOD | 3,1 U/ml |
| BCMA | 0,125 mM |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 97,4 mM |
| Peroxidasa | 6,5 U/ml |
| ASOD | 3,1 U/ml |
| MCDP | 0,115 mM |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 97,4 mM |
| Peroxidasa | 6,5 U/ml |
| ASOD | 3,1 U/ml |
* Soluciones reactivas para la determinación de
ácido ascórbico total
| CCAP | 0,089 mM |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 97,4 mM |
| Peroxidasa | 6,5 U/ml |
| ASOD | 3,1 U/ml |
| Ditiotreitol | 2,16 mM |
| BCMA | 0,125 mM |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 97,4 mM |
| Peroxidasa | 6,5 U/ml |
| ASOD | 3,1 U/ml |
| Ditiotreitol | 2,16 mM |
* Kit de soluciones reactivas para la
determinación de ácido ascórbico reducido
| Solución reactiva A-4a | |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 9,5 mM |
| CCAP | 0,115 mM |
| Solución reactiva A-4b | |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 86,7 mM |
| Peroxidasa | 25,0 U/ml |
| ASOD | 12,0 U/ml |
* Kit de soluciones reactivas para la
determinación de ácido ascórbico total
| Solución reactiva C-1a | |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 9,5 mM |
| Ditiotreitol | 0,58 mM |
| CCAP | 0,115 mM |
| Solución reactiva C-1b | |
| Tampón fosfato de potasio (pH 6,0) | 86,7 mM |
| N-etilmaleimida | 4,27 mM |
| Peroxidasa | 25,0 U/ml |
| ASOD | 12,0 U/ml |
Como soluciones estándar, se prepararon
soluciones tampón de ácido glicina-hidroclórico 10
mM (pH 3,0) que contenían diversas concentraciones de ácido
ascórbico reducido.
Después de calentar 2,9 ml de la Solución
reactiva A-1 a 37ºC durante 5 minutos, se le agregó
0,1 ml de cada solución estándar de ácido ascórbico, seguido por la
reacción a 37ºC durante 5 minutos. Después de que la reacción se
hubo completado, se midió el aumento en la absorbancia de la
solución de reacción a 660 nm.
La correlación entre la concentración de ácido
ascórbico reducido y la absorbancia se muestra en la Fig. 1. La
concentración de la solución de ácido ascórbico reducido agregada
(mg/dl) se traza como la abscisa y la absorbancia a 660 nm como la
ordenada. A partir del dibujo, resulta claro que la cantidad de
ácido ascórbico reducido en una muestra de prueba puede medirse
satisfactoriamente utilizando la relación proporcional a la
absorbancia del contenido de ácido ascórbico reducido en la muestra
de prueba. El ácido ascórbico reducido puede determinarse con
precisión hasta aproximadamente 0,2 mg/dl.
Se repitió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1, excepto que se utilizó la Solución reactiva
A-2 en lugar de la Solución reactiva
A-1, y el aumento en la absorbancia de la solución
de reacción se midió a 755 nm. Los resultados se muestran en la
Fig. 2.
A partir del dibujo, resulta claro que la
cantidad de ácido ascórbico reducido en una muestra de prueba puede
medirse satisfactoriamente utilizando la relación proporcional a la
absorbancia del contenido de ácido ascórbico reducido en la muestra
de prueba. El ácido ascórbico reducido puede determinarse con
precisión hasta aproximadamente 0,2 mg/dl.
Se determinó la concentración de ácido ascórbico
reducido en las muestras 1-3 de suero nuevo
utilizando las Soluciones reactivas A-1,
A-2 y A-3 de acuerdo con el método
del Ejemplo 1. La absorbancia de la solución reactiva se midió a la
longitud de onda de absorción máxima del cromógeno empleado.
Con fines comparativos, se determinó la
concentración de ácido ascórbico reducido en dichas muestras de
suero utilizando un kit para la determinación de ácido ascórbico
(Boehringer Mannheim, F-kit, ácido
L-ascórbico, Producto Nº 409677). Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
Como se muestra en la Tabla 5, los valores
obtenidos por el método para la determinación de la presente
invención fueron casi iguales a los obtenidos por el método
utilizando el F-kit. En cuanto a la muestra de suero
3, la concentración de ácido ascórbico no fue mensurable por el uso
del F-kit debido a su baja absorbancia, pero pudo
determinarse por el método de la presente invención.
Se determinó la cantidad total de ácido ascórbico
reducido y de ácido ascórbico oxidado utilizando el Kit
A-4 y el Kit C-1.
Las soluciones de muestra se prepararon
disolviendo ácido ascórbico reducido y ácido ascórbico oxidado en
soluciones tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 6,0) de modo que
la cantidad total de dichos ácidos en cada solución fue de 2,5
mg/dl como se muestra en la Tabla 6.
A 2,2 ml de cada Solución reactiva
A-4a y Solución reactiva C-1a se
agregó 50 \mul de cada solución de muestra, seguido por
calentamiento a 37ºC durante 5 minutos. A las mezclas resultantes
se agregó, respectivamente, 0,75 ml de cada una de las Soluciones
reactivas A-4a y C-1b, seguido por
la reacción a 37ºC durante 5 minutos. Después de completada la
reacción, se midió el aumento en la absorbancia de cada solución de
reacción a 660 nm. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Como se muestra en la Tabla 6, la absorbancia
proporcional a la cantidad de ácido ascórbico reducido se obtuvo
por el método utilizando el Kit A-4, y la
absorbancia correspondiente a la cantidad total de ácido ascórbico
reducido y de ácido ascórbico oxidado se obtuvo por el método
utilizando el Kit C-1.
La determinación de ácido ascórbico se llevó a
cabo utilizando el Kit C-1 de acuerdo con el método
del Ejemplo 4 en 50 \mul de cada una de las muestras de suero, la
muestra de suero 1 empleada en el Ejemplo 3 y la muestra de suero 1
que se había dejado reposar a temperatura ambiente durante 6 horas.
También se llevó a cabo la determinación en las mismas muestras de
la misma manera utilizando el F-kit. Los resultados
se muestran en la Tabla 7.
El resultado de que no se haya podido medir la
absorbancia de la sangre almacenada mediante el uso del
F-Kit, el cual es un kit para la determinación de
ácido ascórbico reducido, demuestra que el ácido ascórbico reducido
había sido convertido en ácido ascórbico oxidado en la sangre
almacenada.
El valor obtenido en la muestra en la cual el
ácido ascórbico reducido se había convertido en ácido ascórbico
oxidado a través del reposo durante un período prolongado fue
similar al correspondiente para la cantidad total de ácido
ascórbico reducido y de ácido ascórbico oxidado antes del reposo. Se
considera que la cantidad total de ácido ascórbico reducido y de
ácido ascórbico oxidado en la muestra de sangre almacenada fue
menor que la cantidad presente en la muestra de sangre nueva debido
a que el ácido ascórbico oxidado se había descompuesto,
irreversiblemente, en ácido 2,3-diketogulónico por
el almacenamiento. La razón por la cual el valor en la sangre nueva
obtenido por el presente método fue superior al correspondiente
para el Ejemplo 3 es que el ácido ascórbico oxidado originalmente
contenido en la sangre se midió en conjunto.
Como soluciones estándar, se prepararon
soluciones tampón (pH 3,0) de ácido
glicina-hidroclórico 10 mM que contenían diversas
concentraciones de ácido ascórbico reducido.
Después de calentar 2,9 ml de la Solución
reactiva B-1 a 37ºC durante 5 minutos, se le agregó
0,1 ml de cada solución estándar de ácido ascórbico reducido,
seguido por la reacción a 37ºC durante 20 minutos. Después de
completada la reacción, se midió el aumento en la absorbancia en la
solución de reacción a 660 nm.
La correlación entre la concentración de ácido
ascórbico reducido y la absorbancia se muestra en la Fig. 3 La
concentración de ácido ascórbico reducido agregado (mg/dl) se traza
como la abscisa y la absorbancia a 660 nm como la ordenada. A partir
del dibujo resulta claro que es posible determinar
satisfactoriamente una cantidad menor de ácido ascórbico reducido en
una muestra de prueba utilizando la relación proporcional del
contenido de ácido ascórbico reducido en la muestra de prueba a la
absorbancia mediante el uso de la Solución reactiva
B-1 la cual es altamente sensible al ácido ascórbico
reducido. El ácido ascórbico reducido puede determinarse con
precisión aproximadamente a 0,05 mg/dl.
La presente invención proporciona un método, un
reactivo y un kit para la determinación de ácido ascórbico los
cuales son útiles en el campo de la medicina diagnóstica.
Claims (23)
1. Un método para la determinación cuantitativa
de ácido ascórbico en una muestra utilizando
ascorbato-oxidasa que cataliza la reacción del ácido
L-ascórbico con oxígeno para formar el ácido
deshidroascórbico y peróxido de hidrógeno (de aquí en adelante la
enzima se denomina ASOD), el cual comprende las etapas de:
- (i)
- hacer reaccionar el ácido ascórbico en un medio acuoso en la muestra con oxígeno en presencia de la ASOD, cromógeno y peroxidasa; y
- (ii)
- medir una absorbancia del medio acuoso,
en el cual dicho cromógeno es un compuesto
representado por las fórmulas generales (I) ó (II):
en las que Y representa un átomo de
hidrógeno o un grupo representado por la fórmula general
(III):
(III)---
\delm{C}{\delm{\para}{X}} \biequalZ
en la que Z representa oxígeno o
azufre; y X representa hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, amino
mono-sustituido o amino no sustituido); R^{1}
representa hidrógeno, amino mono- o di-sustituido o
amino no sustituido; R^{2} representa hidrógeno, hidroxi,
alquilo, alcoxi, arilo, alquenilo, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, que pueden ser iguales o diferentes,
representa cada uno hidrógeno, alquilo, alquenilo, alcanoílo,
aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo, carboxi, hidroxi, alcoxi o
un grupo representado por la fórmula general (IV), (V), (VI), (VII)
u
(VIII):
en las que A^{1} representa
alquileno; A^{2} representa hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi,
arilo, alquenilo, alquilo alicíclico, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; y B^{1},
B^{2}, B^{3}, B^{4}, B^{5} y B^{6}, que pueden ser
iguales o diferentes, representa cada uno hidrógeno, alquilo,
alquenilo, alcanoílo, aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo,
carboxi, hidroxi, alcoxi o alquilo sustituido con hidroxi; o R^{3}
y R^{4}, o R^{5} y R^{6} se consideran juntos formando
alquenileno; y J representa oxígeno, azufre o un grupo representado
por la fórmula general (IX) u
(XI):
en las que R^{7} y R^{8}, que
pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno,
alquilo o alquenilo, en los que los sustituyentes en el amino mono-
o di-sustituido de R^{1}, R^{2} y A^{2} son
alquilo sustituido o no sustituido, arilo, alquilo alicíclico,
alcanoílo, aroílo, alquenilo, alcoxicarbonilo, alcoxi,
alcoxisulfonilo y carbamoílo, y los sustituyentes en el amino
mono-sustituido de X son alquilo alicíclico, alquilo
sustituido o no sustituido, y arilo sustituido o no
sustituido.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicho medio acuoso comprende un agente reductor que
convierte el ácido deshidroascórbico en el ácido
L-ascórbico.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el ácido deshidroascórbico en la muestra se deja
reaccionar con un agente reductor que convierte el ácido
deshidroascórbico en el ácido L-ascórbico antes de
la adición de la ASOD y un compuesto que desactiva el agente
reductor, y luego la reacción de la ASOD se lleva a cabo en
presencia del desactivador que no posee efectos perjudiciales para
el procedimiento colorimétrico para la posterior medición del
peróxido de hidrógeno formado en la solución.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho cromógeno se selecciona del
grupo que consiste en
10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(CCAP),
10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(MCDP), sal de sodio de
N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina
(DA-64),
4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina y
bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina
(BCMA).
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho agente reductor se
selecciona del grupo que consiste en compuestos que contienen grupo
SH, fosfinas, difosfanos, sulfitos, ditionitos y borohidruros.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que dicho agente reductor es ditiotreitol.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho compuesto que desactiva el agente reductor es un
reactivo de SH.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho reactivo de SH es
N-etilmaleimida.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicho agente reductor es ditiotreitol y dicho compuesto
que desactiva el agente reductor es
N-etilmaleimida.
10. Una composición para la determinación de
ácido ascórbico que comprende ascorbato-oxidasa que
cataliza la reacción del ácido L-ascórbico con
oxígeno para formar el ácido deshidroascórbico y peróxido de
hidrógeno, cromógeno y peroxidasa,
en el que dicho cromógeno es un compuesto
representado por las fórmulas generales (I) ó (II):
en las que Y representa un átomo de
hidrógeno o un grupo representado por la fórmula general
(III):
(III)---
\delm{C}{\delm{\para}{X}} \biequalZ
en la que Z representa oxígeno o
azufre; y X representa hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, amino
mono-sustituido o amino no sustituido; R^{1}
representa hidrógeno, amino mono- o di-sustituido o
amino no sustituido; R^{2} representa hidrógeno, hidroxi,
alquilo, alcoxi, arilo, alquenilo, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, que pueden ser iguales o diferentes,
representa cada uno hidrógeno, alquilo, alquenilo, alcanoílo,
aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo, carboxi, hidroxi, alcoxi o
un grupo representado por la fórmula general (IV), (V), (VI), (VII)
u
(VIII):
en las que A^{1} representa
alquileno; A^{2} representa hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi,
arilo, alquenilo, alquilo alicíclico, amino mono- o di- sustituido o
amino no sustituido; y B^{1}, B^{2}, B^{3}, B^{4}, B^{5}
y B^{6}, que pueden ser iguales o diferentes, representa cada uno
hidrógeno, alquilo, alquenilo, alcanoílo, aroílo, arilo, halógeno,
nitro, sulfo, carboxi, hidroxi, alcoxi o alquilo sustituido con
hidroxi; o R^{3} y R^{4}, o R^{5} y R^{6} se consideran
juntos formando alquenileno; y J representa oxígeno, azufre o un
grupo representado por la fórmula general (IX) u
(XI):
en las que R^{7} y R^{8}, que
pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno,
alquilo o alquenilo, en los que los sustituyentes en el amino mono-
o di-sustituido de R^{1}, R^{2} y A^{2} son
alquilo sustituido o no sustituido, arilo, alquilo alicíclico,
alcanoílo, aroílo, alquenilo, alcoxicarbonilo, alcoxi,
alcoxisulfonilo y carbamoílo, y los sustituyentes en el amino
mono-sustituido de X son alquilo alicíclico, alquilo
sustituido o no sustituido, y arilo sustituido o no
sustituido.
11. La composición de acuerdo con la
reivindicación 10, que además comprende un agente reductor que
convierte el ácido deshidroascórbico en el ácido
L-ascórbico.
12. La composición de acuerdo con la
reivindicación 10 u 11, en la que dicho cromógeno se selecciona del
grupo que consiste en
10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(CCAP),
10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(MCDP), sal de sodio de
N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina
(DA-64),
4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina y
bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina
(BCMA).
13. La composición de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12, en la que dicho agente reductor se
selecciona del grupo que consiste en compuestos que contienen grupo
SH, fosfinas, difosfanos, sulfitos, ditionitos y borohidruros.
14. La composición de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que dicho agente reductor es
ditiotreitol.
15. Un kit para la determinación de ácido
ascórbico, que consiste en:
- (i)
- un primer reactivo que comprende cromógeno; y
- (ii)
- un segundo reactivo que comprende peroxidasa y ascorbato-oxidasa que cataliza la reacción del ácido L-ascórbico con oxígeno para formar el ácido deshidroascórbico y peróxido de hidrógeno,
en el que dicho cromógeno es un compuesto
representado por las fórmulas generales (I) ó (II):
en el que Y representa un átomo de
hidrógeno o un grupo representado por la fórmula general
(III):
(III)---
\delm{C}{\delm{\para}{X}} \biequalZ
en la que Z representa oxígeno o
azufre; y X representa hidrógeno, alquilo, alquenilo, arilo, amino
mono-sustituido o amino no sustituido); R^{1}
representa hidrógeno, amino mono- o di-sustituido o
amino no sustituido; R^{2} representa hidrógeno, hidroxi,
alquilo, alcoxi, arilo, alquenilo, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; R^{3},
R^{4}, R^{5} y R^{6}, que pueden ser iguales o diferentes,
representa cada uno hidrógeno, alquilo, alquenilo, alcanoílo,
aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo, carboxi, hidroxi, alcoxi o
un grupo representado por la fórmula general (IV), (V), (VI), (VII)
u
(VIII):
en las que A^{1} representa
alquileno; A^{2} representa hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi,
arilo, alquenilo, alquilo alicíclico, amino mono- o
di-sustituido o amino no sustituido; y B^{1},
B^{2}, B^{3}, B^{4}, B^{5} y B^{6}, que pueden ser
iguales o diferentes, representa cada uno hidrógeno, alquilo,
alquenilo, alcanoílo, aroílo, arilo, halógeno, nitro, sulfo,
carboxi, hidroxi, alcoxi o alquilo sustituido con hidroxi; o R^{3}
y R^{4}, o R^{5} y R^{6} se consideran juntos formando
alquenileno; y J representa oxígeno, azufre o un grupo representado
por la fórmula general (IX) u
(XI):
en las que R^{7} y R^{8}, que
pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa hidrógeno,
alquilo o alquenilo, en los que los sustituyentes en el amino mono-
o di-sustituido de R^{1}, R^{2} y A^{2} son
alquilo sustituido o no sustituido, arilo, alquilo alicíclico,
alcanoílo, aroílo, alquenilo, alcoxicarbonilo, alcoxi,
alcoxisulfonilo y carbamoílo, y los sustituyentes en el amino
mono-sustituido de X son alquilo alicíclico, alquilo
sustituido o no sustituido, y arilo sustituido o no
sustituido.
16. El kit de acuerdo con la reivindicación 15,
en el que dicho primer reactivo además comprende un agente reductor
que convierte el ácido deshidroascórbico en el ácido
L-ascórbico.
17. El kit de acuerdo con la reivindicación 16,
en el que dicho segundo reactivo además comprende un compuesto que
desactiva el agente reductor.
18. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho cromógeno se selecciona
del grupo que consiste en
10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(CCAP),
10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina
(MCDP), sal de sodio de
N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina
(DA-64),
4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina y
bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina
(BCMA).
19. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que dicho agente reductor se
selecciona del grupo que consiste en compuestos que contienen grupo
SH, fosfinas, difosfanos, sulfitos, ditionitos y borohidruros.
20. El kit de acuerdo con la reivindicación 19,
en el que dicho agente reductor es ditiotreitol.
21. El kit de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que dicho compuesto que desactiva el agente reductor es un
reactivo de SH.
22. El kit de acuerdo con la reivindicación 21,
en el que dicho reactivo de SH es
N-etilmaleimida.
23. El kit de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que dicho agente reductor es ditiotreitol y dicho compuesto
que desactiva el agente reductor es
N-etilmaleimida.
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