JPS6342470A - ペルオキシダ−ゼまたはｈ↓２ｏ↓２の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペルオキシダーゼの測定または過酸化氷嚢（
Ｈ２Ｏ２）の測定法に間する。

ペルオキシダーゼの測定またはＨ２０２の測定は、各種
の生体物質の測定において重要であり、臨床検査の分野
で広く用いられている。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）により抗原または抗体を測定するに際しては、酵素
活性を測定することが必要であるが、この酵素としては
ペルオキシダーゼが多用されている。具体的な例を示す
と、サンドイツチ法と称されろＥ　Ｉ　Ａを用いて抗原
を測定する場合、固相に固定された抗体に測定する抗原
を結合させ、洗浄後、酵素（ペルオキシダーゼ）で標識
した抗体を同相化抗体についた抗原に結合させた後、再
び洗浄し酵素反応を行ってその活性を測定する。測定さ
れた酵素活性（ペルオキシダーゼ活性）は、結合した酵
素標識抗体の量に相当し、酵素標識抗体の量は存在して
いた抗原の量に相当する。即ち、酵素活性（ペルオキシ
ダーゼ活性）を測定することによって目的とする抗原の
測定が可能となる。ここで、ペルオキシダーゼは、次の
式で示される酵素反応を触媒する酵素である。

Ｈ２Ｏ２＋　　ＡＨ２→２Ｈ２０＋　Ａ　　（１）式中
、Ａ　Ｈ２は発色基質を表す。即ち、ペルオキシダーゼ
の存在下に線式で表される酵素反応が起こると０２０２
により発色基質が酸化されて発色を呈することになる。

したがって、一定量のＨ２Ｏ２の存在下に発色基質の発
色の程度を分光学的に測定すればペルオキシダーゼの活
性を知ることができ、前述したようなＥＩＡにおいては
この原理を利用して酵素活性（ペルオキシダーゼ活性）
を測定する。

一方、（１）式で示される酵素反応を利用して、血中の
グルコース（ぶとうＶ！りやハ酸等の測定に必要なＨ２
Ｏ２の測定も行われており、この場合には、一定量のペ
ルオキシダーゼの存在下に該酵素反応を行わせることに
なる。例えば、グルコースをグルコースオキシダーゼで
酸化してＨ２Ｏ２を生成しくこのＨ２Ｏ２がグルコース
の量に対応する）、ペルオキシダーゼの存在下で、発色
基質の発色の変化を分光学的に測定することにより該Ｈ
２０２の量を測定し、グルコースの量を知ることができ
る。

従来、ペルオキシダーゼ活性測定あるいはＨ２Ｏ２測定
の発色基質として、一般に、０−フェニレンジアミン（
ＯＰＤ）、２．２′−アジノージ（３−エナルーシアゾ
リンーサルフェート）（ＡＢＴＳ）等が用いられている
が、これらの基質は感度は高いが、突然変異誘発物質で
あり、特にＯＰＤは発癌性の疑いのある有害物質として
知られている。

最近、これらの発色基質に代わるものとして、３．３’
５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等のベン
ジジン誘導体が、有効かつ高感度であるという報告がな
されている。Ｔ　Ｍ　Ｂ等のベンジジン誘導体は、ＯＰ
ＤやＡＢＴＳ等に比べて更に感度が高く、発癌性も認め
られない。このベンジジン誘導体は有ｎ溶媒にのみ可溶
である。他方、前述した（１）式で示されるような酵素
反応は、本来、水溶液中で行われることが好ましく、有
機溶媒を用いると酵素活性を低下させて感度を悪くする
傾向がある。そこて、ＴＭＢ等を発色基質として用いる
場合には、有機溶媒にバッファー水溶液を加えた混合溶
媒に溶解させている。しかし、このような混合溶媒にＴ
ＭＢ等を溶解させた状態では保存安定性が低く、長時間
おくと白色の沈澱を生じるため、短時間に測定を実施し
なければならないという制約がある。有機溶媒を含有す
る混合溶媒系に工夫を凝らして沈澱が可及的に生じない
ようにしたものもあるが、この場合においては、溶解後
空′ｆｒ、酸化等によって酵素反応によらない非特異的
な発色が起こることが認められている。また、使用する
溶媒によっては、廃）α処理の問題も生じてくる。

一方、発色基質としてＴＭＢ等のベンジジン誘導体の塩
を用いることも提案されている。この塩は水系で使用す
ることができるので、前述したような有機溶媒の使用に
伴う問題を回避することができ、また、ＯＰＤ等を用い
た系に比べて数倍の吸光度を得ることも可能である。し
が・し、このようなＴＭＢの塩等を用いる場合において
も、溶解後の水溶液の状態では、酵素反応によらない非
特異的な発色が起こるために感度を低下させることがあ
るという問題を残している。

本発明の目的は、前述したような従来の問題を解決し、
ペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２の優れた測定法を提供
することにある。

本発明者は、この目的を果たすために研究を重ねた結果
、ベンジジンの塩または特定のベンジジン誘導体の塩を
発色基質として用いるとともに、系中に少量のキレート
剤を存在させることにより、従来の問題を解決し得るこ
とを見いだした。かくして、本発明は、キレート剤の存
在下に、発色基質として一般式 （式中Ｒは、水素原子、Ｃ＋＝Ｃ３のアルキル基または
メトキシ基を示す） のベンジジンまたはベンジジン誘導体の塩を用いること
を特徴とするペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２を測定す
る方法を提供する。

本発明に従うペルオキシダーゼまたはＨ２Ｏ２の測定法
においては、発色基質として高感度で水溶性のベンジジ
ンの塩またはベンジジン誘導体の塩を用いるので、有８
を溶媒を含有する混合溶媒を用いる場合のように沈澱が
生じることはなく、また、非特異的な発色が起こること
もなく、きわめて長時間にわたって発色系が安定に保持
される。従って、本発明の方法は、ペルオキシダーゼま
たはＨ２Ｏ２を高感度で測定でき、しかも、発色系の調
整後しばらく経過してから測定を行うことも可能である
ので実用的にも極めて有利である。

本発明に従いキレート剤を存在させることにより発色系
が安定に保持される理由は必ずしも明らかではないが、
水中に含まれ非特異的反応に対して触媒作用を有するよ
うな微量の金属がキレート剤によりキレート化されて該
触媒作用が阻止されるためと推察される。キレート剤と
しては、以下に示すような化合物が好ましく、傾向とし
て、凹座または水産配位子を有するものが好ましい。

・エチレンジアミン四酢酸　　　（ＥＤＴＡ）・トラン
ス−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ） ・グリコールエーテルジアミン四酢酸 （ＧＥＤＴＡ） ・エチレンジアミン三酢酸　　（ＥＤＴＡ−ＯＨ）・メ
チレンスルホンＭ　　　　　　（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ｏ）
・トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）およびこ
れらの塩 ・ニトロトリス（メチルスルホン酸）三ナトリウム塩　
　　　　　　　　　　　　（ＮＴＰＯ）・ビシン また、クエン酸ナトリウム塩、シュウ酸ナトリウム等も
効果が認められる。本発明の方法においては、これらの
キレート剤を少量、即ち、１．０ｍＭ未満の濃度で使用
することが好ましく、特に０．３〜０．７ｍ　Ｍの濃度
で使用することが好ましい。キレート剤の濃度が高くな
ると沈澱が生じ、他方、キレート剤の濃度が低いと非特
異的発色が生じることが認められている。

本発明において用いられるベンジジンの塩またはベンジ
ジン誘導体の塩は、塩酸塩が好ましいが、硫酸塩などの
他の塩も使用可能である。

本発明の方法に従い、前述したようなＥＩＡにより各種
の抗原または抗体を測定するには、ベンジジンの塩また
はベンジジンの誘導体の塩（発色基質）、キレート剤お
よびＨ２Ｏ２を含有する基質水溶液を調整し、これをペ
ルオキシダーゼで標識した抗原−抗体反応系に加え、前
述の（１）式で表され得るような酵素反応を行わせる。

所定時間経過後、適当な停止液で酵素反応を停止させ、
発色基質に起因する吸光度を測定することによりペルオ
キシダーゼ活性を求めて、抗原または抗体の濃度を知る
ことになる。しかして、本発明の方法の特徴の一つは、
発色基質、キレート剤およびＨ２Ｏ２から成る基質水溶
液が極めて安定であり、長時間放置していても非特異的
な吸光度の変化は認められないことである。従って、本
発明の方法は、基質水溶液を調整した後、都合のよいと
きに酵素反応を行わせることができるという利点がある
。さらに、本発明に従えば、停止液添加後の溶液も非常
に安定であり、吸光度の経時的な変化は認められず、従
って、本発明の方法は分光学的測定を随時に実施できる
という点においても実用的である。

酵素反応を停止させるには、従来より、硫酸または塩酸
等の強酸を高濃度（Ｈ２ＳＯ４二１−４Ｎ、ＨＣＭ４Ｎ
等）で用いている。本発明者は、ペルオキシダーゼの濃
度が低く吸光度が低い場合にはこのような停止液も使用
できるが、ペルオキシダーゼの濃度が高く吸光度が高い
場合には、従来のような停止液の濃度では、反応から数
分後に黒い沈澱を生じ、殆と測定が不可能となることを
見いだしている。従って、本発明の好ましい態様に従え
ば、停止液として最終濃度０．１〜０．２Ｎとなるよう
な硫酸を加えることによって、広い範囲のペルオキシダ
ーゼ活性の測定が可能となる。また、この濃度の停止ン
夜を用いろことによって、酵業反応の吸光度を２時間後
でも殆と変化なく測定できる。本発明の方法は、上述し
たようなＥＩＡによる抗原や抗体の）財定に必要なペル
オキシダーゼの測定の他に、Ｈ２Ｏ２を測定することに
よる血中のグルコースや尿酸等の生体物質の測定にも適
用できる。例えば、グルコースを測定する場合には、グ
ルコースオキシダーゼ（グルコース酸１ヒ酵素）、ベン
ジジンの塩またはベンジジン誘導体の塩（発色基質）、
キレート剤および一定量のペルオキシダーゼを含有する
試薬を調整し、これに、グルコース濃度を測定すべき検
体を加える。この場合においても、キレート剤を含有す
る本発明に従う該試薬は、発色基質が経時的に非特異的
発色を呈することもなく極めて安定である。従って、そ
の様な本発明に従う試薬を用いて酵素反応を行わせ、Ｈ
２Ｏ２の量に対応する発色基質の吸光度を測定すること
によりグルコースの濃度を精度よく求めることができる
。なお、この場合においては、酵素反応の停止液を加え
ることはせず、グルコース量に対応するＨ２Ｏ２が消費
されるまで反応を行わせた後、吸光度を測定する。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。

実施例！ ６種類のキレート剤（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＣｙＤＴＡ、
ＤＴＰＡ、ＧＥＤＴＡ、　　クエン酸ナトリウム）をテ
トラメチルベンジジン塩酸塩０．４ｍｇ／ｍ　ｌ、　　
Ｈ２Ｏ２０，００６％を含有する水溶液に添加し、室温
に放置して、　６５０ｎｍにおける吸光度を測定するこ
とによりその安定性を調べた。その結果を第１表に示す
。表から、キレート剤を添加しない場合には経時的に発
色が進行しているのに対し、本発明に従いキレート剤を
添加したときにはそのような発色は殆ど認められずに安
定しており、空気酸化等の影響を受けないことが理解さ
れる。

実施例２ テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ　−ＨＣｌ）、
テトラメトキシベンジジン塩酸塩（ＴＭＯＢ−ＨＣＩ）
を用い、キレート剤として、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＣｙＤ
ＴＡを添加して、実施例１と同様の方法により、酵素基
質としての安定性を調べた。比較のためにＴＭＢ−ＨＣ
Ｉを用いるが、キレート剤を添加しない従来のものにつ
いても安定性を調べた。

試薬Ａ ＴＭＢ　φＨＣＩ　　　　　　０．４ｍ　ｇ／ｍ　ＩＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　・２　Ｎ　ａ　　　　　０．５ｍ　ＭＨ
２０２０，００６％ 試薬Ｂ ＴＭＯＢ　φＨＣＩ　　　　　０．４ｍｇ／ｍ　１Ｃｙ
ＤＴＡ　　　　　　　０．５ｍＭ Ｈ２０２０，００６％ 従来試薬 ＴＭＢ　赤ＨＣＩ　　　　　　０．４ｍｇ／ｍ　１８２
０２　　　　　　　　０．００６％その結果を第１図に
示す。線図に示されるように、従来のＴＭＢ−ＨＣＩの
みを用いる方法では吸光度の増加がみられ、空気酸化等
の影響を受は非特異的反応が生じると考えられるのに対
し、本発明による試薬Ａ、試薬Ｂでは非特異的な吸光度
の増加はほとんどなく、２４時間後でも吸光度の変化は
ほとんどみられなかった。

実施例３ ＥＩＡ測定によるＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）測定へ
の応用 キレート剤で安定かしたＴＭＢ塩酸塩溶液を実際のＥＩ
Ａに応用した。

所定濃度のＴＳＨ標準液２００μｌとホースラデイツシ
ュパーオキシダーゼで標識した抗ＴＳＨモノクローナル
抗体溶液２００μｍ及び常法により抗ＴＳＨモノクロー
ナル抗体を固定したポリスチレンビーズとを試験管に入
れ、３７℃で２時間反応させ、Ｈ２Ｏてビーズを３回洗
浄後、別の試験管に移しかえた。これに、次の組成の基
質水溶液１ｍｌ添加し、３７℃で３０分反応させた。

基質水溶ｌα ＴＭＢ−ＨＣＩ　　　　　　０．４ｍｇ／ｍ　ＩＥＤＴ
Ａ　・２＋’Ｊａ　　　　　０．５ｍＭ８２０２　　　
　　　　　　０．００６％更に、０．３ＮのＨ２ＳＯ４
溶液１ｍｌを添加して、酵素反応を停止後、４５０ｎｍ
の吸光度を測定した（第２図参照）。その結果、キレー
ト剤で安定化したＴＭＢ塩酸塩を用いることにより、酵
素活性に影響を与えることな〈従来のＯＰＤ等よりも数
倍高い吸光度を安定に得ることができた。また、停止液
の反応液は２時閏でもほとんど変わらない吸光度を示し
た。更に、調整した基質溶液は、２４時間、冷暗所に保
存した後に、上記測定に使用してもほとんど変わらない
吸光度が得られた。

実施例４ グルコース（血糖）測定への応用 試験管に所定濃度のグルコース標準液２０μｌずつとり
、それぞれに次の組成を有する試薬Ａを３．０ｍｌ加え
て混合し、３７℃で１５分間加温した。

試薬Ａ グルコースオキシダーゼ　　５Ｕ／ｍｌペルオキシダー
ゼ　　　　０．５Ｕ／ｍｌＴＭＢ　争ＨＣＩ　　　　　
　０．１ｍｇ／ｍ　ＩＤ　Ｐ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　
　　０．３ｍＭ試薬ブランクを対照にして６５０ｎｍの
吸光度を測定した。その結果４００ｍｇ／ｄｌまで直線
性を有する良好な検量線が得られ、この方法がグルコー
スの測定に適用できることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従いＴＭＢ塩酸塩にＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ、ＴＭＯＢ塩酸塩にＣｙＤＴＡをそれぞれ添加して得
られた基質溶液の安定性を示すグラフであり、比較のた
めに従来法による基質溶液の安定性も示している。 第２図は、本発明に従いＴＭＢ塩酸塩を用いＥＩＡによ
るＴＳＨを測定する場合の検量線であり、従来のＯＰＤ
に比較して数倍の吸光度を安定に得ることかできること
を示している。 第３図は、本発明の方法をグルコースの測定に適用する
場合の検量線を示すものである。 吸光度 時開（１＋ｒ） 吸光度 ０．１　　　　　　　　　１．０　　　　　　　　１０
Ｔ　Ｓ　ＩＩ　温度　（７１ｔＪ／ｍｌ）第２図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）キレート剤の存在下に、発色基質として一般式▲
   数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基または
   メトキシ基を示す。） の、ベンジジンまたはベンジジン誘導体の塩を用いるこ
   とを特徴とするペルオキシダーゼまたはＨ＿２Ｏ＿２を
   測定する方法。
2. （２）キレート剤が、四座配位子または六座配位子を有
   する化合物である特許請求の範囲第一項に記載の方法。