KR880002235B1 - N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법 - Google Patents

N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR880002235B1
KR880002235B1 KR1019860006077A KR860006077A KR880002235B1 KR 880002235 B1 KR880002235 B1 KR 880002235B1 KR 1019860006077 A KR1019860006077 A KR 1019860006077A KR 860006077 A KR860006077 A KR 860006077A KR 880002235 B1 KR880002235 B1 KR 880002235B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
carboxylic acid
group
less
compounds
hydrogen peroxide
Prior art date
Application number
KR1019860006077A
Other languages
English (en)
Other versions
KR870001183A (ko
Inventor
클라인 크리스티안
폰 데르 엘쯔 헤르베르트
헤르만 루페르트
쥬니우스 마르티나
Original Assignee
뵈링거 만하임 게엠베하
다움.포우퀘트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뵈링거 만하임 게엠베하, 다움.포우퀘트 filed Critical 뵈링거 만하임 게엠베하
Publication of KR870001183A publication Critical patent/KR870001183A/ko
Priority to KR1019870005785A priority Critical patent/KR890004092B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR880002235B1 publication Critical patent/KR880002235B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/38—[b, e]-condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/904—Oxidation - reduction indicators
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/20—Oxygen containing
    • Y10T436/206664—Ozone or peroxide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법
제 1 도는 578㎜에서 흡광에 대한 과산화수소 농도를 나타낸 도면.
제 2 도는 시간에 의존하여 흡광을 나타낸 도면.
제 3 도는 실시예 5에 따른 용액에 대한 578㎜에서 흡광을 나타낸 도면.
본 발명은 신규의 N-아실디히드로 레조루핀 유도체, 이들의 제조방법 및 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
과산화효소에 의해 활성화된 산화 지시약과 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물의 반응은 분석화학에 중요한 역활을 한다. 이러한 반응은 과산화수소 및 과산화염-작용화합물의 검출뿐만아니라 과산화효소 및 헤모글로빈과 같은 과산화효소 활성을 갖는 물질의 검출과 아울러 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물의 형성과 더불어 적당한 옥시다제의 존재하에 산소와 반응하는 일련의 물질의 결정 및 끝으로 이러한 옥시 다제 자체의 결정을 위해 사용된다. 예를들면, 다음 부류로 나타낸 적당한 옥시다제인 몇가지 화합물들을 예시하였다 : 글루코스(글루코스 옥시다제), 갈락토오스(갈락토오스 옥시다제), D-아미노산(D-아미노산 옥시다제), 콜레스테롤(콜레스테롤 옥시다제), 콜레스테롤(콜레스테롤 옥시다제), 크산틴(크산틴 옥시다제), 뇨산(우리카제), 글리세롤(글리세롤 옥시다제), 피루베이트(피루베이트 옥시다제) 및 사르코신(사르코신 옥시다제).
통상적으로 이러한 결정은 착색된 물질을 얻기 위해 색원체와 과산화효소의 존재하에 과산화수소가 화학 양론적으로 반응하는 그러한 방법으로 수행된다. 반응혼합물의 흡수는 광도 측정법으로 측정하고, 반응은 과산화수소의 양 및 결정되는 화합물의 양을 위해 측정한다.
보통, 검출반응은 코벳(cuvettes)내에서 또는 건조한 시약 운반체의 도움으로 수행된다. 후자의 경우에, 정량측정은 예를들면 투과측정을 통한 광도계, 면제(remission)측정을 통한 면제 광도계 또는 육안비교에 의한 비교색상의 도움으로 수행된다.
더욱더, 과산화효소의 검출은 과산화효소가 표지효소로서 사용되는 ELISA(enzyme linked immuno sorbent assay)와 같은 면역학적 시험방법의 경우에 필요하다. 이러한 면역학적 시험방법의 경우에 과산화 효소의 농도는 통상적으로 <10-5M정도의 크기이다.
문헌으로 부터, 많은 화합물들은 과산화수소 또는 과산화효소의 검출을 위해 지시약으로서 사용할 수 있는 상기 언급한 방법을 위해 공지되어 있다. 예를들면, 벤지딘 및 벤지딘유도체, 디클로로페놀인도페놀, 아미노 카르바졸 및 4-아미노안티피린의 산화성 결합의 생성물로서 형성된 착색된 물질 또는 페놀, 나트톨, 아닐린유도체 및 다른 결합성분과 관련된 화합물들을 언급할 수 있다.
과산화수소, 과산화염-작용화합물 또는 과산화효소의 검출을 위한 공지의 산화환원 지시약이 많이 있음에도 불구하고, 이러한 화합물들은 아직도 다양한 효소 시험계통에 폭넓게 사용할 수 있고, 거의 중성으로 부터 약한 알칼리성의 효소시험을 위해 사용된 폭넓은 pH범위내에서 높은 감도를 갖고 있고, 그리고 UV광측정, 육안 및 형광분석 측정과 같은 다양한 방법을 위해 매우 알맞은 화합물들이 아니다.
본 발명의 목적은 상기 요구들을 만족하는 적당한 과산화효소 기질을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 본 발명에 따른 신규의 N-아실디히드로 레조루핀 유도체에 의하여 달성된다.
즉, 본 발명에 따라, 다음 일반식(Ⅰ)의 화합물들이 제공된다 :
Figure kpo00001
상기식에서, R1은 카르복실산 또는 술폰산잔기로 치환될 수 있는 저급알킬, 아릴 또는 아랄킬기이고, R2, R3및 R4는 같거나 또는 다를 수 있고, 수소원자, 할로겐원자, 저급알킬기 또는 저급알콕시기이고, Y는 -NR5R6또는 -OR7기(식중, R5및 R6는 각각의 경우에 수소원자 또는 카르복실산 또는 술폰산 잔기에 의해 치환될 수 있는 저급알킬기이거나 또는 R5및 R6는 함께 헤테로원자가 임의로 참여하는 탄화수소 다리를 나타내고, R7은 저급알콕시 또는 폴리-저급알콕시기에 의해 치환될 수 있는 저급알킬기임)이다.
치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6및 R7의 정의에 사용된 저급알킬 및 저급알콕시기는 C7이하를 함유하는, 바람직하게는 C4이하를 함유하는 포화된 직쇄 및 측쇄 탄화수소기이고, 특히 바람직하게는 메틸, 에틸 메톡시 및 에톡시기이다.
R7의 치환체의 정의에서 폴리-저급알콕시기는 2 내지 5개, 바람직하게는 2 또는 3개의 저급알콕시 부분으로 구성된다.
R1의 정의에서 아릴기로서, 특히 바람직하게는 페닐 또는 나프틸기가 있다. R1의 정의에서 아랄킬기는 바람직하게는 아릴부분으로서 페닐 또는 나프틸기, 아킬부분으로서 C5이하, 바람직하게는 C3이하를 함유하고, 아랄킬기로서 특히 바람직하게는 벤질기이다.
또한 치환체 R1, R5및 R6의 정의에서 저급알킬, 아릴 및 아랄킬기들은 각각의 경우에 카르복실산 및 술폰산 잔기에 의해 한번 또는 그 이상 치환될 수 있고, 바람직하게는 이러한 치환체를 3개 이하 함유한다.
R2, R3및 R4의 정의에서 할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드이고, 바람직하게는 염소 및 브롬이다.
치환체 R5및 R6에 의해 형성될 수 있는 헤테로원자에 의해 임의로 간섭되는 탄화수소다리는 C2내지 C5, 특히 C3또는 C4를 함유한다. 탄화수소다리는 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 3개이하의 헤테로원자에 의해 간섭될 수 있다. 특히, 모르폴린 및 피페라진기들이 바람직하다.
일반식(Ⅰ)의 신규의 화합물들은 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 일반식(Ⅰ)의 화합물의 바람직한 제조방법에 따라, 다음 일반식(Ⅱa) 및 (Ⅱb)의 화합물을 환원시키고, 아실화반응시켜 다음 일반식(Ⅲ)의 화합물을 얻고 ;
Figure kpo00002
상기식에서, R2, R3및 R4는 상기에 정의한 바와 같다.
Figure kpo00003
상기식에서, R1, R2, R3및 R4는 일반식(Ⅰ)에 정의한 바와 같다.
그다음 카르복실산 기능을 반응성 카르복실산 유도체로 임의로 전환시킨 후, 다음 일반식(Ⅳ)의 화합물과 반응시켜, 결과적으로 0-아실기를 선택적으로 분열시킨다 :
HY (Ⅳ)
상기식에서, Y는 일반식(Ⅰ)에 정의한 바와 같다.
일반식(Ⅱa) 및(Ⅱb)의 화합물들은 레조루핀으로부터 유도된 공지된 물질이거나 또는 공지된 방법과 유사하게 제조할 수 있다.
이러한 목적을 위해, 다음 일반식(Ⅴ)의 니트로소레조르시놀은 낮은 온도에서 피롤루자이트 및 황산의 존재하에 다음 일반식(Ⅵ)의 레조르시놀 유도체와 반응한다 :
Figure kpo00004
상기식에서 R3및 R4는 일반식(Ⅰ)에 정의한 바와 같다.
Figure kpo00005
상기식에서, R2는 일반식(Ⅰ)에 제시한 것과 같다.
이러한 화합물은 암모니아의 존재하에 아연분말과 반응시켜 일반식(Ⅱa) 또는 (Ⅱb)의 화합물로 전환될 수 있다.
일반식(Ⅴ)의 화합물과 일반식(Ⅵ)의 화합물의 반응은 통상 -10 내지 50℃의 범위, 바람직하게는 0 내지 30℃의 범위내에서 수행된다. 특히, 반응은 일반식(Ⅴ) 및 (Ⅵ)의 화합물을 약 0℃에서 혼합할때 온화하게 진행되고, 그 다음 반응 혼합물은 실온에서 방치한다. 피롤루자이트의 농도는 바람직하게는 0.5 내지 5몰/리터, 특히 1 내지 2몰/리터이어야 한다. 황산의 농도는 0.5 내지 5몰/리터, 바람직하게는 1 내지 3몰/리터이다.
일반식(Ⅱa) 또는 (Ⅱb)의 화합물을 얻기 위해 최초로 형성된 레자주린 유도체의 환원반응은 바람직하게는 아연분말과 더불어 암모니아성 용액내에서(참고, Nietzki et al., Ber.Dtsch.Chem.Ges., 22, 3020/1889) 또는 수소화붕소나트륨과 더불어 바람직하게 수행된다. 용매로서, 바람직하게는 물-알코올 혼합물, 바람직하게는 메탄올 0 내지 4부와 물 1부의 혼합물을 사용한다. 환원되는 화합물의 몰당, 1 내지 20몰 및 바람직하게는 1 내지 5몰의 아연분말 또는 수소화붕소나트륨이 사용되고 소량씩 가한다. 반응용액의 온도는 -10 내지 +35℃, 바람직하게는 +5 내지 +10℃에서 유지된다. 온도범위의 정확한 유지는 반응의 정확한 경로를 위해 필요한 것으로 입증되었다. 냉각없이, 발열반응은 분리하기 어려운 부생성물을 생성한다.
선택된 온화한 조건하에서, 일반식(Ⅴ)의 화합물과 일반식(Ⅵ)의 화합물 사이의 반응은 명료하게 좋은 수득률로 발생한다. 선택된 합성경로는 변화시킬 수 있다. 특히, 비대칭적으로 치환된 레조루핀 유도체의 제법과 관련하여, 합성의 다양한 가능성이 있다.
일반식(Ⅲ)의 트리아실 유도체의 제조를 위해, 일반식(Ⅱa) 및 (Ⅱb)의 적절한 레조루핀 유도체는 염화 제 1 주석 또는 아세트산크롬과 같은 강한 환원제와 더불어 또는 전기화학적으로 처음으로 환원된다. 환원을 위해, 레조루핀 유도체는 5 내지 35% 염산수용액중에서 바람직하게는 염화 제 1 주석과 더불어 적당한 용매 중에서 2 내지 10당량, 바람직하게는 2 내지 6당량의 환원제와 함께 10 내지 60분동안 가열한다. 그 다음 냉각하여 디히드로화합물이 침전한다. 아실화반응은 초산무수물, 염화벤조일등과 같은 적당한 아실화제와 더불어 통상의 방법으로 발생한다. 바람직하게는, 일반식(Ⅲ)의 화합물은 레조루핀 유도체(Ⅱa) 및 (Ⅱb)의 환원 아실화에 의해 1-포트방법으로 제조된다. 이러한 목적을 위해, 적당한 레조루핀 유도체는 5분 내지 3시간동안 적당한 용매중에서 아실화제의 존재하에 2 내지 6당량의 환원제와 더불어 환류하에 가열하거나 또는 4 내지 16시간동안 주변온도에서 교반한다.
화합물(Ⅳ)의 반응을 위해, 일반식(Ⅲ)의 카르복실산은 카르복실산 클로라이드, 에스테르 또는 무수물과 같은 반응성 카르복실산 유도체로 전환시키는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해 많은 방법들이 문헌에 제시되어 있다. 특히, 카르복실산 작용기능을 염화옥살릴/디메틸포름아미드 또는 염화티오닐/디메틸포름아미드와 더불어 카르복실산 클로라이드로 전환시키는 것이 바람직하다.
일반식(Ⅳ)의 화합물들은 일반식(Ⅲ)의 카르복실산 유도체 또는 그의 반응성 유도체들이 디메틸아미노피리딘과 같은 아실화 촉매의 존재하에 카르복실산아미드 또는 에스테르로 전환되는 아민 또는 알코올이다.
특히 일반식 HY의 바람직한 아민으로는 해당하는 로이코 레조루핀 유도체의 물에 대한 용해도가 증가하기 때문에 모르폴린, 메톡시에틸아민 또는 글리신아미드와 같은 극성그룹을 갖는 아민이다. 아미노 카르복실산들은 같은 방법으로 사용할 수 있다. 통상의 방법으로 반응에 참여하지 않는 작용기들은 보호하는 것이 바람직하다. 이러한 보호된 아미노 카르복실산의 예로는 글리신, 3차-부틸에스테르, 글리신 벤질 에스테르 및 N-BOC리신 메틸에스테르를 포함한다. 반응이 수행된 후에 유입된 보호기들은 공지된 방법으로 다시 분열된다.
본질적으로, 일반식 HY의 알코올로서, 모든 가능한 알코올을 사용할 수 있다. 특히, 디메틸렌 글리콜 모노에틸에테르 및 트리에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 뿐만아니라 해당되는 모노메틸 에테르를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 N-아실유도체의 제조를 위해, 카르복실산(Ⅲ)과 아민 또는 알코올(Ⅳ)의 반응 후, 두개의 0-아실기들은 선택적으로 분열되어야 한다. 이것은 물과 물에 녹는 용매의 혼합물중에서 예를들면, 1,4-디옥산, 메탄올 또는 에탄올 및 바람직하게는 물/1,4-디옥산(1 : 1 v/v)중에서 2 내지 10몰, 바람직하게는 2 내지 4몰의 아황산나트륨과 반응시켜 달성된다. 반응온도는 20 내지100℃, 바람직하게는 80내지 100℃이다. 이러한 반응조건하에서, 본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 N-아실디히드로 레조루핀 유도체들은 높은 수득률로 제조될 수 있다.
일반식(Ⅰ)의 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체들은 색상을 띤 그리고 형광 레조루핀 유도체를 얻기 위해 과산화염의 존재하에 과산화수소에 의해 쉽게 산화될 수 있다.
또한, 결과적으로 본 발명은 과산화수소(또는 과산화염-작용화합물)의 검출 또는 과산화효소(또는 과산화 효소 활성을 갖는 물질)의 검출을 위한 일반식(1)의 화합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 검출 반응에 의해, 또는 물론, 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물의 형성뿐만 아니라 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 제조하는 계에서 효소활성의 형성으로 적당한 산화제의 존재하에 산소와 반응하는 이러한 물질들의 검출이 가능하다.
N-아실-디히드로 레조루핀 유도체들의 얻어진 산화생성물들은 UV-광도측정 및 육안검출뿐만 아니라 특히 형광계측정을 위해 사용할 수 있다. 이것은 중요하기 때문에, 광도측정 방법과 비교하여 형광계결정의 감도는 가끔 10배까지 증가한다. 몇가지 경우에, 예를들면 세포분화(세포형광측정)을 위한 자동장치로 세포의 효소활성을 연구하는 경우뿐만 아니라 미세형광물질과 더불어 작업할 필요가 있다. 다른 경우에, 예를들면, 가끔 과산화효소와 더불어 수행되는 시험계(효소면역검정)의 효소적 표지를 결정하는 경우에, 효소적 촉매의 증가효과는 형광성 물질의 사용에 의하여 상당히 강화된다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물의 UV 및 가시광선 범위에서 광흡수뿐만 아니라 산화생성물의 형광 강도는 실질적으로 중성 내지 약 알칼리성 pH범위의 pH에 의존한다. 용액의 pH값은 최대 활성을 얻기 위해 연구된 효소계에 의존하며 적정화 되어야 하므로, 즉 6.5 내지 9.5의 pH범위에서 변할 수 있으므로, 광흡수 및 형광의 강도의 N-의존은 또한 다른 효소학적 시험에서 비교적 높은 감도의 달성을 위해 매우 중요하다.
이점과 관련하여, 언급된 pH범위에서 본 발명에 따른 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체의 우수한 물-용해도가 특히 강조되고 있다. 결과적으로, 용액에 사용된 색원체를 얻기 위하여 효소적 시험에 유기용매 또는 세제를 가할 필요가 없다. 이러한 장점은 특히, 기질 및 생성물의 우수한 용해도가 필요하고, 용매 또는 제제의 부가가 가끔 효소활성에 영향을 미치는 동역학적 효소 시험의 경우에 이용된다.
과산화수소 또는 과산화염-작용화합물의 결정을 위해, 일반식(Ⅰ)의 화합물, 과산화효소, 적당한 완충계 뿐만 아니라 임의의 다른 시약 및 보조제들은 결정되는 물질을 함유하는 시료와 혼합되고, 그로 인해 일반식(Ⅰ)의 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체들이 산화된다. 흡수의 변화 또는 그로인해 야기된 형광의 강도의 변화는 광측정 또는 형광측정으로 측정된다. 표준 용액과 직접 비교에 의하여 또는 표준곡선과 간접비교에 의하여, 시료에서 결정되는 물질의 함량을 결정할 수 있다. 동적측정 뿐만아니라 종말점측정이 가능하다.
과산화효소 또는 과산화효소 활성을 갖는 화합물의 결정을 위해, 일반식(Ⅰ)의 화합물, 과산화수소(또는 과산화염-작용화합물, 적당한 완충계 뿐만아니라 임의의 다른 시약 및 보조제들은 결정되는 물질을 함유하는 시료와 혼합된다. 얻어진 반응혼합물은 더욱더 상기 제시한 방법으로 처리된다.
또한 일반식(Ⅰ)의 화합물들은 적당한 산화제의 존재하에 산소와 함게 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 제공하는 물질 또는 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 제조하는 계에서 효소활성물질의 결정을 위해 사용할 수 있다. 이러한 물질 또는 이러한 효소들의 결정은 적당한 산화제 뿐만아니라 임의의 다른 보조효소 또는 적당한 기질을 반응혼합물에 추가로 가하는 것을 제외하고 상기 제시한 방법으로 수행한다. 이러한 효소계의 예로서, 글루코노락톤을 얻기 위해 글루코오스와 글루코오스 산화제의 반응, 콜레스테논을 얻기위해 콜레스테롤과 콜레스테롤 산화제의 반응, 알란토인을 얻기 위해 뇨산과 우리카제의 반응 또는 글리세르 알데히드를 얻기 위해 글리세롤과 글리세롤 옥시다제의 반응을 언급할 수 있다. 체액에서 이러한 기질 또는 효소의 농도는 상기 방법으로 간단하게 및 정확히 결정할 수 있는 중요한 진단 매개변수이다.
즉, 본 발명은 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 적당한 산화제의 존재하에 산소와 더불어 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 만드는 물질의 결정을 위한 방법 뿐만아니라 과산화효소, 과산화효소 활성을 갖는 화합물의 결정 및 일반식(Ⅰ)의 화합물의 사용으로 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 제조하는 계에서 효소활성의 결정을 위한 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 언급한 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 시약들을 제공한다. 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 이러한 화합물을 만드는 물질의 검출을 위한 시약은 한편으로 본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 N-아실-디히드로 레조루핀 하나 또는 그 이상, 과산화효소 뿐만아니라 특정 매개변수 검출을 위해 더욱 필요한 효소, 적당한 완충계 또한 임의의 다른 시약 및 보조제, 예를들면 수화제, 안정제, 생약 첨가제, 구조 형성제등을 함유한다.
과산화효소, 과산화효소 활성을 갖는 화합물 및 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물을 제조하는 계의 효소활성의 검출을 위한 시약은 한편으로 일반식(Ⅰ)의 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체의 하나 또는 그 이상, 과산화수소 또는 과산화염-작용화합물, 임의로 필요한 기질 및 보조효소, 적당한 완충계 뿐만아니라 임의의 다른 시약 및 보조제들을 함유한다.
본 발명에 따른 시약은 용액, 동결건조물, 분말 혼합물 또는 시약 정제의 형태일 수 있고, 적당한 담체물질과 사용할 수 있다.
용액의 형태로 본 발명에 따른 시약은 바람직하게는 시험을 위해 필요한 모든 시약들을 함유한다. 용매로서, 물 또는 물과 물에 녹는 유기용매, 예를들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 디메틸포름아미드의 혼합물을 사용할 수 있다. 저장 안정성의 이유 때문에 실질적인 연구를 수행하기 위해 단지 혼합된 둘 또는 그 이상의 용액으로 시험을 위해 필요한 시약을 나누는 것이 유리할 수 있다.
동결 건조 형태의 시약의 제조를 위해, 용액은 한편으로 시험을 위해 필요한 시약, 통상의 구조 형성제, 예를들면 폴리비닐 피롤리돈 및 임의의 다른 충진물질, 예를들면 만니톨, 소르비톨 또는 크실리톨을 함유하고, 이를 건조시킨다.
분말혼합물 또는 시약 정제의 형태의 시약은 시험성분과 과립화에 의해 수반되는 통상의 생약 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 종류의 추가물질들은 예를들면 만니톨, 소르비톨 및 크실리톨과 같은 알코올 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 다른 용해되는 불활성 화합물을 포함한다. 일반적으로 분말 혼합물 또는 시약정제는 약 30 내지 200㎎, 바람직하게는 50 내지 80㎎의 최종 중량을 갖는다.
시험조각을 위한 담체 물질로서, 예를들면 종이, 유리 또는 합성수지 양모, 섬유물질의 망사 또는 직물 또는 흡수, 다공성 필름 또는 겔과 같은 공지된 담체물질을 사용할 수 있다.
시험조각 형태의 시약의 제조를 위해, 적당한 담체물질, 바람직하게는 여과지, 셀룰로오스 또는 합성수지 양모가 물, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤과 같은 즉시 휘발하는 용매에 시험조각의 제조를 위해 통상 사용되는 필요한 시약의 용액으로 침지된다. 이것은 하나의 침지단계로 수행될 수 있다. 그러나, 때때로 각각의 경우에 사용되는 용액이 시약 성분의 일부분을 함유하는 여러단계에서 침지화를 수행하는 것이 유리하다. 즉, 예를들면, 첫번째 단계에서, 침지화는 완충제 및 다른 물에 녹는 첨가제를 함유하는 수용액과 더불어 수행할 수 있고, 두번째 단계에서, N-아실-디히드로 레조루핀 유도체를 함유하는 용액과 더불어 수행할 수 있다. 완성된 시험지는 독일연방공화국 특허 2118455에 제시된 방법으로 합성수지와 미세한 망사 사이에서 조작하거나또는 바람직하게밀봉된 공지된 방법으로 사용하거나 또는 제조할 수 있다.
용해되는 필름 형성제로 부터 건조한 시약의 제조를 위해 래킹(raking), 포핸드 방법(forehand process), 롤링 피복등과 같은 공지된 제조방법에 따라 그로부터 제조할 수 있는 점성을 갖는 필름인 중합체로 부터 제조된다. 시약, 완충물질, 보조제 및 시약 안정제들은 이러한 용액속에 참여하고, 피복 덩어리는 담체필름에 적용되고, 건조되고, 시험조각을 얻기 위해 완성된 필름을 처리한다.
또한 일반식(Ⅰ)의 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체들은 지시 효소로서 사용되는 과산화효소의 결정 및 면역학적 반응을 수행한후 결정되어야 하는 활성의 면역학적 방법을 위해 사용될 수 있다.
효소학적 지시약 반응과 더불어 결정되는 이러한 면역학적 방법은 효소 면역검정으로 알려졌다. 이러한 방법들은 단백질, 폴리삭카라이드, 호르몬, 제약 및 다른 낮은 분자량 물질을 10-5내지 10-12몰/리터의 범위에서 결정하기 위해 사용된다. 상 분리단계의 요구에 의존하여, 구별은 시험을 수행하는 균일과 비균일 사이에서 만들어 진다. 더욱더 상세한 구분은 경쟁적 및 비 경쟁적 시험 원리 사이에서 만들 수 있다. 그러나, 모든 시험원리는 효소-항원 또는 효소-항체 접합과 더불어 적용된다. 효소학적 지시약 반응은 모든 효소 면역 검정에 공통적이다. 이러한 목적을 위해 적당한 효소 지시약은 예를들면 과산화효소이다. 통상적으로 이러한 효소 면역검정에서 과산화효소의 검출은 효소학적으로 과산화수소와 더불어 산화되고, 광측정 또는 형광측정계로 통상의 방법으로 측정되는 적당한 기질을 가하여 수행된다.
다음 실시예들은 본 발명에 따른 화합물의 합성을 위해 사용할 수 있는 다양한 방법중의 몇가지를 제시하였고, 아울러 이들 실시예에 의해 일반식(Ⅰ)의 신규의 N-아실-디히드로 레조루핀 유도체의 용도를 설명하였다.
[실시예 1]
N-아세틸-디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드.
A) 레조루핀-4-카르복실산.
메탄올 200ml에 니트로레조르시놀 16g, 2.6-디히드록시 벤조산 15.5g, 및 피롤루자이트 8.6g을 현탁시키고, 0℃로 냉각한다. 여기에 10.6ml의 진한 황산을 한방울씩 가하고, 반응혼합물을 실온에서 2시간 교반한다. 침전된 적색의 레자루핀-4-카르복실산을 여과하고, 메탄올로 씻고, 건조시킨다.
레자루틴 유도체에 물 200ml 및 25% 암모니아 50ml을 가하고 여과한다. 청색 침전물에 얼름 냉각시키면서 50g의 아연분말을 소량씩 가하고, 반응혼합물을 실온에서 방치한다. 환원반응의 과정은 얇은 막 크로마토그래피(용리제 : 메탄올/초산에틸 1 : 1 v/v 실리카겔 PLC판)을 사용하여 쉽게 추적할 수 있다. 반응용액을 여과하고, 여과액은 빙초산 및 소량의 진한 염산으로 산성화시킨다. 침전된 레조루핀 4-카르복실산을 여과하고, 시카펜트(Sicapent)상에서 진공으로 건조시킨다. 수득률 16.33 : Rf(TLC : 실리카겔 : 용리제 : n-부탄올/빙초산/물 4 : 1 : 1 v/v/v) : 0.4
B) N,O,O-트리아세틸-디히드로 레조루핀-4-카르복실산
빙초산 30ml에 및 초산무수물 30ml에 레조루핀-4-카르복실산 12.9g을 가하고 염화 제1주석 27.6g을 혼합하고, 80℃에서 1시간동안 교반하고, 여기에 얼음물 60ml을 가하고, 1시간동안 교반하고 침전물을 여과한다. 건조시킨후, 고체 물질을 아세톤 500ml로 씻고 흡입 여과한 다음 여과액을 건조시켜 N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 11.3g을 얻는다 : Rf(TLC : 클로로포름/메탄올/빙초산 9 : 1 : 0.1 v/v/v) : 0.46
1H-NMR(D6-DMSO) : δ =2.24, 2.26 및 2.29(각각 s, 각각 3H) ; 6.94(dd, J=8.5 및 2.2Ha, 1H) ; 6.98(d, J=2.2Hz, 1H) ; 7.04(d, J=9Hz, 1H)7.61(d, J=8.5Hz, 1H) ; 7.67 ppm(d, J=9Hz, 1H).
C)N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드.
N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3.85g을 염화 옥살릴 5.4ml와 혼합하고 0℃로 냉각한다. 여기에 디메틸포름 아미드를 한방울씩 가하고, 교반하면서 주변온도하에서 방치하고 기체를 발생시키면서 추출물을 용해시킨다. 반응 혼합물은 진공으로 실온에서 증발시켜 건조시키고, 염화 메틸렌 20ml양으로 3번 추출하고, 증발시켜 다시 건조시킨다. 그 결과, 조생성물로서 N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 클로라이드 4g을 얻고 더 처리한다.
산 클로라이드를 건조한 염화 메틸렌 50ml에 용해시키고, 여기에 트리에틸아민 3.1ml 및 계속하여 모르폴린 1.2ml을 가한다. 2시간동안 교반후, 반응용액을 물, 포화된 탄산수소나트륨용액 및 묽은 염산으로 씻고, 염화메틸렌상을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 증발시킨다. 잔류물을 에탄올로 결정화시켜 N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드 8.1g을 얻는다.
1H-NMR(D6-DMSO) : δ =2.20-2.21(3 s, 9H) ; 3.50-3.80(m, 8H) ; 6.70-7.05(m, 2H) : 7.12(d, J=2Hz, 1H) ; 7.54(d, J=9Hz, 1H) ; 7.60 ppm(d, J=9Hz, 1H).
D) N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드.
디옥산/물(1 : 1 v/v)50ml에 N,O,O-트리아세틸 디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드 2.02g 및 무수 아황산나트륨 1.2g을 가하고 30분간 환류한다. 반응혼합물을 증발시키고, 잔류물을 아세톤 50ml로 씻고, 여과한다음 여과액을 다시 증발시킨다. 잔류물을 실리카겔(용리제 클로로포름/메탄올 8 : 2 v/v)크로마토 그래피하여 N-아세틸 디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드 1.0g을 얻는다 : Rf(TIC : 실리카겔, 용리제 : 클로로포름/메탄올 8 : 2 v/v) : 0.8
1H-NMR(D6-DMSO) :δ =2.20(s, 3H) ; 3.10-3.16(m, 2H) ; 3.4-3.8(m, 6H) ; 6.48(d, J=2.4Hz, 1H) ; 6.53(dd, J=9.8 및 2.4Hz, aH) ; 6.62(d, J=9Hz, 1H) ; 7.30(d, J=9.8Hz, 1H) ; 7.33(d, J=9.8Hz, 1H) ; 9.62(s, 1H) ; 9.91 ppm(s, 1H).
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액, pH 7.5) : λmax=200nm
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=575nm
형광 방출 : λmax=590nm
유사한 방법으로, 다음 화합물을 얻는다 :
a) N-아세틸-6-메틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드
6-메틸레자주린-4-카르복실산 및 6-메틸레조루핀-4-카르복실산을 경유하여 2-메틸-4-니트로소레조르시놀
1H-NMR(D6-DMSO) : δ=2.17 및 2.23(각각 3, 6H) ; 3.5-3.8(m, 8H) ; 6.20(d, J=8.6Hz, 1H) ; 6.66(d, J=8.8Hz, 1H) ; 6.79(d, J=8.8Hz, 1H) ; 7.35 ppm(d, J=8.8 Hz, 1H).
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액 pH 8.0) :
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=585nm
b) N-아세틸-8-에틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드
8-에틸레자주린-4-카르복실산 및 8-에틸레조루핀-4-카르복실산을 경유하여 4-에틸-6-니트로소레조르시놀로부터.
TLC(실리카겔, 영리제 : 초산에틸) : Rf=0.38
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액 pH 8.0) :
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=575nm
형광방출 : λmax=598nm
c) N-아세틸-8-클로로레조루핀-1-카르복실산 모르폴리드
8-클로로레자주린-1-카르복실산 및 8-클로로레조루핀-1-카르복실산을 경유하여 4-클로로-6-니트로소레조르시놀로부터.
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액, pH 8.0) :
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=570nm
d) N-아세틸-6,8-디클로로디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드
6,8-디클로로레자주린-4-카르복실산 및 6,8-디클로로레조루핀-4-카르복실산을 경유하여 2,4-디클로로-6-니트로소레조르시놀로 부터.
e) N-아세틸-8-브로모디히드로 레조루핀-4-카르복실산 모르폴리드
8-브로모레자주린-4-카르복실산 및 8-브로모레조루핀-4-카르복실산을 경유하여 4-브로모-6-니트로소레조르시놀로 부터.
[실시예 2]
N-아세틸 디히드로 레조루핀-4-카르복실산 카르복시메틸 아미드
A) N,O,O-트리아세틸 디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드
N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산(실시예 1 b에 따라 제조된)10.7g을 염화 옥살릴 27ml로 산 클로라이드로 전환시키고, 산 클로라이드는 염화 메틸렌 100ml에 가한 다음, 여기에 염화 메틸렌 20ml에 용해된 글리신 3차-부틸 에스테르 7.8g을 한방울씩 가하고, 반응혼합물을 실온에서 3시간 교반한다. 그 다음 탄산수소나트륨의 포화된 수용액, 1N시트르산 및 물로 씻는다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨후, 유기상을 증발시키고, 잔류물을 소량의 초산에틸에 녹이고, 용리제로서 초산에틸을 사용하여 실리카겔 컬럼으로 여과한다. 그 결과 연한 갈색을 띤 생성물의 형태로 N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드 11g을 얻는다. : Rf(TLC : 실리카겔, 용리제 : 초산에틸) : 0.68
B) N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드
N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드 9g을 디옥산/물(1 : 1 v/v)100ml에 무수 아황산나트륨 4.6g과 더불어 30분간 환류하면서 가열한다. 반응혼합물을 증발시키고, 잔류물을 아세톤 250ml에 녹이고, 여과한 다음 여과액을 다시 증발시킨다. 에탄올로 결정화시켜 생성물 4.5g을 얻는다. 이러한 생성물 1.4g을 용리제로서 염화 메틸렌/메탄올(20 : 1 v/v)을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피하여 N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드 0.9g을 얻는다. Rf(TLC : 실리카겔, 용리제 : 초산에틸)0.77
1H-NMR(D6-DMSO) : δ =1.49(s, 9H) ; 2.20(s, 3H) ; 4.07(d, J=6Hz, 2H) ; 6.61(dd, J=9.8 및 2.4Hz, 1H) ; 6.69(d, J=9.8Hz, 1H) ; 6.86(d, J=2.4Hz, 1H) ; 7.35(d, J=9.8Hz, 1H) ; 7.51(d, J=9.8Hz, 1H) ;8.77(t, 넓은 J=6Hz, 1H) ; 9.74(s, 1H) ;12.61(s, 1H)
C) N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 카르복시 메틸아미드
트리플루오로아세트산 10ml에 N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 3차-부톡시카르보닐메틸아미드 500mg을 가하고 30분간 방치한다. 여기에 물 40ml을 천천히 한방울씩 가하고, 여과한 다음 물로 씻고 건조시킨다. 그 결과 N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 카르복시메틸아미드 410mg을 얻는다.Rf(TLC : 실리카겔 : 용리제 :n-부탄올/빙초산/물 4 : 1 : 1 v/v/v 0.79
1H-NMR : (D6-DMSO) :δ =2.20(s, 3H) ; 4.08(d, J=6Hz, 1H) ; 6.61(dd, J=9.8 및 2.4Hz, 1H) ; 6.69(d, J=9.8Hz, 1H) ; 6.89(d, J=2.4Hz, 1H) ; 7.34 및 7.52(각각 d, J=9.8Hz, 2H) ; 8.81(t, 넓은, J=6Hz, 1H) : 9.74(s, 넓은, 1H) ; 12.5 ppm (s, 1H)
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액, pH 7.5) : λmax=204nm
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=571nm
형광방출 : λmax=588nm
유사한 방법으로, 다음을 얻는다 :
a) N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산(3차-부톡시카르보닐메틸)-메틸아미드(Rf TLC : 실리카겔 : 용리제 : 클로로포름/메탄올/빙초산 9 : 1 : 0.1 v/v/v/ : 0.77) 및N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산(3차-부톡시카르보닐메틸)-메틸아미드(Rf TLC 상기와 같이 전개 : 0.56)을 경유하여 N,O,O-트리아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산으로 부터 : N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산카르복시메틸)-메틸아미드 : Rf(TLC 상기처럼 전개) : 0.10
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액, pH 7.5) : λmax=204nm
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=574nm
b) N-아세틸-6-메틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산(카르복시메틸)-메틸아미드 : Rf(TLC 상기처럼) : 0.62
UV/VIS(0.1M 인산칼륨 완충용액, pH 7.5) : λmax=205nm
과산화수소/과산화효소로 산화후 : λmax=585nm
c) N-아세틸-8-클로로디히드로 레조루핀-4-카르복실산 카르복시메틸아미드
[실시예 3]
과산화수소의 결정
트리스-(히드록시메틸)-메틸-2-아미노-에탄술포 0.1mmo1/ι
네이트(pH 8)
트리톤×100 0.5%
N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실 산 모 2.5mmo1/1
르폴리드
과산화효소 3 U/m1.
의 용액에 알려진 과산화수소 농도의 용액의 다른 양을 피펫으로 주입하고 60분간 방치하고, 578nm에서 흡광을 측정한다.
첨부한 제 1 도에서, 578nm의 흡광은 측정용액의 과산화수소 농도에 대해 도시하였다. 그 결과 과산화수소와 흡광 사이에 우수한 직선을 얻었다.
이 방법으로 얻어진 보 정곡선의 도움으로, 또한 미지의 과산화수소 함량의 시료중에서 과산화수소 농도를 결정할 수 있다.
[실시예 4]
크레아티닌의 결정
용액 1 :
트 리 스-(히드록 시 메 틸)-메 틸 100mmol/l 아지드화 나트륨 0.2%
-2-아미노-에틸술포네이트(pH
8)
트리톤×100 0.5% 과산화효소 3U/ml
N-아세틸 디 히 드 로 레 조 루 핀 2.5mmol/l 리파아제 2U/ml
-4-카르복실산 모르폴리드
염화 나트륨 150mmol/l 아스코르베이트 산화제 10U/ml
염소산 나트륨 5mmol/l 크레아티나제 6.5U/ml
EDTA 0.5mmol/l 사르코신 산화제 6.5U/ml
페로시안화 칼륨 10mmol/l 크레아티니나제 25U/ml
용액 2 :
크레아티닌 표준용액 2mg./100ml.
용액 2의 10, 20, 30, 40 및 50μ l를 용액1의 1ml속에 유입시킨다. 흡광은 시간에 의존하여 조정하였다. 즉 첨부한 제 2 도에 제시한 곡선경로를 얻었고, 미지의 크레아티닌 농도의 결정을 위한 보정곡선으로서 사용할 수 있다.
[실시예 5]
티록신의 결정
용액 1 :
바르비투르산 칼륨 120mmol/l 소혈청 알부민 0.2%
인산칼륨 완충용액(pH 8.5) 18.2mmol/l 티록신-과산화효소 결합 0.5U/l
9-아닐리노-1-나프탈렌술폰산 1.2mmol/l
용액 2 :
트리스/HCL(pH 8.0) 100mmol/l
과붕산 나트륨 3.2mmol/l
N-아세틸디히드로 레조루핀-4-카르복실산 1.82mmol/l
모르폴리드
항티록신 항체(시험관당 약 25mg 티록신 결합능력)로 피복된 합성수지 시험관속에 0.02ml의 티록신 용액 및 1ml의 용액 1을 가하고, 20 내지 25℃에서 30분간 반응시킨다. 시험관의 내용물을 뽑아내고, 시험관을 물로 씻고, 다시 뽑아낸다. 그 다음 용액2와 함께 60분 동안 반응시키고, 천천히 혼합하고, 578nm에서 흡광을 측정한다. 얻어진 보정곡선은 첨부한 제 3 도에 설명하였다.
이러한 보정곡선을 기초로하여 시료중의 미지의 티록신 함량을 결정할 수 있다.

Claims (2)

  1. 다음일반식(Ⅱa) 및(Ⅱb)의 화합물을 환원시키고, 아실화반응시켜 다음 일반식(Ⅲ)의 화합물을 얻고, 그 다음 카르복실산 작용기를 반응성 카르복실산 유도체로 임의로 전환시킨후, 다음 일반식(Ⅳ)의 화합물과 반응시켜, O-아실기들을 선택적으로 분열시킴을 특징으로 하는 다음 일반식(1)의 N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법 :
    Figure kpo00006
    Figure kpo00007
    상기식에서, R1은 카르복실산 또는 술폰산 잔기로 치환될 수 있는 C7이하의 알킬기, 페닐기, 나프틸기, 또는 아릴부분이 페닐기나 나프틸기이며 알킬부분이 C5이하를 갖는 아랄킬기이고, R2, R3및 R4는 같거나 또는 다를 수 있고, 수소원자, 할로겐원자, C7이하를 갖는 알킬기 또는 C7이하를 갖는 알콕시기이고, Y는 -NR5R6또는 -OR7기(식중, R5및 R6는 각각의 경우에 수소원자 또는 카르복실산이나 술폰산 잔기로 치환될 수 있는 C7이하를 갖는 알킬기이거나, 또는 R5및 R6는 함께 산소, 질소 및 황원자로부터 선택된 헤테로원자 3개이하를 임의로 포함하는 C2내지 C5를 갖는 탄화수소다리를 나타내고, R7은 C7이하를 갖는 알콕시기 또는 C7이하를 갖는 알콕시기 2 내지 5개로 구성되는 폴리-알콕시기에 의해 치환될 수 있는 C7이하를 갖는 알킬기임)를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 선택적 가수분해는 아황산나트륨으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
KR1019860006077A 1985-07-25 1986-07-25 N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법 KR880002235B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019870005785A KR890004092B1 (ko) 1985-07-25 1987-06-08 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 방법 및 시약조성물

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853526566 DE3526566A1 (de) 1985-07-25 1985-07-25 N-acyl-dihydroresorufin-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von wasserstoffperoxid, peroxidatisch wirkender verbindungen oder peroxidase
DEP3526566.3 1985-07-25
DE3526566.3 1986-07-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR870001183A KR870001183A (ko) 1987-03-12
KR880002235B1 true KR880002235B1 (ko) 1988-10-20

Family

ID=6276698

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019860006077A KR880002235B1 (ko) 1985-07-25 1986-07-25 N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법
KR1019870005785A KR890004092B1 (ko) 1985-07-25 1987-06-08 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 방법 및 시약조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019870005785A KR890004092B1 (ko) 1985-07-25 1987-06-08 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 방법 및 시약조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4737466A (ko)
EP (1) EP0210559B1 (ko)
JP (1) JPS6229578A (ko)
KR (2) KR880002235B1 (ko)
AT (1) ATE67761T1 (ko)
DE (2) DE3526566A1 (ko)
ES (1) ES2000751A6 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59182361A (ja) * 1983-03-31 1984-10-17 Kyowa Medetsukusu Kk 過酸化水素の定量方法
DE3526565A1 (de) * 1985-07-25 1987-02-05 Boehringer Mannheim Gmbh Resorufin-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung in fluoreszenzimmunoassays
DE3644401A1 (de) * 1986-12-24 1988-07-07 Boehringer Mannheim Gmbh Neue hydrolase-substrate
JPH01211595A (ja) * 1988-02-18 1989-08-24 Kikkoman Corp 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、その製法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬への利用
WO1998022822A1 (en) * 1996-11-21 1998-05-28 Applied Imaging Corporation Photographic color couplers used as cytochemical contrast markers
JP2002502980A (ja) 1998-02-10 2002-01-29 イーワイ ラボラトリーズ インコーポレイテッド 試料ホルダ起伏形状を補償し且つシステム・ノイズのロック除去を行う反射測定システム
US7432372B2 (en) 2003-10-31 2008-10-07 Invitrogen Corporation Fluorinated resorufin compounds and their application

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394512A (en) * 1980-02-05 1983-07-19 Boehringer Mannheim Gmbh 1-(Substituted phenyl) aminoantipyrin compounds
JPS56145352A (en) * 1980-04-14 1981-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Quantifying method for material peroxide
JPS6033479B2 (ja) * 1980-07-30 1985-08-02 協和醗酵工業株式会社 過酸化水素の定量方法
JPS59182361A (ja) * 1983-03-31 1984-10-17 Kyowa Medetsukusu Kk 過酸化水素の定量方法
US4556640A (en) * 1983-06-29 1985-12-03 Miles Laboratories, Inc. Stabilized test composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances
DE3484745D1 (de) * 1983-10-05 1991-08-01 Merck Frosst Canada Inc Inhibitoren fuer die leukotrien-biosynthese.

Also Published As

Publication number Publication date
US4737466A (en) 1988-04-12
KR890004092B1 (ko) 1989-10-20
EP0210559A3 (en) 1989-02-22
DE3526566A1 (de) 1987-02-05
ATE67761T1 (de) 1991-10-15
KR870001183A (ko) 1987-03-12
JPS6229578A (ja) 1987-02-07
KR880001827A (ko) 1988-04-27
JPH0354938B2 (ko) 1991-08-21
ES2000751A6 (es) 1988-03-16
DE3681649D1 (de) 1991-10-31
EP0210559B1 (de) 1991-09-25
EP0210559A2 (de) 1987-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20170037248A1 (en) Fluorinated resorufin compounds and their application
JP3001368B2 (ja) Ｎａｄ（ｐ）ｈを比色検出するための方法および薬剤、ならびにニトロソアニリン化合物
US4657855A (en) Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample
FI85990C (fi) Sammansaettning innehaollande zwitterjonkopplingsmedel och testanordning foer bestaemning av leukocyter.
Burd et al. Specific protein-binding reactions monitored by enzymatic hydrolysis of ligand-fluorescent dye conjugates
CS273617B2 (en) Method of resorufine&#39;s derivatives production
US4978615A (en) Method for the determination of the compound having mercapto group
US5395938A (en) Biotinylated chemiluminescent labels and their conjugates, assays and assay kits
KR870000699B1 (ko) 레소루핀 유도체의 글리코시드의 제조방법
JPH0764986B2 (ja) 新規な発色試薬
KR880002235B1 (ko) N-아실디히드로 레조루핀 유도체의 제조방법
US4719097A (en) Phosphates of resorufin derivatives and compositions thereof for the determination of the activity of phosphatases
JPH0694712A (ja) 標識サイロニンハプテン類似体を用いたイムノアッセイ
US4950593A (en) Improved method for assaying proteolytic enzymes
US5792619A (en) Assay using oxidative chromogenic reagent
USRE34284E (en) Method for assaying proteolytic enzymes
KR910004208B1 (ko) 효소활성을 측정키 위한 신규의 아미노산 치환된 4-아미노페나존
JPS6342470A (ja) ペルオキシダ−ゼまたはｈ↓２ｏ↓２の測定方法
EP0079489A1 (en) Methotrexate-labeled iodothyronine conjugates and method, reagent means and test device for the determination of iodothyronine in or iodothyronine uptake of a liquid sample
JP2583440B2 (ja) 酵素活性測定用の基質及びそれを用いる酵素活性測定方法
JPS60224500A (ja) エステル分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素の検出用試薬
JPS61227570A (ja) 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法
JPS6178399A (ja) 酵素反応試薬

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 19931016

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee