JPS6229578A - Ｎ―アシル―ジヒドロレゾルフィン誘導体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｎ−アシルージヒドロレゾルフイン誘導体、
その製法、過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物及び
これらを供給する化合物を測定する方法及び試薬、並び
にペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ−及び酵素活
性を測定する方法及び試薬に関する。

従来の技術 ペルオキシダーゼの触媒作用下に行なわれる過酸化水素
又はペルオキシｒ機作用物質と酸化指示薬との反応は分
析化学において特に重要である。それは過酸化水素又は
ペルオキシド様作用化合物並びにペルオキシダーゼ又は
ペルオキ、シダーゼ活性を有する物質、例えばヘモグロ
ビンの検出ばかりでなく、相応するオキシダーゼの存在
において酸素と、過酸化水素又はペルオキシド様作用化
合物の形成下に反応する一連の物質の測定及びこれらの
オキシダーゼの測定を可能にする。例として若干の化合
物が挙げられていて、カッコ内は相応するオキシダーゼ
であるニ ゲルコース（グルコースオキシタ−セ）１．ｆｆラクト
ース（がラクトースオキシダーゼ）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ
−アミノ酸オキシダーゼ）、コレステリン（コレステリ
ンオキシダーゼ）、キサンチン（キサンチンオキシダー
ゼ）、尿酸（ウリカーゼ）、グリセリン（グリセリンオ
キシダーゼ）、ピルベート（ピルベートオキシダーゼ）
、サルコシン（サルコシンオキシタ＝セ）。

一般に、そのような測定は、過酸化水素をぺ〜ルオキシ
ダーゼの存在において色原体と化学薫論的に反応させて
色素て変換して行なう。反応混合物の吸収を光度測定し
、かつそれは反応した過酸化水素、従って測定すべき化
合物の量の尺度である。

殊に１検出反応はキュベツト中か又は乾式試薬担体によ
り実施する。例えば後者の場合、定量は光度計により透
過光測定を介して、拡散反射光度計により拡散反射測定
を介して又は比較色を用いて視覚的に比較することによ
り行なう。

更に、ペルオキシダーゼ検出は免疫学的試験法、例えば
ＫＬＩＳＡ　（酵素結合免疫吸着検定：ｅｎｚｙｍｅ　
１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａ
ｙ　）で必要であり、その際にペルオキシダーゼが標識
酵素として使われる。一般に、そのような免疫学的試験
法ではペルオキシダーゼ濃度は（Ｉ　Ｑ−５Ｍの程度で
ある。

文献には、過酸化水素又はペルオキシダーゼを検出する
指示薬として使用することのできる、前記の方法のため
の多数の化合物が公知である。

例として次のものが挙げられる：ベンジジン及ヒヘンジ
ジン訴導体、ジクロルフェノールインげフェノール、ア
ミノカルバゾールもしくは４−アミノアンチピリン又は
類縁物質とフェノール、ナフトール、アニリン誘導体又
は他のカップリング成分との酸化的カップリングの生成
物として生じる色素。

過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物又はペルオキシ
ダーゼを検出するために多数のレドックス指示薬が知ら
れているが、広範な、即ち多種多様の酵素試験糸で使用
することができ、酵素試験でたいていの場合に使用され
るほぼ中性乃至弱アルカリ性の一範囲で…に左右されな
い高い感度を有しかつ例えばＵＶ光度測定、視覚的及び
けい光測定のような種々の方法に非常に好適であるよう
な化合物が今なお求められている。

本発明の練題は、前記の要求を満足する好適なペルオキ
シダーゼ基實を開示することであった。この原題は、本
発明による新規のＮ−アシルージヒｒロレゾルフィン誘
導体により解決される。

それ故、本発明の目的は、一般式Ｉ： 〔式中Ｒ１はカルボキシル−又はスルホン酸残基により
置換されていてよい低級アルキル基、アリール基又はア
ルアルキル基を表わし、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同じか又
は異なっていてよく、水素、ハロゲノ、低級アルキル基
又は低級アルコキシ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ’Ｒ６又は−０Ｒ７を表わし、その際Ｒ５
及びＲ６はそれぞれ水素を表わすか又はカルボキシル−
又はスルホン酸基により置換されていてよい低級アルキ
ル基を表わすがもしくは一緒になって場合にまりへテロ
原子により遮断されている炭化水素架橋基を表わし、が
っＲ７は低級アルコキシ基又はポリ低級アルコキシ基に
より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕の化
合物である。

置換基Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の
定義における低級アルキル−もしくは低級アルコキシ基
とは炭素原子１〜７、殊に１〜４個を有する飽和の直鎖
又は分枝鎖の炭化水素基である。メチル−及びエチル−
もしくはメトキシ−及びエトキシ基が特に優れている。

置換基Ｒ７の定義中のポリ低級アルコキシ基は低級アル
コキシ単位２〜５個、殊に２〜６個より成る。

Ｒ１の定義中のアリール基としてはフェニル−又はナフ
チル基が特だ優れている。殊に、Ｒ１の定義中のフルア
ルキル基はアリール部としてフェニル−もしくはナフチ
ル基を含有し、アルキル部は炭素原子１〜５個、蛛に１
〜３個を含有する。アルアルキル基としてはベンジル基
が特忙優れている。

置換基Ｒ１、Ｒ５及びＲ６の定義中の低級アルキクー、
アリール−及びアルアルキル基はそれぞれ数個のカルボ
キシル基及びスルホン酸基により置換されていてよい。

そのような置換基１〜３個を有する基が優れている。

Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の定義中のハロヶ９ンとは弗素、塩
素、臭素及び沃素、殊に塩素と臭素である。

置換基Ｒ５及びＲ６が形成し得る、場合によりヘテロ原
子で遮断されている炭化水素架橋基は殊に炭素原子２〜
５個、特に３〜４個を含有する。炭化水素架橋基は、窒
素、酸素及び硫黄の群類から選択されるヘテロ原子１〜
３個により遮断されていてよい。モルホリン−及びピペ
ラジン基が特に優れている。

一般式■の化合物は新規である。公知方法により製造す
ることができる。一般式Ｉの化合物の優れた製法は、一
般式１［ａ及び■ｂ：ｒ式中Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記
のものを表わす］の化合物を還元しかつアシル化して一
般弐■：Ｒ３Ｒ２ 、〔式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記のものを表わ
す〕の化合物に変換し、場合によりカルボン酸官能基を
反応性カルボン酸訪導基に変換した後で、一般式■： ＢＹ　　　　　（ＩＶ） 〔式中Ｙは前記のものを表わす〕の化合物と反応させ、
引続いてＯ−アシル基を選択的に脱離することを特徴と
する。

一般式１１ａ又はＩｌｂの化合物は、レゾルフィンから
誘導される公知物質であるか又は公知化合物と同様にし
て製造することができる。

その際に有利には、一般式■： 〔式中Ｒ３及びＲ４は前記のものを表わす〕のニトロン
レゾルシン誘導体を一般式■： 〔式中Ｒ２は前記のものを表わす〕のレゾルシン綺導体
と、カッ石及び硫酸の存在において低温で反応させる。

その際にＮ原子が酸素原子を支持するレサズリン誘導体
が生成する。この化合物をアンモニアの存在において亜
鉛末により簡単に一般式１［ａ又は■ｂの化合物に変換
することができる。

一般に、一般式Ｖの化合物と一般式■の化合物との反応
は温度−１０〜５０℃、殊に０〜６０℃で実施する。１
式及び■式の物質を約Ｏ℃で混合し、引続いて反応混合
物を室ｍＫ加温する際に反応は特に穏やかに進行する。

有利に、カッ石の濃度は０．５〜５モル／ｌ、殊に１〜
２モル／ｌにする。硫酸の濃度は０．５〜５モル／ｌ、
殊に１〜６モル／ｌである。

殊Ｋ、生成したレサズリン誘導体の一般式１１ａ又は１
ｂの化合物への還元はアンモニア性溶液中で亜鉛末によ
りＣＮ１ａｔｚｋｉ及びその他共著、’　Ｂａｒ、　Ｄ
ｔｓｃｈ、　Ｃ！ｈｅｍ、　Ｇｏｓ、　　’、２２巻、
３０２０貞（１８８９年）参照〕又は硼水素化ナトリウ
ムにより実施する。有利に、溶剤としては水／アルコー
ル混合液、殊に水１部とメタノール０〜４部とからの混
合液を使用する。還元すべき物質１モルに対し亜鉛末も
しくは硼水素化す）　ＩＪウム１〜５モルを少量ずつ添
加する。

その際に、反応溶液の温度は一１０〜＋６５℃、殊に＋
５〜＋１０℃に保持する。温度範囲を正確に保持するこ
とは明白な反応の進行に必要であることが明らかになっ
た。冷却しないと発熱反応が分離の困難な副生成物をも
たらす。

選択した穏やかな条件下では、一般式Ｖ及び一般式■の
物質の反応は明瞭にかつ良好な収率で進行する。選択し
た合成法は変更可能である。

特に、非対称で置換されているレゾルフィン誘導体の生
成に関して多数の合成法を開（ものである。

一般式■のトリアジル誘導体の製造に当り、初めに一般
式１［ａ及びｌｌｂの相応するレゾルフィン誘導体を例
えば塩化スズ（ＩＩ）又は酢酸クロム（ｆｆ）のような
強還元剤で又は電気化学的に還元する。還元するに当り
、レゾルフィン誘導体を好適な溶剤中の還元剤、殊に５
〜６５チ水性塩酸中の塩化スズ（■）２〜１０当量、殊
に２〜６当量と１０分間乃至１時間加熱する。冷却する
際にジヒげ口化合物が析出する。アシル化は常法で好適
なアシル化剤、例えば無水酢酸、塩化ベンゾイル等で行
なう。一般式■の化合物は単槽法でレゾルフィン誘導体
１１ａ及びｌｌｂの還元的アシル化により製造する。こ
の際に、相応するレゾルフィン誘導体を還元剤２〜６当
量と、アシル化剤の存在において好適な溶剤中で５分間
乃至６時間還流下に加熱するか又は室温で４〜１６時間
攪拌する。

化合物■との反応に当り、■式のカルボン酸をカルボン
酸クロリド、−エステル又は−アンヒドリドのような反
応性カルボン酸誘導体に変換すると有利である。これに
ついては当業者は多数の文献公知の方法を適用すること
ができる。

カルボン酸を例えば塩化オキサリル／ジメチルホルムア
ミド又は塩化チオニル／ジメチルホルムアミＶでカルボ
ン酸クロリドに変換すると特に優れている。

一般式■の化合物はアミンもしくはアルコールであり、
一般式■のカルボン酸銹導体もしくはその反応性誘導体
を例えばジメチルアミノピリジンのようなアシル化触媒
の存在においてカルボン酸アミドもしくは一エステルに
変換する。

一般式ＨＹの特に優れているアミンは極性基を有するも
の、例えばモルホリン、メトキシエチルアミン又はグリ
シンアミ「である。それというのもそれにより相応する
ロイコレゾルフィン誘導体の水溶性が高められるからで
ある。同様にアミノカルボン酸を使用することができる
。

所望の反応に関与していない官能基を常法で保護するの
は有利である。そのような保護されたアミノカルボン酸
の例はグリシン−ｔ−ブチルエステル、グリシンベンジ
ルエステル又はＮ−ＢＯＣ−リシンメチルエステルであ
る。導入した保護基は反応後に再び公知方法で脱離する
。

一般式ＨＹのアルコールとしては、原則的にすべてのア
ルコールが好適である。特に優れているのはジエチレン
グリコール−モノエチルエーテル及びトリエチレングリ
コール−モノエチルエーテル並びに相応するモノメチル
エーテルである。

一般式Ｉの本発明によるＮ−アシル誘導体の製造に当り
、カルボン酸■とアミンもしくはアルコール■との反応
後に両方の０−アシル基を選択的に脱離しなければなら
ない。これは、水と水性溶剤、例えば１，４−ジオキサ
ン、メタノール又はエタノールとからの混合液、殊に水
／１，４−ジオキサン１：１中で亜硫酸ナトリウム２〜
１０モル、殊１ｃ２〜４モルと反応させることにより達
成される。反応温度は２０〜１００℃、殊に８０〜１０
０℃である。これらの反応条件下に特許請求している一
般式■のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフィンを高収率で
製造することができる。

一般式１　ノＮ−アシルージヒｒロレゾルフインはペル
オキシダーゼの存在において過酸化水素により酸化され
て有色及び螢光発生レゾルフィン誘導体釦変換される。

それ故、本発明の他の目的は、一般式■の物質を過酸化
水素（又はペルオキシド様作用物質）、ペルオキシダー
ゼ（又はペルオキシダーゼ活性を有する物質）の検出に
使用することである。

そのような検出反応を介して、相応するオキシダーゼの
存在において酸素と、過酸化水素もしくはペルオキシｒ
機作用化合物の形成下に反応するような物質並びに過酸
化水素もしくはペルオキシｒ機作用化合物を産生ずる系
中の酵素活性を測定することも可能であることは明らか
である。

生成するＮ−アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体の酸
化生成物はＵＶ光度測定及び目視検出以外に特にけい光
測定にも好適である。光度測定法に比べてけい光測定法
の感度が数十パーセント高いので重要である。たいてい
の場合に例えば細胞分化に関して自動測定装置で細胞中
の酵素活性を試験する（細胞叶い光測定法）場合並びに
貫流マイクロフルオロメトリー（Ｄｕｒｃｈｆｌｕβｍ
ｉｋｒｏｆ１ｕｏｒｏｍｅｔｒｉｅ　）により固定化酵
素を分析する場合に叶い光団基質を用いて作業すべきで
ある。他の場合、例えばしばしばペルオキシダーゼで実
施される、試験系の酵素標識の測定（酵素イムノアッセ
イ）で酵素触媒作用の増強効果がけい元口基質の使用に
より著しく強化される。

本発明による一般式■の化合物の酸化生成物のＵＶ−及
び可視範囲における吸光性並びに叶い光強度は中性乃至
弱アルカリ性−範囲において実質的にｐ！（に左右され
ない。試験すべき酵素系に相応する溶液の一値は最大活
性が達成されるように最適化すべきであり、それにより
範囲６．５〜９．５で変動し得るので、吸光性及びけい
光強度の一非依存性は比較的高い感度を達成するために
は攬々の酵素試験系でも非常に重要である。

これに関連して、特許請求したＮ−アシル−ジヒドロレ
ゾルフィン誘導体が前記の…範囲で良好な水溶性を有す
ることは特に顕著である。

それ故、使用した色原体を溶解するために、酵素試験系
に有機溶剤又は洗浄剤を添加する必要はない。とりわけ
、この利点は、基質及び生成物の良好な溶解度が必要で
ありかつしばしば溶剤又は洗浄剤の添加が酵素活性に影
響を与える動力学的酵素試験で作用する。

過酸化水素又はペルオキシド様作用化合物の測定に当り
、一般式Ｉの化合物、ベルオキ−シダーゼ、好適な緩衝
液系並びに場合により他の試薬及び助剤を、測定すべき
物質を含有する試料と混合する。その際に、一般式Ｉの
Ｎ−アシルージヒドロレゾルフィン誘導体が酸化される
。

それにより惹起される反応混合物の吸収性もしくはけい
光強度の変化を光度測定するかもしくはけい光測定する
。標準溶液との直接的な比較又は標準曲線との間接的な
比較により、試料中の被測定物質の含有量が測定される
。動的測定並びに終点測定が可能である。

ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ活性を有す
る化合物の測定に当り、一般式Ｉの化合物、過酸化水素
もしくはペルオキシげ機作用化合物、好適な緩衝液系並
びに場合により他の試薬及び助剤を、被測定物質を含有
する試料と混合する。得られた反応混合物を前記のよう
に更に処理する。

また一般式■の化合物は、酸素と共に、相応するオキシ
ダーゼの存在において過酸化水素又はペルオキシ−機作
用化合物を供給する物質の測定に、又は過酸化水素又は
ペルオキシド様作用化合物を生成する系中の酵素活性の
測定に使用することができる。これらの物質もしくはこ
れらの酵素の測定は上記の方法で、付加的に反応混合物
に相応するオキシダーゼ並びに場合により他の補酵素も
しくは好適な基質を添加して行なう。そのような酵素系
の例としては、グルコースオキシダーゼによるグルコー
スのりゝルコノラクトンへの反応、コレステリンオキシ
ダーゼにヨルコレステリンのコレステノンへの反応、ウ
リカーゼによる尿酸のアラントインへの反応又はグリセ
リンオキシダーゼによるグリセリンのグリセルアルデヒ
ｒへの反応が挙げられる。

体液中のそのような基質もしくは酵素の濃度は、前記の
ように簡単かつ正確に測定することのできる重要な診断
パラメータである。

それ故、本発明の他の目的は、一般式Ｉの化合物を用い
て過酸化水素、ペルオキシげ機作用化合物及び相応する
オキシダーゼの存在において酸素により過酸化水素又は
ペルオキシド様作用化合物を供給する物質の測定法並び
にペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ活性を有する化
合物及び過酸化水素もしくはペルオキシド様作用化合物
を産生する系中の酵素活性を測定する方法である。更に
、本発明は前記の方法を実施するのに好適である試薬に
関する。

過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物もしくはそのよ
うな化合物を供給する物質を検出するための試薬は、一
般式Ｉの本発明によるＮ−アシル−ジヒドロレゾルフィ
ン誘導体１種以上と共にペルオキシダーゼ並びにそれぞ
れのパラメータ検出に必要な他の酵素、好適な緩衝系並
びに他の試薬及び助剤、例えば湿潤剤、安定剤、ガレヌ
ス添加物、骨格ビルダー等を含有する。

ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ活性を有する化合
物もしくは過酸化水素又はペルオキシド様作用化合物を
産生ずる系中の酵素活性を検出するための試薬は、一般
式Ｉの本発明によるＮ−７シル一ジヒドロレゾルフイン
誘導体１種以上と共に過酸化水素もしくはペルオキシド
様作用化合物、場合により必要な基質及び補酵素、好適
な緩衝系並びに場合により他の試薬及び助剤を含有する
。

本発明による試薬は、溶液の形で、凍結乾燥物、粉末混
合物として、試薬錠剤又は好適な担持物質上に施して存
在していてよい。

溶液の形の本発明による試薬は試験に必要な全試薬を含
有すると有利である。溶剤としては、水又は水と水溶性
有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン又
はジメチルホルムアミドとの混合液が該当する。安定性
のために、試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分けて
、試験する際に初めて混合すると有利である。

試薬を凍結乾燥物の形で製造するに当り、試験に必要な
全試薬と共に例えばポリビニルピロリｖンのような骨格
ビルダー及び場合により他の填料、例えば゛マンニット
、ンルビット又はキシリットを含有する溶液を乾燥する
。

粉末混合物又は試薬錠剤の形の試薬は、試験成分に常用
のガレヌス添加物を加えかつ造粒して製造することがで
きる。この稲の添加物は例えばマンニット、ンルビット
又はキシリットのような糖アルコールもしくはポリエチ
レングリコール又はポリビニルピロリタンのような他の
可溶性不活性化合物である。一般に、粉末混合物又は試
薬錠剤は最終Ｎ量的３０〜２００　ｍ９、殊に５０〜８
０１ｎ９を有する。

担持物質としては試験片に関しで知られている紙−１が
ラス−又はプラスチック７リース、網材及び繊維材料か
らの織物又は吸収性の多孔性フィルムもしくはピルを使
用することができる。

試験片の形の試薬を製造するに当り、好適な担持材料、
殊に濾紙、セルロース又は合成ｉＲ維７リースを水、メ
タノール、エタノール又はアセトンのような易揮発性溶
剤中の、一般に試験片の製造に使用される必要な試薬の
溶液で含浸する。これは１つの含浸工程で行なうことが
できる。しかしながらしばしば含浸を数工程で実施する
と有利であり、その際にそれぞれ試薬の成分の一部を含
有する溶成を使用する。例えば、第１工程で緩衝剤及び
他の水溶性添加物を含有する水溶液で含浸し、次にＮ−
アシルージヒドロレゾルフインを含有する溶液で含浸す
る。調製した試験紙はそのままで使用するか又は公知の
ように握りに接着するか又は有利に西ドイツ国特許第２
１１８４５５号明細書によりプラスチックと微細メツシ
ュの網材との間に封入することができる。

可溶性フィルムビルダーからの乾燥試薬を製造するに当
り、重合体から溶液を製造し、この溶液は、ナイフ塗布
、流し塗り、ロール塗り等のような公知の農法によりフ
ィルムを）造し得る程度に粘性である。これらの溶液中
には、試薬、緩衝剤、助剤及び試薬安定剤が混合されて
いる。被覆剤を担体シート上に施し、乾燥させかつこの
仕上がったフィルムを試、＠片に加工する。

一般式ＩのＮ−アシルージヒ２０レゾルフィン誘導体は
免疫学的測定法にも使用することができ、その際にペル
オキシダーゼを指示薬酵素として使用しかつその活性は
免疫反応の実施後に測定すべきである。酵素指示薬反応
によるそのような免疫測定法は当業者に酵素イムノアッ
セイとして知られている。この方法は、蛋白質、ポリサ
ッカＩＪ　）、Ｉ、ホルモン、医薬及び他の低分子物質
の範囲１０−５〜１０−２モル／ｌの濃度を測定するの
に使われる。相分離工程の心安性に応じて均質−と異質
試験操作とを区別する。他の区分は競合−及び非競合試
験原理で行なうことができる。しかしすべての試験原理
は酵素−抗原−もしくは酵素−抗体−結合体により操作
する。酵素指示薬反応は、すべての酵素イムノアッセイ
に共通１７ている。例えば、そのような目的のために好
適な指示薬＃素はペルオキシダーゼである。一般に、そ
のような酵素イムノアッセイにおけるペルオキシダーゼ
の測定は、過酸化水素により酵素で酸化されかつ常法で
尤度測定又は叶い光測定される好適な基質を添加して行
なう。

実施例 次に実施例により、本発明による化合物を合成するため
のいくつかの方法並びに一般式Ｉの１１Ｎ−アシル−ジ
ヒドロレゾルフィン誘導体の使用について詳説する。し
かし本発明はこれらに限定されるものではない。

例　　１ ルポン酸モルホリｒ Ａ）　　レゾルフィン−４−１フルざン酸ニトロンレゾ
ルシン１６ｇ、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１５．５
　！ｑ及びカッ石８．６Ｉをメタノール２０〇−中に懸
濁しかつ０℃に冷却する。

それに濃硫酸１０．６ゴを滴加し、２時間室温で攪拌す
る。沈殿した赤色のレサズリンー４−カルボン酸を濾別
し、メタノールで洗いかつ乾燥させる。

レサズリン銹導体を水２００ゴ及び２５俤−アンモニア
５Ｑｍ／中に取りかつ濾過する。この青色濾液に水冷下
に亜鉛末５０ｇを少量ずつ加えかつ室温に昇温させる。

還元の軽過は間車に薄層クロマトグラフィにより追跡す
ることができる（溶媒：メタノール／酢酸エステル１：
１、珪酸デルプレート）。

反応溶液を濾過し、その後、濾液を氷酢酸及び少量の濃
塩酸で酸性にする。析出したレゾルフィン−４−カルボ
ン酸を濾取しかつ真空中シカベント（５ｉｃａｐｅｎｔ
　）上で乾燥する。

収量：ＩＳ、３３．Ｆ Ｒｆ：０．４（珪酸ｒル；溶媒：ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水４：に１） Ｂ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフィン
−４−カルボン酸 レゾルフィン−４−カルボン酸１２．９．９を氷酢酸３
０ｒＬｌ及び無水酢酸６０−中に取り、塩化スズ（Ｉｆ
　）　２７．６　ｇを加えかつ８０℃で１時間攪拌する
。氷水６００ゴに加え、１時間攪拌しキつ沈殿を濾取す
る。乾燥後に固体をアセトン５００ゴに取る。吸引濾過
し、濾液を蒸発濃縮し、かつ乾燥後に生成物１１．３．
９が得られる。

Ｒ，：０．４６（珪酸デル；溶媒：クロロホルム／メタ
ノール／氷酢酸９二１　：　［１，１）ＩＨ−ＮＭＲ（
ｒ　Ｄ、　）−ＤＭＳＯ）　：δ＝　２．２４．２．２
６及び２．２９（それぞれ８．それぞれ３Ｈ）； ６．９４　（ａａ、　、ｒ　−８，５及び２．２Ｈ２゜
Ｉ　Ｈ）　；　６．９８　（ｄ、　Ｊ　＝２．２Ｈｚ。

１Ｈ）； ７．０４　（ｄ、　：ｆ　＝９　Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　
；　７．６１（ｄ、　　Ｊ−８，５Ｈｚ、　　Ｉ　　Ｈ
）；　　７．６７ｐｐｍ　（ｄ　、　　Ｊ　＝　９　Ｈ
ｚ　、　　Ｉ　　Ｈ）。

Ｃ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフィン
−４−カルボン酸モルホリＶ Ｎ、Ｏ，０−）ＩＪアセチルージヒ−コレゾルフィン−
４−カルボン酸３．８５．９に塩化オキサリル５．４−
を加えかつ０℃に冷却する。それにジメチルホルムアミ
ｒ１滴を加えかつ反応混合物を攪拌下に反応温度忙高め
る。その際にガス発生下に抽出物が溶ける。真空中室温
で蒸発乾固し、乾燥塩化メチレン２０ゴ中ＶＣ３回取り
かつ再び蒸発乾固する。このようにしてＮ、０゜０−ト
リアセチル−ジヒドロレゾルフィン−４−カルポン酸ク
ロリド４ｙが得られ、これは粗製生成物として更に加工
する。この酸塩化物を塩化メチレン５０ゴ中に溶解する
。これにトリエチルアミン３．１．ｄ、引続いてモルホ
リン１．２コを滴加する。２時間攪拌した後で、反応溶
液を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び稀塩酸で洗い
、塩化メチレン相を硫酸マグネシウム上で乾燥しかつ蒸
発濃縮する。残渣をエタノールから結晶させる。

収量：　８．１．９ ”Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ、３−ＤＭＳＯ）：δ−２，２０−
２，２１（３ｓ　。

９Ｈ）　；　３．５０−３．８０　（ｍ、　　８Ｈ）　
；６．７０　−　７．０５　　（ｍ　ｒ　　　２　　Ｈ
）　　＊　　７．１２（ｄｐ　　Ｊ−２”ｚｓ　　Ｉ　
Ｈ）　ｓ　７−５４　（ｄ。

Ｊ−９ａｚ　ｓ　　Ｉ　Ｂ　）　＊ ７．６０ｐｐｍ　（ｄ、　　Ｊ＝９Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）
。

Ｄ）　　Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフィン−４−カ
ルボン酸モルホリＶ Ｎ、Ｏ，０−）ＩＪアセチルージヒ−コレゾルフィン−
４−カルボン酸モルホリ）Ｆ　２．０２　＃をジオキサ
ン／水１：１　５Ｑｍｌ中で亜硫酸ナトリウム（無水）
１．２．９と還流下に加熱する。蒸発濃縮し、アセトン
５０１ｄに取り、濾過しかつ濾液を再度蒸発濃縮する。

珪酸ゲルでクロマトグラフィ処理をしく溶離剤クロロホ
ルム／メタノール８：２）、生成物１．０μを得る。

Ｒ，：０．８（珪酸ｒル；溶媒：クロロホルム／メタノ
ール８：２） １’Ｈ−ＮＭＲ（〔Ｄ、）−ＤＭＳＯ）　：δ−２，２
０（ａ、　　３Ｈ）　：３．１０−３−１６　（ｍ、　
　２）１　）　；　３．４−３．８　（ｍ、　　６Ｈ）
　：　６．４Ｂ　（ｄ、　　；ｒ　−２，４Ｈｚ、ＩＨ
）：６．５３（ｄｄ、Ｊ−９，８及び２−４　Ｈ２ｙ　
Ｉ　Ｈ）　：　６４２　（ａｔＪ画９　Ｈｍ　ｐ　　Ｉ
　Ｈ）　＃　７−３０　（ｄ　ｙ　　Ｊ雲９−８Ｈｚ、
　　Ｉ　Ｈ）　； ７．３３で（１，、Ｔｍ−９，８Ｈｆｆ、　　Ｉ　Ｈ’
）　：９．６２　（ａ、　　１Ｈ）　；　９．９１　ｐ
ｐｍ　（ｓ。

ＩＨ） ＵＶ、／’Ｖ工Ｓ（０゜１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，５）：　λｍａｚ−２Ｄ　ＯｎｍＨ２Ｏ２／ペル
オキシダーゼで酸化後：λ　　−５７５ｎｍ ｍａｘ 叶い光放射　　　：λ　　−５９０ｎｍａｘ 同様にして次のものが得られる； フィン−４−カルボン酸モルホリド ２−メチル−４−ニトロソレゾルシンかう６−メチルー
レサズリンー４−カルボン酸及び６−メチル−レゾルフ
ィン−４−カルボン酸ヲ介して ｌＨ−ＮＭＲ（ｒＤ、　］−ＤＭＳＯ）：δ２．１７及
び２．２３　（それぞれ８ｒ　６Ｈ）　：　３−５−３
．８　（ｍ、８Ｈ）：６．２０　　（ｄ、　　：Ｊ−８
，６Ｈｚ、　　Ｉ　　Ｈ）　　：６．６６　　（ｄ、　
　Ｊ＝８．８Ｈｚ、　　Ｉ　　Ｈ）；６．７９　　（ｄ
　ｓ　　Ｊ−８，８Ｈｚ　、　　１　　１　　Ｈ）　ニ
ア、３５　ｐｐｍ　　（ａ、　　、ｒ　−８，８Ｈｚ、
　　Ｉ　　Ｈ）ｕｖ／’ｖｘｓ　（０，１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝顯、ｐＨ８，０１ Ｈ２０□／ペルオキシダーゼによる酸化後　　　　　　
：　λ　　　−５８５ｎｍａｘ ４−エチル−６−ニトロソレゾルシンかう８−エチルー
レサズリンー４−カルボン酸及び８−ニチルーレゾルフ
イン−４−カルボン酸を介して 薄層クロマトグラフィ（珪酸ケ９ル、溶媒：酢酸エステ
ル’）　：　Ｒｆ−０゜３８ １７Ｖ／Ｖ工ｓ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ８，０）： Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼによる酸化後：：λｍａｍ
ミニ−７５ｎｍ けい光放射　　　　：λｍａｘ　”　５９８　ｎｍｃ）
Ｎ−アセチル−８−クロルレゾルフィン−１−カルボン
酸モルホリｒ ４−クロル−６−ニトロンレゾルシンかう８−クロルー
レサズリン−１−カルボン酸及び８−クロル−レゾルフ
ィン−１−カルボンＭ　ｋ　介して ＵＶ／Ｖ工Ｓ　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐｉ
−１８，０）： ａ２ｏ２／ペルオキシダーゼで酸（１ ：λ　　−５７０ｎｍ ｍａｘ　、 ２．４−ジクロル−６−二トロンレゾルシンから６，８
−ジクロルーレサズリン−４−カルポン酸及び６，８−
ジクロル−レゾルフィン−４−カルボン酸を介して ４−−７”ロム−６−二トロンレゾルシンかう８−プロ
ムーレサズリン−４−カルボン酸及び８−フロム−レゾ
ルフィン−４−、’フルボン酸ヲ介して 例　　２ Ａ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルージヒげコレゾルフィン
−４−カルボン酸−１−ブトキシカルボニルメチルアミ
ｆ Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチル−ジヒドロレゾルフィン−４
−カルボン酸（例１ｂ）により製造）１０．７．９を例
１　ｃ）と同様に塩化オキサリル２７１１Ｌｌにより酸
クロリドに変換する。

酸クロリｒを塩化メチレン１００ゴ中に取る。

塩化メチレン２０ゴ中に溶解したグリシン−ｔ−プチル
エステル７．８ｇを滴加しかつ室温で６時間攪拌する。

飽和炭酸水素ナトリウム、１Ｎ−クエン酸及び水で洗浄
する。硫酸マグネシウム上で乾燥後、有機相を蒸発ｇ縮
し、少量の酢酸エステル中に取り、珪酸ゲルを介して溶
離剤として酢酸エステルを用いて濾過する。明るい帯褐
色の生成物１１ｇが得られる。

Ｒ，（薄層クロマトグラフィ：珪酸ゲル、溶媒：酢酸エ
ステル”）　：　０．６８ Ｂ）　　Ｎ−アセチルージヒＶロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸−ｔ−ブトキシカルボニルメチルアミＶ Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフィン−４
−カルボン酸−ｔ−ブトキシカルボニルメチルアミド９
Ｉを無水亜硫酸ナトリウム４．６１１とジオキサン／水
１：１°　１００Ｉｎｌ中で６０分間還流下に加熱する
。蒸発濃縮し、残渣をアセトン２５０ゴ中に取り、濾過
しかつ濾液を蒸発濃縮する。エタノールからの結晶によ
り生成物４．５ｇが得られる。そのうちの１．４９を珪
酸ゲルで塩化メチレン／メタノール２０：１によりクロ
マトグラフィ処理をする。

収量：０．９１ Ｒｆ　：０．７７（薄層クロマトグラフィ：珪酸デル、
溶媒：酢酸エステル） ＩＨ−ＮＭＲ（ｒＤ、　］−ＤＭＳＯ）　：δ＝　１．
４９　（θ、９Ｈ）：２．２０　（ｓ、　３Ｈ）　：　
４．０７　（ｄ。

、Ｔ−６Ｈｚ、　２Ｈ）　；　６．６１　（ｄｄ。

、Ｔ　＝　９．８及び２．４　Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　：
　６．６９（ａ、　　Ｊ＝９．８　Ｈｚ、　　ｆ　Ｈ）
　；６．８６　（ｄ、　Ｊ−２，４Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）
　ニア−３５（ｄｐ　Ｊ−９，８Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）７
．５１　（ｄ、　、Ｔ−９，３Ｈｚ、　１Ｈ）　；８．
７７　（ｔ、広幅ｐ　　Ｊ−６Ｈｚ　ｓ　　Ｉ　Ｈ）　
：９．７４　（θ）　　Ｉ　Ｅ　）　；　１２−６１　
（ｓ、ＩＨ）。

０）　　Ｎ−７セチル〜ジヒρロレゾルフィン−４−カ
ルボン酸−（カルヴキシメチル）アミドＮ−ア七チルジ
ヒドロレゾルフィン−４−カルボン酸−ｔ−ブトキシカ
ルボニルメチルアミド５００〜をトリフルオル酢酸１０
ｍε中に６０分間放置する。

収量：４１０〜 Ｒｆ　：０．７９（薄層クロマトグラフィ：珪酸ゲル、
溶ｔ＆：　ｎ−ブタノール／氷酢酸／水４：１　：１　
’） ＬＨ−ＮＭＲ：　（〔Ｄ６］−ＤＭ８０）：δ−２−２
０（ａ　ｐ　　３　Ｈ）　：４．０８　（ｄ、　　Ｊ−
６Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　：６．６１　（ａａ　、　Ｊ−
９，８及び２．４　Ｈｚ　。

Ｉ　Ｈ）　；　６−６９　（ｄ、　　Ｊ　−９，８Ｈｚ
。

１Ｈ）； ２Ｈ）； ８−８１（ｔ、広幅、Ｊ−６Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）；９．７４
（ｓ、広幅、ＩＨ）； １２・５ｐ１）ｍ（ｓ、ＩＨ）。

ＵＶ／Ｉ／工８　（０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，５）　　　：　λｍａｍミニ−０４ｎｍＨ２Ｏ２
／ペルオキシダーゼで酸化後 ：λｍａｘ　−５７１ｎｍ 叶い光放射　　　　　：λ。ａＸ虐５８８　ｎｍ同様に
して次のものが得られるニ ルアミげ Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルージヒｐロレゾルフイン−４
−カルボン酸及びサルコシン−ｔ−ブチルエステルから
Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルージヒげコレゾルフィン−４
−カルボン酸−（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−メ
チルアミドを介して Ｒｆ　：０．７７（薄層クロマトグラフィ：珪酸ｒル、
溶媒：クロロホルム／メタノール／氷酢酸９　：　１　
：　０．１　） Ｎ−アセチルージヒーロレゾルフイン−４−カルボン酸
−（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−メチルアミドを
介して Ｒ，：０．５６（薄層クロマトグラフィ：上記参照） Ｒｆ　：０．１０（薄層クロマトグラフィ：上記参照） υＶ／Ｖ工Ｅｌ　（Ｑ、ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液、
ｐＨ７，５）　　　：　λｍａｚ　−２０４ｎｍＨ２Ｏ
２／ペルオキシダーゼで酸化後：λｍａｘ　−５７４ｎ
ｍ フィン−４−カルボン酸−（カルボキシメチル）−メチ
ルアミｒ Ｒ，：　０．６２’（薄層クロマトグラフィ：上記参照
） ＵＶ／７１８　（’０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液、
ｐＨ７，５）　　：λｍａｗ　−２０５ｎｍＨ２Ｏ２／
ペル′オキシダーゼで酸化後：λｍａｍミニ−８５ｎｍ ｃ）Ｎ−アセチル−８−クロルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボン酸−（カルボキシメチル）−アミｒ 例２に挙げた化合物と同様にして製造する。

例　　３ 過酸化水素の測定 トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタン
スルホネート０．１ミリモル／ｌ、ト　リ　ト　ン　（
Ｔｒｉｔｏｎ　　）　　Ｘ　　１　０　０　　　　　　
０−５　９６Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフィン−４
一カルボン酸モルホリｒ　２．５ミリモル／１ペルオキ
シダーゼ　　　　　　　３Ｕ／ｌ１１７？より成る溶液
にＨ２０□含量が既知の溶液を異なる量でピペット添加
し、６０分間放置しかつ５７８　ｎｍで吸光度を測定す
る。

第１図には、測定溶液中のＨ２Ｏ２ＩＩＩ度に対する５
　７８　ｎｍでの吸光度がプロットされている。

過酸化水素濃度と吸光度との間に良好な直線性が得られ
る。

このようにして得られた検量線を用いて未知のＨ２Ｏ２
含蓋の試料中のＨ２０□濃度を測定することもできる。

例　　４ 溶ａ１ニドリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミ
ンエチルスルホネート １００ミリモル／ｌ、Ｐ）（８ ト　リ　ト　ンＸ　　１　０　０　　　　　　　０．５
　　タロＮ−アセチルージヒドロレゾルフイ ン−４−カルボン酸モルホリｐ ２．５ミリモル／ｌ 塩化ナトリウム　１５０ミリモル／ｌ ナトリウムコレート　　５ミリモル／１ＫＤＴＡ　　　
　　　　　Ｏ，５ミリモル／ｌカリウムへキサシアノ７
エラート（Ｉｆ）１０μモル／ｌ アジ化ナトリウム　　　　　０．２係 ペルオキシダーゼ　　　　３Ｕ／ゴ リパーゼ　　　　　　　　２Ｕ／ｒＩＬｌアスコルベー
トオキシダーゼ １０Ｕ／ｄ クレアチナーゼ　　　　６．５Ｕ／ＩＲＩサルコシンオ
キシダーゼ６．５　Ｕ　／ｍクレアチニナーゼ　　　２
５Ｕ／ゴ 溶液２：クレアチニン標準溶液　２■／１００７ｄ溶液
１１−中に溶液２を１０．２０．６０．４０及び５０μ
！で加える。吸光度を時間との相関関係で追跡する。こ
のようにして第２図による曲線が得られ、これは検量線
として未知のクレアチニン濃度の測定に適用される。

例　　５ 溶液１：バルビツル酸カリウム １２０ミリモル／ｌ リン酸カリウム緩衝液 １８．２ミリモル／ｌ、ＰＨ８，６ ８−アニリノ−１−ナフタリンスル ホン酸　　　　　１．２ミリモル／ｌ 牛血清アルデミン　　　　　０．２係 チロキシン−ペルオキシダーゼ結合 体　　　　　　　　　　　　　　　０．５　Ｕ　／　Ｊ
溶液　２　：　ト　リ　ス／　Ｈｏｔ １００ミリモル／Ａ’、ｐＨ８，０ 過硼酸ナトリウム　６．２ミリモル／ｊＮ−アセチルー
ジヒドロレゾルフィ ン−４−カルボン酸モルホリｒ １．８２ミリモル／１ 抗チロキシン抗体で塗布したプラスチック試験管（結合
能：試験管１本当りチロキシン約２５〜）中にチロキシ
ン溶！０．０２ｍ／及び溶液１１１を加えかつ６０分間
２０〜２５℃で恒温保持する。試験管の内容物を吸引濾
過し、水で１回洗浄し、再度吸引濾過する。その後、溶
液２と共に６０分間恒温保持し、十分に混合しかつ５７
８　ｎｍで吸光度を測定する。

第３図に得しれた検量線が示されている。

そのような検量線により試料の未知のチロキシン含量を
測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、５７８　ｎｍにおける測定溶液中のＨ２Ｏ２
＠度と吸光度との相関関係を示す検量線図、第２図は、
クレアチニン濃度と時間との相関関係を示す検量線図、
第６図は５７８　ｎｍにおけるチロキシン含量と吸光度
との相関関係な第１図 敷廻値掻阜（ｍｇ／ｄｌ） 第３図 Ｔ４　Ｐｇ／ｄｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体。 ２、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす］のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体を製造する方法
   において、一般式IIａ及びIIｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ）■▲数式、
   化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は前記のものを表わす
   〕の化合物を還元かつアシル化して一般式III： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は前記のもの
   を表わす〕の化合物に変換し、場合によりカルボン酸官
   能基を反応性カルボン酸誘導体に変換した後で最後に一
   般式IV： ＨＹ（IV） 〔式中Ｙは前記のものを表わす〕の化合物と反応させ、
   引続いてＯ−アシル基を選択的に脱離することを特徴と
   するＮ−アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体の製法。 ３、選択的加水分解を亜硫酸ナトリウムで行なう特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４、過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物もしくは相
   応するオキシダーゼの存在において酸素により過酸化水
   素又はペルオキシド様作用化合物を供給する物質を測定
   する方法において、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体１種又は数種、
   ペルオキシダーゼ並びに場合により必要な他の酵素、好
   適な緩衝液系並びに場合により他の試薬及び助剤を、被
   測定物質を含有する試料と混合しかつ吸収もしくはけい
   光の変化を測定することを特徴とする過酸化水素、ペル
   オキシド様作用化合物及びこれらを供給する化合物を測
   定する方法。 ５、ペルオキシダーゼ並びに場合により必要な他の酵素
   、色原体及び／又はけい光団基質１種又は数種、好適な
   緩衝液系並びに場合により他の常用の試薬及び助剤を含
   有する、過酸化水素、ペルオキシド様作用物質もしくは
   相応するオキシダーゼの存在において酸素により過酸化
   水素又はペルオキシド様作用化合物を供給する物質を検
   出するための試薬において、色原体及び／又はけい光団
   基質として一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体が含有されてい
   ることを特徴とする過酸化水素、ペルオキシド様作用物
   質及びこれらを供給する化合物を測定するための試薬。 ６、付加的な助剤として湿潤剤、安定剤、ガレヌス添加
   物、有機酸及び／又は骨格ビルダーを含有してよい特許
   請求の範囲第５項記載の試薬。 ７、溶液の形で、錠剤として、凍結乾燥物として、粉末
   混合物として又は好適な担持物質上に施して使用される
   特許請求の範囲第５項又は第６項記載の試薬。 ８、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ活性を有する
   化合物もしくは過酸化水素もしくはペルオキシド様作用
   化合物を産生する系中の酵素活性を測定する方法におい
   て、一般式 I ：▲数式、化学式、表等があります▼（
   I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体１種又は数種、
   過酸化水素もしくはペルオキシド様作用化合物、場合に
   より必要な基質及び補酵素、好適な緩衝液系並びに場合
   により他の試薬及び助剤を被測定物質を含有する試料と
   混合しかつ吸収もしくはけい光の変化を測定することを
   特徴とするペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ−及
   び酵素活性を測定する方法。 ９、過酸化水素もしくはペルオキシド様作用物質、色原
   体及び／又はけい光団基質１種又は数種、場合により必
   要な補酵素、好適な緩衝液系並びに場合により他の常用
   の試薬及び助剤を含有する、ペルオキシダーゼ、ペルオ
   キシダーゼ活性を有する化合物もしくは過酸化水素もし
   くはペルオキシド様作用化合物を産生する系中の酵素活
   性を測定するための試薬において、色原体及び／又はけ
   い光団基質として、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１はカルボキシル−又はスルホン酸基により
   置換されていてよい低級アルキル−、アリール−又はア
   ルアルキル基を表わし、 Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＲ＾４は同じか又は異なつていてよ
   く、水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコキ
   シ基を表わし、 Ｙは基−ＮＲ＾５Ｒ＾６又は−ＯＲ＾７であり、その際
   にＲ＾５及びＲ＾６はそれぞれ水素を表わすか又はカル
   ボキシル−又はスルホン酸基により置換されていてよい
   低級アルキル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテ
   ロ原子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表わ
   し、かつ Ｒ＾７は低級アルコキシ−又はポリ低級アルコキシ基に
   より置換されていてよい低級アルキル基を表わす〕のＮ
   −アシル−ジヒドロレゾルフィン誘導体が含有されてい
   ることを特徴とするペルオキシダーゼ及びペルオキシダ
   ーゼ−及び酵素活性を測定する試薬。 １０、付加的な助剤として湿潤剤、安定剤、ガレヌス添
   加物、有機酸及び／又は骨格ビルダーを含有してよい特
   許請求の範囲第９項記載の試薬。 １１、溶液の形で、錠剤として、凍結乾燥物として、粉
   末混合物として又は好適な担持物質上に施して使用され
   る特許請求の範囲第９項又は第１０項記載の試薬。