JPH0354938B2 - - Google Patents

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JPH0354938B2
JPH0354938B2 JP61173992A JP17399286A JPH0354938B2 JP H0354938 B2 JPH0354938 B2 JP H0354938B2 JP 61173992 A JP61173992 A JP 61173992A JP 17399286 A JP17399286 A JP 17399286A JP H0354938 B2 JPH0354938 B2 JP H0354938B2
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C07D265/38—[b, e]-condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｎ−アシル−ジヒドロレゾルフイン
誘導体及びその製法に関する。
従来の技術 ペルオキシダーゼの触媒作用下に行なわれる過
酸化水素又はペルオキシド様作用物質と酸化指示
薬との反応は分析化学において特に重要である。
それは過酸化水素又はペルオキシド様作用化合物
並びにペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活
性を有する物質、例えばヘモグロビンの検出ばか
りでなく、相応するオキシダーゼの存在において
酸素と、過酸化水素又はペルオキシド様作用化合
物の形成下に反応する一連の物質の測定及びこれ
らのオキシダーゼの測定を可能にする。例として
若干の化合物が挙げられていて、カツコ内は相応
するオキシダーゼである： グルコース（グルコースオキシダーゼ）、ガラ
クトース（ガラクトースオキシダーゼ）、Ｄ−ア
ミノ酸（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ）、コレステ
リン（コレステリンオキシダーゼ）、キサンチン
（キサンチンオキシダーゼ）、尿酸（ウリカーゼ）、
グリセリン（グリセリンオキシダーゼ）、ピルベ
ート（ピルベートオキシダーゼ）、サルコシン
（サルコシンオキシダーゼ）。
一般に、そのような測定は、過酸化水素をペル
オキシダーゼの存在において色原体と化学量論的
に反応させて色素に変換して行なう。反応混合物
の吸収を光度測定し、かつそれは反応した過酸化
水素、従つて測定すべき化合物の量の尺度であ
る。
殊に、検出反応はキユベツト中か又は乾式試薬
担体により実施する。例えば後者の場合、定量は
光度計により透過光測定を介して、拡散反射光度
計により拡散反射測定を介して又は比較色を用い
て視覚的に比較することにより行なう。
更に、ペルオキシダーゼ検出は免疫学的試験
法、例えばELISA（酵素結合免疫吸着検定：ｅ
nzyme ｌinked ｉmmunoｓorbent ａssay）
で必要であり、その際にペルオキシダーゼが標識
酵素として使われる。一般に、そのような免疫学
的試験法ではペルオキシダーゼ濃度は＜10-5Mの
程度である。
文献には、過酸化水素又はペルオキシダーゼを
検出する指示薬として使用することのできる、前
記の方法のための多数の化合物が公知である。例
として次のものが挙げられる：ベンジジン及びベ
ンジジン誘導体、ジクロルフエノールインドフエ
ノール、アミノカルバゾールもしくは４−アミノ
アンチピリン又は類縁物質とフエノール、ナフト
ール、アニリン誘導体又は他のカツプリング成分
との酸化的カツプリングの生成物として生じる色
素。
過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物又はペ
ルオキシダーゼを検出するために多数のレドツク
ス指示薬が知られているが、広範な、即ち多種多
様の酵素試験系で使用することができ、酵素試験
でたいていの場合に使用されるほぼ中性乃至弱ア
ルカリ性のPH範囲でPHに左右されない高い感度を
有しかつ例えばUV光度測定、視覚的及びけい光
測定のような種々の方法に非常に好適であるよう
な化合物が今なお求められている。
発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、前記の要求を満足する好適な
ペルオキシダーゼ基質を開示することであつた。
この課題は、本発明による新規のＮ−アシル−ジ
ヒドロレゾルフイン誘導体により解決される。
問題点を解決するための手段 それ故、本発明の目的は、一般式： 〔式中R1は低級アルキル基を表わし、 R2、R3及びR4は同じか又は異なつていてよく、
水素、ハロゲン、低級アルキル基又は低級アルコ
キシ基を表わし、 Ｙは基−NR5R6を表わし、その際 R5及びR6はそれぞれ水素を表わすか又はカル
ボキシル基により置換されていてよい低級アルキ
ル基を表わすかもしくは一緒になつて場合により
ヘテロ原子により遮断されている炭化水素架橋基
を表わす］の化合物である。
置換基R1、R2、R3、R4、R5及びR6の定義にお
ける低級アルキル−もしくは低級アルコキシ基と
は炭素原子１〜７、殊に１〜４個を有する飽和の
直鎖又は分枝鎖の炭化水素基である。メチル−及
びエチル−もしくはメトキシ−及びエトキシ基が
特に優れている。
置換基R5及びR6の定義中の低級アルキル基は
それぞれ数個のカルボキシル基により置換されて
いてよい。そのような置換基１〜３個を有する基
が優れている。
R2、R3及びR4の定義中のハロゲンとは弗素、
塩素、臭素及び沃素、殊に塩素と臭素である。
置換基R5及びR6が形成し得る、場合によりヘ
テロ原子で遮断されている炭化水素架橋基は殊に
炭素原子２〜５個、特に３〜４個を含有する。炭
化水素架橋基は、窒素、酸素及び硫黄の群類から
選択されるヘテロ原子１〜３個により遮断されて
いてよい。モルホリン−及びピペラジン基が特に
優れている。
一般式の化合物は新規である。公知方法によ
り製造することができる。一般式の化合物の優
れた製法は、一般式ａ及びｂ： 〔式中R2、R3及びR4は前記のものを表わす〕
の化合物を還元しかつアシル化して一般式： 〔式中R1、R2、R3及びR4は前記のものを表わ
す〕の化合物に変換し、場合によりカルボン酸官
能基を反応性カルボン酸誘導体に変換した後で、
一般式： HY （） 〔式中Ｙは前記のものを表わす〕の化合物と反
応させ、引続いてＯ−アシル基を選択的に脱離す
ることを特徴とする。
一般式ａ又はｂの化合物は、レゾルフイン
から誘導される公知物質であるか又は公知化合物
と同様にして製造することができる。
その際に有利には、一般式： 〔式中R3及びR4は前記のものを表わす〕のニ
トロソレゾルシン誘導体を一般式： 〔式中R2は前記のものを表わす〕のレゾルシ
ン誘導体と、カツ石及び硫酸の存在において低温
で反応させる。その際にＮ原子が酸素原子を支持
するレサズリン誘導体が生成する。この化合物を
アンモニアの存在において亜鉛末により簡単に一
般式ａ又はｂの化合物に変換することができ
る。
一般に、一般式の化合物と一般式の化合物
との反応は温度−10〜50℃、殊に０〜30℃で実施
する。式及び式の物質を約０℃で混合し、引
続いて反応混合物を室温に加温する際に反応は特
に穏やかに進行する。有利に、カツ石の濃度は
0.5〜５モル／、殊に１〜２モル／にする。
硫酸の濃度は0.5〜５モル／、殊に１〜３モ
ル／である。
殊に、生成したレサズリン誘導体の一般式ａ
又はｂの化合物への還元はアンモニア性溶液中
で亜鉛末により〔Nietzki及びその他共著、“Ber.
Dtsch.Chem.Ges.”、22巻、3020頁（1889年）参
照〕又は硼水素化ナトリウムにより実施する。有
利に、溶剤としては水／アルコール混合液、殊に
水１部とメタノール０〜４部とからの混合液を使
用する。還元すべき物質１モルに対し亜鉛末もし
くは硼水素化ナトリウム１〜５モルを少量ずつ添
加する。その際に、反応溶液の温度は−10〜＋35
℃、殊に＋５〜＋10℃に保持する。温度範囲を正
確に保持することは明白な反応の進行に必要であ
ることが明らかになつた。冷却しないと発熱反応
が分離の困難な副生成物をもたらす。
選択した穏やかな条件下では、一般式及び一
般式の物質の反応は明瞭にかつ良好な収率で進
行する。選択した合成法は変更可能である。特
に、非対称で置換されているレゾルフイン誘導体
の生成に関して多数の合成法を開くものである。
一般式のトリアシル誘導体の製造に当り、初
めに一般式ａ及びｂの相応するレゾルフイン
誘導体を例えば塩化スズ（）又は酢酸クロム
（）のような強還元剤で又は電気化学的に還元
する。還元するに当り、レゾルフイン誘導体を好
適な溶剤中の還元剤、殊に５〜35％水性塩酸中の
塩化スズ（）２〜10当量、殊に２〜６当量と10
分間乃至１時間加熱する。冷却する際にジヒドロ
化合物が析出する。アシル化は常法で好適なアシ
ル化剤、例えば無水酢酸、塩化ベンゾイル等で行
なう。一般式の化合物は単槽法でレゾルフイン
誘導体ａ及びｂの還元的アシル化により製造
する。この際に、相応するレゾルフイン誘導体を
還元剤２〜６当量と、アシル化剤の存在において
好適な溶剤中で５分間乃至３時間還流下に加熱す
るか又は室温で４〜16時間撹拌する。
化合物との反応に当り、式のカルボン酸を
カルボン酸クロリド、−エステル又は−アンヒド
リドのような反応性カルボン酸誘導体に変換する
と有利である。これについては当業者は多数の文
献公知の方法を適用することができる。カルボン
酸を例えば塩化オキサリル／ジメチルホルムアミ
ド又は塩化チオニル／ジメチルホルムアミドでカ
ルボン酸クロリドに変換すると特に優れている。
一般式の化合物はアミンもしくはアルコール
であり、一般式のカルボン酸誘導体もしくはそ
の反応性誘導体を例えばジメチルアミノピリジン
のようなアシル化触媒の存在においてカルボン酸
アミドもしくは−エステルに変換する。
一般式HYの特に優れているアミンは極性基を
有するもの、例えばモルホリン、メトキシエチル
アミン又はグリシンアミドである。それというの
もそれにより相応するロイコレゾルフイン誘導体
の水溶性が高められるからである。同様にアミノ
カルボン酸を使用することができる。所望の反応
に関与していない官能基を常法で保護するのは有
利である。そのような保護されたアミノカルボン
酸の例はグリシン−ｔ−ブチルエステル、グリシ
ンベンジルエステル又はＮ−BOC−リシンメチ
ルエステルである。導入した保護基は反応後に再
び公知方法で脱離する。
一般式HYのアルコールとしては、原則的にす
べてのアルコールが好適である。特に優れている
のはジエチレングリコール−モノエチルエーテル
及びトリエチレングリコール−モノエチルエーテ
ル並びに相応するモノメチルエーテルである。
一般式の本発明によるＮ−アシル誘導体の製
造に当り、カルボン酸とアミンもしくはアルコ
ールとの反応後に両方のＯ−アシル基を選択的
に脱離しなければならない。これは、水と水性溶
剤、例えば１，４−ジオキサン、メタノール又は
エタノールとからの混合液、殊に水／１，４−ジ
オキサン１：１中で亜硫酸ナトリウム２〜10モ
ル、殊に２〜４モルと反応させることにより達成
される。反応温度は20〜100℃、殊に80〜100℃で
ある。これらの反応条件下に特許請求している一
般式のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフインを高
収率で製造することができる。
一般式のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフイン
はペルオキシダーゼの存在において過酸化水素に
より酸化されて有色及び螢光発生レゾルフイン誘
導体に変換される。
それ故、本発明の他の目的は、一般式の物質
を過酸化水素（又はペルオキシド様作用物質）、
ペルオキシダーゼ（又はペルオキシダーゼ活性を
有する物質）の検出に使用することである。その
ような検出反応を介して、相応するオキシダーゼ
の存在において酸素と、過酸化水素もしくはペル
オキシド様作用化合物の形成下に反応するような
物質並びに過酸化水素もしくはペルオキシド様作
用化合物を産生する系中の酵素活性を測定するこ
とも可能であることは明らかである。
生成するＮ−アシル−ジヒドロレゾルフイン誘
導体の酸化生成物はUV光度測定及び目視検出以
外に特にけい光測定にも好適である。光度測定法
に比べてけい光測定法の感度が数十パーセント高
いので重要である。たいていの場合に例えば細胞
分化に関して自動測定装置で細胞中の酵素活性を
試験する（細胞けい光測定法）場合並びに貫流マ
イクロフルオロメトリー
（Durchfluβmikrofluorometrie）により固定化酵
素を分析する場合にけい光団基質を用いて作業す
べきである。他の場合、例えばしばしばペルオキ
シダーゼでで実施される、試験系の酵素標識の測
定（酵素イムノアツセイ）で酵素触媒作用の増強
効果がけい光団基質の使用により著しく強化され
る。
本発明による一般式の化合物の酸化生成物の
UV−及び可視範囲における吸光性並びにけい光
強度は中性乃至弱アルカリ性PH範囲において実質
的にPHに左右されない。試験すべき酵素系に相応
する溶液のPH値は最大活性が達成されるように最
適化すべきであり、それにより範囲6.5〜9.5で変
動し得るので、吸光性及びけい光強度のPH非依存
性は比較的高い感度を達成するためには種々の酵
素試験系でも非常に重要である。
これに関連して、特許請求したＮ−アシル−ジ
ヒドロレゾルフイン誘導体が前記のPH範囲で良好
な水溶性を有することは特に顕著である。それ
故、使用した色原体を溶解するために、酵素試験
系に有機溶剤又は洗浄剤を添加する必要はない。
とりわけ、この利点は、基質及び生成物の良好な
溶解度が必要でありかつしばしば溶剤又は洗浄剤
の添加が酵素活性に影響を与える動力学的酵素試
験で作用する。
過酸化水素又はペルオキシド様作用化合物の測
定に当り、一般式の化合物、ペルオキシダー
ゼ、好適な緩衝液系並びに場合により他の試薬及
び助剤を、測定すべき物質を含有する試料と混合
する。その際に、一般式のＮ−アシル−ジヒド
ロレゾルフイン誘導体が酸化される。それにより
惹起される反応混合物の吸収性もしくはけい光強
度の変化を光度測定するかもしくはけい光測定す
る。標準溶液との直接的な比較又は標準曲線との
間接的な比較により、試料中の被測定物質の含有
量が測定される。動的測定並びに終点測定が可能
である。
ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ活
性を有する化合物の測定に当り、一般式の化合
物、過酸化水素もしくはペルオキシド様作用化合
物、好適な緩衝液系並びに場合により他の試薬及
び助剤を、被測定物質を含有する試料と混合す
る。得られた反応混合物を前記のように更に処理
する。
また一般式の化合物は、酸素と共に、相応す
るオキシダーゼの存在において過酸化水素又はペ
ルオキシド様作用化合物を供給する物質の測定
に、又は過酸化水素又はペルオキシド様作用化合
物を生成する系中の酵素活性の測定に使用するこ
とができる。これらの物質もしくはこれらの酵素
の測定は上記の方法で、付加的に反応混合物に相
応するオキシダーゼ並びに場合により他の補酵素
もしくは好適な基質を添加して行なう。そのよう
な酵素系の例としては、グルコースオキシダーゼ
によるグルコースのグルコノラクトンへの反応、
コレステリンオキシダーゼによるコレステリンの
コレステノンへの反応、ウリカーゼによる尿酸の
アラントインへの反応又はグリセリンオキシダー
ゼによるグリセリンのグリセルアルデヒドへの反
応が挙げられる。体液中のそのような基質もしく
は酵素の濃度は、前記のように簡単かつ正確に測
定することのできる重要な診断パラメータであ
る。
それ故、本発明の一般式の化合物を用いて過
酸化水素、ペルオキシド様作用化合物及び相応す
るオキシダーゼの存在において酸素により過酸化
水素又はペルオキシド様作用化合物を供給する物
質を測定し並びにペルオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ活性を有する化合物及び過酸化水素もしく
はペルオキシド様作用化合物を産生する系中の酵
素活性を測定することができる。更に、本発明に
よる式の化合物を含有する前記の方法を実施す
るのに好適である試薬が得られる。
過酸化水素、ペルオキシド様作用化合物もしく
はそのような化合物を供給する物質を検出するた
めの試薬は、一般式の本発明によるＮ−アシル
−ジヒドロレゾルフイン誘導体１種以上と共にペ
ルオキシダーゼ並びにそれぞれのパラメータ検出
に必要な他の酵素、好適な緩衝系並びに他の試薬
及び助剤、例えば湿潤剤、安定剤、ガレヌス添加
物、骨格ビルダー等を含有する。
ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ活性を有
する化合物もしくは過酸化水素又はペルオキシド
様作用化合物を産生する系中の酵素活性を検出す
るための試薬は、一般式の本発明によるＮ−ア
シル−ジヒドロレゾルフイン誘導体１種以上と共
に過酸化水素もしくはペルオキシド様作用化合
物、場合により必要な基質及び補酵素、好適な緩
衝系並びに場合により他の試薬及び助剤を含有す
る。
試薬は、溶液の形で、凍結乾燥物、粉末混合物
として、試薬錠剤又は好適な担持物質上に施して
存在していてよい。
溶液の形の試薬は試験に必要な全試薬を含有す
ると有利である。溶剤としては、水又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、ア
セトン又はジメチルホルムアミドとの混合液が該
当する。安定性のために、試験に必要な試薬を２
種以上の溶液に分けて、試験する際に初めて混合
すると有利である。
試薬を凍結乾燥物の形で製造するに当り、試験
に必要な全試薬と共に例えばポリビニルピロリド
ンのような骨格ビルダー及び場合により他の填
料、例えばマンニツト、ソルビツト又はキシリツ
トを含有する溶液を乾燥する。
粉末混合物又は試薬錠剤の形の試薬は、試験成
分に常用のガレヌス添加物を加えかつ造粒して製
造することができる。この種の添加物は例えばマ
ンニツト、ソルビツト又はキシリツトのような糖
アルコールもしくはポリエチレングリコール又は
ポリビニルピロリドンのような他の可溶性不活性
化合物である。一般に、粉末混合物又は試薬錠剤
は最終重量約30〜200mg、殊に50〜80mgを有する。
担持物質としては試験片に関して知られている
紙−、ガラス−又はプラスチツクフリース、網材
及び繊維材料からの織物又は吸収性の多孔性フイ
ルムもしくはゲルを使用することができる。
試験片の形の試薬を製造するに当り、好適な担
持材料、殊に濾紙、セルロース又は合成繊維フリ
ースを水、メタノール、エタノール又はアセトン
のような易揮発性溶剤中の、一般に試験片の製造
に使用される必要な試薬の溶液で含浸する。これ
は１つの含浸工程で行なうことができる。しかし
ながらしばしば含浸を数工程で実施すると有利で
あり、その際にそれぞれ試薬の成分の一部を含有
する溶液を使用する。例えば、第１工程で緩衝剤
及び他の水溶性添加物を含有する水溶液で含浸
し、次にＮ−アシル−ジヒドロレゾルフインを含
有する溶液で含浸する。調製した試験紙はそのま
まで使用するか又は公知のように握りに接着する
か又は有利に西ドイツ国特許第2118455号明細書
によりプラスチツクと微細メツシユの網材との間
に封入することができる。
可溶性フイルムビルダーからの乾燥試薬を製造
するに当り、重合体から溶液を製造し、この溶液
は、ナイフ塗布、流し塗り、ロール塗り等のよう
な公知の製法によりフイルムを製造し得る程度に
粘性である。これらの溶液中には、試薬、緩衝
剤、助剤及び試薬安定剤が混合されている。被覆
剤を担体シート上に施し、乾燥させかつこの仕上
がつたフイルムを試験片に加工する。
一般式のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフイン
誘導体は免疫学的測定法にも使用することがで
き、その際にペルオキシダーゼを指示薬酵素とし
て使用しかつその活性は免疫反応の実施後に測定
すべきである。酵素指示薬反応によるそのような
免疫測定法は当業者に酵素イムノアツセイとして
知られている。この方法は、蛋白質、ポリサツカ
リド、ホルモン、医薬及び他の低分子物質の範囲
10-5〜10-2モル／の濃度を測定するのに使われ
る。相分離工程の必要性に応じて均質−と異質試
験操作とを区別する。他の区分は競合−及び非競
合試験原理で行なうことができる。しかしすべて
の試験原理は酵素−抗原−もしくは酵素−抗体−
結合体により操作する。酵素指示薬反応は、すべ
ての酵素イムノアツセイに共通している。例え
ば、そのような目的のために好適な指示薬酵素は
ペルオキシダーゼである。一般に、そのような酵
素イムノアツセイにおけるペルオキシダーゼの測
定は、過酸化水素により酵素で酸化されかつ常法
で光度測定又はけい光測定される好適な基質を添
加して行なう。
実施例 次に実施例により、本発明による化合物を合成
するためのいくつかの方法並びに一般式の新規
Ｎ−アシル−ジヒドロレゾルフイン誘導体の使用
について詳説する。しかし本発明これらに限定さ
れるものではない。
例 １ Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸モリホリド Ａ） レゾルフイン−４−カルボン酸 ニトロソレゾルシン16ｇ、２，６−ジヒドロキ
シ安息香酸15.5ｇ及びカツ石8.6ｇをメタノール
200ml中に懸濁しかつ０℃に冷却する。それに濃
硫酸10.6mlを滴加し、２時間室温で撹拌する。沈
殿した赤色のレザズリン−４−カルボン酸を濾別
し、メタノールで洗いかつ乾燥させる。
レザズリン誘導体を水200ml及び25％−アンモ
ニア50ml中に取りかつ濾過する。この青色濾液に
氷冷下に亜鉛末50ｇを少量ずつ加えかつ室温に昇
温させる。
還元の経過は簡単に薄層クロマトグラフイによ
り追跡することができる（溶媒：メタノール／酢
酸エステル１：１、珪酸ゲルプレート）。反応溶
液を濾過し、その後、濾液を氷酢酸及び少量の濃
塩酸で酸性にする。析出したレゾルフイン−４−
カルボン酸を濾取しかつ真空中シカペント
（Sicapent）上で乾燥する。
収量：16.33ｇ Rf：0.4（珪酸ゲル；溶媒：ｎ−ブタノール／氷
酢酸／水４：１：１） Ｂ） Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾ
ルフイン−４−カルボン酸 レゾルフイン−４−カルボン酸12.9ｇを氷酢酸
30ml及び無水酢酸30ml中に取り、塩化スズ（）
27.6ｇを加えかつ80℃で１時間撹拌する。氷水
600mlに加え、１時間撹拌しかつ沈殿を濾取する。
乾燥後に固体をアセトン500mlに取る。吸引濾過
し、濾液を蒸発濃縮し、かつ乾燥後に生成物11.3
ｇが得られる。
Rf：0.46（珪酸ゲル；溶媒：クロロホルム／メ
タノール／氷酢酸９：１：0.1） 1H−NMR（〔D6〕−DMSO）：δ＝2.24，2.26及
び2.29（それぞれｓ，それぞれ3H）：6.94
（dd，Ｊ＝8.5及び2.2Hz，1H）；6.98（ｄ，Ｊ
＝2.2Hz，1H）； 7.04（ｄ，Ｊ＝９Hz，1H）；7.61（ｄ，Ｊ＝8.5
Hz，1H）；7.67ppm（ｄ，Ｊ＝９Hz，1H）。
Ｃ） Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾ
ルフイン−４−カルボン酸モルホリド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸3.85ｇに塩化オキサリル
5.4mlを加えかつ０℃に冷却する。それにジメチ
ルホルムアミド１滴を加えかつ反応混合物を撹拌
下に反応温度に高める。その際にガス発生下に抽
出物が溶ける。真空中室温で蒸発乾固し、乾燥塩
化メチレン20ml中に３回取りかつ再び蒸発乾固す
る。このようにしてＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−
ジヒドロレゾルフイン−４−カルボン酸クロリド
４ｇが得られ、これは粗製生成物として更に加工
する。この酸塩化物を塩化メチレン50ml中に溶解
する。これにトリエチルアミン3.1ml、引続いて
モルホリン1.2mlを滴加する。２時間撹拌した後
で、反応溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液
及び稀塩酸で洗い、塩化メチレン相を硫酸マグネ
シウム上で乾燥しかつ蒸発濃縮する。残渣をエタ
ノールから結晶させる。
収量：8.1ｇ 1H−NMR（〔D6〕−DMSO）：δ＝2.20−2.21
（3s，9H）；3.50−3.80（ｍ，8H）；6.70−7.05
（ｍ，2H）；7.12（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H）；7.54
（ｄ，Ｊ＝９Hz，1H）； 7.60ppm（ｄ，Ｊ＝９Hz，1H）。
Ｄ） Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸モルホリド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸モルホリド2.02ｇをジオキ
サン／水１：１ 50ml中で亜硫酸ナトリウム（無
水）1.2ｇと還流下に加熱する。蒸発濃縮し、ア
セトン50mlに取り、濾過しかつ濾液を再度蒸発濃
縮する。珪酸ゲルでクロマトグラフイ処理をし
（溶離剤クロロホルム／メタノール８：２）、生成
物1.0ｇを得る。
Rf：0.8（珪酸ゲル；溶媒：クロロホルム／メタ
ノール８：２） 1H−NMR（〔D6〕−DMSO）：δ＝2.20（ｓ，
3H）；3.10−3.16（ｍ，2H）；3.4−3.8（ｍ，
6H）；6.48（ｄ，Ｊ＝2.4Hz，1H）；6.53（dd，
Ｊ＝9.8及び2.4Hz，1H）；6.62（ｄ，Ｊ＝９
Hz，1H）；7.30（ｄ，Ｊ＝9.8Hz，1H）； 7.33（ｄ，Ｊ＝9.8Hz，1H）； 9.62（ｓ，1H）；9.91ppm（ｓ，1H） UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
7.5）：λnax＝200nmH2O2／ペルオキシダーゼ
で酸化後： λnax＝575nm けい光放射 ：λnax＝590nm 同様にして次のものが得られる： ａ） Ｎ−アセチル−６−メチルジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸モルホリド ２−メチル−４−ニトロソレゾルシンから６−
メチル−レザズリン−４−カルボン酸及び６−メ
チル−レゾルフイン−４−カルボン酸を介して 1H−NMR（〔D6〕−DMSO）：δ2.17及び2.23（そ
れぞれｓ，6H）；3.5−3.8（ｍ，8H）；6.20
（ｄ，Ｊ＝8.6Hz，1H）；6.66（ｄ，Ｊ＝8.8Hz，
1H）；6.79（ｄ，Ｊ＝8.8Hz，１ 1H）；
7.35ppm（ｄ，Ｊ＝8.8Hz，1H） UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
8.0）： H2O2／ペルオキシダーゼによる酸化後
：λnax＝585nm ｂ） Ｎ−アセチル−８−エチルジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸モルホリド ４−エチル−６−ニトロソレゾルシンから８−
エチル−レサズリン−４−カルボン酸及び８−エ
チル−レゾルフイン−４−カルボン酸を介して 薄層クロマトグラフイ（珪酸ゲル、溶媒：酢酸
エステル）：Rf＝0.38 UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
8.0）： H2O2／ペルオキシダーゼによる酸化後： ：λnax＝575nm けい光放射 ：λnax＝598nm ｃ） Ｎ−アセチル−８−クロルレゾルフイン−
１−カルボン酸モルホリド ４−クロル−６−ニトロソレゾルシンから８−
クロル−レザズリン−１−カルボン酸及び８−ク
ロル−レゾルフイン−１−カルボン酸を介して UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
8.0）： H2O2／ペルオキシダーゼで酸化後 λnax＝570nm ｄ） Ｎ−アセチル−６，８−ジクロルジヒドロ
レゾルフイン−４−カルボン酸−モルホリド ２，４−ジクロル−６−ニトロソレゾルシンか
ら６，８−ジクロル−レザズリン−４−カルボン
酸及び６，８−ジクロル−レゾルフイン−４−カ
ルボン酸を介して ｅ） Ｎ−アセチル−８−ブロムジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸−モルホリド ４−ブロム−６−ニトロソレゾルシンから８−
ブロム−レザズリン−４−カルボン酸及び８−ブ
ロム−レゾルフイン−４−カルボン酸を介して 例 ２ Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸−（カルボキシメチル）アミド Ａ） Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾ
ルフイン−４−カルボン酸−ｔ−ブトキシカル
ボニルメチルアミド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸（例1b）により製造）10.7
ｇを例1c）と同様に塩化オキサリル27mlにより酸
クロリドに変換する。
酸クロリドを塩化メチレン100ml中に取る。塩
化メチレン20ml中に溶解したグリシン−ｔ−ブチ
ルエステル7.8ｇを滴加しかつ室温で３時間撹拌
する。飽和炭酸水素ナトリウム、1N−クエン酸
及び水で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥
後、有機相を蒸発濃縮し、少量の酢酸エステル中
に取り、珪酸ゲルを介して溶離剤として酢酸エス
テルを用いて濾過する。明るい帯褐色の生成物11
ｇが得られる。
Rf（薄層クロマトグラフイ：珪酸ゲル、溶
媒：酢酸エステル）：0.68 Ｂ） Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸−ｔ−ブトキシカルボニルメチル
アミド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸−ｔ−ブトキシカルボニル
メチルアミド９ｇを無水亜硫酸ナトリウム4.6ｇ
とジオキサン／水１：１ 100ml中で30分間還流
下に加熱する。蒸発濃縮し、残渣をアセトン250
ml中に取り、濾過しかつ濾液を蒸発濃縮する。エ
タノールからの結晶により生成物4.5ｇが得られ
る。そのうちの1.4ｇを珪酸ゲルで塩化メチレ
ン／メタノール20：１によりクロマトグラフイ処
理をする。
収量：0.9ｇ Rf：0.77（薄層クロマトグラフイ：珪酸ゲル、
溶媒：酢酸エステル） 1H−NMR（〔D6〕−DMSO）：δ＝1.49（ｓ，
9H）；2.20（ｓ，3H）；4.07（ｄ，Ｊ＝６Hz，
2H）；6.61（dd，Ｊ＝9.8及び2.4Hz，1H）；
6.69（ｄ，Ｊ＝9.8Hz，1H）； 6.86（ｄ，Ｊ＝2.4Hz，1H）；7.35（ｄ，Ｊ＝9.8
Hz，1H）7.51（ｄ，Ｊ＝9.8Hz，1H）；8.77
（ｔ，広幅，Ｊ＝６Hz，1H）；9.74（ｓ，
1H）；12.61（ｓ，1H）。
Ｃ） Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸−（カルボキシメチル）アミド Ｎ−アセチルジヒドロレゾルフイン−４−カル
ボン酸−ｔ−ブトキシカルボニルメチルアミド
500mgをトリフルオル酢酸10ml中に30分間放置す
る。
収量：410mg Rf：0.79（薄層クロマトグラフイ：珪酸ゲル、
溶媒：ｎ−ブタノール／氷酢酸／水４：１：
１） 1H−NMR：（〔D6〕−DMSO）：δ＝2.20（ｓ，
3H）；4.08（ｄ，Ｊ＝６Hz，1H）； 6.61（dd，Ｊ＝9.8及び2.4Hz，1H）；6.69（ｄ，
Ｊ＝9.8Hz，1H）； 6.89（ｄ，Ｊ＝2.4Hz，1H）； 7.34及び7.52（それぞれｄ，Ｊ＝9.8Hz，
2H）； 8.81（ｔ，広幅，Ｊ＝６Hz，1H）； 9.74（ｓ，広幅，1H）； 12.5ppm（ｓ，1H）。
UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH7.5）
：λnax＝204nm H2O2／ペルオキシダーゼで酸化後 ：λnax＝571nm けい光放射 ：λnax＝588nm 同様にして次のものが得られる： ａ） Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４
−カルボン酸−（カルボキシメチル）−メチルア
ミド Ｎ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒドロレゾルフ
イン−４−カルボン酸及びサルコシン−ｔ−ブチ
ルエステルからＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチル−ジヒ
ドロレゾルフイン−４−カルボン酸−（ｔ−ブト
キシカルボニルメチル）−メチルアミドを介して Rf：0.77（薄層クロマトグラフイ：珪酸ゲル、
溶媒：クロロホルム／メタノール／氷酢酸
９：１：0.1） Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸−（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−メ
チルアミドを介して Rf：0.56（薄層クロマトグラフイ：上記参照） Rf：0.10（薄層クロマトグラフイ：上記参照） UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
7.5） ：λnax＝204nm H2O2／ペルオキシダーゼで酸化後： λnax＝574nm ｂ） Ｎ−アセチル−６−メチルジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸−（カルボキシメチル）
−メチルアミド Rf：0.62（薄層クロマトグラフイ：上記参照） UV／VIS（0.1Mリン酸カリウム緩衝液、PH
7.5） ：λnax＝205nm H2O2／ペルオキシダーゼで酸化後： λnax＝585nm ｃ） Ｎ−アセチル−８−クロルジヒドロレゾル
フイン−４−カルボン酸−（カルボキシメチル）
−アミド 例２に挙げた化合物と同様にして製造する。
例 ３ 過酸化水素の測定 トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミ
ノエタンスルホネート 0.1ミリモル／、PH８ トリトン（Triton）X100 0.5％ Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−カ
ルボン酸モルホリド 2.5ミリモル／ ペルオキシダーゼ 3U／ml より成る溶液にH2O2含量が既知の溶液を異なる
量でピペツト添加し、60分間放置しかつ578nmで
吸光度を測定する。
第１図には、測定溶液中のH2O2濃度に対する
578nmでの吸光度がプロツトされている。過酸化
水素濃度と吸光度との間に良好な直線性が得られ
る。
このようにして得られた検量線を用いて未知の
H2O2含量の試料中のH2O2濃度を測定することも
できる。
例 ４ クレアチニンの測定 溶液１：トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエチルスルホネート 100ミリモル／、PH８ トリトンX100 0.5％ Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−
カルボン酸モルホリド 2.5ミリモル／ 塩化ナトリウム 150ミリモル／ ナトリウムコレート ５ミリモル／ EDTA 0.5ミリモル／ カリウムヘキサシアノフエラート（） 10μモル／ アジ化ナトリウム 0.2％ ペルオキシダーゼ 3U／ml リパーゼ 2U／ml アスコルベートオキシダーゼ 10U／ml クレアチナーゼ 6.5U／ml サルコシンオキシダーゼ 6.5U／ml クレアチニナーゼ 25U／ml 溶液２：クレアチニン標準溶液 ２mg／100ml 溶液１ １ml中に溶液２を10、20、30、40及び
50μで加える。吸光度を時間との相関関係で追
跡する。このようにして第２図による曲線が得ら
れ、これは検量線として未知のクレアチニン濃度
の測定に適用される。
例 ５ チロキシンの測定 溶液１：バルビツル酸カリウム 120ミリモル／ リン酸カリウム緩衝液 18.2ミリモル／、PH8.6 ８−アニリノ−１−ナフタリンスルホン酸
1.2ミリモル／ 牛血清アルブミン 0.2％ チロキシン−ペルオキシダーゼ結合体
0.5U／ 溶液２：トリス／HCl 100ミリモル／、PH８ 過硼酸ナトリウム 3.2ミリモル／ Ｎ−アセチル−ジヒドロレゾルフイン−４−
カルボン酸モルホリド 1.82ミリモル／ 抗チロキシン抗体で塗布したプラスチツク試験
管（結合能：試験管１本当りチロキシン約25mg）
中にチロキシン溶液0.02ml及び溶液１ １mlを加
えかつ30分間20〜25℃で恒温保持する。試験管の
内容物を吸引濾過し、水で１回洗浄し、再度吸引
濾過する。その後、溶液２と共に60分間恒温保持
し、十分に混合しかつ578nmで吸光度を測定す
る。
第３図に得られた検量線が示されている。
そのような検量線により試料の未知のチロキシ
ン含量を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、578nmにおける測定溶液中のH2O2
濃度と吸光度との相関関係を示す検量線図、第２
図は、クレアチニン濃度と時間との相関関係を示
す検量線図、第３図は578nmにおけるチロキシン
含量と吸光度との相関関係を示す検量線図であ
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： ［式中R1は低級アルキル基を表わし、 R2、R3及びR4は同じか又は異なつていてよく、
    水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコ
    キシ基を表わし、 Ｙは基−NR5R6であり、その際に R5及びR6はそれぞれ水素を表わすか又はカル
    ボキシル基により置換されていてよい低級アルキ
    ル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテロ原
    子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表
    わす］のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフイン誘導
    体。 ２ 一般式： ［式中R1は低級アルキル基を表わし、 R2、R3及びR4は同じか又は異なつていてよく、
    水素、ハロゲン、低級アルキル−又は低級アルコ
    キシ基を表わし、 Ｙは基−NR5R6であり、その際に R5及びR6はそれぞれ水素を表わすか又はカル
    ボキシル基により置換されていてよい低級アルキ
    ル基を表わすかもしくは一緒になつて、ヘテロ原
    子により中断されていてよい炭化水素架橋基を表
    わす］のＮ−アシル−ジヒドロレゾルフイン誘導
    体を製造する方法において、一般式ａ及び
    ｂ： ［式中R2、R3及びR4は前記のものを表わす］
    の化合物を還元かつアシル化して一般式： ［式中R1、R2、R3及びR4は前記のものを表わ
    す］の化合物に変換し、場合によりカルボン酸官
    能基を反応性カルボン酸誘導体に変換した後で最
    後に一般式： HY （） ［式中Ｙは前記のものを表わす］の化合物と反
    応させ、引続いてＯ−アシル基を選択的に脱離す
    ることを特徴とするＮ−アシル−ジヒドロレゾル
    フイン誘導体の製法。 ３ Ｏ−アシル基の選択的脱離を亜硫酸ナトリウ
    ムで行う特許請求の範囲第２項記載の方法。
JP61173992A 1985-07-25 1986-07-25 Ｎ―アシル―ジヒドロレゾルフィン誘導体及びその製法 Granted JPS6229578A (ja)

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DE3681649D1 (de) 1991-10-31
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JPS6229578A (ja) 1987-02-07
US4737466A (en) 1988-04-12
KR890004092B1 (ko) 1989-10-20
KR870001183A (ko) 1987-03-12
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