JPH0650997B2 - コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 - Google Patents
コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法Info
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- JPH0650997B2 JPH0650997B2 JP61086744A JP8674486A JPH0650997B2 JP H0650997 B2 JPH0650997 B2 JP H0650997B2 JP 61086744 A JP61086744 A JP 61086744A JP 8674486 A JP8674486 A JP 8674486A JP H0650997 B2 JPH0650997 B2 JP H0650997B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 (1)産業上の利用分野 本発明は臨床検査における血清中のコリンエステラーゼ
活性の測定方法に関する。より詳細には、本発明は一般
式（Ｉ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｙ１は２位または５
位に、Ｙ２は３位に置換された水酸基を表わす）で表わ
されるコリン誘導体を基質として用いることを特徴とす
るコリンエステラーゼ活性の測定方法に関する。
活性の測定方法に関する。より詳細には、本発明は一般
式（Ｉ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｙ１は２位または５
位に、Ｙ２は３位に置換された水酸基を表わす）で表わ
されるコリン誘導体を基質として用いることを特徴とす
るコリンエステラーゼ活性の測定方法に関する。
(2)従来の技術 従来、合成基質を使用する血清中のコリンエステラーゼ
（以下ＣｈＥと記す）活性の測定方法は種々報告され、
また日常の臨床検査に実用化されているものもある。し
かし、それらの測定方法には種々の欠点や問題点があ
り、測定値の不正確さの原因になつている。それらの測
定方法の例をあげると、ガス分析法、pHメーター法、pH
指示薬比色法、チオコリン発色法、酵素法、ＵＶ法等が
ある。
（以下ＣｈＥと記す）活性の測定方法は種々報告され、
また日常の臨床検査に実用化されているものもある。し
かし、それらの測定方法には種々の欠点や問題点があ
り、測定値の不正確さの原因になつている。それらの測
定方法の例をあげると、ガス分析法、pHメーター法、pH
指示薬比色法、チオコリン発色法、酵素法、ＵＶ法等が
ある。
(3)発明が解決しようとする問題点 ガス分析法〔アモン（R.Ammon）：プフリユーゲルス
アーカイブ，ゲス フイジオロジー（Pflgers Arch,G
es Physiol.），２２３，４８７（１９３３）〕は合成
基質としてアセチルコリンを用い、ＣｈＥの酵素作用で
生成した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生する炭
酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑で多数の検
体を処理することができないなどの欠点がある。
アーカイブ，ゲス フイジオロジー（Pflgers Arch,G
es Physiol.），２２３，４８７（１９３３）〕は合成
基質としてアセチルコリンを用い、ＣｈＥの酵素作用で
生成した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生する炭
酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑で多数の検
体を処理することができないなどの欠点がある。
pHメーター法〔マイケル（H.O.Michel）：ジヤーナル
オブラボラトリー アンド クリニカルメデイシン（J.
Lab.& Clin.Med.），３４，１５６４（１９４９）〕も
ガス分析法と同様にＣｈＥの酵素作用によつて生じた酢
酸によるpHの変化をpHメーターで測定する方法である
が、pHメーターの精度、多数の検体を処理することがで
きないなど実用上の問題がある。
オブラボラトリー アンド クリニカルメデイシン（J.
Lab.& Clin.Med.），３４，１５６４（１９４９）〕も
ガス分析法と同様にＣｈＥの酵素作用によつて生じた酢
酸によるpHの変化をpHメーターで測定する方法である
が、pHメーターの精度、多数の検体を処理することがで
きないなど実用上の問題がある。
pH指示薬比色法はpHメーター法とは異なり、ＣｈＥによ
り生じた酢酸によるpHの変化を指示薬の分子吸光度を測
定する方法で、指示薬としてはフエノールレツド〔高橋
浩、柴田進：医学と生物学、２０、９６（１９５
１）〕、ブロムチモールブルー〔ビツグス他（H.G.Bigg
s,et al）：アメリカンジヤーナル オブ クリニカル
パソロジー（Amer.J.Clin.Path.），３０，１８１
（１９５８）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、１２，５５５（１９６４）〕などが使われて
いる。この方法は操作も簡便で多数の検体を処理するこ
ともできるが、反応時間が長く、反応中にもpHが一定で
なく、低値と高値で再現性があまり良くないなどの欠点
が指摘されている。
り生じた酢酸によるpHの変化を指示薬の分子吸光度を測
定する方法で、指示薬としてはフエノールレツド〔高橋
浩、柴田進：医学と生物学、２０、９６（１９５
１）〕、ブロムチモールブルー〔ビツグス他（H.G.Bigg
s,et al）：アメリカンジヤーナル オブ クリニカル
パソロジー（Amer.J.Clin.Path.），３０，１８１
（１９５８）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、１２，５５５（１９６４）〕などが使われて
いる。この方法は操作も簡便で多数の検体を処理するこ
ともできるが、反応時間が長く、反応中にもpHが一定で
なく、低値と高値で再現性があまり良くないなどの欠点
が指摘されている。
上述したアセチルコリンを基質として用いる方法では、
アセチルコリンは非酵素的加水分解を起こしやすく、ま
た基質特異性もあまりないので、基質そのものにも問題
がある。
アセチルコリンは非酵素的加水分解を起こしやすく、ま
た基質特異性もあまりないので、基質そのものにも問題
がある。
チオコリン法〔ゲイリー（P.Garry）：ジヤーナル オ
ブ クリニカル ケム（J.Clin.Chem.），１１
（２），９１（１９６５）〕は基質としてアセチルチオ
コリン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が使
用されている。
ブ クリニカル ケム（J.Clin.Chem.），１１
（２），９１（１９６５）〕は基質としてアセチルチオ
コリン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が使
用されている。
これらの基質はＣｈＥの酵素作用でチオコリンを生成
し、それが５，５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸
（ＤＴＮＢ）と反応して黄色を生じる。この黄色の吸光
度を比色計で測定する方法である。この方法は反応性に
優れ、感度が高く、また操作も簡単で多数の検体を処理
することができるとともに初速度法もできるなど優れた
点もあるが、呈色が黄色であるため血清中のビリルビン
の影響を強く受け、またグルタチオンのようなチオール
基を有する化合物の影響もまぬがれえないし、さらに基
質そのものが不安定であることも問題になつているなど
の欠点があり、測定値の誤差の原因になつている。
し、それが５，５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸
（ＤＴＮＢ）と反応して黄色を生じる。この黄色の吸光
度を比色計で測定する方法である。この方法は反応性に
優れ、感度が高く、また操作も簡単で多数の検体を処理
することができるとともに初速度法もできるなど優れた
点もあるが、呈色が黄色であるため血清中のビリルビン
の影響を強く受け、またグルタチオンのようなチオール
基を有する化合物の影響もまぬがれえないし、さらに基
質そのものが不安定であることも問題になつているなど
の欠点があり、測定値の誤差の原因になつている。
酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明他：臨床病理、２
５、７５１（１９７７）〕オルソトルオイルコリン〔特
開昭５４−１３８５３３〕などを基質として用い、Ｃｈ
Ｅの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシダーゼに
よりベタインに変化させ、その時生成する過酸化水素を
ペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリンを
フエノールなどとの酸化的縮合反応で発色させる方法で
ある。この方法は呈色が赤色になるので、血清中のビリ
ルビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処理すること
もできるが、発色系の試薬として使用するフエノールや
４−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮抗阻害があ
るので、それらの使用量が非常に限定され、十分な発色
が難しい。一般に過酸化水素を経由する定量法は血清中
のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質による
影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解などで生じる
コリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを基質として
用いた場合は、非酵素的加水分解性も問題になつている
など種々の問題がある。
５、７５１（１９７７）〕オルソトルオイルコリン〔特
開昭５４−１３８５３３〕などを基質として用い、Ｃｈ
Ｅの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシダーゼに
よりベタインに変化させ、その時生成する過酸化水素を
ペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリンを
フエノールなどとの酸化的縮合反応で発色させる方法で
ある。この方法は呈色が赤色になるので、血清中のビリ
ルビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処理すること
もできるが、発色系の試薬として使用するフエノールや
４−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮抗阻害があ
るので、それらの使用量が非常に限定され、十分な発色
が難しい。一般に過酸化水素を経由する定量法は血清中
のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質による
影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解などで生じる
コリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを基質として
用いた場合は、非酵素的加水分解性も問題になつている
など種々の問題がある。
ＵＶ法には２種類があり、１つはカロウ（W.Kalow）の
ベンゾイルコリン〔カロウおよびゲネツト（W.Kalow an
d K.Genet）：カナデイアンジヤーナル オブ バイオ
ケミストリー アンド フイジオロジー（Canad.J.Bioc
hem.& Physiol.，）３５，３３９（１９５７）〕を基質
とする方法であり、もう１つはｐ−ヒドロキシコリン
〔特開昭５７−１１０１９８、特開昭５８−１２９９９
９〕を基質とする方法である。前者はＣｈＥの酵素作用
によつて基質が加水分解し、その基質が減少していく様
子を測定波長２４０ｎｍで追跡していく方法である。こ
の方法の測定原理は直接基質の減少を測定しているので
単純明快であるが、測定波長が２４０ｎｍであるため血
清成分の干渉を受けやすいし、基質のベンゾイルコリン
が基質阻害を起すため、反応液の基質濃度が限定され、
直線性の範囲が狭く、またベンゾイルコリンの非酵素的
加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの至適pHで反応を行
つていない。測定波長２４０ｎｍでは吸光スペクトルの
スロープで測定することになり、波長のずれによる吸光
係数のずれが大きくなるなどの問題がある。
ベンゾイルコリン〔カロウおよびゲネツト（W.Kalow an
d K.Genet）：カナデイアンジヤーナル オブ バイオ
ケミストリー アンド フイジオロジー（Canad.J.Bioc
hem.& Physiol.，）３５，３３９（１９５７）〕を基質
とする方法であり、もう１つはｐ−ヒドロキシコリン
〔特開昭５７−１１０１９８、特開昭５８−１２９９９
９〕を基質とする方法である。前者はＣｈＥの酵素作用
によつて基質が加水分解し、その基質が減少していく様
子を測定波長２４０ｎｍで追跡していく方法である。こ
の方法の測定原理は直接基質の減少を測定しているので
単純明快であるが、測定波長が２４０ｎｍであるため血
清成分の干渉を受けやすいし、基質のベンゾイルコリン
が基質阻害を起すため、反応液の基質濃度が限定され、
直線性の範囲が狭く、またベンゾイルコリンの非酵素的
加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの至適pHで反応を行
つていない。測定波長２４０ｎｍでは吸光スペクトルの
スロープで測定することになり、波長のずれによる吸光
係数のずれが大きくなるなどの問題がある。
後者は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを使
用し、ＣｈＥの酵素作用によつて生成するｐ−ヒドロキ
シ安息香酸を補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐ−ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨが酸化さ
れＮＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長３４０ｎ
ｍで測定追跡する方法である。この方法はほぼ至適pHで
反応が行えるし、過酸化水素−発色系における欠点、す
なわちビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質に
よる影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに多数の
検体処理が可能な自動分析装置に適した優れたＣｈＥ活
性測定方法である。しかしながら、使用する補酵素ＮＡ
ＤＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一定の品
質に維持および管理するのが難しいし、また酵素として
ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やプロトカテキユ酸
−３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、測定原理と
しては前者に比較して大分複雑であり、測定値の誤差要
因が多い。またＣｈＥ活性の測定方法としては異型コリ
ンエストラーゼ活性測定も重要である。しかし、後者の
方法はフツ化ナトリウムの影響を強く受けるため異型コ
リンエストラーゼの活性測定には問題がある。
用し、ＣｈＥの酵素作用によつて生成するｐ−ヒドロキ
シ安息香酸を補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐ−ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨが酸化さ
れＮＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長３４０ｎ
ｍで測定追跡する方法である。この方法はほぼ至適pHで
反応が行えるし、過酸化水素−発色系における欠点、す
なわちビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質に
よる影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに多数の
検体処理が可能な自動分析装置に適した優れたＣｈＥ活
性測定方法である。しかしながら、使用する補酵素ＮＡ
ＤＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一定の品
質に維持および管理するのが難しいし、また酵素として
ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やプロトカテキユ酸
−３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、測定原理と
しては前者に比較して大分複雑であり、測定値の誤差要
因が多い。またＣｈＥ活性の測定方法としては異型コリ
ンエストラーゼ活性測定も重要である。しかし、後者の
方法はフツ化ナトリウムの影響を強く受けるため異型コ
リンエストラーゼの活性測定には問題がある。
以上に述べたごとく、従来のＣｈＥの酵素活性測定方法
には種々の問題があり、測定値の誤差の原因になつてい
る。
には種々の問題があり、測定値の誤差の原因になつてい
る。
(4)問題点を解決するための手段 我々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し、一般式
（Ｉ）で表わされる化合物中の２種である２，３−ジヒ
ドロキシベンゾイルコリンアイオダイド（以下、化合物
Ｉと記述する）および３，５−ジヒドロキシベンゾイル
コリンアイオダイド（以下、化合物IIと記述する）を用
いる血清ＣｈＥ活性を測定する新規な方法を発明するに
至つた。第３図に化合物Ｉと２，３−ジヒドロキシ安息
香酸のＵＶスペクトルを、第４図に化合物IIと３，５−
ジヒドロキシ安息香酸のＵＶスペクトルを示す。
（Ｉ）で表わされる化合物中の２種である２，３−ジヒ
ドロキシベンゾイルコリンアイオダイド（以下、化合物
Ｉと記述する）および３，５−ジヒドロキシベンゾイル
コリンアイオダイド（以下、化合物IIと記述する）を用
いる血清ＣｈＥ活性を測定する新規な方法を発明するに
至つた。第３図に化合物Ｉと２，３−ジヒドロキシ安息
香酸のＵＶスペクトルを、第４図に化合物IIと３，５−
ジヒドロキシ安息香酸のＵＶスペクトルを示す。
(5)作用および効果 化合物Ｉ又は化合物IIがＣｈＥの作用で加水分解すると
コリンと２，３−ジヒドロキシ安息香酸又は３，５−ジ
ヒドロキシ安息香酸を生成する。コリンは波長３００ｎ
ｍ以上ではＵＶ吸収はない。２，３−ジヒドロキシ安息
香酸及び３，５−ジヒドロキシ安息香酸は波長３４０ｎ
ｍ以上ではＵＶ吸収はほとんどない。したがつて、化合
物Ｉ及び化合物IIをＣｈＥ活性を測定する基質として、
使用し、測定波長３４０から３６０ｎｍで反応を追跡す
れば基質の化合物Ｉ及び化合物IIの減少を正確に追うこ
とができる。前述のカロウ（W.Kalow）のＵＶ法では、
測定波長が２４０ｎｍであるので初期吸収において血液
成分の干渉を大きく受けるが、本発明の基質では測定波
長が３４０から３６０ｎｍであるから血液成分の干渉を
あまり受けないので、至適な測定条件の設定が容易であ
る。この２種類の基質は非酵素的加水分解に対して安定
である。たとえばpHが８．２０の２００ｍＭグリシルグ
リシン緩衝液中３７℃の条件下で１０分間では加水分解
は非常に少なかつた（第７図参照）。
コリンと２，３−ジヒドロキシ安息香酸又は３，５−ジ
ヒドロキシ安息香酸を生成する。コリンは波長３００ｎ
ｍ以上ではＵＶ吸収はない。２，３−ジヒドロキシ安息
香酸及び３，５−ジヒドロキシ安息香酸は波長３４０ｎ
ｍ以上ではＵＶ吸収はほとんどない。したがつて、化合
物Ｉ及び化合物IIをＣｈＥ活性を測定する基質として、
使用し、測定波長３４０から３６０ｎｍで反応を追跡す
れば基質の化合物Ｉ及び化合物IIの減少を正確に追うこ
とができる。前述のカロウ（W.Kalow）のＵＶ法では、
測定波長が２４０ｎｍであるので初期吸収において血液
成分の干渉を大きく受けるが、本発明の基質では測定波
長が３４０から３６０ｎｍであるから血液成分の干渉を
あまり受けないので、至適な測定条件の設定が容易であ
る。この２種類の基質は非酵素的加水分解に対して安定
である。たとえばpHが８．２０の２００ｍＭグリシルグ
リシン緩衝液中３７℃の条件下で１０分間では加水分解
は非常に少なかつた（第７図参照）。
この結果は測定中非酵素的加水分解は無視できることを
示している。pHを一定に保持するための緩衝剤として、
バルビタール酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、グリシ
ン、グリシルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンなどが使用できる。上記以外の緩衝剤でもpHを
７．５〜１０．０の間において緩衝能を維持できるもの
であれば用いることが可能である。
示している。pHを一定に保持するための緩衝剤として、
バルビタール酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、グリシ
ン、グリシルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンなどが使用できる。上記以外の緩衝剤でもpHを
７．５〜１０．０の間において緩衝能を維持できるもの
であれば用いることが可能である。
ＣｈＥに対するＫｍ値はベンゾイルコリンと同程度で化
合物Ｉは２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液（pH８．２
０）では３．３３×１０-5mol／であり、化合物IIは
２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液（pH８．６０）では
１．２５×１０-4mol／である。Ｋｍ値が十分小さい
ので、本発明の測定法の反応系では十分な基質濃度で反
応を行うことができ、経時的直線範囲が広くなり、高単
位の活性まで十分測定が可能である。
合物Ｉは２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液（pH８．２
０）では３．３３×１０-5mol／であり、化合物IIは
２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液（pH８．６０）では
１．２５×１０-4mol／である。Ｋｍ値が十分小さい
ので、本発明の測定法の反応系では十分な基質濃度で反
応を行うことができ、経時的直線範囲が広くなり、高単
位の活性まで十分測定が可能である。
化合物Ｉおよび化合物IIを基質として用いた場合、２０
０ｍＭグリシルグリシン緩衝液ではＣｈＥの至適pHは
８．００〜８．６０であり、たとえば化合物ＩではpH
８．２０〜８．４０であつた（第６図参照）。また前述
のごとくpH８．２０で非酵素的加水分解に対しては安定
であるので、本発明の測定法はＣｈＥの至適のpHで反応
を行うことができる。
０ｍＭグリシルグリシン緩衝液ではＣｈＥの至適pHは
８．００〜８．６０であり、たとえば化合物ＩではpH
８．２０〜８．４０であつた（第６図参照）。また前述
のごとくpH８．２０で非酵素的加水分解に対しては安定
であるので、本発明の測定法はＣｈＥの至適のpHで反応
を行うことができる。
検体中の共存物質が測定値に影響する場合、測定値の誤
差原因となることは前述の通りである。本発明の方法は
測定原理的にみても共存物質の影響を受け難い。共存物
質たとえば、アスコルビン酸２０mg／dl、尿酸２０mg／
dl、グルコース５００mg／dl、ヘモグロビン２００mg／
dl、アルブミン５ｇ／dl、ビリルビン２０mg／dl、グル
タチオン（還元型）５０mg／dlまでは添加試験では問題
はなかつた（第８図〜第１４図参照）。抗凝固剤ＥＤＴ
Ｅ・２Ｎａ、クエン酸塩、ヘパリン、酸塩、二重酸
等の添加試験でも問題はなかつた（第１５図参照）。
差原因となることは前述の通りである。本発明の方法は
測定原理的にみても共存物質の影響を受け難い。共存物
質たとえば、アスコルビン酸２０mg／dl、尿酸２０mg／
dl、グルコース５００mg／dl、ヘモグロビン２００mg／
dl、アルブミン５ｇ／dl、ビリルビン２０mg／dl、グル
タチオン（還元型）５０mg／dlまでは添加試験では問題
はなかつた（第８図〜第１４図参照）。抗凝固剤ＥＤＴ
Ｅ・２Ｎａ、クエン酸塩、ヘパリン、酸塩、二重酸
等の添加試験でも問題はなかつた（第１５図参照）。
前述のカロウ（W.Kalow）のＵＶ法では、使用している
基質ベンゾイルコリンは１／15Ｍリン酸緩衝液（pH７．
４０）中で２３０ｎｍ附近に極大吸収をもち、測定波長
２４０ｎｍではスロープである。このため表Ｉに示すよ
うに波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなる。基
質ベンゾイルコリンでは測定波長が２４０ｎｍから±２
ｎｍずれると吸光係数は約１５％ずれる。本発明の新規
な基質ではこのずれが小さい。たとえば測定波長３４０
ｎｍから±２ｎｍずれると、化合物Ｉでは約６％、化合
物IIでは約４％で、カロウ（W.Kalow）のＵＶ法より非
常に小さい。このことは分析器の波長精度の問題から発
生する吸光係数の違いなどが非常に小さくなることを示
唆している。本発明は共存物質の影響を非常に受け難い
方法であり、分析器の波長精度から発生する吸光係数の
違いなどがカロウ（W.Kalow）のＵＶ法より非常に小さ
いことと相俟ち、測定値の誤差原因が大幅に解消され
た。
基質ベンゾイルコリンは１／15Ｍリン酸緩衝液（pH７．
４０）中で２３０ｎｍ附近に極大吸収をもち、測定波長
２４０ｎｍではスロープである。このため表Ｉに示すよ
うに波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなる。基
質ベンゾイルコリンでは測定波長が２４０ｎｍから±２
ｎｍずれると吸光係数は約１５％ずれる。本発明の新規
な基質ではこのずれが小さい。たとえば測定波長３４０
ｎｍから±２ｎｍずれると、化合物Ｉでは約６％、化合
物IIでは約４％で、カロウ（W.Kalow）のＵＶ法より非
常に小さい。このことは分析器の波長精度の問題から発
生する吸光係数の違いなどが非常に小さくなることを示
唆している。本発明は共存物質の影響を非常に受け難い
方法であり、分析器の波長精度から発生する吸光係数の
違いなどがカロウ（W.Kalow）のＵＶ法より非常に小さ
いことと相俟ち、測定値の誤差原因が大幅に解消され
た。
コリンエステラーゼには血清中に存在するプソイドコリ
ンエステラーゼと赤血球中に存在するツルーコリンエス
テラーゼの二種が知られている。通常臨床検査で測定さ
れてるのは血清中のプソイドコリンエステラーゼである
が、血清中にツルーコリンエステラーゼが混入している
場合があるので、検査目的としてはプソイドコリンエス
テラーゼのみと選択的に反応する基質が望ましい。本発
明の方法に用いるプロトカテキユイルコリンアイオダイ
ド（以下ＰＣＩと記述する）はプソイドコリンエステラ
ーゼとは良く反応するが、ツルーコリンエステラーゼと
はほとんど反応しない非常に特異性の高い基質である。
ンエステラーゼと赤血球中に存在するツルーコリンエス
テラーゼの二種が知られている。通常臨床検査で測定さ
れてるのは血清中のプソイドコリンエステラーゼである
が、血清中にツルーコリンエステラーゼが混入している
場合があるので、検査目的としてはプソイドコリンエス
テラーゼのみと選択的に反応する基質が望ましい。本発
明の方法に用いるプロトカテキユイルコリンアイオダイ
ド（以下ＰＣＩと記述する）はプソイドコリンエステラ
ーゼとは良く反応するが、ツルーコリンエステラーゼと
はほとんど反応しない非常に特異性の高い基質である。
外科および精神科領域で麻酔剤とプソイドコリンエステ
ラーゼの関係で異常プソイドコリンエステラーゼ検査が
重要である。本発明の測定方法は反応機構的に単純明快
なので異常プソイドコリンエステラーゼ検査法として非
常に適している。
ラーゼの関係で異常プソイドコリンエステラーゼ検査が
重要である。本発明の測定方法は反応機構的に単純明快
なので異常プソイドコリンエステラーゼ検査法として非
常に適している。
本発明のＣｈＥ活性測定方法は上記のごとく種々の点で
従来法の問題点が解決されている。本発明の利点を記す
と次のごとくである。
従来法の問題点が解決されている。本発明の利点を記す
と次のごとくである。
(1)測定系の反応機構が単純明快で、測定値の誤差原因
が非常に少い。
が非常に少い。
(2)基質に用いる化合物Ｉ、および化合物IIが非酵素的
加水分解や酸化に対して安定なので、測定値の再現性が
非常に良い。
加水分解や酸化に対して安定なので、測定値の再現性が
非常に良い。
(3)化合物Ｉおよび化合物IIはプソイドコリンエステラ
ーゼに対して、基質特異性が高い。
ーゼに対して、基質特異性が高い。
(4)基質以外に酸化還元系の酵素や補酵素、呈色系の試
薬など用いないので安価である。
薬など用いないので安価である。
(5)前記のごとく、ビリルビン、アスコルビン酸、グル
タチオン等の検体成分や抗凝固剤の影響をほとんど受け
ない。
タチオン等の検体成分や抗凝固剤の影響をほとんど受け
ない。
(6)検体ごとに検体ブランクをたてる必要がないので簡
易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理することが可
能である。
易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理することが可
能である。
(7)異常プソイドコリンエステラーゼ検査が可能であ
る。
る。
(8)基質が安定なので、至適pH（８．００〜８．６０）
での反応が可能である。
での反応が可能である。
(9)高単位まで測定可能である。
(10)波長のずれによる吸光係数のずれがカロウ（W.Kalo
w）のＵＶ法より小さく、分析器の波長精度から発生す
る吸光係数の違いを小さくする事が可能である。
w）のＵＶ法より小さく、分析器の波長精度から発生す
る吸光係数の違いを小さくする事が可能である。
以上のごとく、本発明のＣｈＥ活性測定方法は従来法の
有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣｈ
Ｅ活性測定に充分貢献できるものである。
有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣｈ
Ｅ活性測定に充分貢献できるものである。
以下に参考例および実施例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれによつて限定されるものではない。
が、本発明はこれによつて限定されるものではない。
(6)実施例および参考例 参考例 ２，３−ジヒドロキシベンゾイルコリンアイオ
ダイドの合成法 ２，３−ジヒドロキシ安息香酸１２．３ｇを濃硫酸２．
４mlを含むメタノール４０ml中で油浴上で１０時間還流
後、溶媒を減圧留去し油状残留物にエーテルを加え、飽
和食塩水で洗浄しエーテル相を無水硫酸マグネシウム上
で乾燥後、溶媒を減圧留去し結晶残留物１１．８ｇを得
た。これをエーテル／ｎ−ヘキサンより再結晶し２，３
−ジヒドロキシ安息香酸メチエステル１０．７ｇを得
た。この１０ｇを防湿下ＤＭＦ２６．０ml中無水炭酸カ
リウム２５．１ｇおよびベンジルクロライド１６．５ml
を加え油浴上で１５０〜１６０℃で３０分反応させた。
反応終了後、冷水１６０mlに加え結晶を凝集しよく水洗
し２０．７ｇの結晶を得た。これを水酸化ナトリウム
４．４ｇ、水２．２ml、メタノール８８mlから造つたメ
タノール性水酸化ナトリウム溶液中水浴上で３０分還流
させた。反応溶液に温水８０mlを加え、冷５Ｎ−ＨＣｌ
にてpH２に調整し、折出した結晶を凝集し五酸化リン上
で真空乾燥し１７．０ｇを得た。この結晶６．７ｇを乾
燥ベンゼン２５ml中塩化チオニル１．８mlとピリジン数
滴を加え水浴上で４０分還流させた。反応後、冷却しｎ
−ヘキサンを加え折出した結晶を凝集し、五酸化リン上
で真空乾燥し結晶３ｇを得た。この結晶３ｇをベンゼン
６mlに溶解した液を、ジメチルアミノエタノール１mlを
ベンゼン１６mlに溶解した液に５〜１０℃に冷却しなが
ら滴下した。滴下後室温で一晩撹拌し反応させた後、水
及び飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、１．９ｇの油状物
を得た。これをエタノール２６０mlに溶解し、パラジウ
ム黒１ｇを加え接触還元を５時間行い、触媒を濾別して
溶媒を減圧留去し、油状物０．９ｇを得た。これをアセ
トン９mlに溶解し、ヨウ化メチル０．６ｇを加え室温で
一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、ア
セトンで洗浄し、五酸化リン上で一晩真空乾燥し、２，
３−ジヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイド０．８
５ｇを得た。融点２０８〜２１０℃。
ダイドの合成法 ２，３−ジヒドロキシ安息香酸１２．３ｇを濃硫酸２．
４mlを含むメタノール４０ml中で油浴上で１０時間還流
後、溶媒を減圧留去し油状残留物にエーテルを加え、飽
和食塩水で洗浄しエーテル相を無水硫酸マグネシウム上
で乾燥後、溶媒を減圧留去し結晶残留物１１．８ｇを得
た。これをエーテル／ｎ−ヘキサンより再結晶し２，３
−ジヒドロキシ安息香酸メチエステル１０．７ｇを得
た。この１０ｇを防湿下ＤＭＦ２６．０ml中無水炭酸カ
リウム２５．１ｇおよびベンジルクロライド１６．５ml
を加え油浴上で１５０〜１６０℃で３０分反応させた。
反応終了後、冷水１６０mlに加え結晶を凝集しよく水洗
し２０．７ｇの結晶を得た。これを水酸化ナトリウム
４．４ｇ、水２．２ml、メタノール８８mlから造つたメ
タノール性水酸化ナトリウム溶液中水浴上で３０分還流
させた。反応溶液に温水８０mlを加え、冷５Ｎ−ＨＣｌ
にてpH２に調整し、折出した結晶を凝集し五酸化リン上
で真空乾燥し１７．０ｇを得た。この結晶６．７ｇを乾
燥ベンゼン２５ml中塩化チオニル１．８mlとピリジン数
滴を加え水浴上で４０分還流させた。反応後、冷却しｎ
−ヘキサンを加え折出した結晶を凝集し、五酸化リン上
で真空乾燥し結晶３ｇを得た。この結晶３ｇをベンゼン
６mlに溶解した液を、ジメチルアミノエタノール１mlを
ベンゼン１６mlに溶解した液に５〜１０℃に冷却しなが
ら滴下した。滴下後室温で一晩撹拌し反応させた後、水
及び飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、１．９ｇの油状物
を得た。これをエタノール２６０mlに溶解し、パラジウ
ム黒１ｇを加え接触還元を５時間行い、触媒を濾別して
溶媒を減圧留去し、油状物０．９ｇを得た。これをアセ
トン９mlに溶解し、ヨウ化メチル０．６ｇを加え室温で
一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を濾取し、ア
セトンで洗浄し、五酸化リン上で一晩真空乾燥し、２，
３−ジヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイド０．８
５ｇを得た。融点２０８〜２１０℃。
この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー（ｎ−ブ
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポツト（Rf
＝０．３４）を与えた。
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポツト（Rf
＝０．３４）を与えた。
元素分析値 Ｃ12Ｈ18ＮＯ４Ｉ(M.W.367.166) 実測値（％） Ｃ：39.7 Ｈ：5.07 Ｎ：3.90 計算値（％） Ｃ：39.25 Ｈ：4.94 Ｎ：3.81 同様にして３，５−ジヒドロキシベンゾイルコリンアイ
オダイドを合成した。融点２０８〜２１０℃。
オダイドを合成した。融点２０８〜２１０℃。
この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー（ｎ−ブ
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポツト（Rf
＝０．３８）を与えた。
タノール：酢酸：水＝４：１：２）で単一スポツト（Rf
＝０．３８）を与えた。
元素分析値 Ｃ12Ｈ18ＮＯ４Ｉ(M.W.367.166) 実測値（％） Ｃ：39.11 Ｈ：5.05 Ｎ：3.88 計算値（％） Ｃ：39.25 Ｈ：4.94 Ｎ：3.81 １ＲスペクトルおよびＵＶスペクトルをそれぞれ第１図
〜第４図に示した。
〜第４図に示した。
実施例１ (1)２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液 （pH８．２０、２５℃） (2)検体 (3)２．０ｍＭ基質（化合物Ｉ）液 (1)の緩衝液２．０mlに検体０．０２５mlを加え、２〜
１０分間程度３７℃で予加温し、それに(3)の基質液
０．５mlを加え、すばやく撹拌してから、分光光度計で
測定する。基質の３４０ｎｍにおける吸光度を経時的に
測定追跡する。グリシルグリシン緩衝液のpHは２５℃で
調整した。血清はコンセーラＩ（日水製薬社製）を使用
し、血清希釈は５％アルブミンを含む０．８７７％食塩
水で行つた。
１０分間程度３７℃で予加温し、それに(3)の基質液
０．５mlを加え、すばやく撹拌してから、分光光度計で
測定する。基質の３４０ｎｍにおける吸光度を経時的に
測定追跡する。グリシルグリシン緩衝液のpHは２５℃で
調整した。血清はコンセーラＩ（日水製薬社製）を使用
し、血清希釈は５％アルブミンを含む０．８７７％食塩
水で行つた。
第５図に血清希釈濃度とΔＯＤとの関係を示した。この
結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事実
はＣｈＥ活性とΔＯＤとが比例関係にあることをあらわ
すとともに、この新規なＣｈＥ活性測定方法の実用性あ
るいは有用性を示している。
結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事実
はＣｈＥ活性とΔＯＤとが比例関係にあることをあらわ
すとともに、この新規なＣｈＥ活性測定方法の実用性あ
るいは有用性を示している。
実施例２ 実施例１の(1)の緩衝液のpHを７．６０から８．６０ま
で変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適pHを求め
た。緩衝液のpH以外は全て実施例１に従つた。その結果
を第６図に示した。この条件下では至適pHは８．２０か
ら８．６０であつた。
で変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適pHを求め
た。緩衝液のpH以外は全て実施例１に従つた。その結果
を第６図に示した。この条件下では至適pHは８．２０か
ら８．６０であつた。
実施例３ 実施例１の(1)の緩衝液２．０mlに(3)の基質液０．５ml
を加え、３７℃の保温セルに入れ、波長３４０ｎｍにお
ける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非酵素的加
水分解安定性を調べた。その結果は第７図に示したごと
く、１０分まではほとんど安定であつた。基質化合物Ｉ
は至適pH８．２０において安定であるので、検体のごと
の試薬ブランクを測定する必要はない。
を加え、３７℃の保温セルに入れ、波長３４０ｎｍにお
ける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非酵素的加
水分解安定性を調べた。その結果は第７図に示したごと
く、１０分まではほとんど安定であつた。基質化合物Ｉ
は至適pH８．２０において安定であるので、検体のごと
の試薬ブランクを測定する必要はない。
実施例４ 実施例１の測定法に従い、反応系での下記の添加物の影
響を調べた。
響を調べた。
測定結果は相対活性（％）で第８図から第１５図に示し
た。ＮａＦはプソイドコリンエステラーゼの阻害剤であ
るので、ＮａＦの存在下では一般にＣｈＥ活性の測定は
いかなる方法でも正しい測定値を与えない。従つて、第
１５図のＮａＦの結果よりプソイドコリンエステラーゼ
活性を測定する場合には、抗凝固剤としてＮａＦは使用
することができない。
た。ＮａＦはプソイドコリンエステラーゼの阻害剤であ
るので、ＮａＦの存在下では一般にＣｈＥ活性の測定は
いかなる方法でも正しい測定値を与えない。従つて、第
１５図のＮａＦの結果よりプソイドコリンエステラーゼ
活性を測定する場合には、抗凝固剤としてＮａＦは使用
することができない。
実施例５ 血清ＣｈＥ活性測定方法 実施例１の測定方法に従い、下記の血清を用いて測定し
た。
た。
(1)血清Ｉ：コンセーラＩ（×２） 0.025ml (2)血清II：コンセーラＩ 0.025ml (3)血清III：プレチパスＥ 0.025ml 血清希釈は５％アルブミンを含む０．８７７％食塩水で
行つた。
行つた。
ＣｈＥ活性値は下記の式により計算した。
1)ΔＯＤは測定波長３４０ｎｍにおける１分間当りの吸
光度の変化量。
光度の変化量。
2)波長３４０ｎｍにおける分子吸光係数は２４５８であ
る。
る。
第１６図に示した如く、３種共に、血清希釈と酵素活性
は非常に良く原点を通過する直線的な比例関係にあつ
た。
は非常に良く原点を通過する直線的な比例関係にあつ
た。
第１図は２，３−ジヒドロキシベンゾイルコリンアイオ
ダイドの１Ｒスペクトル図である。第２図は３，５−ジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイドの１Ｒスペク
トル図である。第３図はa)２，３−ジヒドロキシベンゾ
イルコリンアイオダイド（濃度１００μＭ）およびb)
２，３−ジヒドロキシ安息香酸（濃度１００μＭ）のＵ
Ｖスペクトル図〔２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液
（pH８．２０）中〕である。第４図はa)３，５−ジヒド
ロキシベンゾイルコリンアイオダイド（濃度１００μ
Ｍ）およびb)３，５−ジヒドロキシ安息香酸（濃度１０
０μＭ）のＵＶスペクトル図〔２００ｍＭグリシルグリ
シン緩衝液（pH８．６０）中〕である。第５図は希釈血
清とΔＯＤとの関係を示すグラフである。第６図はＣｈ
Ｅの至適pHを示すグラフである。第７図は２，３−ジヒ
ドロキシベンゾイルコリンアイオダイドの非酵素的加水
分解安定性を示すグラフである。第８図〜第１５図は添
加物の影響を示すグラフである。第１６図は３種の血清
についての希釈血清と酵素活性との関係を示すグラフで
ある。
ダイドの１Ｒスペクトル図である。第２図は３，５−ジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイドの１Ｒスペク
トル図である。第３図はa)２，３−ジヒドロキシベンゾ
イルコリンアイオダイド（濃度１００μＭ）およびb)
２，３−ジヒドロキシ安息香酸（濃度１００μＭ）のＵ
Ｖスペクトル図〔２００ｍＭグリシルグリシン緩衝液
（pH８．２０）中〕である。第４図はa)３，５−ジヒド
ロキシベンゾイルコリンアイオダイド（濃度１００μ
Ｍ）およびb)３，５−ジヒドロキシ安息香酸（濃度１０
０μＭ）のＵＶスペクトル図〔２００ｍＭグリシルグリ
シン緩衝液（pH８．６０）中〕である。第５図は希釈血
清とΔＯＤとの関係を示すグラフである。第６図はＣｈ
Ｅの至適pHを示すグラフである。第７図は２，３−ジヒ
ドロキシベンゾイルコリンアイオダイドの非酵素的加水
分解安定性を示すグラフである。第８図〜第１５図は添
加物の影響を示すグラフである。第１６図は３種の血清
についての希釈血清と酵素活性との関係を示すグラフで
ある。
Claims (1)
- 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｙ１は２位または５
位に、Ｙ２は３位に置換された水酸基を表わす）で表わ
されるコリン誘導体を基質として用いることを特徴とす
るコリンエステラーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61086744A JPH0650997B2 (ja) | 1986-04-15 | 1986-04-15 | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
| DE8787105517T DE3780201D1 (de) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | Verfahren zur bestimmung der cholinesteraseaktivitaet. |
| US07/038,293 US4861713A (en) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | Novel method for determining cholinesterase activity |
| EP87105517A EP0241915B1 (en) | 1986-04-15 | 1987-04-14 | Method for determining cholinesterase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61086744A JPH0650997B2 (ja) | 1986-04-15 | 1986-04-15 | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62244397A JPS62244397A (ja) | 1987-10-24 |
| JPH0650997B2 true JPH0650997B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=13895298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61086744A Expired - Lifetime JPH0650997B2 (ja) | 1986-04-15 | 1986-04-15 | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4861713A (ja) |
| EP (1) | EP0241915B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0650997B2 (ja) |
| DE (1) | DE3780201D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2095495C (en) * | 1992-06-01 | 2002-06-04 | Stephen Carl Hasselberg | Assay for serum cholinesterase |
| FR2776289B1 (fr) | 1998-03-20 | 2001-02-02 | Oreal | Composition de teinture d'oxydation contenant un coupleur cationique, procedes de teinture, nouveaux coupleurs cationiques |
| US6764831B2 (en) | 1998-11-23 | 2004-07-20 | Proteome Sciences, Inc. | Methods and compositions for pain management |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2914721A1 (de) * | 1978-04-17 | 1979-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur bestimmung der cholinesterase-aktivitaet sowie fuer dieses verfahren verwendbare cholin-derivate |
| JPS5935599B2 (ja) * | 1980-12-25 | 1984-08-29 | 株式会社 シノテスト研究所 | コリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| JPS57144999A (en) * | 1981-03-04 | 1982-09-07 | Fujirebio Inc | Measurement of activity of cholinesterase |
| JPS5854800A (ja) * | 1981-09-29 | 1983-03-31 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | ステレオ・アンプの出力回路 |
| JPS603837A (ja) * | 1983-06-22 | 1985-01-10 | Hitachi Ltd | マグネトロン |
| JPS603838A (ja) * | 1983-06-22 | 1985-01-10 | Nec Corp | ジヤイロトロン用空胴共振器 |
| JPS60238000A (ja) * | 1984-05-10 | 1985-11-26 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
-
1986
- 1986-04-15 JP JP61086744A patent/JPH0650997B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-14 DE DE8787105517T patent/DE3780201D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-14 EP EP87105517A patent/EP0241915B1/en not_active Expired
- 1987-04-14 US US07/038,293 patent/US4861713A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3780201T2 (ja) | 1992-12-24 |
| JPS62244397A (ja) | 1987-10-24 |
| US4861713A (en) | 1989-08-29 |
| DE3780201D1 (de) | 1992-08-13 |
| EP0241915A1 (en) | 1987-10-21 |
| EP0241915B1 (en) | 1992-07-08 |
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