JPS60238000A - 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 - Google Patents
新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法Info
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- JPS60238000A JPS60238000A JP59093547A JP9354784A JPS60238000A JP S60238000 A JPS60238000 A JP S60238000A JP 59093547 A JP59093547 A JP 59093547A JP 9354784 A JP9354784 A JP 9354784A JP S60238000 A JPS60238000 A JP S60238000A
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- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般式（１）
（式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされるコリン
誘導体を基質として用いることを特徴とするコリンエス
テラーゼ活性の測定法に関する。
誘導体を基質として用いることを特徴とするコリンエス
テラーゼ活性の測定法に関する。
従来合成基質を使用する血清中のコリンエステラーゼ（
以下ＣｈＥと記す）活性の測定法は種々報告され、また
日常の臨床検査に実用化されているも゛のもある。しか
しそれらの測定法には褌々の欠点や問題点があり、測定
値の不正確さの原因になっている。それらの測定法の例
をあげると、ガス分析法、−メーター法、−指示薬比色
法、チオコリン発色法、酵素法％ Ｕ Ｖ法等がある。
以下ＣｈＥと記す）活性の測定法は種々報告され、また
日常の臨床検査に実用化されているも゛のもある。しか
しそれらの測定法には褌々の欠点や問題点があり、測定
値の不正確さの原因になっている。それらの測定法の例
をあげると、ガス分析法、−メーター法、−指示薬比色
法、チオコリン発色法、酵素法％ Ｕ Ｖ法等がある。
ガス分析法（Ｒ，Ａｍｍｏｎ 二ｐｆＦｕｇｅｒｓ Ａ
ｒｃｈ、Ｇｅ５Ｐｈｙｓｉｏ１．ｔ ２３３．４８７
（１９３３） ）は合成基質としてアセチルコリンを用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成した酢酸により炭酸水素ナ
トリウムから発生する炭酸ガスを定量する方法であるが
、操作が煩雑で多数の検体を処理することができないな
どの欠点がある。
ｒｃｈ、Ｇｅ５Ｐｈｙｓｉｏ１．ｔ ２３３．４８７
（１９３３） ）は合成基質としてアセチルコリンを用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成した酢酸により炭酸水素ナ
トリウムから発生する炭酸ガスを定量する方法であるが
、操作が煩雑で多数の検体を処理することができないな
どの欠点がある。
一メーター法（Ｈ，Ｏ，Ｍｉｃｈｅｌ ： Ｊ、 Ｌａ
ｂ、 ＆Ｃ１１ｎ、 Ｍｅｄ、、 ３４．１５６４ （
１９４９） ）もガス分析法と同様にＣｈＥの酵素作用
によって生じた酢酸による−の変化を一メーターで測定
する方法であるが、−メーターの精度、多数の検体を処
理することができないなど実用上の問題がある。
ｂ、 ＆Ｃ１１ｎ、 Ｍｅｄ、、 ３４．１５６４ （
１９４９） ）もガス分析法と同様にＣｈＥの酵素作用
によって生じた酢酸による−の変化を一メーターで測定
する方法であるが、−メーターの精度、多数の検体を処
理することができないなど実用上の問題がある。
ｐ）Ｉ指示薬比色法はｐＨメーター法とは異なり、図に
より生じた酢酸によるＰＨの変化を指示薬の分子吸光度
を測定する方法で、指示薬としてはフェノールレッド〔
高橋浩、柴田進：医学と生物学、〃、９６ （１９５１
） ）、ブロムチモールブルー（Ｈ，Ｇ、 Ｂｉｇｇｓ
。
より生じた酢酸によるＰＨの変化を指示薬の分子吸光度
を測定する方法で、指示薬としてはフェノールレッド〔
高橋浩、柴田進：医学と生物学、〃、９６ （１９５１
） ）、ブロムチモールブルー（Ｈ，Ｇ、 Ｂｉｇｇｓ
。
ｅｔａｌ ： Ａｍａｒ、 、ｒ、 ｃｌｉｎ、 Ｐａ
ｔｈ、＋ ３０．１８１（１９５８） ）、ｍ−ニトロ
フェノール〔佐々木匡秀：臨床病理、１２゜５５５ （
１９６４） ）などが使われている。この方法は操作も
簡便で多数の検体を処理することもできるが、反応時間
が長く、反応中にもｐＨが一定でなく、低値と高値で再
現性があまり良くないなどの欠点が指摘されている。
ｔｈ、＋ ３０．１８１（１９５８） ）、ｍ−ニトロ
フェノール〔佐々木匡秀：臨床病理、１２゜５５５ （
１９６４） ）などが使われている。この方法は操作も
簡便で多数の検体を処理することもできるが、反応時間
が長く、反応中にもｐＨが一定でなく、低値と高値で再
現性があまり良くないなどの欠点が指摘されている。
上述したアセチルコリンを基質として用いる方法では、
アセチルコリンは非酵素的加水分解を起しやすく、また
基質特異性もあまりないので、基質そのものにも問題が
ある。
アセチルコリンは非酵素的加水分解を起しやすく、また
基質特異性もあまりないので、基質そのものにも問題が
ある。
チオコリン法（Ｐ、 Ｇａｒｒｙ ： Ｊ、 Ｃｌ１ｎ
、 Ｃｈｅｍ、。
、 Ｃｈｅｍ、。
１１ （２）、 ９１ （１９６５） ）は基質として
アセチルチオコリン、プロピルチオコリン、ブチルチオ
コリン等が使用されている。これらの基質はＣ’ｈＥの
酵素作用でチオコリンを生成し、それが５，５′−ジチ
オビス−２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して黄
色を生じる。この黄色の吸光度を比色計で測定する方法
である。この方法は反応性に優れ、感度が高く、また操
作も簡単で多数の検体を処理することができるとともに
初速変法もできるなど優れた点もあるが、呈色が黄色で
あるため血清中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなチオール基を有する化合物の影響も
まぬがれえないし、さらに基質そのものが不安定である
ことも問題になっているなどの欠点があり、測定値の誤
差の原因になっている。
アセチルチオコリン、プロピルチオコリン、ブチルチオ
コリン等が使用されている。これらの基質はＣ’ｈＥの
酵素作用でチオコリンを生成し、それが５，５′−ジチ
オビス−２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して黄
色を生じる。この黄色の吸光度を比色計で測定する方法
である。この方法は反応性に優れ、感度が高く、また操
作も簡単で多数の検体を処理することができるとともに
初速変法もできるなど優れた点もあるが、呈色が黄色で
あるため血清中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなチオール基を有する化合物の影響も
まぬがれえないし、さらに基質そのものが不安定である
ことも問題になっているなどの欠点があり、測定値の誤
差の原因になっている。
酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明他：臨床病理、２
５．７５１ （１９７７） ）とオルソトルオイルコリ
ン〔特開昭５４−１３８５３３ ）などを基質として用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼによりベタインに変化させ、その時生成する過酸
化・水素をペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアン
チピリジンフェノールなどとの酸化的縮合反応で発色さ
せる方法である。この方法は呈色が赤色になるので、血
清中のビリルビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処
理することもできるが、発色系の試薬として使用するフ
ェノールや４−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮
抗阻害があるので、それらの使用量が非常に限定され、
十分な発色が難しい。一般に過酸化水素を経由する定量
法は血清中のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性
物質による影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解な
どで生じるコリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを
基質として用いた場合は、非酵素的加水分解性も問題に
なっているなど種々の問題がある。
５．７５１ （１９７７） ）とオルソトルオイルコリ
ン〔特開昭５４−１３８５３３ ）などを基質として用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼによりベタインに変化させ、その時生成する過酸
化・水素をペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアン
チピリジンフェノールなどとの酸化的縮合反応で発色さ
せる方法である。この方法は呈色が赤色になるので、血
清中のビリルビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処
理することもできるが、発色系の試薬として使用するフ
ェノールや４−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮
抗阻害があるので、それらの使用量が非常に限定され、
十分な発色が難しい。一般に過酸化水素を経由する定量
法は血清中のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性
物質による影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解な
どで生じるコリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを
基質として用いた場合は、非酵素的加水分解性も問題に
なっているなど種々の問題がある。
ＵＶ法には２種類があり、一つはＷ、 Ｋａｌｏｗのベ
ンゾイルコリン（Ｗ、 Ｋａｌｏｗ ａｎｄ Ｋ、 Ｇ
ｅｎｅｔ ：Ｃａｎａｄ、 ｔＴ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
＆ Ｐｈｙｏｌｏｌ、、 ３５＋ ３３９（１９５７
） ）を基質とする方法であり、もう一つはｐ−ヒドロ
キシコリン〔特開昭５７−１１０１９８゜特開昭５８−
１２９９９９ ）を基質とする方法である。前者はＣｈ
Ｅの酵素作用によって基質が加水分解し、その基質が減
少していく様子を測定波長２４０ ｎｍで追跡していく
方法である。この方法の測定原理は直接基質の減少を測
定しているので年純明解であるが、測定波長が２４０
ｎｍであるため血清成分の干渉を受けやすいし、基質の
ベンゾイルコリンが基質阻害を起すため、反応液の基＊
＊度が限定され、直線性の範囲が狭く、またベンゾイル
コリンの非酵素的加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの
至適ＰＨで反応を行っていないなどの問題がある。後者
は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを使用し
、ＣｈＥの酵素作用によって生成するｐ−ヒドロキシ安
息香酸を補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐ−ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨが酸化されＮ
、ＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長５４０ ｎ
ｍで測定追跡する方法である。この方法はほぼ至適−で
反応が行えるし、過酸化水素−発色系における欠点、す
なわちビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質に
よる影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに多数の
検体処理が可能な自動分析装置に適した優れたＣｈＥ活
性測定法である。しかしながら、使用する補酵素ＮＡＤ
ＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一定の品質
に維持および管理するのが難しいし、また酵素としてｐ
−ヒドロキシ安息香配水酸化酵素やプロトカテキュ酸−
３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、測定原理とし
ては前者に比較して大分被雑であり、測定値の誤差要因
が多い。またＣｈＥ活性の測定法としては異型コリンエ
ステラーゼの活性測定も重要である。しかし、この後者
の方法はフッ化ナトリウムの影響を強く受けるため異型
コリンエステラーゼの活性４１１１定には問題がある。
ンゾイルコリン（Ｗ、 Ｋａｌｏｗ ａｎｄ Ｋ、 Ｇ
ｅｎｅｔ ：Ｃａｎａｄ、 ｔＴ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
＆ Ｐｈｙｏｌｏｌ、、 ３５＋ ３３９（１９５７
） ）を基質とする方法であり、もう一つはｐ−ヒドロ
キシコリン〔特開昭５７−１１０１９８゜特開昭５８−
１２９９９９ ）を基質とする方法である。前者はＣｈ
Ｅの酵素作用によって基質が加水分解し、その基質が減
少していく様子を測定波長２４０ ｎｍで追跡していく
方法である。この方法の測定原理は直接基質の減少を測
定しているので年純明解であるが、測定波長が２４０
ｎｍであるため血清成分の干渉を受けやすいし、基質の
ベンゾイルコリンが基質阻害を起すため、反応液の基＊
＊度が限定され、直線性の範囲が狭く、またベンゾイル
コリンの非酵素的加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの
至適ＰＨで反応を行っていないなどの問題がある。後者
は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを使用し
、ＣｈＥの酵素作用によって生成するｐ−ヒドロキシ安
息香酸を補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐ−ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨが酸化されＮ
、ＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長５４０ ｎ
ｍで測定追跡する方法である。この方法はほぼ至適−で
反応が行えるし、過酸化水素−発色系における欠点、す
なわちビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物質に
よる影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに多数の
検体処理が可能な自動分析装置に適した優れたＣｈＥ活
性測定法である。しかしながら、使用する補酵素ＮＡＤ
ＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一定の品質
に維持および管理するのが難しいし、また酵素としてｐ
−ヒドロキシ安息香配水酸化酵素やプロトカテキュ酸−
３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、測定原理とし
ては前者に比較して大分被雑であり、測定値の誤差要因
が多い。またＣｈＥ活性の測定法としては異型コリンエ
ステラーゼの活性測定も重要である。しかし、この後者
の方法はフッ化ナトリウムの影響を強く受けるため異型
コリンエステラーゼの活性４１１１定には問題がある。
以上に述べたごとく、従来のＣｈＥの酵素活性測定法に
は棟々の問題があり、測定値の誤差の原因になっている
。我々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し、一般式
（１）で表わされる化合物の１種であるプロトカテキュ
イルコリンアイオダイド（以下ＰＣＩと記す）を基質と
して用いる血清ＣｈＥ活性＆ ＩＩＩ定する新規な方法
を発明するに至った。
は棟々の問題があり、測定値の誤差の原因になっている
。我々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し、一般式
（１）で表わされる化合物の１種であるプロトカテキュ
イルコリンアイオダイド（以下ＰＣＩと記す）を基質と
して用いる血清ＣｈＥ活性＆ ＩＩＩ定する新規な方法
を発明するに至った。
第２図にＰＣＩとプロトカテキュ酸のＵＶスペクトルを
示した。ＰＣＩがＣｈＥの作用で加水分解するとコリン
とプロトカテキュ酸を生成する。コリンは波長３００
ｎｍ以−ヒではＵＶ吸収はない。プロトカテキュ酸は波
長３４０ ｎｍ以上ではＵＶ吸収はほとんどない。した
がって、ＰＣＩをＣｈＥ活性を測定する基質として使用
し、測定波長３４０から３６０ ｎ、ｍで反応を追跡す
れは、基質ＰＣＩの減少を正確に追うことができる。前
述のＷ、ＫａｌｏｗのＵＶ法１ま測定波長２４０ ｎｍ
であるので初期吸収において血液成分の干渉を大きく受
けるが、本発明の測定波長６４０かも３６０ ｎｍでは
あまり受けないので、至適な測定条件の設定が容易であ
る。
示した。ＰＣＩがＣｈＥの作用で加水分解するとコリン
とプロトカテキュ酸を生成する。コリンは波長３００
ｎｍ以−ヒではＵＶ吸収はない。プロトカテキュ酸は波
長３４０ ｎｍ以上ではＵＶ吸収はほとんどない。した
がって、ＰＣＩをＣｈＥ活性を測定する基質として使用
し、測定波長３４０から３６０ ｎ、ｍで反応を追跡す
れは、基質ＰＣＩの減少を正確に追うことができる。前
述のＷ、ＫａｌｏｗのＵＶ法１ま測定波長２４０ ｎｍ
であるので初期吸収において血液成分の干渉を大きく受
けるが、本発明の測定波長６４０かも３６０ ｎｍでは
あまり受けないので、至適な測定条件の設定が容易であ
る。
この基質ＰＣＩは非酵素的加水分解に対して非常に安定
である。たとえはＰＨが８．５の５９ ｍＭバルビター
ル緩衝液中６７°Ｃの条件下で９０分間ではほとんど加
水分解は起きなかった（第６図参照）。
である。たとえはＰＨが８．５の５９ ｍＭバルビター
ル緩衝液中６７°Ｃの条件下で９０分間ではほとんど加
水分解は起きなかった（第６図参照）。
この結果は測定中非酵素的加水分解は無視できることを
示している。ｐＨを一定に保持するための緩衝剤として
、バルビタール酸塩、リン酸塩、ビロリン酸塩、グリシ
ン、グリシルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンなどが使用できる。
示している。ｐＨを一定に保持するための緩衝剤として
、バルビタール酸塩、リン酸塩、ビロリン酸塩、グリシ
ン、グリシルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタンなどが使用できる。
上記以外の緩衝剤でもＰＨを７．５〜１０．０の間にお
いて緩衝能を維持できるものであれば用いることが可能
である。
いて緩衝能を維持できるものであれば用いることが可能
である。
ＣｈＥに対するＰＣＩのＫｍ値はベンゾイルコリンと同
程度で５０ ｍＭ ） ！７ス・マレイン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，２）では２．６ Ｘ １０”” ｍｏノ／ｌ ％
５０ ｍＭバルビタール緩衝液ＣｐＨ８，５）では５
．８８ ×１０−５ｍｏＪ／Ａ！である。ＰＣＩのＫｍ
値が十分小さいので、本発明の測定波の反応系では十分
な基質濃度で反応を行うことができ、経時的直線範囲が
広くなり、高単位の活性まで十分測定が可能である。
程度で５０ ｍＭ ） ！７ス・マレイン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，２）では２．６ Ｘ １０”” ｍｏノ／ｌ ％
５０ ｍＭバルビタール緩衝液ＣｐＨ８，５）では５
．８８ ×１０−５ｍｏＪ／Ａ！である。ＰＣＩのＫｍ
値が十分小さいので、本発明の測定波の反応系では十分
な基質濃度で反応を行うことができ、経時的直線範囲が
広くなり、高単位の活性まで十分測定が可能である。
ＰＣＩを基質として用いた場合、５０ ｍＭバルビター
ル緩衝液ではＣｈＥの至適−は８．５〜８．６であった
（第５図参照）。前述のごと＜ ｐＣｒはｐｌ−１８，
５で非酵素的加水分解安定性があるめで、本発明の測定
法はｃｈｇの至適の市で反応を行うことができる。
ル緩衝液ではＣｈＥの至適−は８．５〜８．６であった
（第５図参照）。前述のごと＜ ｐＣｒはｐｌ−１８，
５で非酵素的加水分解安定性があるめで、本発明の測定
法はｃｈｇの至適の市で反応を行うことができる。
検体中の共存物質が測定値に影響する場合、測定値の誤
差原因になることは前述の通りである。
差原因になることは前述の通りである。
本発明の方法は測定原理的にみても共存物質の影響を受
け難い。共存物質たとえば、アスコルビン酸２０即／ａ
ｔ、尿酸２０１１ＱＡＩ 、グルコース５００ｍｐ／ａ
ｚ 、ヘモグロビン２００ ｍｙ／ｄｔ 、アルジミン
５、！９／ｄｔ、ビリルビン２０１ｎｇ／ｄｌ！、クル
タチオン（還元型） ５０ ｍｌ？／ｄｉまでは添加試
験では問題はなかった（第７図〜第１３図参照）。抗凝
固剤ＥＤＴＥ・２Ｎａ 、クエン酸塩、ヘパリン、蓚酸
塩、二重シュウ酸等の添加試験でも問題はなかった（第
１４図参照）。本発明は共存物質の影箒な非常に受け難
い方法であり、測定値の誤差原因が大幅に解消された。
け難い。共存物質たとえば、アスコルビン酸２０即／ａ
ｔ、尿酸２０１１ＱＡＩ 、グルコース５００ｍｐ／ａ
ｚ 、ヘモグロビン２００ ｍｙ／ｄｔ 、アルジミン
５、！９／ｄｔ、ビリルビン２０１ｎｇ／ｄｌ！、クル
タチオン（還元型） ５０ ｍｌ？／ｄｉまでは添加試
験では問題はなかった（第７図〜第１３図参照）。抗凝
固剤ＥＤＴＥ・２Ｎａ 、クエン酸塩、ヘパリン、蓚酸
塩、二重シュウ酸等の添加試験でも問題はなかった（第
１４図参照）。本発明は共存物質の影箒な非常に受け難
い方法であり、測定値の誤差原因が大幅に解消された。
コリンエステラーゼには血清中に存在するシソイドコリ
ンエステラーゼと赤血球中に存在するツルーコリンエス
テーゼの二種が知られている。通常臨床検査で測定され
ているのは血清中のシンイドコリンエステラーゼである
が、血清中にツルーコリンエステラーゼが混入している
場合があるので、検査目的としてはプソイドコリンエス
テラーゼのみと選択的反応する基質が望ましい。本発明
の方法に用いるＰＣＩはシソイドコリンエステラーゼと
は良く反応するが、ツルーコリンエステーゼとはほとん
ど反応しない非常に特異性の高い基質である。
ンエステラーゼと赤血球中に存在するツルーコリンエス
テーゼの二種が知られている。通常臨床検査で測定され
ているのは血清中のシンイドコリンエステラーゼである
が、血清中にツルーコリンエステラーゼが混入している
場合があるので、検査目的としてはプソイドコリンエス
テラーゼのみと選択的反応する基質が望ましい。本発明
の方法に用いるＰＣＩはシソイドコリンエステラーゼと
は良く反応するが、ツルーコリンエステーゼとはほとん
ど反応しない非常に特異性の高い基質である。
外科および精神科領域で麻酔剤とプソイドコリンエステ
ラーゼの関係で異常プソイドコリンエステラーゼ検査が
重要である。本発明の測定方法は反応機構的に単純明解
なので異常プソイドコリンエステラーゼ検査法として非
常に適している。
ラーゼの関係で異常プソイドコリンエステラーゼ検査が
重要である。本発明の測定方法は反応機構的に単純明解
なので異常プソイドコリンエステラーゼ検査法として非
常に適している。
本発明のＣｂＥ活性測定方法は上記のごとく種々の点で
従来法の問題点が解決されている。本発明の利点を記す
と次のごとくである。
従来法の問題点が解決されている。本発明の利点を記す
と次のごとくである。
（１）測定系の反応機構が単純明解で、測定値の誤差原
因が非常に少い。
因が非常に少い。
（２）基質に用いるＰＣＩが非酵素的加水分解や酸化に
対して安定なので、測定値の再現性が非常に良い。
対して安定なので、測定値の再現性が非常に良い。
（３） ＰＣＩはシンイドコリンエステラーゼに対して
、基質特異性が高い。
、基質特異性が高い。
（４）基質ＰＣＩ以外に酸化還元系の酵素や補酵素、１
呈色系の試薬など用いないので安価である。
（５） 前記のごとく、ビリルビン、アスコルビン酸、
グルタチオン等の検体成分や抗凝固剤の影響をほとんど
受けない。
グルタチオン等の検体成分や抗凝固剤の影響をほとんど
受けない。
（６）検体ごとに検体ブランクをたてる必要がないので
簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理することが
可能である。
簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理することが
可能である。
（７）異常プソイドコリンエステラーゼ検査が可能であ
る。
る。
（８）ＰＣＩが安定なので、至適ｐＨ（８，５〜８．６
）での反応が可能である。
）での反応が可能である。
（９）高単位まで測定可能である。
以上のごとく、本発明のｃｈｇ活性測定方法は従来法の
有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣｈ
Ｅ活性測定に充分貢献できるものである。
有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣｈ
Ｅ活性測定に充分貢献できるものである。
以下に参考例および実施例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
２
参考例１ プロトカテキュイルコリンアイオダイドの合
成法 プロトカテキュ酸１０ｇを２．７３ Ｎ ＮａＯＨ７１
Ｍに溶解し、０〜５°Ｃに氷冷し、激しく攪拌しなから
カルボベンゾキシクロライド２２ｍ１を滴下した。ＰＨ
を９〜１０に保つように２．７３ Ｎ ＮａＯＨも同時
に滴下した。約１時間でｐＨは一定になり、次いで°室
温で３時間楕拌下反応させ、反応終了後冷５ Ｎ Ｈ”
ＣＩでＰＨを２に調整し、酢酸エチル２００−１次いで
１００ｍ１で抽出し、酢酸エチル相を合せ、食塩水で洗
浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥後、溶媒を減圧留
去し、油状物２５．！ｉ’を得た。これを酢酸エチル／
ｎ−へキサンより再結晶し、０．０′−ジカルボペンゾ
キシプロトカテキュ酸９．２ｇを得た。この４ｇを防湿
下エーテル５Ｑｍｌに懸濁し、五塩化リン２ｇを粉末で
加え、室温で攪拌下５時間反応させた。反応終了後溶媒
を減圧留去し、油状物４．５ｇを得た。これをベンゼン
２０ｍ１ｉに溶解した液をジメチルアミノエタノール２
ｄをベンゼン３Ｑｍｌに溶解した液に５〜１０°Ｃに冷
却しながら滴下した。滴下後室塩で一晩攪拌し、反応さ
せた後、水次いで飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無
水硫酸マグネシウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、４．
９．９の油状物を得た。これをエタノール２６０ ｍｌ
に溶解し、パラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間
行い、触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、油状物
３ｇを得た。これをアセトン９０ｒｎｌに溶解し、ヨウ
化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室温で一晩放置す
ると結晶が析出した。この結晶を濾取し、アセトンで良
く洗浄後五酸化リン上で一晩減圧乾燥し、本発明の新規
化合物プロトカテキュイルコリンアイオダイド２．５ｇ
を得た。融点２０５〜２０９°にの結晶はシリカゲル薄
層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４
：１：２）で単一のスポット（Ｒｆ＝０．３１）を与え
た。
成法 プロトカテキュ酸１０ｇを２．７３ Ｎ ＮａＯＨ７１
Ｍに溶解し、０〜５°Ｃに氷冷し、激しく攪拌しなから
カルボベンゾキシクロライド２２ｍ１を滴下した。ＰＨ
を９〜１０に保つように２．７３ Ｎ ＮａＯＨも同時
に滴下した。約１時間でｐＨは一定になり、次いで°室
温で３時間楕拌下反応させ、反応終了後冷５ Ｎ Ｈ”
ＣＩでＰＨを２に調整し、酢酸エチル２００−１次いで
１００ｍ１で抽出し、酢酸エチル相を合せ、食塩水で洗
浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥後、溶媒を減圧留
去し、油状物２５．！ｉ’を得た。これを酢酸エチル／
ｎ−へキサンより再結晶し、０．０′−ジカルボペンゾ
キシプロトカテキュ酸９．２ｇを得た。この４ｇを防湿
下エーテル５Ｑｍｌに懸濁し、五塩化リン２ｇを粉末で
加え、室温で攪拌下５時間反応させた。反応終了後溶媒
を減圧留去し、油状物４．５ｇを得た。これをベンゼン
２０ｍ１ｉに溶解した液をジメチルアミノエタノール２
ｄをベンゼン３Ｑｍｌに溶解した液に５〜１０°Ｃに冷
却しながら滴下した。滴下後室塩で一晩攪拌し、反応さ
せた後、水次いで飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無
水硫酸マグネシウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、４．
９．９の油状物を得た。これをエタノール２６０ ｍｌ
に溶解し、パラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間
行い、触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、油状物
３ｇを得た。これをアセトン９０ｒｎｌに溶解し、ヨウ
化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室温で一晩放置す
ると結晶が析出した。この結晶を濾取し、アセトンで良
く洗浄後五酸化リン上で一晩減圧乾燥し、本発明の新規
化合物プロトカテキュイルコリンアイオダイド２．５ｇ
を得た。融点２０５〜２０９°にの結晶はシリカゲル薄
層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４
：１：２）で単一のスポット（Ｒｆ＝０．３１）を与え
た。
元素分析値二Ｃよ２Ｈ１８ＮＯ，Ｉ（Ｍ、Ｗ、３６７
、１６６＞として実測値（％） Ｃ： ３９．３４ Ｈ
： ５．０７ Ｎ： ３．９０計算値（％） Ｃ： ３
９．２５ Ｈ： ４．９４ Ｎ： ３．８１１Ｒスペク
トルおよびＵＶスペクトルをそれぞれ第１図およ′び第
２図に示した。
、１６６＞として実測値（％） Ｃ： ３９．３４ Ｈ
： ５．０７ Ｎ： ３．９０計算値（％） Ｃ： ３
９．２５ Ｈ： ４．９４ Ｎ： ３．８１１Ｒスペク
トルおよびＵＶスペクトルをそれぞれ第１図およ′び第
２図に示した。
実施例１
血清ＣｈＥ活性測定方法
（１）５０ｍＭバルビタール緩衝液（ＰＨ８，５，２５
°Ｃ）（２）検体 （３） ６．３ｍＭ基質（ＰＣＩ）液 （１）ノ緩衝液２．Ｑｍｌに検体Ｑ、１ｍ、ｌを加え、
２〜１０定する。基質の３４０ｎｍＫおける吸光度を経
時的に測定追跡する。第３図は血清および希釈血清にお
けるタイムコースを各２度測定した結果である。
°Ｃ）（２）検体 （３） ６．３ｍＭ基質（ＰＣＩ）液 （１）ノ緩衝液２．Ｑｍｌに検体Ｑ、１ｍ、ｌを加え、
２〜１０定する。基質の３４０ｎｍＫおける吸光度を経
時的に測定追跡する。第３図は血清および希釈血清にお
けるタイムコースを各２度測定した結果である。
バルビタール緩衝液のＰＨは２５℃で調整した。血清は
コンセーラＩ（日永製薬社製）を使用し、血清希釈は０
．８７７％食塩水で行った。第６図かられかるように、
各血清において８分までは直線性を示した。第４図に血
清希釈濃度とΔＯ，Ｄ、との関係を示した。この結果は
原点を通過するきれいな直線を示した。この事実はＣｈ
Ｅ活性とΔＯ，Ｄ、とが比例関係にあることをあられす
とともに、この新規なＣｈＥ活性測定方法の実用性およ
び有用性を示している。
コンセーラＩ（日永製薬社製）を使用し、血清希釈は０
．８７７％食塩水で行った。第６図かられかるように、
各血清において８分までは直線性を示した。第４図に血
清希釈濃度とΔＯ，Ｄ、との関係を示した。この結果は
原点を通過するきれいな直線を示した。この事実はＣｈ
Ｅ活性とΔＯ，Ｄ、とが比例関係にあることをあられす
とともに、この新規なＣｈＥ活性測定方法の実用性およ
び有用性を示している。
実施例２
実施例１の（１）の緩衝液の−を７．４から９．２まで
変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適ｐＨをめた。
変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適ｐＨをめた。
緩衝液のＰＨ以外は全て実施例１に従った。その結果を
第５図に示した。この条件下では至適ｐＨは８．５から
８．６であった。
第５図に示した。この条件下では至適ｐＨは８．５から
８．６であった。
実施例３
実施例１の（１）ノ緩衝液２．０ｍｌに（３）の基質液
０．１ｍｌを加え、６７℃の保温セルに入れ、波長３４
０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の
非酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６図に
示したごとく、９０分まではほとんど安定であった。基
質ＰＣＩは至適ｐ８８．５において安定であるので、検
体ごとの試薬ブランクを測定する必要はない。
０．１ｍｌを加え、６７℃の保温セルに入れ、波長３４
０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の
非酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６図に
示したごとく、９０分まではほとんど安定であった。基
質ＰＣＩは至適ｐ８８．５において安定であるので、検
体ごとの試薬ブランクを測定する必要はない。
実施例４
実施例１の測定法に従い、反応系での下記の添加物の影
響を調べた。
響を調べた。
０
添加物 添加量
（１） ７ スｓ ／Ｉ／ ２” ン酸 ０〜２０１ｎ
９／ｄｌ（２）グルコース ｏ〜５ｏｏｍｇ／ｄｌ（３
）尿酸ｏ〜２０■／ｄｌ （４） へモグロビｙ （１１−５００１＋Ｉ＆／ｄｊ
（５） アルジミン ０〜５ ｙ／ｄｔ（６） ビリル
ビ／ ０〜２０ ｍｌ！／ｄｉ（カ グルタチオンｏ〜
５０ＩｎＯ／ｄ！（８）抗凝固剤 二重蓚酸 ２００ を／ａ ７ 蓚酸ソーダ ２００１ｎ９／ｄｔ ヘパリン ２〜／ａｚ クエン酸ソーダ ５００ 即／ａｔ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２００ ｍｙ／ ｄｊＮａＦ ５０
０ ｍｙ／ａｔ 測定結果は相対活性（％）で第７図から第１４図に示し
た。ヘモグロビンは３００■／ａ ｔの添加で相対活性
が９７．３％であったので、この程度までは測定可能で
ある。ＮａＦはプソイドコリンエステ６ ラーゼの阻害剤であるので、ＮａＦの存在下では一般に
ＣｈＥ活性の測定はいかなる方法でも正しい測定値を与
えない。従って、第１４図のＮａＦの結果よりプソイド
コリンエステラーゼ活性を測定する場合には、抗凝固剤
としてＮａＦは使用することができない。
９／ｄｌ（２）グルコース ｏ〜５ｏｏｍｇ／ｄｌ（３
）尿酸ｏ〜２０■／ｄｌ （４） へモグロビｙ （１１−５００１＋Ｉ＆／ｄｊ
（５） アルジミン ０〜５ ｙ／ｄｔ（６） ビリル
ビ／ ０〜２０ ｍｌ！／ｄｉ（カ グルタチオンｏ〜
５０ＩｎＯ／ｄ！（８）抗凝固剤 二重蓚酸 ２００ を／ａ ７ 蓚酸ソーダ ２００１ｎ９／ｄｔ ヘパリン ２〜／ａｚ クエン酸ソーダ ５００ 即／ａｔ ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２００ ｍｙ／ ｄｊＮａＦ ５０
０ ｍｙ／ａｔ 測定結果は相対活性（％）で第７図から第１４図に示し
た。ヘモグロビンは３００■／ａ ｔの添加で相対活性
が９７．３％であったので、この程度までは測定可能で
ある。ＮａＦはプソイドコリンエステ６ ラーゼの阻害剤であるので、ＮａＦの存在下では一般に
ＣｈＥ活性の測定はいかなる方法でも正しい測定値を与
えない。従って、第１４図のＮａＦの結果よりプソイド
コリンエステラーゼ活性を測定する場合には、抗凝固剤
としてＮａＦは使用することができない。
実施例５
血清ＣｈＥ阻害活性の測定法
（１） ５０ｍＭパルビタール緩衝液（ｐＨａ５．２５
°Ｃ）（２） 検体 （３） ６．５ｍＭ基質（ＰＣＩ）液 （４） ６．５ｍＭ基質（ＰＣＩ）と０．４４ｍＭジプ
カイン液（５１６，３ｍＭ基質（ＰＣＩ ）と２２０
ｍＭ ＮａＦ液（１）、（２）および（３）は実施例１
と同一のものである。
°Ｃ）（２） 検体 （３） ６．５ｍＭ基質（ＰＣＩ）液 （４） ６．５ｍＭ基質（ＰＣＩ）と０．４４ｍＭジプ
カイン液（５１６，３ｍＭ基質（ＰＣＩ ）と２２０
ｍＭ ＮａＦ液（１）、（２）および（３）は実施例１
と同一のものである。
（４）および（５）は基質と阻害剤の各指定しである濃
度の混合液である。測定方法は実施例１の方法と同じで
ある。すなわち（３）の液のかわりに（４）または（５
）の液を加え、反応を測定波長３４０ ｎｍで追跡した
。結果はジプカイン添加では８０％、ＮａＦ添加では５
７．．９チ阻害された。
度の混合液である。測定方法は実施例１の方法と同じで
ある。すなわち（３）の液のかわりに（４）または（５
）の液を加え、反応を測定波長３４０ ｎｍで追跡した
。結果はジプカイン添加では８０％、ＮａＦ添加では５
７．．９チ阻害された。
実施例６
血清ＣｈＥ活性測定法
（１） ２５０ ｍＭ基質（ＰＣＩ）液 ２．０ｍ１（
５０ｍＭ ）リス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８，２，２
５°Ｃ）に溶解〕 （２） 血清または希釈血清 （１）血清１：コｙセーラＴ Ｄ、１ｍ１（ＩＩ） 血
清１：ｒｙセーラＩ Ｏ，２ｍ１（ｌｉｉ） 血清■：
ゾレチパスＥ Ｑ、１ｍＡ！（１） ノ２．０ ｍｌを
２〜１０分間６７℃で予加温し、それに（２）の血清又
は希釈血清をＱ、１ｍｌまたは０．２−加え、すばやく
攪拌してから分光器の６７℃に保温されたセルに入れ、
測定波長３４０ｎｍで吸光度の減少を測定追跡する。（
１）の緩衝液の可調整は２５℃で行った。血清はコンセ
ーラＩ（日永製薬社製）とプレチパスＥ（ベーリンガー
・マンノ・イム社製）を使用し、血清希釈は０．８７７
１食塩水で行った。
５０ｍＭ ）リス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ８，２，２
５°Ｃ）に溶解〕 （２） 血清または希釈血清 （１）血清１：コｙセーラＴ Ｄ、１ｍ１（ＩＩ） 血
清１：ｒｙセーラＩ Ｏ，２ｍ１（ｌｉｉ） 血清■：
ゾレチパスＥ Ｑ、１ｍＡ！（１） ノ２．０ ｍｌを
２〜１０分間６７℃で予加温し、それに（２）の血清又
は希釈血清をＱ、１ｍｌまたは０．２−加え、すばやく
攪拌してから分光器の６７℃に保温されたセルに入れ、
測定波長３４０ｎｍで吸光度の減少を測定追跡する。（
１）の緩衝液の可調整は２５℃で行った。血清はコンセ
ーラＩ（日永製薬社製）とプレチパスＥ（ベーリンガー
・マンノ・イム社製）を使用し、血清希釈は０．８７７
１食塩水で行った。
ＣｈＥ活性値は下記の弐により計算される。
９
１）ΔＯＤは測定波長３４０ ｎｍにおける１分間当り
の吸光度の変化量。
の吸光度の変化量。
２）波長３４０ ｎｍにおける分子吸光係数は２９６０
である。
である。
第１５図に示した如く、３種共に、血清希釈と酵素活性
は非常に良く原点を通過する直線的な比例関係にあった
。
は非常に良く原点を通過する直線的な比例関係にあった
。
第１図はプロトカテキュイルコリンアイオダイＰのＩＲ
スペクトルを示す。第２図は（ａ）プロトカテキュイル
コリンアイオダイド（濃度１００μＭ）および（ｂ）プ
ロトカテキュ酸（濃度１００μＭ）のＵＶスペクトルＣ
５０ｍＭバルビタール緩衝液（ｐＨ８，５）中〕を示す
。第３図は希釈血清によるタイムコースを示す。第４図
は血清希釈とΔＯ，Ｄ、との関係を示す。第５図はｃｈ
ｇの至適ＰＨな示す。第６図は基質の非酵素的加水分解
安定性を示す。第７図〜第１４図は添加物の影響を示す
。第１５図は０ ３種の血清についての血清希釈と酵素活性との関係を示
す。 代理人 桟材 皓 第１図 慎表（、ｕｍ） （％）工１、Ｔ詳酊 ｖＥｌ（％）斜ヰ囃
スペクトルを示す。第２図は（ａ）プロトカテキュイル
コリンアイオダイド（濃度１００μＭ）および（ｂ）プ
ロトカテキュ酸（濃度１００μＭ）のＵＶスペクトルＣ
５０ｍＭバルビタール緩衝液（ｐＨ８，５）中〕を示す
。第３図は希釈血清によるタイムコースを示す。第４図
は血清希釈とΔＯ，Ｄ、との関係を示す。第５図はｃｈ
ｇの至適ＰＨな示す。第６図は基質の非酵素的加水分解
安定性を示す。第７図〜第１４図は添加物の影響を示す
。第１５図は０ ３種の血清についての血清希釈と酵素活性との関係を示
す。 代理人 桟材 皓 第１図 慎表（、ｕｍ） （％）工１、Ｔ詳酊 ｖＥｌ（％）斜ヰ囃
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 一般式（Ｉ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされるコリン
誘導体を基質として用いることを特徴とするコリンエス
テラーゼ活性の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59093547A JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| US06/731,069 US4717659A (en) | 1984-05-10 | 1985-05-06 | Novel method for determining cholinesterase activity |
| DE8585105635T DE3584385D1 (de) | 1984-05-10 | 1985-05-08 | Verfahren zur aktivitaetsbestimmung von cholinesterase. |
| EP85105635A EP0160980B1 (en) | 1984-05-10 | 1985-05-08 | Novel method for determining cholinesterase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59093547A JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60238000A true JPS60238000A (ja) | 1985-11-26 |
| JPH0542278B2 JPH0542278B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=14085284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59093547A Granted JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4717659A (ja) |
| EP (1) | EP0160980B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60238000A (ja) |
| DE (1) | DE3584385D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62244397A (ja) * | 1986-04-15 | 1987-10-24 | Nitto Boseki Co Ltd | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2095495C (en) * | 1992-06-01 | 2002-06-04 | Stephen Carl Hasselberg | Assay for serum cholinesterase |
| US6764831B2 (en) | 1998-11-23 | 2004-07-20 | Proteome Sciences, Inc. | Methods and compositions for pain management |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54136895A (en) * | 1978-04-17 | 1979-10-24 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of measuring activity of cholinesterase by choline derivative |
| JPS5721352A (en) * | 1980-07-11 | 1982-02-04 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | Novel substance for measuring cholineesterase activity and method thereof |
| JPS57144999A (en) * | 1981-03-04 | 1982-09-07 | Fujirebio Inc | Measurement of activity of cholinesterase |
| JPS57166999A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Fujirebio Inc | Determination of cholinesterase activity |
| JPS57167000A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Fujirebio Inc | Determination of cholinesterase activity |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2914721A1 (de) * | 1978-04-17 | 1979-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur bestimmung der cholinesterase-aktivitaet sowie fuer dieses verfahren verwendbare cholin-derivate |
| JPS5935599B2 (ja) * | 1980-12-25 | 1984-08-29 | 株式会社 シノテスト研究所 | コリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| EP0060059B1 (en) * | 1981-03-04 | 1985-08-21 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Method for determining the activity of cholinesterase and diagnostic solution for use therein |
| JPS60197643A (ja) * | 1984-03-21 | 1985-10-07 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規コリン誘導体 |
-
1984
- 1984-05-10 JP JP59093547A patent/JPS60238000A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-06 US US06/731,069 patent/US4717659A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-08 DE DE8585105635T patent/DE3584385D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-08 EP EP85105635A patent/EP0160980B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54136895A (en) * | 1978-04-17 | 1979-10-24 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of measuring activity of cholinesterase by choline derivative |
| JPS5721352A (en) * | 1980-07-11 | 1982-02-04 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | Novel substance for measuring cholineesterase activity and method thereof |
| JPS57144999A (en) * | 1981-03-04 | 1982-09-07 | Fujirebio Inc | Measurement of activity of cholinesterase |
| JPS57166999A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Fujirebio Inc | Determination of cholinesterase activity |
| JPS57167000A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Fujirebio Inc | Determination of cholinesterase activity |
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| JPS62244397A (ja) * | 1986-04-15 | 1987-10-24 | Nitto Boseki Co Ltd | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0160980B1 (en) | 1991-10-16 |
| EP0160980A3 (en) | 1987-10-07 |
| EP0160980A2 (en) | 1985-11-13 |
| US4717659A (en) | 1988-01-05 |
| JPH0542278B2 (ja) | 1993-06-28 |
| DE3584385D1 (de) | 1991-11-21 |
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