DE2914721A1

DE2914721A1 - Verfahren zur bestimmung der cholinesterase-aktivitaet sowie fuer dieses verfahren verwendbare cholin-derivate

Info

Publication number: DE2914721A1
Application number: DE19792914721
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Hayashi; Tadatoshi Hayashi; Yoshiaki Shimizu; Toshio Tatano; Katsuyuki Watanabe
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1978-04-17
Filing date: 1979-04-11
Publication date: 1979-10-18
Also published as: IT7921922A0; FR2438030B1; GB2018988A; FR2438030A1; IT1113317B; FR2427600A1; GB2018988B; US4271310A; CA1137508A; FR2427600B1

Description

29M721

Ändrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch Patentanwälte

Diplom-Physiker

Dr. Walter Andrejewski

Diplom-Ingenieur

Dr.-lng. Manfred Honice

Diplom-Ingenieur

Hans Dieter Gesthuysen

Diplom-Physiker

Dr. Karl Gerhard Masch

Anwaltsakte:

43 Essen 1, Theaterplatz 3, Postf.789

9. April 1979

! Patentanmeldung

: KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI KAISHA

! 6-1, Ohte-machi 1-chome,

Chiyoda-ku, Tokyo-to, Japan

Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität sowie für dieses Verfahren verwendbare Cholin-Derivate.

Zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität sind verschiedene Verfahren bekannt, welche insgesamt Cholin-Derivate als Substrat für die Reaktion mit Cholinesterase verwenden. Es ist. auch bekannt, daß durch die Einwirkung von Cholinesterase auf· das Substrat Cholin und eine von dem Cholin-Derivat abgeleitete Säure gebildet werden, was anscheinend eine Hydrolyse bewirkt.

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Bei den bekannten Verfahren können beispielsweise Acetylcholin,
Butyryleholin, Acetylthxocholin, Propylthiocholin, £-nitrophenyl- ^: butyrat oder Indophenylacetat als Substrate verwendet werden. Zur ; Reaktion mit Cholinesterase können derartige Substrate in einer
^; gegebenen Konzentration enthaltende Puffer-Lösungen verwendet

werden. Die Reaktion mit Cholinesterase führt zur Bildung einer ■ : Säure, wodurch der pH-Wert der Pufferlösung gesenkt wird. Die _; Cholinesterase-Aktivität wird in Bezug auf die Veränderung des j

ί pH-Wertes (d pH) über einen gegebenen Zeitraum bestimmt (Glass j electrode method, Baum G. :Clin. Chimica Acta, j56, 405 (I972)). j Derartige Cholin-Derivate besitzen jedoch eine geringe Stabili-. tat, sodaß es schwierig ist, die nötigen Messungen genau durchzuführen. Es ist infolgedessen auch schwierig, die Cholinesterase-Aktivität mit guten Resultaten zu bestimmen.

Bekannt ist auch die Verwendung von Benzoylcholin-' als Substrat · (Kalow method) Kaow W., Genest. K. : Canad. J. Biochem. Physiol. ' 35, 341 (1957)). Dieses Verfahren beinhaltet (i) ein Verfahren j zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität in Bezug auf die
Benzoesäure, welche gebildet wird, wenn Benzoylcholin als Substrat verwendet und durch die Wirkung von Cholinesterase zerlegt wird, : und (ii) ein Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität in Bezug auf das Cholin, welches gebildet wird, wobei die j gebildete Cholinmenge durch Verwendung von Cholinoxidase geschätzt' wird, welche dem Reaktionssystem zugesetzt wird (Japanische
Patentanmeldung IjJO 984/77* Kokai Koho). Es ist jedoch, schwierig, ^: durch derartige Verfahren die Bestimmung genu durchzuführen, da ' j das als Substrat verwendete Benzoylcholin nur geringe Stabilität
besitzt. i

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Außerdem bietet die Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität im Blut spezielle Schwierigkeiten. So schreitet beispielsweise, wenn die Konzentration des als Substrat verwendeten Benzoylcholin zu gering ist, die Hydrolysewirkung der Cholinesterase auf das Substrat sehr schnell voran, sodaß es sehr schwierig ist, diese Reaktion manuell oder mechanisch genau aufzuspüren. Es ist daher schwierig, die Menge an vorhandener Cholinesterase auch nur annähernd genau zu bestimmen. Wenn außerdem Cholinoxidase verwendet wird, um das durch die Wirkung der Cholinesterase erzeugte Cholin zu schätzen, so ist zusätzlich zu dem gebildeten Cholin und der Cholinesterase das Vorhandensein einer bestimmten Säuerstoffmengej welche im Reaktionssystem gelöst ist, erforderlich, wenn auch die Menge an derart vorhandenem Sauerstoff gewöhnlich sehr gering ist. Außerdem ist es in derartigen Fällen nicht nur schwierig, sondern auch unpraktisch, die Sauerstoffmenge zu erhöhen, indem beispielsweise Sauerstoff in das Reaktionssystem eingeblasen wird. Andererseits wird Cholin sehr schnell durch die Wirkung von Cholinesterase auf Benzoylcholin freigegeben und in Gegenwart von Sauerstoff durch die Wirkung von Cholinoxidase in Betainaldehyd umgewandelt. Infolgedessen entsteht eine molekular gleichgroße Menge an Wasserstoffsuperoxid, welches in eine Farbentwickler-Lösung eingebracht wird, um die als Resultat der Cholinesterase-Aktivität ausgebildete Cholinmenge zu bestimmen. Diese Reaktionen werden jedoch infolge des ^] Sauerstoffverbrauchs im Reäktionssystem unterbrochen. Es ist da- , her schwierig, die Menge an gebildetem Cholin genau zu bestimmen.

Die Messung muß daher unbedingt innerhalb einer möglichst kurzen , Zeit durchgeführt werden, bevor der in der Reaktionslösung gelöste Sauerstoff verbraucht ist, wenn Benzoylcholin als Substrat verwendet wird.

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-X-

Wenn andererseits die Konzentration an Benzoylchlorid zu hoch ist, es es schwierig, die Menge an Cholinesterase genau zu bestimmen, da das Benzoylcholin per se dazu dient, die Cholinesterase im Blut zu hemmen, und die Reaktion unterbrochen wird.

Es ist auch bekannt, die Cholinesterase-Aktivität durch Verwendung von Butylthiocholin als Substrat zu bestimmen (Szasz, G.: Clin. Chim. Acta, 1_£, I9I (1968)). Die Cholinesterase-Aktivität | wird dabei durch Bildung von Thiocholin als Reaktionsprodukt von ■ Butylthiocholin und Cholinesterase bestimmt, wobei das gebildete \ Thiocholin der Reaktion mit einer Verbindung wie 4,4'-dithiobisbenzoesaure (z.B. 2,2'- oder 4,4'-dithiopyridin) unterworfen wird, um eine farbige Substanz zu erhalten und wobei der Extinktionskoeffizient dieser Substanz gemessen wird. Sowohl Butylthiolin wie auch 5j5'-dithiobisbenzoesaure und die diesbezüglichen Substanzen, welche für dieses Verfahren verwendet werden, sind je- ; doch sehr unstabil und machen eine natürliche Oxidation durch. Die durch dieses Verfahren durchgeführte Reaktion ist die gleiche wie die Reaktion verschiedener Thiolderivate im Blut (z.B. Glutathion), sodaß es wiederum nicht möglich ist, irgendeine Messung mit entsprechender Genauigkeit durchzuführen.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren ■ zu schaffen, mittels welchem zumindest teilweise die verschiedenen Nachteile der bisher bekannten Verfahren ausgeschaltet werden, wobei der Erfindung der Gedanke zugrunde liegt, die Cholin- '■ esterase-Aktivität durch Verwendung von Verbindungen als Substrate zu bestimmen, welche sehr stabil sind und durch die Wirkung von Cholinesterase auch mit einer geeigneten geringen Reaktionsgeschwindigkeit zerfallen.

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Des weiteren soll das erfindungsgemäße Verfahren einen hohen Sättigungswiderstand gewährleisten. Bei der Sättigung handelt es ^; sich um eine noch zu beschreibende Schwierigkeit, welche zu ungenauen Resultaten führt.

Gekennzeichnet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität im wesentlichen dadurch, daß die

; Cholinesterase mit einer Verbindung der allgemeinen Struktur-. formel:

>— B - CII- - CH₀ - N — CII

(D

^J η

zur Reaktion gebracht wird, wobei A ein Wasserstoffatom oder ein C^__r Alkyl oder eine Alkoxygruppe und B eine Gruppe der Formel - R - COO - (wobei - R - eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomen ' darstellt); oder A eine Hydroxygruppe in einer oder beiden ^Positionen des Benzolringes oder eine C, ,- Alkylgruppe und B eine Gruppe der Formel - COO - ; X ein stabilisierendes Anion und η | die Ladung des Anion darstellt, und daß die Cholinesterase-Aktivität durch das erhaltene Cholin und/oder die erhaltene Säure bestimmt wird.

Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Verbindung gemäß Strukturformel I verwendet, in

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-fr-

; welcher X ein wasserlösliches stabilisierendes Anion, z.B. ein i

Halogenid-Ion, insbesondere ein Chlorid-Ion darstellt, und η = 1 '

' ist. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich beispielsweise auch

: durch Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I durchführen, in welcher A ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Methoxy-

gruppe in der ^-Position des Benzolringes und B eine Gruppe der ■,

Formel - R - COO darstellt (worin R eine Alkenylgruppe mit 2 bis ■

: 6 C-Atomen darstellt) oder A eine Methylgruppe in einer oder I

■ beiden <o-Positionen des Benzolringes und B die Gruppe - COO - ■ darstellt. !

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird daher eine Verbindung gemäß Formel (i) der vorbeschriebenen Art als Substrat verwendet und der Reaktion mit Cholinesterase unterworfen, um Cholin und/ oder eine Säure zu bilden. Die .Cholinesterase-Aktivität wird bei- ' ^; spielsweise dadurch bestimmt, daß das gebildete Cholin und/oder ' , die gebildete Säure gemessen wird, wenn es auch möglich ist, die Cholinesterase-Aktivität in Bezug auf die Veränderung des pH-Wertes einer die gebildete Säure enthaltenden Lösung zu bestimmen.

Die Menge des gebildeten Cholins läßt sich beispielsweise dadurch ' bestimmen, daß das Cholin der Wirkung von Cholindehydrogenase in ·

■ Gegenwart von NAD unterworfen wird und in eine Färbentwickler- ^: lösung gegeben wird. Es ist auch möglich,.,das gebildete Cholin ; der Einwirkung von Cholinoxidase zu unterwerfen, um Wasserstoffj Superoxid zu bilden, welches dann einer Farbentwicklerlösung ^; zugesetzt wird. Verschiedene bekannte Verfahren (z.B. das von i Kalow und anderen vorgeschlagene Verfahren und das von Takasashi [ ; und anderen vorgeschlagene Verfahren) können zur Bestimmung der

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/T-

durch die gebildete Säure verursachten Veränderung des pH-V/ertes angewendet werden.

Bevorzugte Verbindungen gemäß Strukturformel I sind nachstehend zusammen mit ihren physikalischen Eigenschaften in der Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1
Strukturformel Name M.P.

C + CH-] _ 2-methyl cinnamoyl-

, r_//^S-CiI=CH-C-O-CIU-CH₉-IKqCHi Cl cholinchlorid 170-

^J ^Ltl3)J (Verbindung I)

0 £-methoxycinnamoyl-

+ CH.

cholinchlorid ^C1 (Verbindung II) ^{l84 C}

^ Vr=/

CiU 0 £-methylbenzoyl-

" -- ⁿ ' cholinchlorid 142-

ZW

⁰ CII.

Γ / V-CH = CH -C-O- CH₉-CH₉-N^-CHt

(Verbindung IV)

(Verbindung III) Cinnamoylcholin-

Cl~chlorid 1965

^CH3, ι? , CII."] m-methylbenzoyl-

,-N^CIi;) Cl" cholinchlorid

^⁰¹^' (Verbindung V)

0:1 0 , ',

o-hydroxybenzoyl-

Γ (/ \ - c - 0 -cn -CH₉-rr^--cir.

~ 2 ^z \CH.

^cl - cholinchlorid

(Verbindung Vl)

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Fortsetzung Tabelle 1 ;

H.H.R. (in CD-OD) IR(KEr) cnf

Verbindung

I 2.00 G 311; 3.55 a 9:1; 3.70 η 2H; 1711; l625; /».63 m 2:1; 6.^3 d=18HzlIl; 7.18

. . ■ d=3ilz.?ll; 7.50 d=81l22il; 7.72' d= -18HzIH

II 3.30 3 SIi; 3.83 s 3H; 3.07 m 2H; 1710; lC^O; i\ 60 m 2H; 6.^2 d=lSHzlII; 6.93 1ο0ί>, 1175; d=10II?.2H; .750 d=10Hz2II; 7.72 d= Q25; 0Op lOHzlII

III 2.60 s 3H; 3.33 s 9H; 3.93 m 2Π; 1730; 7'<2 /k81 g 211; 7.32 π 3H; .795 m III

3.35 s 911; 3.95 m 2lt; 4-75 ro 211; 1720; 1635; IV 7.18 d=3llz 211; 7.22 d=8!I 211; 775

7.60 m 51!

In der Tabelle 1 handelt es sich bei den Verbindungen I, II und IV um neue Verbindungen, wenn auch die Verbindungen, welche durch die Strukturformel:

[ Z -Y )-CH=CII- C - 0-CII₉-CII₀- M ^C

Vi-y

2 ""2

CII-

Br ...(Ha)

¹3j

(wobei Z für -NO₀ oder ™b^> N- steht).

in Chemical Abstracts, 5>8, 59^0h-erwähnt werden, v/obei es heißt, daß diese Verbindungen gemäß Formel (Ha) die Cholinesterase-Aktivität hemmen. Nirgends ist Jedoch die Rede von der Verwendung

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dieser Verbindungen als Substrate bei einem Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Alctivität.

Die lifer Ii indung gemäß Formel III ist eine neue Verbindung, die Verbindung gemäß Formel V jedoch alt (Chemical Abstracts, J2, 53978t). Diese Literaturstelle beschreibt eine Verbindung analog der Verbindung gemäß Formel III mit einer _o-nitrogruppe anstelle einer o-methylgruppe sowie eine Verbindung analog der Verbindung gemäß Formel III mit einer m-chlorogruppe anstelle einer m-methylgruppe. Diese Literaturstelle lehrt außerdem, daß derartige Verbindungen wirksame Inhibitoren für das Wachstum von Pflanzen sind. Nichts in dieser Literaturstelle weist jedoch darauf hin, daß derartige Verbindungen als Substrate bei der Bestimmung von Cholinesterase-Aktlvität verwendbar sind.

Bei der Verbindung gemäß Formel VI handelt es sich um eine alte Verbindung, welche in Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, Berlin, 288, 51 (1951) beschrieben wird, wobei jedoch nirgends erwähnt wird, daß diese Verbindung als Substrat bei der Bestimmung von Cholinesterase-Aktivität verwendbar ist.

Das Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität unter Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I als Substrat wird vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß beispielsweise Cholin, welches durch die Wirkung von Cholinesterase gebildet wurde, der Wirkung von Cholinoxidase unterworfen wird, um Wasserstoffsuperoxid zu bilden, und daß dieses dann in ein Farbentwicklersystem (nachstehend als Methode A bezeichnet) eingebracht wird, oder indem die durch die infolge der Wirkung von Cholinesterase gebildete Säure verursachte Senkung des pH-Wertes mit Hilfe einer

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Elektrode oder eines pH-Indikators gemessen wird (nachstehend bezeichnet als Methode B).

Die Methode A kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

Die gewünschte Menge eines geeigneten Farbentwickler-Reagenz (beispielsweise 4-aminoantiyprin, Phenol usw.), Cholinoxidase (beispielsweise hergestellt entsprechend der japanischen Offenlegungsschrift IJO 98V77 oder entsprechend der nachstehend genannten Druckschrift 2), eine Peroxidase und ein Substrat der Erfindung wird einer geeigneten Pufferlösung (z.B. einer 0,002- . 0,1M tris HCl-Pufferlösung (pH 7,0-8,0)) zugesetzt. Die auf diese Weise hergestellte Lösung wird mit einer Probe (Cholinesterase oder ein Cholinesterase enthaltendes Material wie beispielsweise Blut, Serum und verdünntes Blut oder Serum) zwecks Reaktion in Berührung gebracht. Das Substrat wird durch die Wirkung von Cholinesterase gespalten, um Cholin zu erzeugen,' welches dann durch die Wirkung der Cholinoxidase in Betainaldehyd und Wasserstoffsuperoxid gespalten wird. Das auf diese V/eise hergestellte Wasserstoffsuperoxid wird mit Phenol und 4-aminoantipyrin in Gegenwart einer Peroxidase zur Reaktion gebracht, wodurch ein Chinonimin-Pigment entsteht. Die Menge des entstandenen Pigmentes wird durch Messung seiner optischen Dichte (nachstehend als OD bezeichnet) bestimmt, Vielehe der Aktivität der Cholinesterase entspricht.

Vorzugsweise wird die Reaktion bei 20-40°C innerhalb einer Zeitspanne von 1 min bis 1 h durchgeführt.

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Die Methode B wird zweckmäßigerweise ebenso wie das Shibata-Takahashi-Verfahren durchgeführt, welches von G. Kitamura beschrieben wird ("Jissen Rinsho Kagaku", Seite J>6K, veröffentlicht von Ishika Shuppansha, Japan), und zwar in Bezug auf den OD-Wert von Phenol-rot in verschiedenen Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten. Um die Cholinesterase-Aktivität zu bestimmen, wird die durch eine Säure, welche durch die Wirkung von Cholinesterase gebildet wurde, verursachte Veränderung des pH-Wertes indirekt durch Messung der Veränderung des OD-Wertes von Phenolrot in der Reaktionslösung bestimmt.

Tabelle 2 gibt die Reaktionsraten der Verbindungen gemäß Formel I, welche für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, an. Die Reaktionsrate ist dabei in Bezug auf die Reaktionsrate von Benzoylcholin, bei welchem es sich um ein bekanntes Substrat handelt, angegeben. Die Reaktionsrate wurde folgendermaßen bestimmt:

Jeweils 0,2 mg der in Tabelle 2 angegebenen Substrate wurden einer tris HCl-Pufferlösung ( Jval; pH 7,5) zugesetzt, welche folgende Bestandteile enthielt:

4-aminoantipyrin 3 mg

Phenol _ 2,8 mg

Cholinoxidase (hergestellt in Referenz 2) 7,05 Einheiten

Peroxidase (Worthington Corp., USA) 9,1 "

Jede Lösung wurde vorher 10 min lang auf J57°C erwärmt und ein Standardserum (jeweils 20/ul) zugesetzt. Die Veränderung des

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OD-VJertes vmrde dann fortlaufend gemessen, um die Anstiegrate im OD-V/ert in einer Zeiteinheit (min) zu messen. In Tabelle 2 ist die Rate der Zunahme des OD-Wertes von Benzoylcholin in einer Zeiteinheit als 1 bezeichnet.

	Name	Tabelle 2	(I)	B	O
	Benzoylcholin- chlorid	In Formel	O l! -C-O-	-CH=CH-C-O-
Verbindung		A
Nr.	p-methylcinnamoyl- cholinchlorid	O-
T
	^CI13"O"
1

Reaktionsrate

2-methoxycinnamoyl- n CO-/ V -CH=CH-O-O- 0.017-

cholinchlorid -> \=z/ (,-.019

^methylbenzoyl- .,-,_—CIU :; ('.32-

cholinchlorid ( ">- -C-O- 0.37

²I- CinnamoylchoLin- _rr^ Ii

Chlorid f V -CH-CH-C-O-

mmethylbenzoyl- _r!, j.

cholirichlorid "'."I'~-:~_N\ -'.''-U-

p H ft

0 Ü H B Λ J / 0 9 2 5
BAD ORtGINAL

■"iho L Lrichlorid

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-ya-

Anmerkung: Verbindung 7 = Bezugsverbindung, Verbindungen 1-4 = neue Verbindungen der Erfindung, Verbindungen 5-6 = alte Verbindungen der Erfindung.

Die Lösungsstabilität der Verbindungen (Substrate) der vorliegenden Erfindung sowie die Lösungsstabilität der bekannten Substrate wurden bestimmt und sind in Tabelle 3 angegeben, wobei die Zerfallrate von Benzoylcholin als 1 bezeichnet ist. Die Zerfallrate wurde folgendermaßen bestimmt:

Eine tris HCl-Pufferlösung (0,05M; pH 7,5), welche eine spezifizierte Verbindung gemäß Formel I (O,6l5 millimol/^ ml) enthielt, wurde hergestellt und 'ί Tage lang bei j57 C stehengelassen. Anschließend wurde die Zerfallrate auf Basis der aus dieser Verbindung erzeugten Cholinmenge bestimmt. In gleicher V/eise wie bereits beschrieben wurde WasserstoffSuperoxid, welches durch die Einwirkung von CholinoxLdase erzeugt worden war, mit 4-aminoantipyrin behandelt, um ein Chinonimin-Pigment zu bilden. Der OD-V/ert wurde bei 500 nm gemessen, um die Menge an gebildetem Cholin zu bestimmen. Die Menge dieses Pigments hängt von der Menge an erzeugten. Cholin ab, soi.'UJ eine geringere Menge des gebildeten Pigments eine [',erLngero Ze r frill, rate angibt.

Wie nachstehende Tabelle ''> zeigt, zersetzen sich die bekannten i'iubsträte wLe beispi.e Lsweise BenzoylchoLiri und Acetylcholin relativ sehne Li im Laufe der Zeit und ihre Blindwerte neigen auch dazu, i-inir;e Zeit rrioh Hers te Llung von derartige .Substrate enthaltenden !le.igemüon uimu; to igen. Demgegenüber zerfallen die wUiuitr.-iti; der- fCt-nri-lun»', Langcam und besitzen eine bessere HaItl-.U'kelt, wan für· die F'-';r;tirr;r..ung der Choiinesterase-Aktivit.ät ein-(1 ■.μ t" i. r· '/fii 7c> c^ο i 1 j:; t.

ι] ■') ü ■ /0925

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Tabelle 3

Verbindung	Name	Strukturformel (I	B	Zerfallrate
Nr.	Benzoylcholin chlorid	A	-C-O- [\|
7			[t O	1
	Acetylcholin chlorid		-C-O- O
8	Propionylcholin chlorid	CH₃-	-Cj-O- O	Z
9	p-methylcinnamoyl- cholinchlorid	• CH₃-CH,-		2.3
1	p_-methoxycinnamoyl- cholinchlorid	^C»3-O		0.1 .
2	£-methylbenzoyl- cholin-chlorid	HCO-Q.		0.05
3	Cinnamoylcholin- chlorid	0.^CH3		'0.002
4	m-methylbenzoyl- cholin-chlorid	0-		0.26
5	£-hydroxybenzoyl- cholinchlorid	dl. V=/		0.005
6	■'rf⁰¹¹ Ο"	O -CH=CH-C-O-	0.5
O -CH=CH-C-O-
O -i-o-

O H -CH=CH-C-O-
O -C-O-
0 Il -C-O-

Anm.: Nr.

1-²I- .... neu

5-6 .... alt

1-6 .... Erfindung

7-9 ···· Vergleichsverbindungen

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Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung sind Verbindungen gemäß Formel I vorgesehen, bei denen A ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Methoxygruppe in der para-Position des Benzolringes und B eine Gruppe der Formel -R-COO- darstellt (wobei -R- eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomen darstellt); oder wobei A eine Methylgruppe in einer oder beiden ortho-Positionen des Benzolringes und B eine Gruppe der Formel -COO- darstellt, während X ein stabilisierendes Anion und η die Ladung des Ions darstellen.

Bevorzugt werden die Verbindungen der Erfindung gemäß Formel I, bei denen X ein Halogenid-Ion, z.B. ein Chlorid-Ion, darstellt und η = 1 ist, und zwar als Substrate bei der Bestimmung von Cholinesterase-Aktivität.

Bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind insbesondere als Substrate bei der Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität:

jo-methylcinnamoylcholinchlorid, jD-methoxycinnamoylcholinchlorid, o_-methylbenzoylcholinchlorid., und cinnamoylcholinchlorid.

Diese neuen Derivate können in gleicher Weise hergestellt v/erden wie an sich bekannte Cholin-Derivate, indem beispielsweise ein Säure-Derivat und ein halogeniertes Cholin verwendet werden.

Die Reaktion zwischen dem Säure-Derivat und dem halogenierten Cholin kann beispielsweise in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden, in welchem Fall die Reaktion vorzugsweise

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bei einer Temperatur zwischen 100 und 200 C -zweekmäßigerweise während einer Zeitspanne von 2-8 h durchgeführt wird. Bei Durchführung der Reaktion in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels wie beispielsweise Chloroform, Toluol, Benzol und dgl. wird die Reaktion vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20 und βθ C zweckmäßigerweise während einer Zeitspanne von 8-20 h durchgeführt. Die Isolierung und Reinigung der gewünschten Verbindung kann z.B. in der bei der Synthese organischer Verbindungen üblichen Weise erfolgen. "

Nach einer weiteren Besonderheit der Erfindung sind zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verbindungen gemäß Formel I vorgesehen, in.denen A ein Wasserstoffatom oder eine C, ,- Alkyl- oder Alkoxygruppe und B eine Gruppe der Formel -R-COO- darstellt (wobei -R- eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomen darstellt); oder in welcher A eine Hydroxygruppe in einer oder beiden £-Positiohen des Benzolringes oder^:eine C, ^ Alkylgruppe und B eine Gruppe der Formel -COO- darstellt, und wobei X für ein stabilisierendes Anion steht und η die Ladung des Anions darstellt.

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren rn-methylbenzoylcholinchlorid und o-hydroxybenzoylcholinchlorid als Verbindungen verwendet.

Die Erfindung sieht auch ein Reagenz zur Bestimmung der Cholinestsrase-Aktivität vor, welches eine Verbindung gemäß Formel I, ein Farbentwickler-Reagenz, Cholinoxidase und eine Peroxidase enthält. Das Farbentwickler-Reagenz besteht vorzugsweise aus " 4-aminoantipyrin und Phenol.

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Beispiel 1

Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität unter Verwendung eines Substrates der Erfindung und Cholinoxidase:

(A) Herstellung des Reagenz: . -

In herkömmlicher Weise wird ein Reagenz unter Verwendung einer 0,05M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) hergestellt, welches folgende Bestandteile enthält:

4-aiTiinoantipyf in . · 3 ^mg

Phenol 2,8 mg

Cholinoxidase (gemäß Referenz 2) 7,05 U

Peroxidase 9,1 U

(Worthington Biochemical Corp. USA) Substrat (cD-methylbenzoylcholinchlorid) 0,2 mg

(B) Analysevorgang:

Jedes Testserum, sowie Q-PAKI-Standardserum mit einer Cholinesterase-Aktivität von 1458 mU/ml (Handelsprodukt der Highland Div. Travenol Laboratories Inc., USA) wird dem vorstehend hergestellten Reagenz (3 ml) zugesetzt und bei 37°C eine vorgegebene Zeitspanne (siehe Tabelle 4) bebrütet. Die Reaktion wird durch Zusatz von Neostigmin (2 mg) unterbrochen. Nachstehende Tabelle 4 gibt die verschiedenen optischen Dichtewerte an, welche bei 500 nm mittels eines Spektrometer gemessen wurden. Zum Vergleich

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wird das erfindungsgemäße Substrat durch Benzoylcholin ersetzt, bei dem es sich um ein bekanntes Substrat handelt, um die entsprechenden Werte zu erhalten, welche ebenfalls in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben sind. Das Benzoylcholin enthaltende Reagenz wird in herkömmlicher Weise hergestellt, wobei 3 tnl einer 0,05M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7*5) verwendet wurde, welche folgende Bestandteile enthielt:

4-aminoantipyrin 0,5 nig

Phenol 1,4 mg

Cholinoxidase 7*15 Einheiten

Peroxidase 10,3 '^r

Substrat (Benzoylcholin) 0,5 mg

Q-PAKI Standard

Serum (Cholinesterase-

Aktivität (1458 mU/ml}

Serum des Patienten (1)
bei Leberkrankheit

Serum des Patienten (2)
bei Nierenerkrankung

Tabelle	4	Optische Dichte nach 4 10 20	0,350 1,100	0,700 1,600	(rain)+ 40
Substrat		0,140 0,440	0,202 0,638	O,4o4 1,300	1.400 1,650
III ** VII ^x		0,08l 0,255	0,543 1,600	1,085 1,650	0,808 1,650
III VII	0,217 0,679		2,100 1,670
III VII

Anmerkung:

+ Reaktionszeit

sx Ortho-methylbenzoylcholinchlorid iK:K5ß Benzoylcholinchlorid (Verbindung VII)

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Wenn ci-methylbenzoylcholinchlorid verwendet wird., wird die Cholinesterase-Aktivität (etv;a 84l rr.U/ml) des Serum des Patienten (1) durch folgende proportionale Verteilerrriethode bestimmt (nachstehend wird die optische Dichte als OD bezeichnet).

Cholinesterase-Aktivität = (l45S/(OD des Standardserum)) X (OD des Serum des Patienten (I)).

Bei Verwendung von Eenzoylcholinchlorid als Substrat wurde die Cholinesterase-Aktivität (etwa 844 mU/ml) des Serum des Patienten (1) in gleicher V/eise durch doe proportionale Verteilermethode bestimmt, und zwar in Bezug auf die nach 4 und 10 min gemessenen Werte. Die nach 20 und 40 min gemessenen Werte sind wahrscheinlich ungenau.

Bei Verwendung von cj-methylbenzoylcholinchlorid .als Substrat ergab ein gleiches Verfahren wie vorgenannt eine Aktivität von 2260 mU/ml in Bezug auf das Serum des Patienten (2). Bei Verwendung von Benzoylcholinchlorid als Substrat erhielt man in gleicher V/eise eine Aktivität von 2250 mU/ml bei dem Serum des Patienten (2) in Bezug lediglich auf den g€-Wert (foe-e-) bei einer Messung nach 4 min. Dieses Resultat kann als zuverlässig angenommen werden. Andere OD-Werte sind allerdings wahrscheinlich infolge ihrer Sättigung unzuverlässig. Nach Ansicht der Anmelderin kann eine derartige Sättigung durch Fehlen von ausreichend gelöstem Sauerstoff verursacht werden, der von der Cholinoxidase benötigt wird. In derartigen Fällen verläuft die Reaktion von Benzoylcholin übermäßig schnell. Γη derartigen Fällen ist es erwünscht, das Serum zu verdünnen, um ein zu-

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verlässiges Resultat zu erhalten (eine derartige Verdünnung ist allerdings virtuell unpraktisch).

Vom praktischen Gesichtspunkt aus kann die Unterbrechung der Messung nach H- Minuten auch zu verschiedenen Nachteilen wie . beispielsweise einer großen Fehlerstreuung führen.

Bei .Verwendung der erfindungsgemäßen Substrate kann man jedoch ein zuverlässiges OD-Resultat erhalten, und zwar ohne Sättigung, selbst wenn die Cholinesterase-Aktivität sehr hoch ist und die Reaktion über eine lange Zeitspanne hinweg durchgeführt wird. Infolgedessen eignen sich die erfindungsgemäßen Substrate sehr gut zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität.

Nachstehende Tabelle 5 zeigt jeweils die bevorzugten Konzentrationen der Bestandteile des erfindungsgemäßen Reagenz und des bekannten Reagenz, welches Benzoylcholin enthält.

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.Tabelle 5

A... Erfindungsgeir.aßes Reagenz B... Bekanntes Reagenz

Bestandteile

4-aminoantipyrin Phenol

Cholinoxidase Peroxidase Substrat der Erfindung

1 -6 mg
0,7-1^ mg
1,4-50 Einh.
0,1-20 Einh.
0,1-6 mg

0,1-1 mg 0,7-3 mg 0,5-10 Einh. 0,5-50 Einh.

Substrat (Benzoylcholin)

0,1-1 mg-

Reaktionstemperatur: 20-40 C Reaktionszeit: 1 min bis 1 h.

ι Wie Tabelle 5 zeigt,, ist der Bereich der Konzentration von

Benzoylcholin schmäler als der entsprechende Bereich des Sub-' strates der Erfindung, sodaß die erfindungsgemäßen Substrate , wesentlich vielseitiger einsetzbar sind als das Substrat Benzoyl-' cholin.

■ Beispiel 2

' OD-Werte des Standardserums und des Serums des Patienten (1) (bei Lebererkrankung) gemäß nachfolgender Tabelle β wurde in

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- se -

gleicher Vfeise wie im Beispiel 1 erhalten, mit Ausnahme dessen, daß o-methylbenzoylcholin durch die anderen Substrate der Erfindung ersetzt wurde, wie sie im einzelnen in der Tabelle angegeben sind.

Diese Resultate zeigen, daß die OD-Werte zuverlässig sind und frei von den vorgenannten Schwierigkeiten der Sättigung, wenn die Messung unter "Verwendung der Substrate der Erfindung vorgenommen wird.

Tabelle 6

Serum Substrat	Q-PAKI Standard-	I	0,	OD gemessen nach	0,055	... min	jD-methylcinnamoylcholinchlorid	moylc	orid	40
	Serum (Cholin-	II	0,	(+Reaktionszeit)	0,021	20	^-methoxycinnamoylcholinchlorid	iho]		0,220
Verbindung Nr.	esterase-Aktivität r	IV	0,	022	0,079 -■	0,110	Cinna	.inchl		0,084
1458 mU/ml)	V	0,	008	0,770	0,042	0,316
	VI	0,	031	0,082	0,158	3,080
Serum des	I	0,	308	0,032	1,540	0,321
Patienten (1) bei:	II	0,	031	0,012	0,163	0,126
Lebererkrankung	IV	0,	012	0,046	0,063	0,050
	V	Q,	005	0,446	0,025-	0,l8l
	VI "	0,	OI7	0,042	0,090	1,785
Anm: Verbindung I		179	0,892	0,176
II		QI7	0,088
IV

V m-methylbenzoylcholinchlorid

VI o-hydroxybenzoylcholinchlorid.

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Beispiel 3

Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität unter Verwendung eines Substrates der Erfindung (in gleicher V/eise wie bei der Shibata-Takasashi-Methode):

1. Herstellung der Reagenzien:

(1) Veronal/ /3-glycerophosph.orsäure-Pufferlösung (pH 8,3)·' 5,5-Diathylbarbitursäure (Natriumsalz; 3.»00 g)

wird in etwa 500 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 4,4-diäthylbarbitursäure (1,00g) behandelt, welche bei erhöhter Temperatur gelöst wird. Die Lösung wird abgekühlt und mit fs -glycerophosphorsäure (Natriumsalz; 5,00 g) behandelt, und anschließend wird Wasser zugesetzt bis zu einer Gesamtmenge von 1 .'000,-ml.

(2) Substratlösung·"

(A) Acetylcholinchlorid (1 g) wird zu 10 ml''zugesetzt und gelöst.

(3) ci-methylbenzoylcholinchlorid (0,5 g) wird zu 10 ml Wasser zugesetzt und gelöst.

(3) Phenol-rot-Lösung:

Phenol-rot (100 mg) wird einer 0,lN-Natriumhydroxidlösung (3,0 ml) und Wasser (7,5 ml) zugesetzt. Die Lösung wird auf etwa 6o°C erwärmt, um die Zusätze vollständig zu lösen. Die Lösung wird dann abgekühlt und mit Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 250 ml aufgefüllt.

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(4) Eserin-Lösung:

Physostigminsalicylat (0,1 g) wird in Wasser gelöst und dann Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 100 ml nachgefüllt,

(5) Phosphat-Pufferlösung (1/15 M):

(A) Kaliumhydrogenphosphat (KHpPO^... 9,O8 g) wird in Wasser gelöst und sodann Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 1.000,- ml nachgefüllt.

(B) Natriumhydrogenphosphat (NaHPO₂₁_· 2H₂O. .. 11,88 g) wird in V/asser gelöst und anschlieiSend so viel V/asser zugesetzt, bis eine Gesamtmenge von 1.000,- ml-erreicht ist.

2. Herstellung der Reaktionslösung:

1) Verona.1/fo -glycerophosphat-Puf f erlösung 1,5 ml

2) Substratlösung - 0,25 ml

3) Phenol-rot-Lösung 0,1 ml

4) Wasser 5,05 ml.

Die Reaktionslösung enthält die vorgenannten Bestandteile. Das Mischungsverhältnis ist in Volumenteilen angegeben.

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3. Herstellung der Eichkurve:

Verschiedene Pufferlösungen (Kaliumdihydrogenphosphat und Natriumhadrogenphsphat) werden hergestellt und nacheinander auf verschiedene pH-Werte innerhalb des Bereiches 5,9-8,3 eingestellt. Jeweils 5,0 ml der auf diese Weise hergestellten Pufferlösungen werden der Phenol-rot-Lösung (0,1 ml) zugesetzt und das Ganze gut gemischt. Jede Mischung wird dann auf 20+ 1°C gehalten und der OD-Wert bei 570 nm in Bezug auf V/asser, welches für Kontrollzwecke verwendet wird, gemessen.

Die auf diese Weise gemessenen OD-Werte und der jeweils angegebene pH-Wert werden in ein Diagramm eingezeichnet, um eine pH-OD-Wert-Eichkurve zu erhalten.

h. Durchführung der Bestimmung:

Behälter für Blindmuster und Testproben (Serum) erhalten eine Reaktionslösung (jeweils 4·,9 ^ml) ^und werden dann 5 rnin lang zunächst bei 37⁰C gehalten. Anschließend v/erden Wasser (0,1 ml) und Serum (0,1 ml) in die Behälter für die Blindprobe und das Serum unter Umrühren zugesetzt und sodann die Reaktion bei 37°C genau βθ min lang durchgeführt. Jede Reaktionsmischung wird mit der Eserin-Lösung (0,1 ml) behandelt und bei Raumtemperatur stehengelassen, woraufhin die Mischung in einem Wasserbad (20°n) stehenbleibt, bis die Lösung in dem Testrohr auf 20+ 2⁰C abgekühlt ist (in etwa Lu min). Anschließend wird der OD-Wert bei 57O nm in Bezug auf 'Jasper gemessen. Entsprechend der vorher hergestellten Eichkurvc werden die pH-Werte der Blindprobe und

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der Serumprobe bestimmt. Die Δ pH-Werte (d.h. pH-Wert Blind probe minus pH-Wert Serum), welche auf diese Weise erhalten werden, sind in nachstehender Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

A Cholinesterase-Aktivität (ApH) von

Acetylcholinchlorid

B Cholinesterase-Aktivität (/4 pH) von

o-methylbenzoylcholinchlorid

Serum Nr.	Substrat	B	Serum Nr.	Substrat	B
	A	1,30		A	0,87
1	0,83	1,28	6	o,35	1,10
2	0,75	1.90	7	0,58	0,90
3	1,46	1,20	8	0,43	1,15
4	0,65	1,25	9	0,60	1,17
5	0,70	10	0,63

Vorstehende Tabelle zeigt, daß die Korrelation zwischen pH von Acetylcholinchlorid und A pH von £-methylbenzoylcholinchlorid ausgezeichnet ist.

Korrelations-Koeffizient 0,993

Regressionslinie y = 0,9-28 X + 0,564,

wobei y den Viert darstellt, welcher bei Verwendung von o-methylbenzoylcholinchlorid, dem Substrat der Erfindung, gemessen wurde,

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und X' den Wert darstellt, welcher bei Berwendung von Acetylcholinchlorid gemessen wurde.

Es ist infolgedessen möglich, die Cholinesterase-Aktivität einfach in Bezug auf die vorstehend angefertigte Liste der Korrelationen zwischen den pH-Werten von Acetylcholinchlorid und der Cholinesterase-Aktivität (IU) zu bestimmen.

Beispiel 4

Die in nachstehender Tabelle 8 angegebenen Resultate wurden in gleicher Weise wie in der Referenz 3 erhalten, mit Ausnahme dessen, daß das Serum Nr.5j welches dort verwendet wird, wiederholt bestimmt wurde. Wie diese Tabelle zeigt, ergibt die Verwendung des Substrates der Erfindung einen sehr.geringen Abweichungs-Koeffizienten und einen genauen analytischen Wert.

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Tabelle 8

A Cholinesterase-Aktivität (/ipH) von

acetylcholinchlorid

B Cholinesterase-Aktivität (/IpH) von

o_-methylbenzoylcholinchlorid.

Serum	Substrat	B	Durchschnittswert	; der	A	Serum	B	0	Substrat	B	·*	25
	A	1,24	Standard-Abweichung		0,696		1,247	0	A	1.		25
1 0	,68	1,26	Koeffizient		0,025	6	0,009	0	,70	1,		26
2 0	,73	1,25	Abweichung		3,59	7	0,72	0	,74	1,		25
3 0	,69	1,25	Beispiel 5			8		0	,69	1,		24
4 0	,70	1,23			9			,76	1,
5 0	,65			10			,68
Substrat

Herstellung der Verbindungen (Substrate) der Erfindung:

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(A) Synthese von <o-methylbenzoylcholinchlorid:

o_-benzoylchlorid (25 g) und Cholinhydrochlorid [22.,K g) werden unter Rückführung 4 h lang auf 12O-l4o°C erwärmt und die Reaktionslösung auf Trockenzustand konzentriert. Der Peststoff wird mit Zusatz von n-hexan (100 ml) gut gewaschen. Nach Abfiltern von n-hexan wird das Material zu 4o ml Tert-Butanol zugesetzt und erwärmt, um es zu lösen. Die Lösung wird in einem Kühlschrank bei 5 C über Nacht stehengelassen, sodaß sich Kristalle bilden. Die Kristalle werden ausgefiltert und aus einer Mischung von Tert-Butanol/Ä'thanol (30 ml; Mengenverhältnis 3:1) rekristallisiert und anschließend unter vermindertem Druck getrocknet. 33 S des gewünschten Produktes wird bei einer Ausbeute von etwa 33$ (M.P. 142-143 C) erhalten. Das gewünschte Produkt wird in Bezug auf verschiedene Eigenschaften gemäß Tabelle 1 identifiziert . In gleicher Weise wie vorbeschrieben werden auch andere Substrate durch Verwendung entsprechender Säurechloride und Cholinhydrochlorid hergestellt, deren Eigenschaften ebenfalls in Tabelle 1 angegeben sind.

Referenz

Herstellung von Cholinoxidase:

(A) Bestimmung der Aktivität:

Wenn Cholin mit Cholinoxidase oxidiert wird, wird Wasserstoffsuperoxid frei. Dieses Wasserstoffsuperoxid wird mit Peroxidase zerlegt und einem Farbentwicklersystem zugeführt, welches Phenol

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und 4-aminoantipyrin enthält. Im Einzelnen wird eine tris-Pufferlösung (0,05 mol/lj pH 7,0), welche 4-aminoantipyrin (0,01 mol/l) und Phenol (0,01 mol/l) enthält, mit Peroxidase (500 U/100 ml) behandelt, um eine Farbentwicklerlösung herzustellen. Dieser Lösung (3 ml) wird die Enzymlösung (0,1 ml) zugesetzt, welche bestimmt werden soll, sowie eine Cholinchloridlösung (1/30 mol/l; 0,1 ml). Nach Ablauf der Reaktion innerhalb von 20 min bei 37°C wird der E.G. (Extinktions-Koeffizient) bei 500 nm gemessen. Der Ausdruck "u" (Einheit der Aktivität) bezeichnet eine Aktivität, welche 1 /umol des Substrates innerhalb 1 min zerlegen kann.

(B) Herstellung von Cholinoxidase:

Brevibacterium album KY 4^19 (FERM P-3777; NRRL B-11046) wird als Mikroorganismus verwendet, um Cholinoxidase'zu erzeugen. Ein Zuchtmedium (10 ml), welches Cholinchlorid (2 g/dl), Getreidemaische (0,5 g/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Natriumglutamat (0,5 g/dl) und Magnesiumsulfat 7 H₂O (0,05 g/dl) enthält, wird in ein Testrohr mit einem Fassungsvermögen von etwa 70 ml eingefüllt und 15 min lang bei 120⁰G sterilisiert. Anschließend wird mit einer Platinschleife das Medium geimpft und 48 h lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Alle auf diese Weise erhaltenen Brühen werden auf ein anderes Zuchtmedium (300 ml) übertragen, welches die gleichen Bestandteile wie das erste Zuchtmedium enthält, und dieses dann in einen Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 2 { eingefüllt und in diesem 48 h lang unter Schütteln bei 30⁰C gezüchtet. Nach Abschluß der Fermentierung werden alle Brühen zur Impfung eines Hauptmediums

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(2,0 l) verwendet, welches die gleichen Bestandteile besitzt und dieses dann in 5 1-Fermentiergefäß eingefüllt, in welchem unter Belüftung 24 h lang bei 30°C die Züchtung durchgeführt wird (1 1/1 des Mediums/min), wobei der Behälter mit 500 U/min geschüttelt wird. Die fermentierte Flüssigkeit enthält 0,62 U/ml an Cholinoxidase.

Zwecks Gewinnung der Cholinoxidase aus der fermentierten Flüssigkeit werden Mikrobenkörper aus der Flüssigkeit durch Zentrifugierung abgetrennt und in 1 1 einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0) dispergiert, welche dann in eine Mühle gefüllt wird (Dyno Laboratory mill, KDL-Type von Willy A Bachofen Inc., Schweiz), um eine Lösung zu erhalten, welche zerkleinerte Mikrobenkörper enthält. Diese Lösung wird zentrifugiert, um eine obenstehende Lösung (supernatant) zu erhalten (die vorgenannte Menge an entstandener Cholinoxidase wird durch Verwendung dieses Obenstehenden als Enzymlösung zur Messung der Aktivität von Cholinoxidase bestimmt). Diesem Obenstehenden wird Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von JiQfo Ammoniumsulfat zugesetzt. Die Niederschläge werden aus der gesättigten Lösung durch Zentrifugieren entfernt und das auf diese Weise erhaltene Obenstehende wird mit Ammoniumsulfat behandelt, um eine Sättigung von 6ofo Ammoniumsulfat zu erreichen. Die gesättigte Lösung wird zentrifugiert, um die Niederschläge aufzufangen. Die Niederschläge werden in einer tris-Pufferlösung (pH 8,Oj 0,05 mol/l) gelöst und über Nacht der Dialyse unterworfen, wobei die gleiche tris-Pufferlösung und eine Dialyse-Membran in Form eines Zellophanschlauches verwendet wird. Die Lösung in dem Schlauch wird in eine Säule übergeführt, welche mit 1 1 von DEAE-Zellulose vollgepackt ist, welche mit einer tris-Pufferlösung (pH 8,0) ab-

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geglichen wird, welche Natriumchlorid (0,05 mol/l) enthält. Die Lösung wird, mit 1 1 einer tris-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,05 mol/l Natriumchlorid enthält, gewaschen und die zunehmende Elution wird durch Verwendung einer Elutionslösung erreicht, Vielehe Natriumchlorid (0,05-0,45 mol/l) enthält. Fraktionen, welche Cholinoxidase enthalten, werden aufgefangen und dann insgesamt mit Ammoniumsulfat behandelt, um eine mit 60$ Ammoniumsulfat gesättigte Lösung zu erhalten. Die Niederschläge werden durch Zentrifugieren aufgefangen und in einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0) gelöst. Die Lösung wird in 500 ml von Sephadex G-I50 (ein Molekularsieb aus Dexstran-Derivaten der Firma Pharmacia Fine Chemicals In., USA) übergeführt, welches mit einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0) abgeglichen wurde, und die Elution wird durch Verwendung einer identischen Pufferlösung durchgeführt.

Cholinoxidase enthaltende Fraktionen werden aufgefangen und zusammengeschüttet. Die Fraktionen werden insgesamt mit 60% Ammoniumsulfat gesättigt. Die Niederschläge werden durch Zentrifu-, gieren aufgefangen und in einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0) gelöst. Die Lösung wird über Nacht der Dialyse unterworfen, wobei die gleiche Pufferlösung und eine Dialyse-Membrane in Form eines Zellophanschlauches verwendet wurde. Die dialysierte Lösung wird in 500 ml Sephadex A-50 (schwach basisches Anionentauscherharz der Pharmacia Fine Chemicals Inc.,USA) eingebracht, welches mit einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0), welche Natriumchlorid (0,1 mol/l) enthielt, abgeglichen wurde. Die Lösung wurde dann mit 500 ml einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0), welche natriumchlorid (0,1 mol/l) enthielt, gewaschen. Dann wird mit einer Elutionslösung, welche

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Natriumchlorid (Ο,1-0,5 mol/l) enthielt, die zunehmende Elution durchgeführt. Cholinoxidase enthaltende Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt. Die zusammengefassten Fraktionen werden unter Verwendung einer tris-Pufferlösung (0,05 mol/l; pH 8,0) und eines Zellophanschlauches der Dialyse unterworfen. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet und man erhielt

Cholinoxidase in einer Ausbeute von etwa 10$ (Aktivität

2,2 U/mg Protein).

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Claims

Patentansprüche:

Verfahren zu ν Bestimmung der Cholinestorase-Aktivität, ei a durch g ^c ·^: e η η ζ e L c h η e t , daß die Choi ines terase mit einer Verbindung der¹ allgemeinen Strukturformel:

/^CHi

P. - CH., - CIL, - H

_v π θ

zur Reaktion gebracht wird, wobei .A ein Wasserstoffatom oder ein C, _r Alkyl oder eine Alkoxygruppe und B eine Gruppe der Formel -R- COO - (wobei. - R - eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomen dai'stellt); oder A eine Hydroxylgruppe in einer oder beiden o-Posit ionen de:; Benzol ringes oder eine C--r__r Alkylgruppe und B eine Gruppe der Forme L - COO --; X ein stabilisierendes Anion und η die ladung des Anion darstellt, und daß die CholLnesterase-Aktivität durch das erhaltene Cliolin und/oder die erhaltene Säure bestimmt wird.

?:. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der· Formel I verwendet wird, in welcher X ein Halogenid-Ton darstellt und η = 1 ist.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gornäß der Formel I verwendet wird, in v/elcher X ein Chlorid-Ion darstellt.

k. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis J5> dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß Formel I verwendet wird, in welcher Λ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Methoxygruppe Ln der p-Position des Benzolringes darstellt und B eine Gruppe der Formel -R- COO - darstellt (worin R eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomon darstellt) oder A eine Methylgruppe in einer odor beiden ^-Positionen des Benaolringes und B die Gruppe - COO - darstellt.

5- Verfahren nach Anspruch '(-, dadurch gekennzeichnet, daß eine Formel gemäß I p-rne thy Lcinnanioylcholinchiorid verv/endet wird.

6. Verfahren nach Anspruch K, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung gemäß Formel I jj-methoxycinnamoylcholinchlorid verv/endet wi i'd.

7· Verfahren nach Anspruch h, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung gemäß Forme L Γ ci-methylbenzoylcholinchlorid verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch ¹I, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung gemäß Formel Γ Cinnamoylcholinchlorid verv/endet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung gemäß Formel T m-methylbenzoylcholinchlorid verwendet v/ird.

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IC. Verfahren nach Anspruch ~5, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung gemäß Formel I cj-hydroxybenzoylcholinchiorid verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholinesterase-Aktivität durch das infolge der Einwirkung der Cholinesterase auf die Verbindung gemäß I erhaltene Cholin bestimmt wird, wobei die Bestimmung durch Spaltung des Chollns in Wasserstoffsuperoxid durchgeführt wird und dieses WasserstoffSuperoxid in einem Farbentwicklersystem zur Bildung eines Pigmentes zur Reaktion gebracht wird und die Menge des gebildeten Pigmentes durch optische Dichtenmessung bestimmt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholin durch Verwendung von Cholinoxidase gespalten wird, um WasserstoffSuperoxid zu bilden. ~ .

1]5. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Pigment durch Reaktion des Wasserstoffsuperoxides mit Phenol und ^Jl-aminoantipyrin in Gegenwart einer Peroxidase erhalten wird.

lh. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholinesterase-Aktivität durch Messung der Veränderung des pH-Wertes bei der Ausbildung der Säure bestimmt wird, die durch die Einwirkung der Cholinesterase auf die Verbindung gemäß Formel I erhalten wird.

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15. Verbindung gemäß Formel

— B -

Λ..

Λ'

-CU

- ίΐ.

CII.

CU.

ηθ

wobei A ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Methoxygruppe in der p-Position des Benzolringes und B eine Gruppe der Formel R - COO - darstellt (wobei -R- eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 C-Atomen darstellt); oder A eine Methylgruppe in einer oder beiden ^-Positionen des Benzolringes und B eine Gruppe gemäß Formel COO - darstellt; X ein stabilisierendes Anion und η die Ladung des Ions darstellt.

16. Verbindung nach Anspruch I5, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Halogenid-Ion darstellt und η = 1 ist.

17· Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Chlorid-Ion darstellt.

18. Verbindung nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, daß es '. , jD-methylcinnamoylcholinchlorid ist. '■

19- Verbindung nach Anspruch I5, dadurch gekennzeichnet, daß es p_-methoxycinnamoylcholinGhlorid ist. ^!

• 20. Verbindung nach Anspruch I5, dadurch gekennzeichnet, daß es ^; ■ jD-methylbenzoylcholinchlorid ist.

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21. Verbindung nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, daß es Cinnamoylcholinchlorid ist.

22. Verwendung der Verbindungen gemäß Strukturformel I zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1.

23· Verwendung von m-methylbenzoylcholinchlorid zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1.

24. Verwendung von o_-hydroxybenzoylcholinchlorid zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1.

25. Reagenz zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität, dadurch ! gekennzeichnet, daß es eine Verbindung gemäß Strukturformel I (entsprechend Anspruch l), ein Farbentwickler-Reagenz, Cholin- : oxidase und eine Peroxidase enthält. |

26. Reagenz nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Farbentwickler-Reagenz aus 4-aminoantipyrin und Phenol besteht.

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