DE3786286T2

DE3786286T2 - Regenbogen-Vorrichtung.

Info

Publication number: DE3786286T2
Application number: DE87104429T
Authority: DE
Inventors: James P Albarella; Steven C Charlton; James W Reinsch; Mary Ellen Warchal
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-04-04
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2007-03-26
Also published as: EP0239926B1; DK169040B1; CA1295216C; ZA871361B; JPH0698037B2; NO871222L; IE870866L; AU7103587A; NO175218C; IE60583B1; FI871450A; ATE90970T1; FI871450A0; NO175218B; JPS62239054A; DK171087A; DE3786286D1; DK171087D0; AU579507B2; EP0239926A3

Description

I. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Testzusammensetzungen und Testvorrichtungen, die sich zur Erzeugung von unterschiedlichen Farbtönen bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen eignen. Die Erfindung ist auf visuelle Tests für klinische Analyten ausgerichtet.
Insbesondere stellt die Erfindung eine selbstanzeigende Testvorrichtung zur Bestimmung von Analyten, wie Glucose, in Körperflüssigkeiten dar, die die Farben des REGENBOGENS zeigt.

II. Brauchbarkeit

Kolorimetrische Tests werden zweckmäßigeweise als visuelle Tests verwendet, mit denen relativ wenig ausgebildetes Personal routinemäßig Ergebnisse durch einfachen vergleich mit einer geeigneten Farbkarte erhalten kann. visuelle Tests sind billig und bequem, da sie keine instrumentelle Einrichtung erfordern. Derzeit werden visuelle Tests für routinemäßige Reihentests (Screening) von Urinproben für eine Anzahl von diagnostisch bedeutsamen Analyten, bei Diabetikern für den Heimtest von urin oder Blutglucose sowie auf anderen Gebieten, z.B. beim Test von Wasser auf den Eisengehalt, verwendet.
Jedoch steht bei den derzeit verfügbarer Tests die Intensität einer speziellen Farbe in Beziehung zur Konzentration des Analyten. Beispielsweise kann sich eine Testvorrichtung mit zunehmender Glucosekonzentration von einem farblosen bis zu einem hellblauen Farbton und zu dunkleren Blauschattierungen verändern. Eine bessere visuelle Unterscheidungsmöglichkeit und daher eine erhöhte Genauigkeit läßt sich erreichen, wenn ein Bereich von Farben anstelle von unterschiedlichen Schattierungen einer einzelnen Farbe bereitgestellt wird. Daher würde eine Testzusammensetzung, die unterschiedliche Farben bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen ergibt, leichter einsetzbar sein und zu genaueren visuellen Ergebnissen führen.
Um eine visuelle Unterscheidung von höheren Glucosekonzentrationen zu ermöglichen, stützen sich derzeit verfügbare Produkte auf die Verwendung von zwei Reagenzienkissen, von denen eines eine bessere Farbunterscheidung im höheren Konzentrationsbereich gewährleistet. Ansonsten würden derartige Produkte nur sehr geringfügig unterschiedliche Schattierungen von dunklem Blau (oder dunklem Grün) oberhalb von 150 mg/dl Glucose ergeben. Im Gegensatz dazu kann eine erfindungsgemäße Testvorrichtung drastische Farbveränderungen in einem Bereich von 0 bis 800 mg/dl von blau bis meeresgrün bis hellgelb bis rot ergeben.
Erfindungsgemäß werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die zur Erzeugung eines Bereichs von Farben verwendet werden können, insbesondere für klinisch bedeutsame Analyten. insbesondere wird eine Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit, wie Vollblut, bereitgestellt, die zur Erzeugung der Farbtöne eines vollen REGENBOGEN- Spektrums in der Lage ist.

III. Ausführungen zum Stand der Technik

US-Patent 4 490 465 beschreibt ein Testsystem zur Bestimmung von Glucose mit einem erweiterten Meßbereich. Das System beinhaltet mindestens eine mit Pyridin verbundene Dehydrogenase und eine nicht mit Pyridin verbundene Dehydrogenase. Ein Beispiel zeigt eine Bestimmung von Glucose mit einem gekuppelten System aus Glucose-dehydrogenase/Nicotin-adenin-dinucleotid/Diaphorase/Tetrazoliumsalz und Glucose-dehydrogenase/Dichlorphenolindophenol.
DE 32 11 167, die die prioritätsbegründende Anmeldung zum US-Patent 4 490 465 darstellt, beansprucht mindestens zwei Enzymsysteme, von denen jedes unabhängig voneinander in der Lage ist, die direkte oder indirekte Umwandlung eines Substrats zu katalysieren. Die Beschreibung definiert "unabhängig voneinander" in der Weise, daß bei gleichzeitiger Anwesenheit der mit dem Substrat reagierenden Systeme die Reaktion über das zweite System erst dann stattfindet, nachdem das Coenzym des ersten Systems weitgehend verbraucht worden ist.
DE 32 47 894 beschreibt ein Testsystem und ein Verfahren zur Bestimmung von reduziertem Nicotin-adenin-dinucleotid, das einen erweiterten Meßbereich für die Bestimmung von NAD(P)H oder Substraten oder Enzymen, die unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagieren, bietet. Das System ist dadurch charakterisiert, daß es gleichzeitig mehrere Substanzen mit unterschiedlichen elektrochemischen Potentialen enthält, die unabhängig voneinander als Elektronenakzeptoren für NAD(P)H fungieren.
In diesem Zusammenhang bedeutet unabhängig beispielsweise, daß die Umsetzung des zweiten Redoxindikators (mit dem niedrigeren elektrochemischen Potential) erst dann stattfindet, nachdem die Umsetzung des ersten (mit dem höheren elektrochemischen Potential) im wesentlichen beendet ist. Spezielle Beispiele für Elektronenakzeptoren sind Dichlorphenolindophenol und INT (2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid). Die Beschreibung gibt an, daß absorbierende Materialien mit dem Testsystem imprägniert werden können. Eine gelbe Komponente wird der ersichtlichen Farbe durch Einverleibung eines Hintergrundfarbstoffs (titangelb) hinzugefügt.
JP-A-59-106299 wurde am 19.6.1984 veröffentlicht. Diese Anmeldung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H mit oxidiertem Glutathion in Gegenwart von Glutathion-reductase und einem Farberzeugungsmittel. Beispiele für Farberzeugungsmittel sind 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), N-(1-Anilinonaphthyl-4)-maleinimid, β-Hydroxyethyl-2,4-dinitrophenyldisulfid, 2,2-Dithiopyridin und Benzimidazolylmaleinimid.
EP-A-0 153 872 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid-(phosphat), das die Umsetzung von NAD(P)H mit (1) Peroxidase oder Thiol-oxid-reduktase und (2) Diaphorase oder einem Elektronenüberträger in Gegenwart eines Chromogens und die Bestimmung des gebildeten Pigments umfaßt. Diese beiden Reaktionen wirken nicht auf ein gemeinsames Substrat ein.
Keine dieser Druckschriften stellt ein aus zwei unabhängigen katalytischen Systemen zusammengesetztes System bereit, von dem es sich bei einem System um ein Disulfid-reduktase-System handelt, das die Bildung eines vollen REGENBOGEN-Spektrums unter Einschluß einer in situ gebildeten gelben Komponente umfaßt, wobei der spezielle endgültige Farbton von der Konzentration des Analyten abhängt.

IV. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die Erfindung stellt eine Testzusammensetzung zur visuellen Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe bereit, die folgendes umfaßt:
(a) ein katalytisches System, das zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid durch Umsetzung mit dem in Frage stehenden Analyten in der Lage ist; (b) ein erstes unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung eines reduzierten ersten Indikators durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist; und (c) ein zweites unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung einer Farbtonänderung einer zweiten Indikatorkomponente durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist, wobei das zweite unabhängige katalytische System folgendes umfaßt:
(i) eine Disulfid-reduktase;
(ii) ein Disulfidsubstrat; und
(iii) einen Thiol-Indikator, wobei die Disulfid-reduktase in der Lage ist, die Umsetzung zwischen reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid und dem Disulfid-Substrat unter Bildung eines Produkts zu katalysieren, das mit dem Thiol-Indikator unter Erzeugung der Farbtonänderung des zweiten Indikators in Wechselwirkung treten kann, wobei die Erzeugung des reduzierten ersten Indikators und der veränderte Farbton des zweiten Indikators im wesentlichen gleichzeitig auftreten, wodurch unterschiedliche Farbtöne bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen erzeugt werden, wobei der von der Testzusammensetzung erzeugte spezielle Farbton von der Konzentration des Analyten abhängt.
Vorzugsweise erzeugt ein System einen gelben Farbton. In einem bevorzugten System ist der Thiol-Indikator reduziert, um einen gelben zweiten Indikator zu bilden.
Die Zusammensetzung kann zur Bereitstellung einer Testlösung gelöst oder zur Bereitstellung in Form einer Testvorrichtung einer Trägermatrix einverleibt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Glucose-Vollblut-Testvorrichtung, die dazu in der Lage ist, ein volles Regenbogenspektrum unter Einschluß eines in situ erzeugten gelben Farbtons zu bilden, wobei der spezielle endgültige Farbton der Testvorrichtung von der Konzentration an Glucose in der Testprobe abhängt.

V. Beschreibung der Erfindung

Eine visuelle Farbabstimmung ist zweckmäßig und kann eine Bestimmung einer Analytkonzentration in annehmbarer Genauigkeit ohne Erfordernis einer teuren Instrumentierung ermöglichen. Die Farbe kann in Komponenten, wie Sättigung, Helligkeit und Farbton, aufgespalten werden. Ein Farbton wird üblicherweise als "Farbe" bezeichnet, womit beispielsweise ausgesagt wird, daß etwas blau, rot oder gelb "aussieht". In der gesamten Beschreibung wird der Ausdruck "Farbton" verwendet.
Im allgemeinen ist ein Farbton mit einer Form eines einzelnen Indikators verbunden. Um daher einen Bereich von Farbtönen zu erzeugen, ist eine Anzahl von unterschiedlichen Indikatormolekülen erforderlich. Es ergeben sich zahlreiche mögliche Veränderungen des Farbtons. Ein Indikator kann von einem Farbton zu einem anderen wechseln, von einem Farbton zu einer farblosen Beschaffenheit oder von einer farblosen Beschaffenheit zu einem Farbton. Es ist auch möglich, daß der Indikator selbst seinen Farbton nicht verändert, aber die Form der die Testzusammensetzung enthaltenden Vorrichtung so beschaffen ist, daß eine Farbtonänderung der Vorrichtung erscheint, wenn die Vorrichtung mit einer den Analyten enthaltenden Testprobe in Kontakt gebracht wird. Beispielsweise ist es möglich, daß der Farbton des Indikators nicht vor der Umsetzung der Testzusammensetzung mit dem Analyten sichtbar ist, jedoch sichtbar wird, nachdem die Umsetzung abläuft. Da es erwünscht ist, daß die Veränderung des endgültigen Farbtons, den die Testvorrichtung bei einer Analytkonzentration im Vergleich zu einer anderen Analytkonzentration aufweist, für den Anwender so klar wie möglich ist, werden Veränderungen einer farblosen Beschaffenheit zu einem Farbton und eines Farbtons zu einer farblosen Beschaffenheit bevorzugt. Bei Verwendung von zwei oder mehr Indikatoren verändert sich mindestens eine Indikatorkomponente von einem Farbton zu einer farblosen Beschaffenheit. Ansonsten verändert sich der endgültige Farbton der Testzusammensetzung oder der Vorrichtung in schwarz, da mehrere Farbtöne gebildet werden.
Es ist besonders wünschenswert, die Bildung und/oder das Verschwinden von Indikatoren zu steuern, die in einer Form eine der primären Farbtöne rot, gelb und blau aufweisen. Obgleich eine Zusammensetzung mit einem Gehalt an zwei Indikatorkomponenten eingesetzt werden kann, hat sich die Verwendung von drei Indikatorkomponenten als vorteilhaft erwiesen.
Beispielsweise kommt eine Testzusammensetzung in Frage, die Indikatoren enthält, die die folgende Veränderung des Farbtons in der angegebenen Reihenfolge zeigt.
Indikator 1) blau zu farblos
Indikator 2) farblos zu gelb
Indikator 3) farblos zu rot
Wenn die Indikatoren nacheinander reagieren, so tritt ein Farbton der Testzusammensetzung von blau zu farblos zu orangefarben (gelb + rot) auf.
Verändert jedoch der Indikator 2 den Farbton gleichzeitig mit der Veränderung des Farbtons von Indikator 1, wobei die Veränderung des Farbtons von Indikator 3 später auftritt, so tritt ein Farbton der Testzusammensetzung von blau zu grün (blau + gelb) zu gelb zu orangefarben (gelb + rot) zu rot auf. Ein ähnliches Beispiel ist:
Indikator 1) rot zu farblos
Indikator 2) farblos zu gelb
Indikator 3) farblos zu blau
Wenn die Indikatoren nacheinander reagieren, so tritt ein Farbton der Testzusammensetzung von rot zu farblos zu gelb zu grün (blau + gelb) auf. Wenn die Indikatoren auf die vorstehend beschriebene Weise reagiert haben, wobei zwei Indikatorveränderungen gleichzeitig auftreten und die dritte Indikatorveränderung verzögert ist, so tritt ein Farbton der Testzusammensetzung von rot zu orangefarben (rot + gelb) zu gelb zu grün (gelb + blau) zu blau auf.
Diese beiden Schemata mit gleichzeitigen Farbtonveränderungen können ein volles REGENBOGEN-Spektrum erzeugen. Ein derartiger REGENBOGEN ist erwünscht, da er den breitesten Bereich an für das Auge sichtbaren Farben erzeugt, die herangezogen werden können, um eine Unterscheidung zwischen Analytkonzentrationen leichter interpretierbar zu machen.
Es ergibt sich ein zweifaches Problem: 1) Auswahl der Indikatoren mit unabhängig voneinander induzierten Farbtonveränderungen zur Erzeugung der maximalen Farbtonveränderung und 2) Gewährleistung der Tatsache, daß diese Indikatoren in einer geordneten Weise reagieren, die nur von der Konzentration des Analyten abhängt.
Es wurde festgestellt, daß ein Bereich von Farbtönen unter Verwendung von zwei unabhängigen katalytischen Systemen gebildet werden kann, wobei jedes System mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) unter Bildung von einer oder mehreren Farbtonveränderungen reaktiv ist. Die Systeme reagieren im wesentlichen gleichzeitig mit NADH. Der durch eine spezielle Analytkonzentration erzeugte Farbton kann durch die relative Zunahme oder Abnahme der Konzentrationen der Komponenten und der Katalysatoren in der Testzusammensetzung gesteuert werden.
Bei den einzelnen unabhängigen katalytischen Systemen handelt es sich um Systeme, die in der Lage sind, mit einem oder mehreren Indikatoren in Gegenwart von NADH unter Erzeugung einer Farbtonveränderung des oder der Indikatoren zu reagieren. Ein System enthält mindestens einen oxidierten Indikator und einen Katalysator, der zur Erleichterung der Reduktion des oxidierten Indikators in Gegenwart von NADH in der Lage ist. Das andere System enthält mindestens ein Disulfid-Substrat, einen Thiol- Indikator und eine Disulfid-reduktase (den Katalysator). Die Funktionsweise des Disulfid-reduktase-Systems kann nach drei allgemeinen Wegen erfolgen: 1) Der Thiol-Indikator kann mit dem gebildeten Produkt durch Umsetzung von NADH und dem Disulfid-Substrat unter Erzeugung der Farbtonveränderung des zweiten Indikators in Wechselwirkung treten; 2) der Thiol-Indikator kann unter Bildung eines reduzierten zweiten Indikators reduziert werden; und 3) dieser zweite Indikator kann in beiden Fällen einen gelben Farbton aufweisen. Es hat sich als besonders schwierig erwiesen, einen gelben Farbton in situ zu erzeugen.
Die Ausdrücke "Katalysator" und "katalytisch" werden hier in ihrer herkömmlichen Bedeutung verwendet. Bei einer "katalytischen" Reaktion handelt es sich um eine Reaktion, deren Geschwindigkeit sich durch Zugabe eines "Katalysators" verändert, wobei aber der Katalysator selbst unverändert bleibt. Die katalytischen Reaktionen, auf die hier bezug genommen wird, sind üblicherweise enzymatischer Natur, sie können aber auch nichtenzymatische Reaktionen umfassen, z.B. solche, die durch Phenazinmethosulfat katalysiert sind. Der Ausdruck "unabhängig" bedeutet, daß der oder die oxidierten Indikatoren, die in einem katalytischen System reduziert werden, mit dem oder den Indikatoren, die in dem anderen katalytischen System reduziert werden, während der in Frage stehenden Reaktionszeit nicht im Gleichgewicht stehen.
Das NADH wird aus dem in Frage stehenden Analyten durch ein katalytisches System, das üblicherweise enzymatisch ist, erzeugt. Tabelle 1 zeigt Analyten von klinischem Interesse und wertvolle enzymatische Systeme, die NADH bilden können. Diese Reaktionen und die erforderlichen Reaktionskomponenten sind bekannt und stellen derzeit die Grundlage für zahlreiche diagnostische Reaktionen dar, die Veränderungen in der Intensität eines einzelnen Farbtons entsprechend der Analytkonzentration erzeugen. Bei dem Enzymsystem, das zur Erzeugung von NADH aus dem in Frage stehenden Analyten in der Lage ist, handelt es sich üblicherweise um ein Dehydrogenase-System, obgleich auch beliebige andere Systeme, die zur Erzeugung von NADH in der Lage sind, verwendet werden können. Tabelle 1 Analyt Enzym Glucose Cholesterin Alkohol Lactat Glucose-dehydrogenase Hexokinase/Glucose-6-phosphat-dehydrogenase Cholesterin-dehydrogenase Alkohol-dehydrogenase Lactat-dehydrogenase
Die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid, NADH, hat sich als besonders geeignetes gemeinsames Substrat erwiesen. Obgleich die vorliegende Beschreibung sich ausschließlich auf Nicotinamid-adenin-dinucleotid, NAD, und dessen reduzierte Form, NADH, bezieht, ist die Beschreibung so zu verstehen, daß sie auch in gleicher Weise für die phosphorylierten Formen NAD(P) und NAD(P)H gilt.
Nachstehend werden für das gemeinsame Substrat NADH geeignete katalytische Systeme auf der Basis von Diaphorase oder Katalysatoren mit einer diaphoraseähnlichen Aktivität, wie Phenazinmethosulfat und 1-Methoxyphenazinmethosulfat, näher erläutert.
Das Diaphorase-System hat sich als eine Möglichkeit als wertvoll erwiesen, da die beiden oxidierten Indikatoren, die deutliche Farbtonveränderungen aufweisen, leicht zugänglich sind. DCIP, 2,6-Dichlorindophenol, ist ein blauer Farbstoff, der in Gegenwart von Diaphorase und NADH zu einer farblosen Form reduziert wird. INT, 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid, ist in der oxidierten Form farblos, wird aber bei Reduktion in Gegenwart von Diaphorase und NADH rot. Die beiden Farbtonveränderungen laufen nacheinander ab. Es können weitere Indikatoren, die mit Diaphorase und NADH reaktiv sind, verwendet werden. Beispielsweise können N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)-2- chlor-6-sulfo-4-iminobenzochinon, das kurz als TR-1 bezeichnet wird, und p-Nitroblau-tetrazoliumchlorid, das kurz als NBT bezeichnet wird, anstelle von DCIP und INT verwendet werden. Weitere Indophenole und verwandte substituierte Alkyl-, Nitro-, Halogen- und Pseudohalogenderivate davon können anstelle von DCIP verwendet werden, sowie auch andere Indikatoren mit einem ähnlichen Reduktionspotential, die in Gegenwart von NADH reduziert werden können. Weitere Tetrazoliumprodukte können anstelle von INT verwendet werden. Zahlreiche derartige Produkte sind bekannt und in Übersichtsartikeln, wie "An Introduction to the Use of Tetrazolium Salts in Quantitative Enzyme Chemistry", F.P. Altman, Koch-light Laboratories, Ltd., Colnbrook, England, 1972; und "The Chemistry of Formazans and Tetrazolium Salts", A.W. Nineham, Chem. Rev., Bd. 55 (1955), S. 355, aufgeführt.
Ein zweiter paralleler Weg wird durch das zweite unabhängige katalytische System auf der Basis einer Disulfid-reduktase bereitgestellt. Eine Anzahl von Reduktase-Systemen ist in nachstehender Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Disulfid-Substrat L-Cystein oxidiertes Glutathion Lipoamid Disulfid-reduktase Cystein-reduktase Glutathion-reduktase Dihydrolipoamid-reduktase (hier als Lipoamid-dehydrogenase bezeichnet) Protein-disulfid oxidiertes Thioredoxin CoAS-S-Glutathion Asparagusat Protein-disulfid-reduktase Thioredoxin-reduktase CoAS-S-Glutathion-reduktase Asparagusat-reduktase
Das Disulfid-reduktase-System weist drei Komponenten auf: ein Disulfid-Substrat, eine Disulfid-reduktase, die in der Lage ist, die Reaktion zwischen dem Disulfid-Substrat und NADH zu erleichtern, und einen Thiol- Indikator, der mit dem Reaktionsprodukt zwischen dem Disulfid-Substrat und NADH unter Erzeugung der Farbtonänderung des zweiten Indikators in der Lage ist. Bevorzugte Disulfid-Substrate sind Lipoamid und Analoge davon, die mit Lipoamid-dehydrogenase verwendet werden können. Das Disulfid-reduktase-System hat sich als besonders geeignet zur Einführung eines gelben Farbtons in die durch die Testzusammensetzung erzeugte Farbtonskala erwiesen.
Beim Thiol-Indikator handelt es sich um eine beliebige Substanz, die mit einem Thiol (-SH-Verbindung) unter Erzeugung einer beobachtbaren Farbe in Wechselwirkung treten kann. Bevorzugte Thiol-Indikatoren sind farblose Indikatoren, die bei der Wechselwirkung gelb werden. Üblicherweise handelt es sich bei dem Thiol-Indikator um einen oxidierten Indikator, der in Gegenwart des Produkts der Reaktion zwischen dem Disulfid- Substrat und NADH unter Bildung eines reduzierten zweiten Indikators reduziert wird, der gelb sein kann, aber nicht gelb sein muß. Jedoch kommen auch andere Typen einer Wechselwirkung, bei denen eine Farbe entsteht, in Betracht. Beispielsweise kann es sich bei den Thiol-Indikatoren um chelatbildende Mittel, wie Nitroprussiat, handeln, die mit dem Produkt der Disulfid-Substrat/NADH-Reaktion unter Erzeugung eines roten Farbtons in Wechselwirkung treten. Auch ein Palladiumkomplex kann zur Erzeugung eines roten Farbtons verwendet werden. Ein gelber Farbton kann durch Wechselwirkung des Thiol-Indikators mit dem Produkt der Disulfid-Substrat/NADH-Reaktion durch Alkylierung erzeugt werden, wenn es sich bei dem Produkt um Cystein handelt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, ein Cystein-Produkt mit Noradrenochrom unter Bildung eines gelben Farbtons umzusetzen.
Ein weiterer allgemeiner Typ eines Thiol-Indikators besteht in einem Chromophor des gewünschten Farbtons, vorzugsweise gelb, der hinter einem undurchsichtigen Träger immobilisiert ist. Bei der Reaktion mit dem Produkt der Disulfid-Substrat/NADH-Reaktion wird der Chromophor aus der Bindung freigesetzt und kann frei durch den undurchsichtigen Träger in eine Position diffundieren, wo er für den Betrachter sichtbar ist.
Üblicherweise handelt es sich bei den Thiol-Indikatoren, die einer Reduktion unterliegen, um Disulfid-Verbindungen. Besonders bevorzugt sind Analoge von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), die kurz als DTNB bezeichnet werden, deren Struktur nachstehend angegeben ist:
DTNB wird üblicherweise als Ellman's Reagenz bezeichnet. Auch Veränderungen der Carbonsäure-hydroxylgruppe haben sich als geeignet erwiesen. Analoge von DTNB, die hier definitionsgemäß auch Positionsisomere von DTNB umfassen, der nachstehend aufgeführten Struktur werden bevorzugt:
R kann zahlreiche Gruppen bedeuten, beispielsweise solche, die eine Ester- oder Amidbindung bereitstellen, z.B:
Obgleich wasserlösliche Gruppen, wie die vorstehend dargestellten Gruppen, in Form von Gelatinematrices bevorzugt sind, können auch wasserunlösliche Analoge in kompartimentierter Form verwendet werden, wie nachstehend in der Beschreibung erläutert wird.
Eine bevorzugte wasserlösliche, analoge Verbindung ist 3-N-(3-Dimethylaminopropyl)-carboxamido-4-nitrophenyldisulfid der nachstehend angegebenen Strukturformel, deren Herstellung in den Beispielen ausführlich beschrieben wird.
Die Verbindung wird nachstehend in der Beschreibung kurz als 3-ND bezeichnet. Diese Verbindung ist in der oxidierten Form farblos und wird in Gegenwart von Lipoamid, NADH und Lipoamid-dehydrogenase gelb.
In der nachstehenden Tabelle 3 sind Farbtöne von besonders geeigneten Indikatoren aufgeführt. Tabelle 3 oxidiert reduziert blau farblos rot gelb
Es wurde festgestellt, daß die Zusammensetzung mit einem Farbverzögerungsmittel versetzt werden kann. Das Farbverzögerungsmittel hat im wesentlichen keinen Einfluß auf den für den Anwender sichtbaren Farbton, jedoch kann dessen Zugabe die katalytische Beeinträchtigung der unabhängigen Systeme verzögern, die Reduktion der oxidierten Indikatoren verzögern und dadurch den für eine bestimmte Analytkonzentration gebildeten endgültigen Farbton verändern. Zu geeigneten Farbverzögerungsmitteln gehören Kaliumhexacyanoferrat(III) und 1-N-Ethyl-4-methylchinoliniumjodid sowie Analoge davon oder Gemische dieser Verbindungen, wobei Kaliumhexacyanoferrat(III) bevorzugt wird. Farbverzögerungsmittel verändern in wirksamer Weise den Meßbereich der Zusammensetzung.
Weitere Bestandteile, wie Puffer, oberflächenaktive Mittel und Polymere können zu der Zusammensetzung gegeben werden. Der pH-Wert wird im allgemeinen so gewählt, daß die Reagenzien sich in bezug auf Gebrauchseigenschaften und Stabilität günstig verhalten. Der pH-Wert wird durch Verwendung von Puffern gesteuert. Die Verwendung von Puffern wird bevorzugt, da die Enzyme innerhalb des pH-Bereichs von etwa 6,0 bis 8 eine bessere Funktion zeigen. Die Wahl eines Puffers liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns. Zu geeigneten Puffern gehören ohne Beschränkung hierauf N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 2-[Tris- (hydroxymethyl)-methyl]-aminoethansulfonsäure (TES), 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) und [3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure] (MOPS). Oberflächenaktive Mittel und Polymere können in Zubereitungen mit einem Gehalt an einem kationischen Tetrazoliumsalz als oxidiertem Indikator besonders geeignet sein, da oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenether, die unter der Warenbezeichnung TRITON X-100 von der Firma Sigma Chemical Co. erhältlich sind, und Polymere, wie Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, die unter der Bezeichnung PVP K30 von der Firma Aldrich Chemical Co. erhältlich sind, offensichtlich die Solubilisierung des kationischen Indikators unterstützen und eine Wechselwirkung mit den anderen Indikatoren in der Testzusammensetzung verhindern. Oberflächenaktive Mittel verbessern auch die Benetzbarkeit der Vorrichtung in einer Trockenphasen-Zubereitung. Enzymstabilisatoren, wie Rinderserumalbumin, können ebenfalls zugesetzt werden.
Erfindungsgemäße Testzusammensetzungen können verwendet werden, indem man die Zusammensetzung in einer Lösung auflöst, oder sie können einer Trägermatrix einverleibt und auf einem Trägerelement, wie einem Polyesterstreifen befestigt werden, wodurch man trockene Reagenzstreifen erhält, die auf dem Gebiet der Diagnostika bekannt sind. Diese Streifen stellen eine Form dar, die einfach zu transportieren und zu lagern ist und die sich insbesondere für Heimanwender, wie Diabetiker, als wertvoll erweist. Bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung ergeben innerhalb von weniger als etwa 10 Minuten einen endgültigen Farbton, der mit einer bestimmten Analytkonzentration in Verbindung gebracht werden kann.
Bei der verwendeten Trägermatrix kann es sich um verschiedene, gewerblich geläufige Matrices handeln, solange die Zusammensetzung der Matrix einverleibt werden kann und die Matrix die für die Farberzeugung erforderlichen Reaktionen nicht stört. Hierzu gehören Papier und Filme, z.B. Produkte aus natürlichen Polymeren, Latices, Polyurethanen, Silikonen und Kombinationen davon.
Um möglichst klare Farben zu erzielen, wird eine klare Trägermatrix bevorzugt. Da es sich bei für die vorliegende Erfindung üblichen Analyten um wasserlösliche Verbindungen handelt, beispielsweise um Verbindungen, die in Körperflüssigkeiten auftreten, werden Trägermatrices, die Wasser enthalten, z.B. hydrophile Träger, bevorzugt. Beispiele für geeignete hydrophile Träger sind Agarose, Gelatine, Polyvinylalkohol, Polypropylimin, Carrageenan und Alginsäure. Es können auch andere Träger verwendet werden. Gemischte mehrschichtige Träger aus einer absorbierenden undurchsichtigen Matrix, wie Papier, und einer hydrophilen Trägerschicht (z.B. Gelatine) können in vorteilhafter Weise verwendet werden, wenn die Testkomponenten kompartimentiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde eine Lösung von 1,25 % Carbodiimid zur Vernetzung einer mehrschichtigen Gelatine-Trägermatrix verwendet. Dadurch entsteht eine für einen Vollblut-Glucosetest geeignete Form, die es ermöglicht, die Blutprobe von der Testvorrichtung durch Abwischen der Oberfläche zu entfernen. Weitere bekannte Beschichtungsmaterialien können verwendet werden, um die Vorrichtung waschen oder abwischen zu können, um gegebenenfalls eine gefärbte Probe zu entfernen.
Die hydrophile(n) Trägerschicht(en) können auf ein steifes Stütz- oder Trägerelement, z.B. Polystyrol, Polyester und dgl., schichtförmig aufgebracht werden. Die Stützschicht kann undurchsichtig oder durchsichtig sein, obgleich eine undurchsichtige weiße Stützschicht für visuell ablesbare Tests üblicherweise bevorzugt wird.
Die Anzahl und Typen der Komponenten, die in den vorstehend beschriebenen, unabhängigen katalytischen Systemen verwendet werden können, wird durch die Anwendung einer Kompartimentierung von möglicherweise unverträglichen Komponenten in einer Testvorrichtung erhöht. Eine Kompartimentierung kann in zahlreichen Formen vorgenommen werden. Die Komponenten können durch Anordnung in einer getrennten Schicht, durch Solubilisieren innerhalb einer Phase einer Emulsion, durch Ausfällen, durch Einkapseln und dgl. getrennt werden. Einige der verfügbaren Verfahrensweisen sind in den Beispielen ausführlich beschrieben.
Ein mehrschichtiger Gelatineträger wurde für die Kompartimentierung bevorzugt. INT konnte in einer Schicht, die von den anderen Indikatorkomponenten entfernt ist, angeordnet werden. Es wurde auch festgestellt, daß die Position der Komponenten in verschiedenen Schichten den für den Anwender bei einer bestimmten Analytkonzentration sichtbaren Farbton verändern konnte und somit ein weiteres Mittel zur Steuerung des erzeugten Farbtons lieferte. Der auftretende Farbton der Vorrichtung kann durch Veränderung der Reihenfolge oder der Dichte der Schichten verändert werden.
Ein spezielles Beispiel, das den Einfluß der Kompartimentierung der Komponenten in unterschiedlichen Schichten auf den für den Anwender sichtbaren Farbton zeigt, wird nachstehend näher beschrieben.
Eine REGENBOGEN-Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose läßt sich gemäß folgenden unabhängigen katalytischen Reaktionen herstellen:
NADH-Erzeugungssystem:
Glucose (Analyt)
Glucose-dehydrogenase (Enzym)
NAD (zusätzliche Komponente)
Erstes unabhängiges Katalysatorsystem:
Diaphorase (Katalysator)
DCIP (oxidierter erster Indikator, blau)
INT (oxidierter dritter Indikator, farblos)
DCIP wurde zuerst durch NADH reduziert. Daher liefert das erste unabhängige katalytische System eine für den Anwender sichtbare Farbtonveränderung von blau zu farblos und sodann von farblos zu rot.
Zweites unabhängiges katalytisches System:
Lipoamid (Disulfid-Substrat)
Lipoamid-dehydrogenase (Disulfid-reduktase)
DTNB (Thiol-Indikator, oxidierter zweiter Indikator, farblos).
Die Kompartimentierung der oxidierten Indikatoren, indem man beispielsweise die Indikatoren in unterschiedliche Gelatineschichten einbringt, kann in wirksamer Weise den bei unterschiedlichen Glucosekonzentrationen sichtbaren Farbton verändern, obgleich die Konzentrationen der Testkomponenten gleich sind. Beispielsweise wurden drei Filme hergestellt, bei denen die Indikatoren in verschiedenen Schichten angeordnet waren, jedoch die Konzentrationen der Komponenten der gesamten Testzusammensetzung die gleichen waren. FILM Enzyme
In Gelatine sind bestimmte wasserlösliche Moleküle wie DNTB, dazu in der Lage, nach Kontakt mit einer wäßrigen Probe durch die Gelatine zu diffundieren, während andere Moleküle, wie INT, nicht bereitwillig wandern.
Im Film A reagiert Glucose mit den Enzymen, anschließend reagiert das gebildete NADH mit den unabhängigen katalytischen Systemen unter Reduktion von DCIP und DTNB. Jedoch wird die Reduktion von INT solange verzögert, bis das NADH in die untere Schicht des Films diffundieren kann. Bei 250 mg/dl Glucose ist der Film A gelb-orangefarben.
Im Film B muß die Glucose durch die INT-Schicht diffundieren, bevor sie die Enzyme unter Reaktion und Bildung von NADH erreicht. Mit der Bildung von NADH wird das DCIP reduziert, während die Reduktion von INT verzögert wird, da das NADH nach oben in die Deckschicht zurückdiffundieren muß, bevor das INT reduziert werden kann. Daher ist der Film B bei 250 mg/dl Glucose gelb-grün. Die Kompartimentierung von INT über den Enzymen und den anderen Intikatorkomponenten führt zu einer Veränderung der beobachteten Farbe bei dieser speziellen Glucosekonzentration.
Im Film C reagiert die Glucose mit den Enzymen in der Deckschicht. Mit Wanderung des NADH durch die INT-Schicht wird eine geringe Menge an INT unter Erzeugung einer leicht roten Färbung reduziert. Da das NADH zur Bodenschicht hindurchwandert, werden das DCIP und das DTNB reduziert. Da schließlich aufgrund der Konzentration der gewählten Komponenten nicht das gesamte NADH umgesetzt worden ist, reagiert das NADH mit dem INT. Bei 250 ml/dl Glucose ist der Film C rotstichig-orangefarben.
Das letztendliche Ziel der Erfindung bestand darin, unterschiedliche Farbtöne bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen zu erzeugen. Es hat sich erwiesen, daß dieses Ziel mit den erfindungsgemäßen Testzusammensetzungen gemäß einer Reihe von Methoden erreicht werden kann, wie nachstehend zusammenfassend dargestellt wird.
1) Wahl von oxidierten Indikatoren, die bei Reduktion den gewünschten Farbton erzeugen oder farblos werden.
2) Wahl von Indikatoren für die Reaktion in einem speziellen katalytischen System, das unterschiedliche Redox-Potentiale aufweist, die die Reaktionsfolge in diesem System steuern.
3) Steuerung der Mengen der Komponenten in den unabhängigen katalytischen Systemen in der Weise, daß die in einer Reaktionsfolge beteiligten Komponenten bei der gewählten Analytkonzentration im wesentlichen verbraucht werden.
4) Erhöhung (oder Senkung) der Menge des Katalysators in einem System. Dadurch wird die Geschwindigkeit der Wechselwirkung oder Reduktion der Indikatorkomponente durch das System erhöht (oder verringert) und somit erfolgt eine Veränderung des bei einer bestimmten Analytkonzentration auftretenden Farbtons.
5) Kompartimentierung der Komponenten des Reaktionssystems in einer Testvorrichtung. Zu den Vorteilen der Kompartimentierung gehören die Fähigkeit zur: Veränderung des auftretenden Farbtons in der Vorrichtung, selbst wenn die Konzentrationen der Komponenten gleich sind; Verwendung von unverträglichen Indikatoren oder in Wasser unlöslichen Indikatoren; und Verwertung von Enzymsystemen, die normalerweise durch Thiol-Indikatoren gehemmt werden.
6) Zugabe eines Farbverzögerungsmittels, das die Reaktionen der unabhängigen katalytischen Systeme verzögert.
Die vorstehend vorgeschlagenen Methoden können kombiniert werden.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert.

VI. Beispiele

Abkürzungen

MPMS 1-Methoxyphenazinmethosulfat
PMS Phenazinmethosulfat
DCIP 2,6-Dichlorindophenol
TR-1 N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)- 2-chlor-6-sulfo-4-iminobenzochinon (bezüglich der Herstellung vergl. Beispiel 1A)
INT 2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid
NBT p-Nitroblau-tetrazoliumchlorid
DTNB 5,5-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)
3-ND 3-N-(3-Dimethylaminopropyl)-carboxamido-4-nitrophenyldisulfid (bezüglich der Herstellung vergl. Beispiel 1B)
EA1 Dibutyl-5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoat (bezüglich der Herstellung vergl. Beispiel 2C)
NAD&spplus; Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Lithiumsalz
HEPES Puffer, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
MES Puffer, 2-[N-Morpholino)-ethansulfonsäure]
TAPSO Puffer, 3-(N-Tris-(hydroxymethyl)-methylamino)- 2-hydroxypropan-sulfonsäure
TRIS Puffer, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Triton X-100 oberflächenaktives Mittel, Polyoxyethylenether der Firma Sigma Chemical Co.
GDH Glucose-dehydrogenase (EC 1.1.1.47) zur Bildung von NADH fähig
LipDH Lipoamid-dehydrogenase
LDH Lactat-dehydrogenase
U Internationale Einheiten, ein Maß für die Enzymaktivität (1 U ist die Enzymaktivität, die erforderlich ist, um die Umsetzung von 1 uMol Substrat pro Minute unter bestimmten Temperatur- und pH-Bedingungen zu katalysieren.)
PET Polyethylenterephthalat
FMN Flavin-mononucleotid
PE 310 mit Polyethylen beschichtetes Papier
BSA Rinderserumalbumin
PVP K30 Polyvinylpyrrolidon, Molekulargewicht 40 000, Produkt der Firma. Aldrich Chemical Co.
dl Deciliter
ml Milliliter
ul Mikroliter
g Gramm
mm Hg Millimeter Quecksilber, Druckbezeichnung
F. Schmelzpunkt
um Mikrometer
RT Raumtemperatur, üblicherweise 25ºC

Beispiel 1: Herstellung von Verbindungen

A. N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)-2-chlor-6-Sulfo- 4-iminobenzochinon (TR-1)

TR-1 ist ein Indikator, der in oxidierter Form rot und nach Reduktion farblos ist. Sein Reduktionspotential ist ähnlich dem von DCIP. Er wird zur Herstellung eines "umgekehrten" REGENBOGENS verwendet. TR-1 wurde auf folgende Weise hergestellt.
Ammoniumhydroxid (1N, 10 ml) wurde zu einem Gemisch aus 0,4 g (1,9 mMol) 4-Aminoantipyrin und 0,5 g (1,7 mMol) 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonsäure-dinatriumsalz in 50 ml Wasser gegeben. Nach kurzem Rühren wurden 1,3 g (3,8 mMol) Kaliumhexacyanoferrat(III) (K&sub3;Fe(CN)&sub6;) zugesetzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Gemisch filtriert. Man erhielt 0,2 g (21 %) eines dunkelbraunen Feststoffs. Das Produkt erwies sich bei der Dünnschichtchromatographie (Kieselgel, mit 4:1 Chloroform/Methanol) als homogen. Offensichtlich handelte es sich um ein Gemisch aus Alkali- und Ammoniumsalzen.
Analyse: Berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub0;ClN&sub3;O&sub5;Na: C 47,54; H 3,04; N 9,72
Gefunden C 46,10; H 3,61; N 11,00.
¹H NMR (D&sub6;DMSO) δ: 7,80-7,20 (m, 7H), 3,40 (s, 3H), 2,53 (s, 3H),
IR (KCl): 1660, 1630,. 1400 cm&supmin;¹.

B. 3-N-(3-Dimethylaminopropyl)-carboxamido-4-nitrophenyldisulfid (3- ND)

Ein wasserlösliches Analoges von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) wurde zur Verwendung als Thiol-Indikator hergestellt. Es handelt sich um einen bevorzugten Indikator zur Verwendung mit dem Disulfid-reduktase-System, der in oxidierter Form farblos ist und nach Reduktion gelb wird. Die Verbindung 3-ND wurde auf folgende Weise hergestellt:
Eine Suspension mit einem Gehalt an 7,93 g 3-Carboxy-4-nitrophenyldisulfid (20 mMol), 1,2 ml trockenem N,N-Dimethylformamid (1,55 mMol), 11,7 ml Thionylchlorid (60,3 mMol) und 400 ml Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;) wurde 4 Stunden unter Rückfluß erwärrnt. Anschließend ließ man das Gemisch über Nacht bei Umgebungstemperatur rühren. Die erhaltene klare Lösung wurde unter Vakuum (12 mm und anschließend 0,1 mm Hg) zu einem gelben Feststoff eingedampft. Der Rückstand wurde sodann in eine Argon-Atmosphäre gebracht, in 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst, auf 0ºC gekühlt und sodann mit 10,1 ml 3-Dimethylaminopropylamin (80 mMol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dunkel-orangefarben, und es bildete sich ein Niederschlag. Man ließ die erhaltene Lösung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Sodann wurde das Reaktionsgemisch nacheinander viermal mit jeweils 200 ml 5 % Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 200 ml Wasser und einmal mit Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 9,39 g eines dunkelorangefarbenen Öls. Sodann wurde das Gemisch der Flash-Chromatographie an 500 g SiO&sub2;-60 (70-230 mesh, Silicagel-60 der Firma Merck & Co.), das mit einem 50:10:1-Lösungsmittelgemisch aus Dichlormethan/Methanol/konzentriertem Ammoniumhydroxid äquilibriert und eluiert wurde, unterzogen. Die das gereinigte Produkt enthaltenden Fraktionen 110 bis 205 wurden vereinigt und unter Vakuum eingeengt. Man erhielt 7,06 g eines orangefarbenen Feststoffs. Das Rohprodukt wurde aus Essigsäureethylester unter Behandlung mit pulverisiertem Ruß, wie Norit und Diatomeenerde, einer Filtrationshilfe der Firma Manville Products Corp., Denver, Colorado, vertrieben unter der Warenbezeichnung Celite , umkristallisiert. Nach Trocknen bei 55ºC, 0,1 mm, erhielt man 5,47 g hellgelbe Kristalle. Ausbeute = 48,4 %. F. 152-156ºC.
Analyse: Berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub2;N&sub6;O&sub6;S&sub2;: C 51,05; H 5,71; N 14,88
gefunden: C 51,05; H 5,56; N 14,62.
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ: 1,73 (Quintett, J=6Hz, 4H); 2,17 (s, 12H); 2,45 (t, J=6Hz, 4H); 3,53 (q, J=6Hz, 4H); 7,57 (s, 2H); 7,65 (dd, J=7Hz, 2Hz, 2H); 8,02 (m, 2H, N-H), 8,03 (d, J=7Hz, 2H).
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3260, 3060, 2940, 2870, 2820, 2790, 1650, 1560, 1530, 1470, 1345.
Massenspektrum (FAB) m/e: 565 (M&spplus;1, 13,6 %).

C. Dibutyl-5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoat) (EA-1)

Diese Verbindung, die kurz als EA-1 bezeichnet wird, stellt ein lipophiles Analoges von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) dar. Sie wurde zur Verwendung als Thiol-Indikator auf folgende Weise hergestellt:
Eine Suspension mit einem Gehalt an 6,85 g (17,25 mMol) 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), 3,46 ml Thionylchlorid, 0,346 ml N,N-Dimethylformamid und 3,50 ml Dichlormethan wurde 3 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Weiteres Thionylchlorid (3,46 ml) und N,N'-Dimethylformamid wurden zugegeben. Der Rückflußvorgang wurde 2 Stunden fortgesetzt. Man erhielt eine klare, hellgrüne Lösung, was eine vollständige Umwandlung in das Bis-säurechlorid anzeigt. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt.
Der erhaltene hellgrüne Feststoff wurde in eine Argon-Atmosphäre gebracht. Der Rückstand wurde sodann in 100 ml Pyridin suspendiert und mit 20 ml n-Butanol behandelt. Es ergab sich eine schwach exotherme Reaktion. Das Reaktionsgemisch färbte sich dunkel, war aber homogen. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Sodann wurden die Reaktionslösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 300 ml Chloroform gelöst. Die organische Phase wurde sodann nacheinander dreimal mit jeweils 200 ml 0,1 n HCl, zweimal mit jeweils 200 ml 5 % NaHCO&sub3;-Lösung und mit 200 ml Kochsalzlösung extrahiert. Nach Trocknen (MgSO&sub4;) Filtrieren und Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 12,79 g eines Öls, das in Essigsäureethylester gelöst und unter Vakuum an einer geringen Menge SiO&sub2;-60 adsorbiert wurde. Der imprägnierte Feststoff wurde sodann auf eine mit 500 g SiO&sub2;-60 (230-400 mesh) gepackte und mit 8:1 Hexan-Essigsäureethylester äquilibrierte Säule aufgesetzt. Die Säule wurde sodann der Flash-Chromatographie unter Verwendung dieses Lösungsmittelgemisches unterzogen, wobei Fraktionen von 25 ml gewonnen wurden. Die Fraktionen 190-270 wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt 8,07 g Produkt in Form eines Öls, das beim Stehenlassen erstarrte (92 % Ausbeute).
Analyse: Berechnet für: C 51,96; H 4,76; N 5,08
gefunden: C 52,49; H 4,88; N 5,45
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ: 0,97 (t, J=7Hz, 6H, CH&sub3;-CH&sub2;); 1,2-1,9 (m, 8H, -CH&sub2;-CH&sub2;-); 4,37 (t, J=6Hz, 4H, -O-CH&sub2;-CH&sub2;-) 7,77 (s, 2H, C&sub6;H); 7,83 (AB Quartett, J=8Hz, 4H, C&sub3; H, C&sub4;H).
IR (KBr) cm&supmin;¹: 1730 (Ar- -O-CH&sub2;-Streckschwingung)
Massenspektrum: E.I. (70 EV) m/e = 508 (37 %, M&spplus;).

D. Dimethyl-5-5'-dithiobis-(2-nitrobenzoat)

Diese Verbindung stellt ein lipophiles Analoges von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) dar, die zur Verwendung als Thiol-Indikator auf folgende Weise hergestellt wurde:
Eine Suspension mit einem Gehalt an 7,93 g (20 mMol) 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), 1,2 ml N,N-Dimethylformamid, 11,7 ml Thionylchlorid und 400 ml Dichlormethan wurde 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt, bis eine hellgrüne Lösung entstand. Sodann wurden die Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Man erhielt einen gelben Feststoff, der sodann in eine Argon-Atmosphäre gebracht, in 200 ml Dichlormethan gelöst und auf 0ºC gekühlt wurde. Das gerührte Gemisch wurde sodann mit 4,03 ml trockenem Pyridin (50 mMol) und 30 ml Methanol behandelt. Man ließ das erhaltene Gemisch über Nacht auf Umgebungstemperatur erwärmen. Sodann wurde das Reaktionsgemisch nacheinander zweimal mit jeweils 300 ml 5 % NaHCO&sub3;-Lösung, dreimal mit jeweils 300 ml 1 m Citronensäure und 300 ml Kochsalzlösung extrahiert. Nach Trocknen (MgSO&sub4;), Filtrieren und Entfernen der Lösungsmittel erhielt man 8,29 g eines gelben Feststoffs, der sodann in zwei Ausbeuten aus Toluol in Form eines hellgelben Feststoffs umkristallisiert wurde. Ausbeute 92 %. F. 103-104,5ºC.
Analyse: Berechnet für: C 45,28; H 2,86; N 6,60 gefunden: C 45,74; H 3,01; N 6,25.
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ: 3,93 (s, 6H, -O-CH&sub3;); 7,8 (s, 2H, C&sub6;H); 7,83 (AB- Quartett; J=8Hz, 4H, C&sub3;H, C&sub4;H.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 1740 (- -O-CH&sub3; Streckschwingung)
Massenspektrum: EI (70EV) m/e: 424,3 (M&spplus;, 67,7 %).

E. 3,6-Dioxaoctyl-5,5'-dithio-(2-nitrobenzoat)

Diese Verbindung stellt ein wasserlösliches Analoges von 5,5'- Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) dar. Sie wurde zur Verwendung als Thiol- Indikator auf folgende Weise hergestellt.
Eine Suspension mit einem Gehalt an 7,93 g (10 mMol) 5,5'-Dithio- (2-nitrobenzoesäure) 1,17 g N,N-Dimethylformamid, 11,7 ml Thionylchlorid und 400 ml Dichlormethan wurde unter Rühren 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Man erhielt eine klare Lösung. Die Lösungsmittel wurden sodann unter Vakuum entfernt. Man erhielt einen hellgrünen Feststoff, der unter Argon gebracht, auf 0ºC gekühlt und unter Rühren in 120 ml trockenem Pyridin suspendiert wurde. Sodann wurde Carbotil (20 ml) zugegeben, und nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde entstand eine orangestichig-rote homogene Lösung (Carbitol ist ein Warenzeichen der Dow Chemical Co.; die chemische Bezeichnung lautet 2-(2-Ethoxyethoxy)-ethanol). Sodann ließ man das Gemisch über Nacht auf Raumtemperatur kommen. Anschließend wurde die Probe unter Vakuum zu einem dunklen Öl eingedampft und der Flash-Chromatographie an 500 g SiO&sub2;-60 (230-400 mesh) unterworfen, wobei mit einem Lösungsmittelgemisch aus 0,5 % Methanol-Chloroform eluiert wurde. Fraktionen von 25 ml wurden gewonnen. Die Fraktionen 150-186 wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt 7,86 g eines gelben Öls. Sodann wurde die Probe in Ether gelöst, mit 4 g Norit behandelt, durch Celite filtriert und mit Hexan in Form eines dichten gelben Öls ausgefällt. Die Lösungsmittel wurden dekantiert. Die restlichen Lösungsmittel wurden unter Vakuum bei 40ºC (0,1 mm) innerhalb von 1 Stunde entfernt. Man erhielt 5,48 g eines viskosen, gelben Öls (44 % Ausbeute).
Analyse: Berechnet für: C 49,67; H 5,13; N 4,46
gefunden: C 49,41; H 5,09; N 4,37
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;) δ: 1,2 (t, J=7Hz, 6H, &sub3;-CH&sub2;-O-), 3,5 (q, J=7Hz, 4H, CH&sub3;- &sub2;-O-); 3,6 (s, 8H, -CH&sub2;-CH&sub2;-O-); 3,8 (m, 4H, - -O-CH&sub2;- &sub2;-); 4,55 (m, 4H, - - &sub2;-CH&sub2;-O-); 7,8 (s, 2H, C&sub6;H); 7,82 (AB-Quartett, J=8Hz, 4H, C&sub3;H, C&sub4;H).
IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 1740 (- -O-CH&sub2;- Streckschwingung).

F. 3,6,9,12-Tetraoxadodecyl-5,5'-dithio-(2-nitrobenzoat) und 1,12- cyclischer Diester

Die beiden vorgenannten Verbindungen stellen wasserlösliche Analoge von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) dar. Sie wurden zur Verwendung als Thiol-Indikatoren auf folgende Weise hergestellt:
Eine Suspension mit einem Gehalt an 7,93 g (20 mMol) 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), 11,7 ml Thionylchlorid und 1,2 ml N,N-Dimethylformamid wurde 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Man erhielt eine klare gelbe Lösung. Sodann wurden die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Man erhielt einen hellgrünen Feststoff, der in einem Gemisch aus 50 ml Dichlormethan und 5 ml Pyridin gelöst wurde. Die Lösung wurde langsam zu einer 0ºC-Lösung von 34,5 ml (38,8 g, 200 mMol) Tetraethylenglykol in 100 ml Dichlormethan unter Argonatmosphäre gegeben. Sodann ließ man das Reaktionsgemisch über Nacht auf Raumtemperatur kommen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum erhielt man ein braunes 1, das mit Chloroform und Wasser ausgeschüttelt wurde. Die wäßrige Phase wurde erneut mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;). Nach Filtrieren und Abdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum erhielt man ein orangefarbenes Öl, das der Flash-Chromatographie an 500 g SiO&sub2;-60 (230-400 mesh) unter Elution mit einem Lösungsmittelgemisch aus 5 % Methanol-Chloroform unterzogen wurde. Fraktionen von 25 ml wurden gewonnen. Die Fraktionen 24-38 wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt 2,21 g eines gelben, glasartigen Produkts. Dieses Produkt wurde als 1,12-Cyclo-3,6,9,12-tetraoxaundecylester von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) identifiziert. Die Ausbeute an cyclischem Ester betrug 20 %.
¹³C NMR (22,5 MHz, CDCl&sub3;) δ: 66,8, 68,3, 70,4 (alle -O-CH&sub2;-CH&sub2;-O-), 128,8, 142,4, 146,3 (Aryl-C); 164,3
(- -O-CH&sub2;).
IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 1730 cm&supmin;¹ (- -O-CH&sub2;- Streckschwingung).
Die Fraktionen 91-101 wurden vereinigt und eingeengt. Man erhielt 3,94 g des erwarteten 3,6,9,12-Tetraoxadodecyldiesters (Ausbeute 26 %).
¹³C NMR (22,5 MHz, CDCl&sub3;) δ: 61,6, 65,6, 68,3, 70,2, 70,5, 72,4 (alle -O-CH&sub2;-CH&sub2;-O-); 129,0, 142,4, 146,5 (Aryl-C);
164,5 (- -O-CH&sub2;-).
PMR (60 MHz, CDCl&sub3;): Integrationsverhältnis von aliphatischen zu aromatischen Protonen = 5,6.
IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 3600-3350 (.CH&sub2;-OH-Streckschwingung).
1730 (- --CH&sub2;- Streckschwingung).

Beispiel 2: Glucose-Präparate

Glucose-Testvorrichtungen, die zum Testen von Vollblut geeignet sind, lassen sich auf folgende Weise herstellen. Reduziertes Nicotinamid- adenin-dinucleotid stellte das gemeinsame Substrat dar und wurde aus Glucose durch Glucose-dehydrogenase gebildet. Die allgemeine Chemie der REGENBOGEN-Glucose-Präparate ist nachstehend schematisch dargestellt. Der Thiol-Indikator, DTNB, wird üblicherweise als Ellman's-Reagenz bezeichnet. A. Weg 1: Diaphorase/NBT/TR-1 Weg 2: LipDH/Lipoamid/DTNB Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) Gelatine HEPES-Puffer, 1 m, pH 7,5 Wasser Diaphorase (118 U/mg) Lipoamid Mutarotase (5060 U/ml) Triton X-100 (4 %) Carbodiimid 1,25 % "REGENBOGEN"-Chemie Glucose Gluconat Diaphorase Formazon farblos Lipoomide (ox) Llpoomid (rot) Ellman's Reagenz gelbes Addukt blau grün gelb orange rot

Verfahren:

Die Komponenten der einzelnen Lösungen wurden bei 40ºC in der angegebenen Reihenfolge vereinigt. Die Lösungen wurden vor der Beschichtung entgast. Die Schicht 1 wurde auf einer Polyester-Unterlage verteilt und getrocknet. Die Schicht 2 wurde auf der Schicht 1 verteilt und getrocknet usw. Die endgültige Vorrichtung bestand aus drei Gelatineschichten auf einer Polyester-Unterlage. Der Carbodiimid-Überzug bildete durch Vernetzung der Gelatine eine gehärtete Oberfläche, die das Abwischen der Oberfläche der Vorrichtung ermöglicht.
Dosisreaktion: Mit steigenden Glucosekonzentrationen von 50 bis 600 mg/dl ergab sich die Farbsequenz: blaßrot zu olivgrün zu blauschwarz. B. Weg 1: MPMS/DCIP/INT Weg 2: Glutathion-reduktase/Glutathion/DTNB Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) HEPES-Puffer, 1 m, pH 7,5 Glutathion Reduktase (2320 U/ml) Mutarotase (5060 U/ml) Carbodiimid
Das zur Herstellung des Präparats und zum Testen der Vorrichtung angewandte Verfahren war das gleiche wie in Beispiel 2A. Dosisreaktion: Glucose (mg/dl) Farbe pfauenblau grünblau matt hellblau matt rosa rosa rosa dunkelrosa burgunderrot
Die Farbtöne, blau zu rosa zu burgunderrot, lassen sich leicht visuell unterscheiden. C. Weg 1: MPMS/DCIP/INT -Weg 2: LipDH/Lipoamid/DTNB Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) HEPES-Pufffer, 1 m, pH 7,5 Lipoamid Mutarotase (5060 U/ml) Carbodiimid
Das Verfahren zum Herstellen und Testen der Vorrichtung war das gleiche wie in Beispiel 2A Dosisreaktion: Glucose (mg/dl) Farbe pfauenblau aquamarinblau "Teal"-(Krickente)-grün minzgrün meergrün grün-goldfarben goldfarben orange-goldfarben orange dunkelorange tiefdunkel orange
Die Farbtöne blau, grün, goldfarben und orange sind visuell unterscheidbar. D. Weg 1: DCIP/INT/MPMS Weg 2: LipDH/Lipoamid/3-ND Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) HEPES-Puffer, 1 m, pH 7,5 Lipoamid Mutarotase (5060 U/ml) Carbodiimid
Das Verfahren zum Herstellen und Testen der Vorrichtung war das gleiche wie in Beispiel 2A. Dosisreaktion: Glucose (mg/dl) Farbe pfauenblau "Teal" (Krickente)-grün minzgrün hell minzgrün meergrün gelbbraun dunkel gelbbraun blaß braun rostfarben dunkelrot
Mit diesem Präparat war unter Verwendung des DTNB-Derivats 3-ND die Bildung des endgültigen Farbtons der Testvorrichtung in für den Anwender sichtbarer Weise nach 8 Minuten beendet. E. Weg 1: MPMS/DCIP/INT Weg 2: LipDH/Lipoamid/3-ND Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) HEPES-Puffer, 1 m pH = 7,5 Lipoamid Mutarotase (5060 U/ml) Carbodiimid Dosisreaktion: Glucose (mg/dl) gebildeter Farbton blau dunkelblau-grün blaugrün hellgrün gelbgrün goldfarben goldfarben-orange orange rotorange tiefrot
Diese Vorrichtung zeigt ein volles REGENBOGEN-Spektrum; blau, grün, goldfarben, orangerot. Der für den Anwender sichtbare Farbton hängt von der Glucosekonzentration ab, und wird innerhalb von 7 bis 8 Minuten gebildet. F. Vollblut-Glucose-REGENBOGEN-Testvorrichtung Weg 1: Diaphorase/DCIP/INT Weg 2: LipDH/Lipoamid/3-ND Schicht Komponente Menge (g) Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) MES-Puffer, 1m (pH 6,5) Diaphorase (118 U/mg) Mutarotase (5060 U/m) Carbodiimid
Das Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung war das gleiche wie in Beispiel 2A. Die Testdurchführung erfolgte mit Vollblutproben, die auf die gewünschten Glucosekonzentrationen gemäß Analyse mit einem YSI-Glucose-Analysator aufgestockt waren. Die Daten für die Dosisreaktion sind nachstehend aufgeführt. Die Testvorrichtung, die eine erfindungsgemäße Testzusammensetzung in durch Schichtbildung in einem Gelatineträger kompartimentierter Form aufwies, zeigte über eine Glucosekonzentration von 0 bis 800 mg/dl hinweg ein vollständiges REGENBOGEN-Spektrum. Die Zusammensetzung war so beschaffen, daß sich zur Darstellung des normalen Glucosebereichs im Blut ein grüner Farbton ergab. Dosisreaktion: Glucose (mg/dl) erzeugter Farbton blau hellblau blaugrün meergrün blaß-grün hellgelb gelborange orangerot rot

G. Regenbogen: unterschiedliche Enzymkonzentration

Das folgende Beispiel dient zur Darstellung, wie der erzeugte endgültige Farbton durch Veränderung der Konzentrationen der Enzyme gesteuert werden kann. Weg 1: Diaphorase/DCIP/INT Weg 2: LipDH/Lipoamid/3-ND Menge (g) Schicht Komponenten Gelatine Wasser Triton X-100 (4 %) Hepes-Puffer, 1m pH 7,5 3-ND (40 millimolar) Diaphorase (118 U/mg) Lipoamid Mutarotase (5060 U/ml) Carbodiimid
Die Filme wurden gemäß den Angaben in Beispiel 2A hergestellt und getestet. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt. Glucose mg/dl mittelblau hellblau aquamarinblau hellaquamarinblau pfirsichbeigefarben hellrostfarben rostfarbenorange dunkel rostfarben-orange hellgrün hellgelbpfirsichfarben schmutzig goldfarben dunkelrotrostfarben gelbbeigefarben gelbgoldfarben orangegoldfarben orange dunkelblau graustichig grünblau dunkelpfirsichfarben verbrannt orange tiefrot

Beispiel 3: Papier-REGENBOGEN

Obgleich mehrschichtige Gelatine eine bevorzugte Matrix für eine Regenbogen-Vorrichtung darstellt, läßt sich auch eine Vorrichtung unter Verwendung von Papier als Träger herstellen. Eine Lösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wurde in der angegebenen Reihenfolge hergestellt. Reagenz Puffer Konzentration (millimolar) Vorratslösung eingesetztes Volumen (ul) Endkonzentration (millimolar) Mischreihenfolge Reagenz Triton X-100 Glutathion Glut-Reduktase Konzentration (millimolar) Vorratslösung eingesetztes Volumen (ul) Endkonzentration (millimolar) Mischreihenfolge nanomolar mikromolar
Beim Puffer handelte es sich um TAPSO, pH-Wert 7,4. In diesem Beispiel waren sowohl der Polyvinylalkobol (PVA) als auch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe kritisch. Eine Konzentration von 1 bis 1,5 % PVA verhindert die Copräzipitation von DCIP und INT in einer Papiermatrix.
Whatman 31 ET-Papier wurde mit dieser Lösung imprägniert und bei 50ºC getrocknet. Das getrocknete Papier wurde zerschnitten und zur Herstellung von Teststreifen auf einer Kunststoffunterlage befestigt. Die Teststreifen wurden mit einer NADH-Lösung getestet. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt. NADH-Konzentration (millimolar) Zeit (Minuten) blau hellblau blau/grün blaßgrün mattgrün braun braun/orange orange

Beispiel 4: NADH-erzeugende Systeme mit einem Gehalt an gegenüber Thiol-Reagenzien empfindlichen Enzymen

Ein allgemeines Problem mit dem beschriebenen Thiol-Nachweisreagenzsystem besteht darin, daß Thiol-Indikatoren mit Proteinsystemen reagieren können, was häufig zu einer Inaktivierung von Enzym führt. Zahlreiche derartige Enzymhemmungen durch DTNB sind in der Literatur beschrieben. Es gibt zwei allgemeine Lösungen, die beide die Kompartimentierung des Thiol-Reagenz beinhalten: (1) Sequestrieren des Thiol-Indikators in einer organischen Phase oder als unlösliche Teilchen; (2) physikalische Trennung des empfindlichen Enzyms und des Thiol-Reagenz durch Immobilisieren des letztgenannten Produkts

A. Weg (1) - Sequestrieren des Reagenz.

Ein in Wasser unlösliches, Analoges von DTNB, EA1, wurde verwendung (bezüglich der Herstellung vergleiche Beispiel 1C).
Es gibt zwei Möglichkeiten zum Sequestrieren des Reagenz: (a) EA1 wurde in einem Öl gelöst und als Emulsion in einem Gelatinefilm dispergiert.
Organische Phase: EA1 (300 millimolar) wurde in Tricresylphosphat zusammen mit Trioctylamin (1 %) gelöst. wäßrige Phase Endkonzentration Gelatine Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5 millimolar
Die Ölphase wurde mit der wäßrigen Phase in einem Waring-Mischer bis zu einer Endkonzentration von 5 % emulgiert. Lipoamid-Dehydrogenase (Sigma Typ III, 13,3 U/ml) wurde zu der Emulsion gegeben. Die Emulsion wurde schichtförmig auf einen Kunststoffträger (170 um) aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Behandlung des getrockneten Films mit NADH/Lipoamid (etwa 1 millimolar) bei einem pH-Wert von 8,5 (Tris-Puffer) ergab ein sehr rasches Bleichen des blauen Farbtons von DCIP und die Bildung eines gelben Farbtons durch das EA1-Reagenz. Ohne NADH gab es keine Reaktion.
Das Enzym Lactat-dehydrogenase (LDH), das durch DTNB gehemmt wird, wurde mit diesem Film getestet. LDH, etwa 150 U/ml, und Lipoamid (etwa 1 millimolar) in etwa 250 millimolar Lactat vom pH-Wert 8,5 bildeten in etwa 10 Minuten einen gelben Farbton. Der Leerwert ohne LDH war ungefärbt. Als Schlußfolgerung ergibt sich, daß die Verwendung eines öllöslichen Thiol-Indikators bei Kompartimentierung in einer Ölemulsion die Verwendung von Enzymen erlaubt, die im allgemeinen als empfindlich gegenüber den Thiol-Reagenzien angesehen werden.
(b) - EA1 direkt auf Papier aufgebracht.
EA1 wurde in Toluol in einer Konzentration von 5,7 millimolar gelöst. Whatman 31 ET-Papier wurde mit dieser Lösung imprägniert und bei 50ºC getrocknet. Eine zweite Lösung wurdeüs aus folgenden Bestandteilen hergestellt. Endkonzentration Triton X-100 (Tris)&sub2;-sulfat, pH 8,5 PVA (98,5 % hydrolysiert) Lipoamid mikromolar millimolar
(Tris)&sub2;-sulfat ist Tris-Puffer, der mit Schwefelsäure auf den gewünschten pH-Wert eingestellt ist.
Das getrocknete Papier wurde in die zweite Lösung getaucht, erneut bei 50ºC getrocknet und auf einem Kunststoffträger befestigt.
Testlösungen für LDH enthielten L-Lactat (167 millimolar), (Tris)&sub2;-sulfat, pH-Wert 8,5 (0,33 m), und LDH-Enzym (Kaninchenmuskel, Sigma Typ II), wie in der nachstehenden Tabelle zusammen mit den Testergebnissen aufgeführt ist. LDH-Konzentration (ug/ml) Zeit (Minuten) dunkelblau mittleres Blau blaß blau sehr blasses Blau blau/grün blaustichig gelb senffarben gelb
Zwischen den unterschiedlichen Konzentrationen von LDH ist eine sehr gute Farbunterscheidung möglich.

Testlösung für den Alkoholnachweis

Die Eignung dieses kompartimentierten Films zur Durchführung von Tests, bei denen die Anwendung eines gegenüber Thiolreagenzien empfindlichen Enzyms erforderlich ist, wurde außerdem mit Alkohol-dehydrogenase getestet.
Testlösungen wurden hergestellt, die verschiedene Konzentrationen an Ethanol, (Tris)&sub2;-sulfat-Puffer, 0,5 m, pH-Wert 8,5 und Alkohol-dehydrogenase (aus Bäckerhefe, Sigma Katalog #A7011, 22,5 U/ml) enthielten.
Auf die vorstehende Weise hergestellte Teststreifen wurden verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Ethanolkonzentration (mg/dl) Zeit (Minuten) dunkelblau weniger dunkles Blau mittleres Blau blaß blau blau/grün senffarben gelb
Zwischen den Alkoholkonzentrationen ist eine sehr gute Unterscheidung möglich.
Aus diesen Versuchen wurde geschlossen, daß das REGENBOGEN-System unter Verwendung eines Thiol-Nachweisreagenz mit gegenüber Thiol-Reagenzien empfindlichen Enzymen eingesetzt werden kann.

B. Weg 2: Physikalische Trennung des gegenüber dem Thiol-Reagenz empfindlichen Enzyms und des Thiol-Reagenz durch Immobilisieren des letztgenannten Produkts.

DTNB läßt sich kovalent an ein großes Molekül binden oder physikalisch in einer Matrix, wie Gelatine, die nur das Eindringen von kleinen Molekülen erlaubt, einschließen. Somit ist eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Thiol-Reagenz nicht zu erwarten.

Herstellung von immobilisiertem DTNB

DTNB wurde mit Humanserumalbumin über eine Carboxylfunktion unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimid-Reagenz verknüpft.
Eine 30%ige Lösung von Humanserumalbumin wurde in 0,2 m Natriumphosphat hergestellt. Der pH-Wert wurde auf 4,57 eingestellt. Sodann wurde auf 4,8 % Albumin verdünnt, DTNB (10,7 millimolar) und 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC, 10,7 millimolar) wurden in einer geringen Menge an Ethanol gelöst und unter heftigem Rühren zu der auf 0ºC gehaltenen Albuminlösung gegeben. Nach 2 bis 3 Stunden wurde das geringfügig gelierte Material in einen Dialyseschlauch gebracht und gründlich gegen Wasser dialysiert. Sodann wurde das Material lyophilisiert.
Der krustige gelbe Feststoff wurde zu einem feinen Pulver pulverisiert und in einer Konzentration von 1 % in 10 % Gelatine dispergiert. Ein Überzug wurde hergestellt (170 um) und bei Raumtemperatur getrocknet.
Der Film wurde mit folgendem Testgemisch bewertet: Endkonzentration Lithiumlactat Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5 Glutathion Glutathion-reductase millimolar
Bei Kontakt mit dieser Lösung bildete der Film innerhalb von 1 Minute eine klare gelbe Farbe. Eine Kontrollösung ohne LDH bildete keine Farbe.
Daraus ergibt sich die Schlußfolgerung, daß eine Immobilisierung des Thiol-Reagenz einen Test mit gegenüber Thiol-Reagenzien empfindlichen Enzymen ermöglicht.
Insgesamt läßt sich die Schlußfolgerung treffen, daß es zahlreiche Enzyme, wie Alkohol-dehydrogenase und Cholesterin-dehydrogenase gibt, die gemäß der Literatur durch DTNB gehemmt werden, daß es aber zahlreiche Möglichkeiten zur Vermeidung dieser Hemmung gibt. Infolgedessen ist das zweite katalytische System, das die Verwendung von Thiol-Indikatoren beinhaltet, allgemein auf die Bestimmung von NADH als ein Zwischenprodukt anwendbar und kann zur Bestimmung von Alkohol oder Cholesterin als Analyten herangezogen werden.

Beispiel 5: Diffundierbare/nichtdiffundierbare Farbstoffreaktion

Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung eines REGENBOGENS besteht darin, daß der Farbton der Testzusammensetzung infolge einer Diffusion entsteht. Kann beispielsweise ein Indikator aufgrund einer kovalenten Verknüpfung mit einer Matrix nicht diffundieren und ist diese Matrix mit einer undurchsichtigen Schicht bedeckt, dann ist der Indikator von oben her unsichtbar. Wenn aufgrund einer Reaktion die kovalente Bindung des Indikators an der Matrix gelöst wird, dann kann der Indikator durch den undurchsichtigen Überzug nach oben diffundieren und sichtbar werden.
Beispielsweise wurde ein Film gemäß Beispiel 4B hergestellt, wobei DTNB kovalent an Albumin gebunden war und sodann einer Gelatinematrix einverleibt wurde. Whatman 31 ET wurde mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert: Endkonzentration Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5 Glutathion Glutathion-reduktase millimolar
Das imprägnierte Papier wurde bei 50ºC getrocknet. Stücke des getrockneten Papiers wurden ausgeschnitten und auf den Gelatinefilm gelegt. Das Papier war ziemlich undurchsichtig. Eine NADH-Lösung wurde auf die in dieser Weise hergestellte mehrschichtige Vorrichtung gegeben. Eine weitere, als Kontrolle eingesetzte Vorrichtung wurde mit Wasser versetzt. Innerhalb von 20 Sekunden begann bei der mit NADH in Kontakt gebrachten Lösung eine Gelbfärbung, die sich rasch zu einem dunklen gelb entwickelte. Die Kontrolle zeigte keine Färbung.
Ein LDH-Test wurde mit folgender Lösung durchgeführt: Endkonzentration Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5 Lithiumlactat millimolar
LDH (etwa 5 U/ml) wurde zu dieser Lösung gegeben. 30 ul der Lösung wurden auf eine mehrschichtige Papier/Gelatine-Vorrichtung gemäß der vorstehenden Beschreibung gegeben.
Nach etwa 5 1/2 Minuten zeigte die Vorrichtung mit LDH eine blasse, aber deutliche Gelbfärbung. Die Kontrolle ohne LDH wies keine Färbung auf.
Es ergibt sich die Schlußfolgerung, daß Indikatoren als Funktion der Analytkonzentration diffundierbar gemacht werden können.
Bei dieser Möglichkeit besteht das Indikatormolekül aus einer Kombination eines farbtonbestimmenden (chromophoren) Teils und eines reaktiven (spaltbaren) Teils. Diese Bestandteile lassen sich elektronisch so isolieren, daß die verankernde Verknüpfung keine deutliche Veränderung des Farbtons des Indikators ergibt. Die Menge oder die Intensität des Indikators kann durch die Aktivität des katalytischen Systems, das bei der reduktiven Spaltung beteiligt ist, gesteuert werden. Der Farbton, der erzeugt wird, wird unabhängig davon durch den chromophoren Teil des Moleküls festgelegt. Dies stellt einen beträchtlichen Vorteil dar, da das Auffinden von Indikatoren, die eine zur Erzeugung des gewünschten endgültigen Farbtons geeignete Kombination aus Farbton und Reaktivität aufweisen, Schwierigkeiten bereiten kann.
Weitere Matrices, in denen ein Thiol-Indikator durch Oxidation immobilisiert werden kann, sind: Thiol-Agarose oder ein beliebiges Protein unter Verwendung eines bifunktionellen Reagenz, z.B. Lomant-Reagenz, Dithiobis-(succinimidylpropionat).

Claims

1. Testzusammensetzung zur visuellen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend:

(a) ein katalytisches System, das zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus dem Analyten in der Lage ist;

(b) ein erstes unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung eines reduzierten ersten Indikators durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist; und

(c) ein zweites unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung einer Farbtonänderung einer zweiten Indikatorkomponente durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist, wobei das zweite unabhängige katalytische System folgende Bestandteile umfaßt:

eine Disulfid-reduktase;

(ii) ein Disulfid-Substrat; und

(iii) einen Thiol-Indikator; wobei die Disulfid-reduktase in der Lage ist, die Reaktion zwischen reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid und dem Disulfid-Substrat unter Bildung eines Produkts zu katalysieren, das mit dem Thiol-Indikator unter Erzeugung einer Farbtonänderung des zweiten Indikators in Wechselwirkung treten kann;

wobei die Erzeugung des reduzierten ersten Indikators und der veränderte Farbton des zweiten Indikators im wesentlichen gleichzeitig erfolgen, so daß unterschiedliche Farbtöne bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen hervorgerufen werden, wobei der von der Testzusammensetzung erzeugte endgültige Farbton von der Konzentration des Analyten abhängt.

2. Testzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das zweite unabhängige katalytische System, das durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid zur Erzeugung eines reduzierten zweiten Indikators in der Lage ist, folgende Bestandteile umfaßt:

(i) eine Disulfid-reduktase;

(ii) ein Disulfid-Substrat; und

(iii) einen Thiol-Indikator; wobei die Disulfid-reduktase in der Lage ist, die Reaktion zwischen reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid und dem Disulfid-Substrat unter Bildung eines Produkts zu katalysieren, das den Thiol-Indikator unter Bildung des reduzierten zweiten Indikators reduzieren kann;

wobei die Erzeugung der reduzierten Indikatoren im wesentlichen gleichzeitig erfolgt, so daß sich bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen unterschiedliche Farbtöne ergeben, wobei der durch die Testzusammensetzung erzeugte endgültige Farbton von der Analytkonzentration abhängt.

3. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in der das erste oder zweite unabhängige katalytische System zur Bildung eines reduzierten dritten Indikators in der Lage ist.

4. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der die Reduktion einer Indikatorkomponente eine Veränderung eines Farbtons zu einer farblosen Beschaffenheit erzeugt.

5. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die zusätzlich ein Farbverzögerungsmittel enthält.

6. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der die Erzeugung des endgültigen Farbtons der Testzusammensetzung innerhalb von weniger als etwa 10 Minuten im wesentlichen vollständig ist.

7. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in der der reduzierte zweite Indikator gelb ist.

8. Testzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in der es sich bei dem Thiol-Indikator um ein Disulfid handelt.

9. Testzusammensetzung zur visuellen Bestimmung von Glucose in einer wäßrigen flüssigen Probe, enthaltend:

(a) ein katalytisches System, das zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid durch Reaktion mit Glucose in der Lage ist,

(b) ein erstes katalytisches System, das aus einem Katalysator mit Diaphorase-Aktivität, einem oxidierten ersten Indikator und einem oxidierten dritten Indikator zusammengesetzt ist, die jeweils in der Lage sind, mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Gegenwart des Katalysators unter Bildung des reduzierten ersten und dritten Indikators zu reagieren; und

(c) ein zweites katalytisches System, das aus einer Disulfid-reduktase, einem Disulfid-Substrat und einem Thiol-Indikator zusammengesetzt ist, wobei die Disulfid-reduktase in der Lage ist, die Reaktion zwischen reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid und dem Disulfid-Substrat zu katalysieren, wodurch ein Produkt gebildet wird, das den Thiol- Indikator unter Bildung eines reduzierten zweiten Indikators reduziert;

wobei die Erzeugung der reduzierten Indikatoren im wesentlichen gleichzeitig erfolgt, wodurch bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen unterschiedliche Farbtöne entstehen, wobei der durch die Testzusammensetzung gebildete endgültige Farbton von der Glucosekonzentration in der Probe abhängt.

10. Testzusammensetzung nach Anspruch 9, in der die Reduktion von mindestens einem Indikator aus der Gruppe des ersten, dritten oder Thiol- Indikators eine Änderung von einem Farbton zu einer farblosen Beschaffenheit erzeugt.

11. Testvorrichtung zur visuellen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe, enthaltend:

(a) eine Trägermatrix; und

(b) eine darin einverleibte Testzusammensetzung, die folgendes umfaßt: ein katalytisches System, das zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid aus dem Analyten in der Lage ist; ein erstes unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung eines reduzierten ersten Indikators durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist; und ein zweites unabhängiges katalytisches System, das zur Erzeugung eines gelben zweiten Indikators durch Umsetzung mit reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der Lage ist, wobei das zweite unabhängige katalytische System folgendes umfaßt:

(i) eine Disulfid-reduktase;

(ii) ein Disulfid-Substrat; und

wobei die Erzeugung der reduzierten und gelben Indikatoren im wesentlichen gleichzeitig erfolgt, wodurch unterschiedliche Farbtöne bei unterschiedlichen Analytkonzentrationen gebildet werden, wobei der durch die Testzusammensetzung erzeugte spezielle endgültige Farbton von der Konzentration des Analyten abhängt.

12. Testvorrichtung nach Anspruch 11, wobei das erste oder zweite unabhängige katalytische System zur Erzeugung eines reduzierten dritten Indikators in der Lage ist.

13. Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, in der die Reduktion des ersten und/oder dritten oxidierten Indikators eine Farbtonänderung des Indikators von einem Farbton zu einer farblosen Beschaffenheit erzeugt.

14. Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, in der mindestens einer der oxidierten Indikatoren oder des Thiol-Indikators innerhalb der Trägermatrix kompartimentiert ist.

15. Mehrschichtige Testvorrichtung zur visuellen Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend

(a) ein inertes Trägerelement und in laminarer Beziehung dazu;

(b) mindestens zwei Schichten, zusammengesetzt aus einem hydrophilen Träger, wobei eine Schicht einen Bestandteil aus einer ersten oder dritten oxidierten Indikatorkomponente enthält und die zweite Schicht folgendes enthält:

(i) Nicotinamid-adenin-dinucleotid,

(ii) eine Glucose-dehydrogenase, die zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid durch Umsetzung mit Glucose in der Lage ist;

(iii) ein Disulfid-Substrat,

(iv) den anderen Bestandteil aus der Gruppe oxidierter erster Indikator und oxidierter dritter Indikator,

(v) einen Katalysator mit Diaphorase-Aktivität, der dazu in der Lage ist, die Reaktion zwischen der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid und dem oxidierten ersten und dritten Indikator unter Bildung der reduzierten ersten und dritten Indikatoren zu katalysieren,

(vi) eine Disulfid-reduktase; und

(vii) einen Thiol-Indikator; wobei die Disulfid-reduktase in der Lage ist, die Reaktion zwischen dem erzeugten reduzierten Nicotinamid- adenin-dinucleotid und dem Disulfid-Substrat unter Bildung eines Produkts, das den Thiol-Indikator reduzieren kann, zu katalysieren; wobei die Vorrichtung dazu in der Lage ist, die Reduktion der oxidierten Indikatoren im wesentlichen gleichzeitig ablaufen zu lassen, wobei der in der Testvorrichtung gebildete spezielle endgültige Farbton von der Glucosekonzentration in der Probe abhängt.

16. Mehrschichtige Testvorrichtung nach Anspruch 15, in der es sich beim hydrophilen Träger um Gelatine handelt und die einzelnen Schichten durch Beschichtung aufgebracht sind.

17. Mehrschichtige Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 16, in der die eine Schicht zusätzlich ein Farbverzögerungsmittel enthält.