DE69927240T2

DE69927240T2 - Messung von hydriden mit hilfe chemilumineszierender acridiniumverbindungen

Info

Publication number: DE69927240T2
Application number: DE69927240T
Authority: DE
Inventors: David Sharpe; Anand Natrajan; Qingping Jiang; George Parsons; Say-Jong Law
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2019-11-25
Also published as: IL136929A0; JP2002530678A; WO2000031543A1; EP1049933A1; EP1049933B1; DE69927240D1; ATE304711T1; ES2249065T3; BR9907248A; JP2010237226A; CA2319187A1; AU1173400A

Description

Hintergrund der Erfindung
Acridinium-Ester (AE) haben extrem empfindliche Nachweisverfahren ergeben und sind in großem Umfang als chemilumineszierende Markierungen sowohl in Immuno- als auch in Nucleinsäure-Assays verwendet worden. Hydrolytisch stabile polysubstituierte Aryl-Acridinium-Ester (PAAE) haben sich als nützliche Markierungen für analytische Zwecke ( US 4,745,181 , 4,918,192 und 5,110,932) mit einer Vielzahl von Bindungen ( US 5,241,070 , 5,538,901 und 5,663,074) erwiesen und waren die ersten chemilumineszierenden Acridiniumverbindungen, die die stringenten Erfordernisse für kommerzielle Ligand-Bindungsassays erfüllten. Die Eignung von PAAE's wurde noch weiter mit dem Auftreten funktionalisierter hydrophiler PAAE's ( US 5,656,426 ) gesteigert, mit denen die Quantenausbeute der PAAE's sowie die Leistungskraft der PAAE-markierten Bindungspartner bezüglich des beobachteten Signal-zu-Rausch-Verhältnisses und der Empfindlichkeiten verschiedener Bindungsassays erhöht wurden. Außerdem brachte die Einführung ionisierbarer Gruppen am Phenoxy-Rest eine weitere Unterklasse hydrophiler PAAE's hervor ( US 5,227,489 , 5,449,556 und 5,595,875).
M. Kawaguichi et al. (Bioluminescence and Chemiluminescence, Proceedings of 9^th International Symposium 1996, Hsg. Hastings, Kricka and Stanley, Hohn Wiley & Sons, 1997, S. 480–484) haben stabilisierte Phenyl-Acridinium-Ester für chemilumineszierende Immunoassays beschrieben. Bei AE-Derivaten mit zusätzlichen Methyl-Substitutionen an C-1, die gegebenenfalls auch an C-3 des Acridinium-Kerns mit einhergehenden Mono- oder Di-Methyl-Substitutionen an den o-Positionen des Phenoxy-Restes vorliegen, wurde gezeigt, dass sie eine ausgezeichnete Stabilität in wässriger Lösung aufweisen.
EP 0 324 202 A1 und anschließend EP 0 609 885 A1 beschreiben beide Acridinium-Ester mit funktionellen Gruppen als Substituenten am Stickstoffatom des Acridinium-Kerns. Die letztere Anmeldung beschreibt ferner alternative Substituenten wie die Diphenyl- oder Naphthyl-Reste als möglichen Ersatz für die Phenylgruppe.
Mattlingly et al. ( US 5,468,646 und 5,543,524) beschreiben chemilumineszierende Acridiniumsalze und deren Anwendungen in Immunoassays. Diese Acridiniumsalze gehören zu einer weiteren Klasse von Verbindungen, die als Acridiniumsulfonylamide (oder als N-Sulfonylacridiniumcarboxamide) bezeichnet werden. Die Acridiniumsulfonylamide (AS) weisen wässrige Stabilitäten auf, die mit PAAE vergleichbar sind. Mattingly et al. beschreiben und beanspruchen ferner die analogen chemilumineszierenden Phenanthridiniumsalze und deren Anwendungen in Immunoassays in US 5,545,739 , 5,565,570 und 5,669,819. Außerdem wird in diesen Patenten eine allgemeine Struktur von Acridiniumsulfonylamiden beschrieben, die mögliche Substituenten einer Markusch-Gruppe am Acridinium-Kern aufzeigen.
Herkömmliche Acridiniumverbindungen, wie die in den vorgenannten Patenten und der Literatur beschriebenen, strahlen Licht mit Maxima bei ca. 428 nm bei Reaktion mit Wasserstoffperoxid in stark alkalischer Lösung aus. Acridiniumverbindungen, die Licht von Wellenlängenmaxima > 500 nm ausstrahlen, sind ebenfalls im Stand der Technik beschrieben worden.
US 5,395,752 , 5,702,887 und 5,879,894 beschreiben neue Acridinium-Ester mit langwelliger Emission (long-emission acridinium esters = LEAE), in denen ein kondensiertes Benzacridinium-System vorliegt und angewandt ist, um die Emissionswellenlänge des Acridinium-Esters zu verlängern. In der parallelen PCT-Anmeldung WO 98/54 574 haben Jiang et al. die PAAE-Emissionsmaxima noch weiter bis gut in den Bereich von 600 bis 700 nm durch Anwendung des Energie-Transfer-Prinzips verlängert. Dies bewerkstelligte eine kovalente Kupplung von Luminophoren an Acridinium-Ester. Als die chemilumineszierenden Reaktionen dieser Konjugate durch Behandlung mit Alkali-Peroxid ausgelöst wurden, wurde die Lichtemission bei langen Wellenlängen beobachtet, wobei die Wellenlängenmaxima von der Struktur des Luminophors abhingen. In der jüngeren parallelen PCT-Anmeldung WO 00/09 487 beschreiben Natrajan et al. neue Acridiniumverbindungen, die intrinsische Emissionsmaxima nahe am oder im nahen IR-Bereich (> 590 nm) aufweisen. Die strukturellen Erfordernisse für derartige langwelliges Licht ausstrahlende Acridiniumverbindungen werden offenbart.
N-Alkylacridinester, die aus der Reduktion von Acridinium-Estern erhalten werden, sind als Enzym-Substrat-Indikatoren zur Bestimmung von Phosphatasen und Oxidasen und deren Substraten oder Produkten verwendet worden. N-Alkylacridanphosphatester sind als Substrate zum direkten Nachweis winziger Konzentrationen alkalischer Phosphatase maßgeschneidert worden (H. Akhavan-Tafti et al. "Lumagen^TM RPS: New Substrates for the Chemiluminescent Detection of Phosphatase Enzymes"; Proc. 9th. Internat'l. Symp. Bioluminescence and Chemiluminescence (1996); J.W. Hastings; L.J. Kricka, P.E. Stanley (Hsg.); John Wiley & Sons, New York, NY; S. 311–314).
Ebenso sind N-Alkylacridancarboxylatester als oxidierbare Indikatoren für Meerrettich-Peroxidase angewandt worden, um die Chemilumineszenz aus dem oxidierten Acridinium-Esterprodukt zur quantitativen Bestimmung entweder von Meerrettich-Peroxidase oder von Oxidasen und deren Substraten in gekoppelten enzymatischen Reaktionen zu nutzen (H. Akhavan-Tafti et al., Chemiluminescent Detection of Oxidase Enzymes by Peroxidase-mediated Oxidation of Acridan Compounds; Proc. 9th. Internat'l. Symp. Bioluminescence and Chemiluminescence (1996); J.W. Hastings, L.J. Kricka; P.E. Stanley (Hsg.); John Wiley & Sons, Inc., New York, NY; S. 501–504).
Luminole sind zusammen mit Peroxidase als chemilumineszierende Detektoren von aus Dehydrogenase und ihren Cofaktoren erzeugtem Wasserstoffperoxid verwendet worden (WO 95/29 255).
Verschiedene Klassen chromogener Hydrid-reduzierbarer Indikatoren sind beschrieben worden (J.M. Ottaway; Oxidation-Reduction Indicators; Internat'l. Ser. Monographs Anal. Chem. (1968); R. Belcher; H. Frieser (Hsg.); Plenum; S. 469–529 (C.L. Bird; A.T. Kuhn; Electrochemistry of the Biologens; Chem. Soc. Rev. (1981), 10, S. 49–82). Einige dieser, einschließlich der oxidierten Salze von Phenazinen, Phenoxazinen und von Phenothiazinen sind als chromogene Indikatoren von Hydrid aus den reduzierten Nicotinamid-Cofaktoren (Dihydronicotinamidadenindinucleotid NADH und Dihydronicotinamidadenindinucleotidphosphat NADPH) und aus den reduzierten Flavin-Cofaktoren (Dihydroflavinmononucleotid FMNH₂ und Dihydroflavinadenindinucleotid FADH₂) verwendet worden, die durch die enzymatische Aktivität von Dehydrogenasen erzeugt werden (G.H. Czerlinski et al., "Coupling of Redox Indicator Dyes into an Enzymatic Reaction Cycle", J. Biochem. Biophys. Methods (1988), 15, S. 241–248 (S. Nakamura et al., "Use of 1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat in the Assay of Some Enzymes of Diagostic Importance", Clin. Chim. Acta (1980), 101, S. 321).
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Messung von Hydrid mit einer chemilumineszierenden Verbindung. Das bevorzugte chemilumineszierende Molekül ist eine Acridiniumverbindung. Die Hydrid-Quelle zur Reaktion mit der Acridiniumverbindung kann chemisch oder biochemischen Ursprungs oder das Ergebnis enzymatischer Katalyse sein. Die chemische Quelle des Hydrids könnte z.B. ein Metallhydrid, wie NaBH₄, sein. Eine biochemische Quelle des Hydrids könnte aus NADH, NADPH, FMNH₂ oder aus FADH₂ abgeleitet sein, während eine enzymatische Quelle durch die Klasse von Oxidoreduktasen dargestellt sein würde, die auch als Dehydrogenasen bezeichnet werden, welche in Redox-Reaktionen NADH, NADPH, FMNH₂ oder FADH₂ in NAD, NADP, FMN oder in FAD überführen.
Es gibt zahlreiche mögliche Anwendungen für Acridiniumverbindungen als chemilumineszierende Indikatoren von Hydrid. Angewandte Tests oder Diagnose-Assays, in denen Hydrid entweder bei Einsetzen eines Reaktionsablaufs oder durch einen solchen erzeugt wird, würden einen Nutzen aus der vorliegenden Erfindung ziehen. Derartige Tests, die viele unterschiedliche Formate umfassen könnten, die weiter unten im Detail noch diskutiert werden, können die quantitative Bestimmung oder den Nachweis von Metallhydriden oder von Enzym-Cofaktoren wie von NADH, NADPH, FMNH₂ oder von FADH₂ beinhalten. Besonders wichtig sind diejenigen Diagnose-Assays, bei denen Dehydrogenasen als Reagenzien, Indikatoren, Diagnose-Marker oder als Markierungen zur Anwendung gelangen. Ethanol könnte beispielsweise mit Acridinium-Ester-Chemilumineszenz durch die Reaktion von Alkohol-Dehydrogenase mit Ethanol nachgewiesen werden, wobei die genannte Reaktion NADH erzeugt. Als Markierung könnte Dehydrogenase in einem ELISA zum Nachweis eines spezifischen Analyts mit Acridinium-Ester verwendet werden, um die Signal-erzeugende Reaktion zu ergeben. Nucleinsäure-Assays mit Dehydrogenase als Markierung werden ebenfalls in Betracht gezogen. Assays zum Nachweis klinisch relevanter Dehydrogenasen wie eine erhöhte Glutamat-Dehydrogenase als Indikator einer hepatozellulären Schädigung könnten ebenfalls entwickelt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Reaktion dar, die die Addition von Hydrid an das C-9 des Acridinium-Kerns zeigt.
2 betrifft die Reaktion von 2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat mit NADH in DMF/0,1 M Phosphat, pH = 7,4, bei Raumtemperatur über 10 min.
3 zeigt die allgemeine Struktur der Haupt-Acridiniumverbindungen zur Verwendung als die Chemilumineszenz-Indikatoren in der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die zusätzlichen Strukturen, die an R₂ und R₃ zur Bildung eines zusätzlichen Rings gebunden sein können.
5 zeigt den polysubstituierten Aryl-Rest, identifiziert als Y.
6 zeigt Beispiele der Abgangsgruppe R₁₀.
7 zeigt die allgemeine Struktur von Phenanthridinium- und Chinolinium-Verbindungen zur Verwendung als die chemilumineszierenden Indikatoren in der vorliegenden Erfindung.
8 zeigt die Addition eines Hydrids an einen Elektron-armen Ester-Rest zur Bildung eines Elektron-reichen Rests.
9 zeigt die Addition von Hydrid an eine Verbindung mit langwelliger Emission zur Bildung einer Verbindung mit kurzwelliger Emission.
10 zeigt einen Acridinium-Kern, worin die Reduktion des Seitenketten-Löschers bevorzugt durchgeführt wird.
11 zeigt einen Acridinium-Kern, worin die Reduktion des Seitenketten-Fluorophors bevorzugt durchgeführt wird.
12 zeigt ein Analysenverfahren, worin die NADH-Bildung quantitativ bestimmt werden kann.
13 zeigt einen homogenen Immunassay mit einer Acridiniumverbindung als Hydrid-Indikator.
14 zeigt einen Assay, in welchem interferierende Substanzen über die Anwendung einer festen Phase im Assay eliminiert werden.
15 veranschaulicht heterogene Assays mit der vorliegenden Erfindung.
16 zeigt den chemiluminometrischen Emit^®-Theophyllin-Assay mit NSP-DMAE₄ als Hydrid-Indikator.
17 zeigt den chemiluminometrischen Emit^®-Valproat-Assay mit NSP-DMAE₄-BSA als Hydrid-Indikator.
18 zeigt den chemiluminometrischen Emit^®-Chinidin-Assay mit NSP-DMAE₄-BSA als Hydrid-Indikator.
19 zeigt den chemiluminometrischen Emit^®-Theophyllin-Assay mit DMAE-Φ als Hydrid-Indikator.
20 zeigt den chemiluminometrischen Emit^®-Valproat-Assay mit DMAE-Φ als Hydrid-Indikator.
21 zeigt berichtete-gegen-ermittelte Analyt-Konzentrationen für Vergleiche.
22 zeigt einen chemiluminometrischen Ethanol-Assay.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung steht, dass herausgefunden worden ist, dass die Chemilumineszenzaktivität einer Acridiniumverbindung durch Hydrid moduliert (erhöht oder abgesenkt) werden konnte. Obwohl die hierin diskutierten Beispiele als Ergebnis eine Absenkung der Chemilumineszenzaktivität zeigen und ergeben, werden auch einige Mechanismen in Betracht gezogen, in denen ein Anstieg der Chemilumineszenzaktivität zu beobachten sein wird. Beispielsweise kann im weiter unten angegebenen Abschnitt B2 und in einem Teil des Abschnitts B3 die Chemilumineszenz erhöht werden, wenn der Detektor empfindlich gegenüber einem selektiven Bereich der Emissionswellenlänge ist. Führt die Reaktion zu einer Verschiebung der Emission zu einer Wellenlänge, bei der ein Detektor empfindlicher ist, wird eine erhöhte Chemilumineszenz beobachtet. In einem weiter unten angegebenen weiteren Teil des Abschnitts B3 wird der Anstieg beobachtet, weil der eine Löschung verursachende Rest durch das Hydrid reduziert und inaktiviert wird.
A. Neue chemilumineszierende Hydrid-Indikatoren
Es ist nun herausgefunden worden, dass die Reduktion von Acridinium-Ester mit Hydrid die chemilumineszierende Aktivität des Acridinium-Esters unterdrückt. Die Verringerung der chemilumineszierenden Aktivität ist das Ergebnis einer Addition von Hydrid an das C-9 des Acridinium-Kerns (siehe 1). Das Produkt, das das Acridan ist, kann sich nicht an der Lichterzeugenden Reaktion mit alkalischem Wasserstoffperoxid beteiligen. Weitere chemilumineszierende Acridiniumverbindungen oder Analoga (z.B. Benzacridinium-, Phenanthridinium-, Chinoliniumverbindungen oder Isomere davon) und deren Derivate sowie chemilumineszierende Verbindungen wie Lucigenin und seine Derivate teilen den gleichen oder einen ähnlichen Mechanismus eines Hydrid-Angriffs am Elektron-armen Acridinium-Kern zur Bildung der reduzierten Acridane.
Die anfänglichen Studien waren auf die Reduktion von 2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat (DMAE-Φ) mit der reduzierenden Chemikalie Natriumborhydrid in Methanol als Lösungsmittel gerichtet. Die Chromatografieanalyse (HPLC) dieser Reduktionsreaktion enthüllte die saubere Umsetzung zum entsprechenden N-Methylacridan, unter Korrelation mit einem Abfall der Chemilumineszenzaktivität, als die Reaktionsmischung mit alkalischem Peroxid behandelt wurde. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch beobachtet, als der Hydrid-Donor NADH zur Reduktion des Acridinium-Esters angewandt wurde. Die Chromatografieanalyse dieser Reaktion enthüllte ebenfalls die saubere Bildung des Acridans unter einhergehendem Verlust der Chemilumineszenzaktivität. Das Ausmaß dieser Absenkung erwies sich als von der NADH-Konzentration abhängig. Wie in der Tabelle der 2 dargestellt, wurden steigende Mengen von NADH von einem entsprechenden Absinken der Chemilumineszenzaktivität der Reaktionsmischung begleitet. Die Reduktionsreaktion war in weniger als 10 min vollständig beendet.
Die Messung von in enzymatischen Systemen erzeugtem Hydrid ist im Stand der Technik in verschiedenen empfindlichen Assayverfahren angewandt worden. Beispielsweise beschreiben Cook et al. in Clin. Chem. 1993, 39/6, 965–971, ein Enzym-Verstärkungssystem zum Nachweis von menschlichem Proinsulin in menschlichem Plasma. Dieser Assay beinhaltet die Verwendung von alkalischer Phosphatase als primäre Markierung, die zur Entphosphorylierung von NADP⁺ zu NAD⁺ herangezogen wird. Die letztere Verbindung wird dann als Cofaktor in einem Redox-Zyklus unter Verwendung der Enzyme Alkohol-Dehydrogenase und Diaphorase eingesetzt. Während das erste Enzym ein NAD⁺ zur Oxidation von Ethanol zu Acetaldehyd unter Erzeugung von NADH nutzt, nutzt das letztere Enzym, die Diaphorase, das NRDH zur Reduktion eines Tetrazolium-Farbstoffs zur Erzeugung eines gefärbten Formazan-Farbstoffs. Mit diesem System konnten Cook et al. 1 Zeptomol alkalische Phosphatase und 0,017 pmol/L menschliches Proinsulin nachweisen. Das gleiche System wurde von Johannsson et al. (J. Immunol. Meth. 1986, 87, 7–11) zur Entwicklung eines hoch empfindlichen Assay für TSH (Empfindlichkeit von 0,0013 ☐IE/L) angewandt. In beiden obigen Assays gelangt ein gefärbter Farbstoff als Indikator zur Anwendung. Da Chemilumineszenz-Indikatoren wie Acridinium-Ester viel empfindlicher sind, dürfte die Messung von Hydrid mit diesen Verbindungen empfindlichere Assayverfahren ergeben. Es werden weitere interessante und nützliche Anwendungen der gewonnenen Erkenntnisse ins Auge gefasst, die in größerem Detail später noch dargelegt werden.
Die Reduktion von 2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridiniumester mit NADH beinhaltet die Addition von Hydrid an das C-9, um das nicht-chemilumineszierende Acridan zu erzeugen. Es liegt auf der Hand, dass Acridiniumverbindungen und deren Analoga mit weit unterschiedlichen strukturellen Modifikationen, aber mit dem gleichen Kern-Acridiniumnucleus oder dem analogen Benzacridinium-, Phenanthridinium- oder Chinolinium-Kern diesen Transformationen zugänglich sind. Solche Verbindungen können ganz allgemein unter der bzw. den Struktur(en) zusammengefasst werden, die in allen Literaturstellen des Standes der Technik beschrieben sind, die hierin im Hintergrundabschnitt am Beginn der vorliegenden Beschreibung angegeben wurden. Diese Strukturen schließen nicht nur blaues Licht (ca. 420 bis 490 nm), sondern auch grünes (ca. 490 bis 570 nm), gelbes (ca. 570 bis 580 nm), orangenes (ca. 580 bis 595 nm) und rotes (ca. 595 bis 780 nm) Licht emittierende Acridiniumverbindungen und genannte Analoga ein.
Zur weiteren Verdeutlichung ist die allgemeine Struktur der Haupt-Acridiniumverbindungen zur Verwendung als die Chemilumineszenz-Indikatoren in der vorliegenden Verbindung schematisch in 3 dargestellt, worin gilt:
R₁ ist Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder Aralkyl mit gegebenenfalls bis zu 20 Heteroatomen, vorzugsweise ist R₁ eine Methyl- oder Sulfoalkylgruppe;
R₂, R₂' und R₃ sind, gleich oder verschieden, ausgewählt aus Wasserstoff, -R, substituiertem oder unsubstituiertem Aryl (ArR oder Ar), Halogenid, Amino, Hydroxyl, Nitro, Sulfonat, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR oder aus -NHC(O)R;
über die gesamte vorliegende Anmeldung hinweg ist R aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl und aus Aralkyl mit gegebenenfalls bis zu 20 Heteroatomen;
alternativ dazu, können R₂ und R₃, wie in 4 dargestellt, verbunden sein, um so einen zusätzlichen Ring zu bilden, der an den gebundenen Acridinium-Kern kondensiert ist. Die C₁-, C₂-, C₃-, C₄-, C₅- und C₈-peri-Positionen des Acridinium-Kerns sind gegebenenfalls substituiert, wie dargestellt durch R₂';
A^– ist ein Gegenion, das eingeführt ist, um sich mit dem quartären Stickstoff des Acridinium-Kerns entweder als Ergebnis einer Quarternierung des Acridin-Ringstickstoffs durch die Verwendung von Alkylierungsmitteln während der Synthese, durch Modifikation des Restes R₁ oder durch einen anschließenden Austausch zu paaren, der während der Aufarbeitung der Reaktionsmischungen und der Reinigung der gewünschten Verbindungen in einer Lösung oder Flüssigkeit auftritt, die überschüssige Mengen weiterer Anionen enthalten. Beispiele der Gegenionen schließen CH₃SO₄ ^–, FSO₃ ^–, CF₃SO₃ ^–, C₄F₉SO₃ ^–, CH₃C₆H₄SO₃ ^–, Halogenid, CF₃COO^–, CH₃COO^– und NO₃ ^– ein;
X ist Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel;
ist X Sauerstoff oder Schwefel, sind Z nicht vorhanden und Y ein in 5 dargestellter polysubstituierter Arylrest, worin R₄ und R₈ (1) Wasserstoff oder (2) Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxyl (-OR), Alkylthiol (-SR) oder substituierte Aminogruppen sein können, die dazu dienen, die -COX-Bindung zwischen dem Acridinium-Kern und dem Y-Rest durch sterische und/oder elektronische Effekte zu stabilisieren; vorzugsweise ist der eine von ihnen wie unten definiert, während der andere Wasserstoff ist, falls die C₁- oder C₈-Position des Acridinium-Kerns mit einer Niederalkylgruppe, vorzugsweise mit Methyl, substituiert sind; bevorzugter sind R₄ und R₈ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxyl (-OR), Alkylthiol (-SR) oder substituierte Aminogruppen, die dazu dienen, die -COX-Bindung zwischen dem Acridinium-Kern und dem Y-Rest durch sterische und/oder elektronische Effekte zu stabilisieren; am meisten bevorzugt sind R4 und R8 Niederalkyl (z.B. eine Methylgruppe);
R₅ und R₇ sind jeder der Reste R₂, R₂' und R₃, die oben definiert sind;
R₆ ist ebenfalls jeder der Reste R₂, R₂' und R₃, die oben definiert sind, wenn die Acridiniumverbindung als freier Chemilumineszenz-Indikator verwendet wird.
Alternativ dazu, können die Agridiniumverbindungen kovalent an ein wasserlöslicheres (natürliches oder synthetisches) Polymer oder an Biopolymere (z.B. an Proteine, Polysaccharide, Glycoproteine und an Nucleinsäuren) in einer Konjugat-Form zur Steigerung ihrer Wasserlöslichkeit zur kommerziellen Anwendbarkeit in der Praxis als Chemilumineszenz-Indikator gebunden sein. Es ist dann notwendig, eine reaktive funktionelle Gruppe, vorzugsweise am R₆, einzuführen, um eine kovalente Bindungsbildung zwischen der Acridiniumverbindung und dem wasserlöslichen Polymer oder Biopolymer der Wahl zu erleichtern.
Somit kann R₆ auch -R₉-R₁₀ sein, worin R₉ nicht unbedingt, aber gegebenenfalls ein verzweigtes oder geradkettiges Alkylen, ein substituiertes oder unsubstituiertes Arylen oder Aralkylen mit gegebenenfalls bis zu 20 Heteroatomen und R₁₀ eine Abgangsgruppe oder eine elektrophile funktionelle Gruppe sind, die mit einer Abgangsgruppe verbunden ist, die, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, in 6 dargestellt ist. R₁₀ kann auch -Q-R-Nu, -Q-R-(I)_nNu-, -Q-Nu, -R-Nu oder -Nu sein, worin n eine Zahl von mindestens 1, Nu eine nukleophile Gruppe, Q eine funktionelle Bindung und I eine ionische oder ionisierbare Gruppe sind; detaillierte Definitionen von Nu, Q und I können in US 5,241,070 , Spalte 3, Zeile 45, bis Spalte 4, Zeile 16, gefunden werden. Die für Nu in Betracht gezogenen Reaktionen wurden auch im gleichen Patent, Spalte 3, Zeile 48 bis Spalte 4, Zeile 18, beschrieben.
R₅ und R₆ sowie R₆ und R₇ sind unter einander austauschbar; und wenn X Stickstoff ist, dann ist Z -SO₂-Y', worin Y' die oben beschriebene Definition von Y hat und beide gleich oder verschieden sein können. Außerdem kann Y selbst ein verzweigtes oder geradkettiges Alkyl mit gegebenenfalls bis zu 20 Kohlenstoffatomen, halogeniertes oder nicht-halogeniertes oder substituiertes Aryl oder ein heterocyclisches Ringsystem sein.
Ebenso kann die allgemeine Struktur der Phenanthridinium- und Chinoliniumverbindungen zur Verwendung als die Chemilumineszenz-Indikatoren in der vorliegenden Erfindung schematisch dargestellt werden, wie dies in 7 aufgezeigt ist. Als Definitionen der Substituenten und des Gegenions des oben diskutierten Phenanthridinium- und Chinolinium-Kerns sind die gleichen wie die vorher für die Acridiniumverbindungen beschriebenen, mit der Ausnahme, dass die möglichen peri-Positionen für den R₂'-Substituent an den C₁-, C₂-, C₃-, C₄-, C₆- und C₉-Positionen des Phenanthridinium-Kerns und an den C₂-, C₃-, C₅- und C₈-Positionen des Chinolinium-Kerns umbezeichnet werden müssen.
B. Alternativen einer Hydrid-Modulation chemilumineszierender Acridiniumverbindungen
Zusätzlich zur Reduktion von Acridinium-Estern zu Acridanen, kann ein Hydrid wie NADH ebenfalls herangezogen werden, um die chemilumineszierende Aktivität von Acridiniumverbindungen auf weiteren neuen und interessanten Wegen zu modulieren, die gegebenenfalls nützlich sein können. Einige derartige Lösungsansätze werden im Folgenden zusammengefasst angegeben, die alle eine chemische Selektivität (Regioselektivität) in der Reduktionsreaktion erforderlich machen.
1. Modulation der Acridinium-Ester- oder -Sulfonylamid-Spaltungslabilität
In einem der Lösungsansätze, kann das Hydrid auf den Ester- oder Sulfonylamid-Rest (anstatt auf den Acridinium-Kern) der Acridiniumverbindung gerichtet sein, um eine Änderung der Emissionscharakteristika der Verbindung zu bewirken. Es ist wohl bekannt, dass Acridinium-Ester mit schwachen Abgangsgruppen nur schwach chemilumineszieren. Schwache Abgangsgruppen sind in typischer Weise Elektron-reich und können durch Hydrid-Addition an Elektron-arme funktionelle Gruppen erzeugt werden. Durch Anwendung dieser Vorgehensweise können ein Acridinium-Ester oder -Sulfonylamid, die einen Elektron-mangelnden Ester- oder Sulfonylamid-Rest enthalten, in einen Elektron-reichen Rest überführt werden, wodurch eine stark chemilumineszierende Verbindung in eine schwache überführt wird. 8 veranschaulicht, wie dies bewerkstelligt wird. Indem einige der nötigen Grund-Substituenten und das Gegenion, wie im obigen Abschnitt A definiert, vorliegen, ist der Acridinium-Kern in der Darstellung gezielt maßgeschneidert, um durch die Bindung von einer oder mehreren gewünschten Elektron-spendenden Gruppen (bezüglich Wasserstoff und bezeichnet mit dem Buchstaben D) Elektron-reich zu sein, welche wie definiert in "Advanced Organic Chemistry", Herry March, Hsg., 4. Ausgabe, S. 18–19, an einer oder mehreren optimalen Positionen des Acridinium-Kerns vorliegen, so dass eine Reduktion des N-Methylpyridinium-Rests bevorzugt durchgeführt wird. Sind mehr als eine Elektron-spendende Gruppen (D's) am Acridinium-Kern substituiert, können die Grupp0en D's gleich oder verschieden sein. Zur Verleihung weiterer wichtiger oder wünschbarer struktureller Charakteristika (z.B. von Hydrophilie, funktioneller Gruppen usw.) sind weitere zusätzliche Substituenten an peri-Positionen des Acridinium-Kerns möglich und erlaubt, solange der kombinierte elektronische Effekt der Substituenten derjenige einer Elektron-Spende ist. Öffentlich trifft die gleiche technische Lehre auch für die Analoga des Acridinium-Esters und -Sulfonylamids zu, wie diese vorher in Abschnitt A beschrieben sind.
2. Modulation der Emissionswellenlängenmaxima der Acridiniumverbindungen
Die Reduktion kann auch zur Änderung der Emissionswellenlänge einer Acridiniumverbindung angewandt werden. Die Emissionswellenlänge blauemittierender Acridiniumverbindungen kann zu langen Wellenlängen durch Erzeugung eines verlängerten elektronischen Konjugationssystems am Acridinium-Kern verschoben werden, wie dies in der PCT-Anmeldung WO 00109 487 diskutiert ist. Indem die Reduktion auf eine Unterbrechung des verlängerten konjugierten Systems in einer Acridiniumverbindung gerichtet wird, kann die Emissionswellenlänge der Acridiniumverbindung von einer langen zu einer kurzen Wellenlänge verschoben werden, und es wird somit die Chemilumineszenzintensität des ausgewählten Wellenlängenbereichs variiert, der unter Betracht steht und verfolgt wird. 9 veranschaulicht das obige Prinzip. Wiederum wird, indem einige der nötigen Grund-Substituenten und das Gegenion vorliegen, wie dies im obigen Abschnitt A definiert ist, der Acridinium-Kern in der Darstellung ebenfalls gezielt maßgeschneidert, um durch die Bindung einer oder mehrerer erwünschter Elektron-spendenden Gruppen (bezüglich Wasserstoff und bezeichnet mit dem Buchstaben D) an einer oder mehreren optionalen Positionen des Acridinium-Kerns Elektronreich zu sein, so dass die Reduktion des an der Seitenkette verlängerten Konjugationssystems bevorzugt durchgeführt wird. Sind mehr als eine Elektron-spendende Gruppen (D's) am Acridinium-Kern substituiert, können die Gruppen D's gleich oder verschieden sein. Zur Verleihung weiterer wichtiger oder erwünschbarer struktureller Charakteristika (z.B. von Hydrophilie, funktioneller Gruppen usw.) sind weitere zusätzliche Substituenten an den peri-Positionen des Acridinium-Kerns möglich und erlaubt, solange der kombinierte elektronische Effekt aller Substituenten derjenige einer Elektron-Spende ist. Offensichtlich tritt die gleiche technische Lehre für die Analoga des Acridinium-Esters und -Sulfonylamids zu, wie diese vorher im Abschnitt A beschrieben sind.
3. Modulation des Löscher/Fluorophor-Rests der Acridiniumverbindungen
Weitere Ausführungsformen der Modulierung der Chemilumineszenzaktivität sind im Schema der 9 veranschaulicht, worin das Hydrid aus einer enzymatischen Reaktion die Struktur des mit Hydrid reduzierbaren Löschers, der kovalent an den eine Gruppe D aufweisenden Acridinium-Rest gebunden ist, zum oben beschriebenen Zweck und somit den Löscheffekt ändert. Die erforderliche Bedingung des Löschers beruht hier auf seiner Fähigkeit zum Löschen der Chemilumineszenzaktivität der Acridiniumverbindung über einen Dipol-Dipol-Resonanz-Energie-Transfer oder über weitere Mechanismen, sowie auf seiner Fähigkeit, durch Hydrid vorzugsweise über die Reduktion des Acridinium-Rests reduziert zu werden. Die Verringerung der Quantenausbeute durch den Löscheffekt des Löschers kann durch die Wechselwirkung von Hydrid mit dem Löscher umgekehrt werden. Somit steigt, in der Gegenwart von Hydrid, die Quantenausbeute des Acridinium-Rests des Konjugats an. Ein offensichtlicher Vorteil der Modulierung der Chemilumineszenzaktivität durch Hydrid mit einem Acridinium-Löscher-Konjugat ist die positive Korrelation zwischen der Konzentration des Hydrids und der Chemilumineszenzaktivität des Konjugats.
Wiederum kann, indem einige der nötigen Grund-Substituenten und das Gegenion vorliegen, wie diese oben im Abschnitt A definiert sind, der Acridinium-Kern in 10 mit einer oder mehreren erwünschten Elektron-spendenden Gruppen D's an einer oder mehreren optimalen Positionen des Acridinium-Kerns verbunden sein, so dass die Reduktion des Seitenketten-Löschers bevorzugt durchgeführt wird. Sind mehr als eine Elektron-spendende Gruppen (D's) am Acridinium-Kern substituiert, können die Gruppen D's gleich oder verschieden sein. Ebenso sind zur Verleihung weiterer wichtiger oder wünschbarer struktureller Charakteristika (z.B. von Hydrophilie, funktioneller Gruppen usw.) weitere zusätzliche Substituenten an den peri-Positionen des Acridinium-Kerns möglich und erlaubt, solange der kombinierte elektronische Effekt aller Substituenten derjenige einer Elektron-Spende ist. Offensichtlich tritt die gleiche technische Lehre auch für die Analoga des Acridinium-Esters und -Sulfonylamids zu, wie diese vorher im Abschnitt A beschrieben sind.
Ein alternativer Modus, der der Verwendung des Acridiniumverbindung-Löscher-Konjugats ähnelt, beruht auf dem Austausch des Löschers durch einen Fluorophor zur Bildung eines AE-Fluorophor-Konjugats. Acridinium-Fluorophor-Konjugate, in denen der Fluorophor an den Acridinium-Kern gebunden ist, emittieren in ihren Chemilumineszenz-Reaktionen Licht in einer Region der Spektrumcharakteristik des Fluorophors. Dies erfolgt über einen Resonanz-Energie-Transfer aus dem elektronisch angeregten Acridon-Rest zum Fluorophor. Das Prinzip und entsprechende Beispiele der AE-Fluorophor-Konjugate sind detaillierter in der PCT-Anmeldung WO 98/54 574 offenbart. Eines der Beispiele dieser neuen Klasse von Verbindungen betrifft das Konjugat von Acridinium-Ester mit Rhodamin, wie dies im Folgenden dargelegt wird. Das Konjugat emittiert Licht bei 628 nm durch wirkungsvollen Energie-Transfer vom AE-Rest zu Rhodamin nach Behandlung mit Wasserstoffperoxid in stark alkalischer Lösung. Der Acridinium-Rest kann durch Variieren der D-Gruppe so modifiziert werden, dass der Rhodamin-Rest selektiv oder bevorzugt durch Hydrid reduziert wird. Als Ergebnis der Reduktion können die Lichtemissionsintensität bei langen Wellenlängen durch den Rhodamin-Rest abgesenkt und die Emissionsintensität bei kurzen Wellenlängen durch den Acridinium-Rest erhöht werden. Somit wird die quantitative Bestimmung von Hydrid entweder durch Nachweis der Absenkung des langwelligen Emissionssignals oder durch Nachweis der Erhöhung des kurzwelligen Emissionssignals ermöglicht.
Wiederum kann, indem einige der nötigen Grund-Substituenten und die Gegenionen vorliegen, wie diese im obigen Abschnitt A definiert sind, der Acridinium-Kern in 11 mit einer oder mehreren erwünschten Elektron-spendenden Gruppen D's an einer oder mehreren optimalen Positionen des Acridinium-Kerns verbunden sein, so dass die Reduktion des Seitenketten-Fluorophor-Rests bevorzugt durchgeführt wird. Sind mehr als eine Elektron-spendende Gruppen (D's) am Acridinium-Kern substituiert, können die Gruppen D's gleich oder verschieden sein. Ebenso sind zur Verleihung weiterer wichtiger oder wünschbarer struktureller Charakteristika (z.B. von Hydrophilie, funktioneller Gruppen usw.) weitere zusätzliche Substituenten an den peri-Positionen des Acridinium-Kerns möglich und erlaubt, solange der kombinierte elektronische Effekt aller Substituenten derjenige einer Elektron-Spende ist. Offensichtlich trifft die gleiche technische Lehre auch für die Analoga des Acridinium-Esters und -Sulfonylamids zu, wie diese vorher im Abschnitt A beschrieben sind.
C. Anwendungen der Chemilumineszenz-Hydrid-Indikatoren
1. Überführung eines kolorimetrischen in einen Chemilumineszenz-Emit^®-Assay
Die Modulierung der Chemilumineszenzaktivität von Acridiniumverbindungen mit Hydrid ergibt zahlreiche Anwendungen in Analysenmessungen. Wie bereits vorher erwähnt, sind gefärbte Indikator-Moleküle zur messenden Verfolgung einer NADH-Bildung zur Entwicklung empfindlicher Immunoassays (siehe oben) angewandt worden. Es ist nun herausgefunden worden, dass die Bildung von NADH (und durch Analogie jedes Hydrids) in einem System quantitativ mit Acridinium-Ester (und durch Analogie mit jeder Verbindung vom Acridinium-Typ) gemessen werden kann, wobei die vorliegende Erfindung ein Analysenverfahren, wie dargestellt in 12, offenbart. Darin stellen A und AH oxidierte und reduzierte Formen einer Acridiniumverbindung dar, deren Chemilumineszenz-Emissionseigenschaften unterscheidbar sind. Die Hydrid-Quelle kann chemisch oder biologisch sein. Außerdem kann das Hydrid entweder direkt auf die Acridiniumverbindung oder indirekt durch die Einwirkung eines Enzyms wie von Diaphorase übertragen werden.
Ein zusätzlicher Vorteil der Anwendung der vorliegenden Erfindung beruht darauf, dass es durch sie für ein Laboratorium ermöglicht ist, die Hydrid-Erzeugung über und durch die Verwendung eines Geräts zu messen, mit dem Chemilumineszenz gemessen wird, wodurch die Notwendigkeit zur Anwendung eines UV-sichtbaren Spektrofotometers eliminiert ist, welches in der Vergangenheit zur Messung der Hydrid-Erzeugung benötigt wurde.
In einem in breitem Umfang eingesetzten, kommerziellen Diagnosetest, der als Emit^® bezeichnet ist (Emit^® ist eine eingetragene Handelsmarke von Behring Diagnostics GmbH und ist unten definiert, R.S. Schneider "Recent Advances in Enzyme Immunoassay" in Ligand Assay; J. Langan und J. Clapp, Hrsg.: Masson Publishing USA, Inc. 1981) gelangt ein homogener Immunoassay-Format zur Anwendung, und es wird die Bildung von NADH (direkt durch UV-Spektrofotometrie) messend verfolgt und quantitativ bestimmt, dessen Konzentration letztlich zur Analyse-Konzentration in Korrelation gebracht wird. Zum Beleg der Eignung von Acridiniumverbindungen als ausgezeichneter quantitativer Indikator von NADH wurde dieser kommerzielle Test für 3 Analyte (Theophyllin, Chinidin und Valproat) eingesetzt. Ebenso ist ein enzymatischer Assay zur Bestimmung von Ethanol im vorliegenden Beispiel 8 gleichfalls angegeben, um die Eignung dieses Lösungsansatzes zu belegen. Es wurde auch wahlweise die direkte Reduktion der Acridiniumverbindung mit dem im Assay erzeugten NADH angewandt, obwohl es offensichtlich ist, dass diese Reduktion auch durch die Einwirkung von Diaphorase durchgeführt werden kann.
Die für diese Studie verwendeten Modell-Chemilumineszenz-Hydrid-Indikatoren waren 2',6'-dimethylpheny1-10-methylacridinium-9-carboxylat (DMAE-Φ) als freie Markierung und 2',6'-Dimethylphenyl-10-(3'-sulfopropyl)acridinium-9-carboxylat (NSP-DMAE), konjugiert über eine Carboxamid-Bindung an Rinderserumalbumin (BSA). Ein spezifischer Beleg der Eignung der Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Redox-Indikatoren von Hydrid wird nun beschrieben, worin das Chemilumineszenz-Signal aus NSP-DMAE oder aus DMAE-Φ in einem Enzym-Immunoassay zur quantitativen Bestimmung von Theophyllin, Chinidin und von Valproat in Serum sowie auch in einem enzymatischen Assay zur quantitativen Bestimmung von Ethanol in Serum angewandt wird. Zu diesem Zweck sind ein Prototyp-Assay am Bayer Diagnostics Corp. ACS:180^® (ACS:180^® ist eine eingetragene Handelsmarke von Bayer Corporation für ein automatisiertes Chemilumineszenz-Analysegerät: ein vollautomatisiertes Immunodiagnose-Assaysystem) mit Behring Diagnostics Emit^® 2000-Theophyllin- und Modell 1-Valproat-Assay-Reagenzien und auch mit Bayer Corporation Immuno 1^TM Emit^® 2000-Chinidin-Assay-Reagenzien sowie ein enzymatischer Assay zur Bestimmung von Ethanol in Serum unter Einschluss eines zusätzlichen Chemilumineszenz-Redox-Indikatorreagens entwickelt worden. DMAE-Φ oder NSP-DMAE-BSA-Konjugate eignen sich für Anwendungen sowohl in organischen als auch in wässrigen Medien. Da eine breite Vielfalt von Acridiniumverbindungen, die die oben beschriebenen hydrophilen AE's des Standes der Technik einschließen, gut dokumentiert sind, vermögen die Anwender der vorliegenden Erfindung eine hoch wasserlösliche Acridiniumverbindung auszuwählen, um die Verwendung organischer Lösungsmittel zu vermeiden, die möglicherweise nachteilig für den Assay sein könnten. Somit hat der Anwender eine Anzahl von Optionen zur Auswahl des Cheminolumineszenz-Hydrid-Indikators mit entsprechend geeigneter Löslichkeit zur Anwendung in einer Assay-Matrix bei gegebener Polarität zur Hand.
Alternativ dazu, könnte die Acridiniumverbindung, die als der Chemilumineszenz-Indikator für das Hydrid ausgewählt wird, an eine Anzahl kleiner Moleküle, Makromoleküle oder Teilchen kovalent oder andersartig konjugiert werden, um Eigenschaften wie, ohne darauf eingeschränkt zu sein, die Löslichkeit, Quantenausbeute, Stabilität und den Resonanz-Energie-Transfer zu verbessern oder zu verleihen.
Enzym-vervielfältigte Immunoassaytechnik (enzyme-multiplied immunoassay technique = Emit^®) wurde ursprünglich von Syva Co. Inc. als Bioanalyse-Technologie entwickelt und wird derzeit in Kits von Dade-Behring Inc. hauptsächlich zur Aufzeichnung und Verfolgung therapeutischer Arzneien (therapeutic drug monitoring = TDM) bei geringerer Anwendung zum Nachweis von Missbrauchsarzneien auf den Markt gebracht. Die automatisierte homogene Behring Diagnostics Inc. Emit^®-Assay-Serie stellt derzeit eine von mehreren bevorzugten Diagnosesystemen für TDM-Analyte dar. In diesen Assayverfahren konkurriert eine in einer Patientenprobe vorliegende Arznei mit einem Arznei-Enzym-Konjugat um eine begrenzte Menge eines Antikörpers, der gegen die Arznei gerichtet ist. Die enzymatische Aktivität des Konjugats, welche in diesem Fall diejenige der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) aus Leuconostoc mesenteroides ist, wird bei Bindung an den Arznei-spezifischen Antikörper teilweise inhibiert. G6PDH katalysiert die Reduktion von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zur reduzierten Form NRDH durch Hydrid-Transfer aus Glucose-6-phosphat (G6P) und wird durch die durch NADH-Bildung gesteigerte UV-Absorption bei 340 nm messend verfolgt. Endogene Proben-G6PDH benötigt NADP, und nicht NAD, zur katalytischen Aktivität und interferiert daher nicht mit einer NAD-Reduktion. Infolgedessen steht die G6PDH-Katalyseaktivität des Konjugats in Korrelation zur Arzneikonzentration in der Patientenprobe durch Umsatz und Geschwindigkeit der NADH-Bildung, z.B. von ΔA₃₄₀ nm/min. Ein Behring Diagnostics Inc. Emit^®-Assay-Kit enthält 2 Reagenzien: Reagens A enthält eine gepufferte Lösung von G6P (Substrat), NAD (Enzym-Cofaktor) und Maus-Monoclonalantikörper, die reaktiv gegenüber einem besonderen Arznei-Analyt sind, während das Reagens B aus einer gepufferten Lösung des Arznei-G6PDH-Konjugats besteht.
Da im Bayer Diagnostics ACS:180^®-Messsystem eine Fotovervielfältigerröhre zur quantitativen Bestimmung des Chemilumineszenz-Signals zur Anwendung gelangt, macht die Anpassung des Behring Diagonstics Inc.-Emit^®-Assay an einen Bayer Diagnostics ACS:180^® ein zusätzliches Reagens zur Überführung des kolorimetrischen Signals in Chemilumineszenz erforderlich. Dieses zusätzliche Reagens wird als Chemilumineszenz-Redox-Hydrid-Indikator (CHI) bezeichnet, und der CHI ist eine Acridiniumverbindung. Die folgenden Versuche haben gezeigt, dass mehrere Acridinium-Esterderivate durch Hydrid-Transfer (am wahrscheinlichsten zur C-9-Position des N-Methylacridinium-Kerns) aus einer äquimolaren Konzentration von NADH im milli- und mikromolaren Bereich reduziert werden.
Die Geschwindigkeit und der Umsatz der Reduktion sind langsam, am wahrscheinlichsten weil die vorherrschende Pseudobase-Form einer Reduktion durch Hydrid nicht zugänglich ist, wodurch sichergestellt wird, dass die differenzielle Absenkung der Chemilumineszenz sogar in der Gegenwart eines großen Überschusses an verfügbarem Hydrid beobachtet wird. Beispielsweise chemiluminesziert reduziertes DMAE-Φ (N-Alkylacridan) nur schwach im Vergleich mit DMAE-Φ und ergibt ein nur geringes nachweisbares Signal, im Blitz-Fall; daher steht, obwohl die Vergleichs-NADH-Konzentration, die in eine Mischung eingebracht ist, viel größer als die von DMAE-Φ sein mag, die realtive NADH-Konzentration in Korrelation zur Absenkung der Gesamt-Chemilumineszenz. Diese Korrelation ist aufgestellt worden. DMAE-Φ und auch NSP-DMAE sollten daher als Chemilumineszenz-Redox-Hydrid-Indikator in einem Assay vom Emit^®-Typ fungieren, wobei erhöhte Analyt-Konzentrationen den Umsatz und die Geschwindigkeit der NADH-Bildung steigern würden, um dadurch die Chemilumineszenz einer festgelegten Menge an Acridiniumverbindung, die in die Assayreaktion eingeschlossen wird, abzusenken.
Die Fähigkeit zur Messung von Veränderungen bei den NADH-Konzentrationen, die im mikro- bis millimolaren Bereich liegen, mit Acridiniumverbindungen oder -Konjugaten im nanomolaren Bereich hat es ermöglicht, Änderungen der Analyt-Konzentrationen (wie wiedergegeben in Änderungen der NADH-Konzentrationen) direkt zu messen, ohne dass entweder verdünntes NADH enthaltende Proben vorliegen oder ein sekundäres Senkereagens zugegeben werden müssen, um die übergroße Menge von NADH in unverdünnten Proben abzufangen.
Eine schematische Darstellung des obigen Assay ist in 13 gezeigt, und Beispiele mit 3 Analyten (Theophyllin, Chinidin und Valproat), gemessen mit der vorgenannten Verfahrenstechnik, sind im Detail in Beispiel 5 bis 8 sowie für einen enzymatischen Assay zur quantitativen Bestimmung von Ethanol beschrieben. Die Daten zeigen ganz klar, dass Acridiniumverbindungen tatsächlich ausgezeichnete quantifizierbare Hydrid-Indikatoren darstellen.
3. Lösung der Assay-Interferenz aus einer Gesamtblutprobe durch die Einfügung einer Fest-Phasen-Abfangstufe
Im beschriebenen homogenen Assay wird die Rest-Chemilumineszenzaktivität in der Assaymischung gemessen, d.h., steigende Analyt-Konzentrationen führen zu sinkenden Gehalten der in der Assaymischung verbliebenen Chemilumineszenzaktivität. Da der Assay homogen abläuft, könnten äußere Substanzen in der Probe aus z.B. einer Gesamtblutprobe möglicherweise die Chemilumineszenz-Reaktion der Acridiniumverbindung mit Wasserstoffperoxid stören oder inhibieren. Für den Fall, dass dies zu beobachten ist, wird es ermöglicht, den Assay so zu handhaben, dass diese Störungsinterferenz/Inhibierung beseitigt wird. Dies kann am direktesten bewerkstelligt werden, wie dies in 14 dargestellt ist. In diesem Assay werden eine feste Phase wie paramagnetische Partikel am Ende des homogenen Assay zugegeben. Die Partikel sind mit einem Antikörper überzogen, der für die Acridiniumverbindung spezifisch ist (Ref.: U. Piran et al., US 5,445,936 , "Method für Non-Competitive Bindung Assays"). Nach Abschluss des homogenen Assay werden die Partikel zum Einfangen der Acridiniumverbindung zugegeben. Die Partikel können dann zur Beseitigung interferierender bzw. störender Substanzen vor der Auslösung durch Wasserstoffperoxid der Chemilumineszenz-Reaktion gewaschen werden.
4. Heterogene Chemilumineszenz-Emit^®-Assays
Assays, in denen ein heterogenes Format angewandt wird, können ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden. 15 veranschaulicht, wie dies durchgeführt werden kann. Für einen Sandwich-Assay unter Einsatz von 2 Antikörpern kann der eine von ihnen an das Hydrid-Erzeugungssystem wie an G6PDH, Alkohol-Dehydrogenase usw. gekoppelt werden. Die Konzentration der Enzym-Markierung im Assay wird dann durch Verwendung des NADH gemessen, das vom Enzym erzeugt wird, um das Acridiniumverbindung-Indikatormolekül zu reduzieren. Alternativ dazu, kann in einem Konkurrenz-Assay für eine kleine Analyse-Menge das Hydrid-Erzeugungssystem wie G6PDH an den Analyt zur Verwendung im Assay als Tracer gekoppelt werden. Ablesung bzw. Messung des Signals im Assay werden in ähnlicher Weise wie im Sandwich-Assay durchgeführt.
Es ist auch offensichtlich, dass durch Anwendung des Hydrid-Erzeugungssystems wie des Enzyms G6PDH als Markierung für Nucleinsäuren Nucleinsäure-Assays ermöglicht werden, um mit Acridiniumverbindungen als der Hydrid-Indikator entwickelt zu werden.
Die Fachleute mit relevantem Fachwissen werden weitere Variationen erkennen, die mit der offenbarten Erfindung übereinstimmen. Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne darauf eingeschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele noch weiter erläutert.
Beispiel 1
2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-Trifluormethansulfonat (DMAE-Φ)
Synthese von 2',6'-Dimethylphenylacridin-9-carboxylat
Acridin-9-carbonsäure (5 g) wurde mit Thionylchlorid (ca. 25 mL) unter einer Stickstoff-Atmosphäre in einem Öl-Bad am Rückfluss gehalten, bis sich die Reaktion aufklarte. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und in Benzol (200 mL, wasserfrei) gegossen. Die Benzol-Suspension wurde im Kühlschrank über Nacht gekühlt, um die Ausfällung des Säurechlorids zu vervollständigen, welches durch Filtration gewonnen und mit wasserfreiem Ether gespült wurde. Ausbeute = 5,3 g (quant.)
Das Säurechlorid (5,3 g) wurde mit 2,6-Dimethylphenol, Dimethylaminopyridin (0,5 g) in wasserfreiem Pyridin (40 mL) vermischt. Die Reaktion wurde in einem Öl-Bad bei 100°C 3 h lang erhitzt. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Rohprodukt wurde durch Blitzchromatografie an Kieselgel mit 1:4-Ethylacetat in Hexanen als Eluierungsmittel gereinigt. Die Einengung der Blitz-Fraktionen ergab das Produkt als hellgelbes Pulver.
Synthese von 2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-Trifluormethansulfonat
Eine Lösung von 2',6'-Dimethylphenyl-acridin-9-carboxylat (20 mg, 0,061 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (ca. 2 mL) wurde mit Methyltrifluormethansulfonat (0,175 mL, 25 Äq.) behandelt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur gerührt. Ein gelber Niederschlag begann sich in ca. 1 h zu bilden. Die Reaktion wurde ca. 16 h lang gerührt, worauf wasserfreier Ether (ca. 50 mL) zugegeben wurde, um das Produkt auszufällen, das durch Filtration gesammelt und mit Ether gewaschen und an der Luft getrocknet wurde.
Ausbeute = 29 mg, MALDI-TOF, MS = 342,9 beob. (342,4 ber.)
Beispiel 2
2',6'-Dimethylphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat
Synthese: Eine Lösung von 2',6'-Dimethylphenyl-l0-methylacridinium-9-carboxylat-Trifluormethansulfonat (50 mg, 0,105 mmol) in Methanol (20 mL, teilweise gelöst) wurde in einem Eis-Bad gekühlt und mit Natriumborhydrid (20 mg, 0,525 mmol) behandelt. Die gelbe Farbe der Lösung wurde sofort gebleicht. Nach 1 h wurde zusätzliches Natriumborhydrid (20 mg) zugegeben, und die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und ca. 16 h lang gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Essigsäure (1 mL) gelöscht und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Acetonitril gelöst. Die HPLC-Analyse an einer 3,9 × 300 mm C18-Säule mit einem 30-min-Gradient von 10 → 100 % MeCN/Wasser (0,05 % TFA in beiden) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 mL/min und durch UV-Nachweis bei 260 nm ergab eine Rt = 27 min (Acridan) und eine Rt = 18 min (Acridinium-Ester). Das Produkt wurde durch präparative HPLC gereinigt, und die HPLC-Fraktionen wurden zur Trockne gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver zu ergeben.
Ausbeute = 30 mg (60 %)
Beispiel 3
2',6'-Dimethylphenyl-10-(3'-sulfopropyl)acridinium-9-carboxyamidyl-BSA-Konjugat
Synthese: Rinderserumalbumin (1,65 mg, 25 nmol) wurde in 475 μL 0,20 M NaHCO₃, pH = 9,0, gelöst. NSP-DMAE-NHS ( US 5,656,426 ) (0,61 mg, 1,03 μmol) wurde in 103 μL N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst, um eine 10 mM Lösung herzustellen. 25 μL der 10 mM NSP-DMAE-NHS wurden mit den 475 μL BSA-Lösung vermischt und bei 4°C 16 h lang inkubiert. Das Konjugat wurde in Wasser mit SEC isoliert. Die NSP-DMAE-Einverleibung auf BSA betrug ca. 4 Markierungen pro Protein-Molekül, wie berechnet aus der bekannten chemilumineszierenden spezifischen Aktivität der Markierung und der Protein-Bestimmung mit dem Bradford-Protein-Assay (6,4 μM).
Beispiel 4
Herstellung eines Chemilumineszenz-Hydrid-Indikators

a. 9 mg (32 μmol) N(10)-Methylacridinium-Tetrafluorborat (NMA, Sigma-Aldrich) wurden in 320 μL N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst, um eine 0,10 M Lösung herzustellen. Eine Masse von 6,25 mg (13 μmol) DMAE-Φ wurde in 2,607 mL Methanol gelöst und anschließend mit Methanol auf eine Konzentration von 0,50 μM verdünnt. 300 μL der 0,10 M NMA wurden mit 750 μL der 0,50 μM DMAE-Φ in 1,95 mL Wasser vermischt. Alternativ dazu, wurden NMA und die 2 weiteren Hydrid-Senken Cetylpyridiniumchlorid und Crotonsäure in 0,20 M Glycinpuffer, 0,1 % IgG, pH = 7,4, gelöst, als der verwendete Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator ein kovalentes Konjugat aus Acridinium-Ester und IgG (Bayer Diagostics) war. Das Acridinium-Ester-IgG-Konjugat wurde auf 12 nM im gleichen Puffer verdünnt.
b. Alternativ dazu, wurde ein NSP-DMAE4-BSA-Konjugat auf eine Konzentration von 12 nM in einem Puffer aus 0,20 M Glycin, 1,0 % (G/V) BSA, p = 7,4, verdünnt.

Beispiel 5
Theophyllin-Assay mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
In diesem automatisierten, homogenen Enzym-Immunoassay konkurriert in einer Patientenprobe vorliegendes Theophyllin mit einem Theophyllin-G6PDH-Konjugat um die Bindung an eine begrenzte Menge eines anti-Theophyllin-Maus-Monoclonalantikörpers. Durch die Bindung des anti-Theophyllin-Antikörpers an das Theophyllin-G6PDH-Konjugat wird die Enzymaktivität teilweise inkibiert. Die G6PDH katalysiert die Reduktion von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zur reduzierten NADH-Form durch Hydrid-Transfer aus dem Glucose-6-phosphat (G6P). Das Hydrid wird dann chemisch aus dem NADH auf das DMAE-Φ oder auf das an BSA konjugierte NSP-DMAE übertragen. Infolgedessen steht die G6PDH-Katalyseaktivität des Konjugats in Korrelation zur Theophyllin-Konzentration in der Patientenprobe und in umgekehrter Korrelation zur Rest-Chemilumineszenz der Assay-Reaktion.
Der folgende Assay wurde insgesamt mit dem Bayer Diagnostics ACS:180^® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) durchgeführt. Küvetten wurden in ein Gestell und dann 10 μL Bayer Diagnostics ACS-Theophillin-Assay-Vergleichsstandards in ihre jeweiligen Küvetten in Replikaten von 3 gegeben. Die Standards enthielten Theophyllin in Konzentrationen von 0,00, 13,9, 27,8, 55,5, 111 und 222 μM. Die Bayer Diagnostics Ligand-Vergleiche 1, 2 und 3 enthielten Theophyllin in Konzentrationen, die in der angegebenen Tabelle spezifiziert sind. In jede Küvette wurden 300 μL Behring Diagnostics Emit^® 2000-Theophyllin-Assay-Reagens 1, enthaltend eine gepufferte Lösung von G6P, NAD und anti-Theophyllin-Antikörper, gegeben und bei 37°C 2 min und 40 s lang inkubiert. Dazu wurden 150 μL Behring Diagnostics Emit^® 2000-Theophyllin-Assay-Reagens 2, enthaltend eine gepufferte Lösung von Theophyllin-G6PDH-Konjugat, gegeben. Die Küvetten wurden bei 37°C weitere 2 min und 40 s lang inkubiert, und dann wurden 20 μL des Chemilumineszenz-Indikators, enthaltend entweder 10 mM NMA und 125 nM DMAE-Φ in wässrigen 10 % (V/V) DMF und 25 % (V/V) Methanol oder 12 nM NSP-DMAE4-BSA-Konjugat, 0,20 M Glycin, 1,0 % (G/V) BSA, pH = 7,4, zur endgültigen Inkubation bei 37°C über 5 min gegeben. Da der Assay homogen abläuft, wurden die Wäschen 1 und 2 sowie die Vakua 1, 2 und 3 weggelassen. Die Reaktionsmischungen wurden der Reihe nach mit den Bayer Diagnostics ACS-Reagenzien 1 (0,1 N HNO₃, 0,5 % (G/V) H₂O₂) und 2 (0,25 N NaOH, 0,5 (G/V) N,N,N,N-Hexadecyltrimethylammoniumchlorid-Oberflächenmittel) vermischt, um die Chemilumineszenz-Reaktion auszulösen.
Beispiel 6
Valproat-Assay mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
In diesem automatisierten, homogenen Enzym-Immunoassay konkurriert in einer Patientenprobe vorhandenes Valproat mit einem Valproat-G6PDH-Konjugat um die Bindung an eine begrenzte Menge eines anti-Valproat-Maus-Monoclonalantikörpers. Durch die Bindung des anti-Valproat-Antikörpers an das Valproat-G6PDH-Konjugat wird die Enzymaktivität teilweise inhibiert. Die G6PDH katalysiert die Reduktion von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zur reduzierten NADH-Form durch Hydrid-Transfer aus dem Glucose-6-phosphat (G6P). Das Hydrid wird dann chemisch aus dem NADH auf das DMAE-Φ oder auf das an BSA konjugierte NSP-DMAE übertragen. Infolgedessen steht die G6PDH-Katalyseaktivität des Konjugats in Korrelation zur Valproat-Konzentration in der Patientenprobe und in umgekehrter Korrelation zur Rest-Chemilumineszenz der Assay-Reaktion.
Der folgende Assay wurde insgesamt mit dem Bayer-Diagnostics ACS:180^® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) durchgeführt. Küvetten wurden in ein Gestell und dann 10 μL Bayer Diagnostics-in-Haus-RCS-Valproat-Assay-Vergleichsstandards in ihre jeweiligen Küvetten in Replikaten von 3 gegeben. Die Standards enthielten Valproat in Konzentrationen von 0,000, 86,7, 173, 347, 693 und von 1387 μM. Die Bayer Diagnostics-in-Haus-TDM-Vergleiche A, B und C enthielten Valproat in Konzentrationen, die in der angegebenen Tabelle spezifiziert sind. In jede Küvette wurden 225 μL Behring Diagnostics Emit^® Modell 1-Valproat-Assay-Reagens A, enthaltend eine gepufferte Lösung von G6P, NAD und anti-Valproat-Antikörper, gegeben und bei 37°C 2 min und 40 s lang inkubiert. Dazu wurden 225 μL Behring Diagnostics Emit^® Modell 1-Valproat-Assay-Reagens B, bestehend aus einer gepufferten Lösung von Valproat-G6PDH-Konjugat, gegeben. Die Küvetten wurden bei 37°C weitere 2 min und 40 s lang inkubiert, und dann wurden 20 μL des Chemilumineszenz-Indikators, enthaltend entweder 10 mM NMA und 125 nM DMAE-Φ in wässrigen 10 % (V/V) DMF und 25 % (V/V) Methanol oder 12 nM NSP-DMAE₄-BSA-Konjugat, 0,20 M Glycin, 1,0 % (G/V) BSA, pH = 7,4, zur endgültigen Inkubation bei 37°C über 5 min gegeben. Da der Assay homogen abläuft, wurden die Wäschen 1 und 2 sowie die Vakua 1, 2 und 3 weggelassen. Die Reaktionsmischungen wurden der Reihe nach mit den Bayer Diagnostics ACS-Reagenzien 1 (0,1 N HNO₃, 0,5 % (G/V) H₂O₂) und 2 (0,25 N NaOH, 0,5 % (G/V) N,N,N,N-Hexadecyltrimethylammoniumchlorid-Oberflächenmittel) vermischt, um die Chemilumineszenz-Reaktion auszulösen. Die Chemilumineszenzdaten wurden 5 s lang als mit einem ACS-Luminometer nachgewiesene Fotonen gesammelt und in relativen Lichteinheiten (RLUs) ausgedrückt.
Beispiel 7
Chinidin-Assay mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
In diesem automatisierten, homogenen Enzym-Immunoassay konkurriert in einer Patientenprobe vorhandenes Chinidin mit einem Chinidin-G6PDH-Konjugat um die Bindung an eine begrenzte Menge eines anti-Chinidin-Maus-Monoclonalantikörpers. Durch die Bindung des anti-Chinidin-Antikörpers an das Chinidin-G6PDH-Konjugat wird die Enzymaktivität teilweise inkubiert. Die G6PDH katalysiert die Reduktion von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zur reduzierten NADH-Form durch Hydrid-Transfer aus dem Glucose-6-phosphat (G6P). Das Hydrid wird dann chemisch aus dem NADH auf das an BSA konjugierte NSP-DMAE übertragen. Infolgedessen steht die G6PDH-Katalyseaktivität des Konjugats in Korrelation zur Chinidin-Konzentration in der Patientenprobe und in umgekehrter Korrelation zur Rest-Chemilumineszenz der Assay-Reaktion.
Der folgende Assay wurde insgesamt mit dem Bayer-Diagnostics ACS:180^® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) durchgeführt. Küvetten wurden in ein Gestell und dann 10 μL Bayer Diagnostics-in-Haus-ACS-Chinidin-Assay-Standards in ihre jeweiligen Küvetten in Replikaten von 3 gegeben. Die Standards enthielten Chinidin in Konzentrationen von 0,00, 0,77, 1,5, 3,1, 6,2, 12, 18 und 25 μM. In jede Küvette wurden 160 mL Bayer Corporation Emit^® 2000-Chinidin-Assay-Reagens A, enthaltend eine gepufferte Lösung von G6PDH und anti-Chinidin-Antikörper, gegeben und bei 37°C 2 min und 40 s lang inkubiert. Dazu wurden 80 μL Bayer Corporation Emit^® 2000-Chinidin-Assay-Reagens B, bestehend aus einer gepufferten Lösung von Chinidin-G6PDH-Konjugat, gegeben. Die Küvetten wurden bei 37°C weitere 2 min und 40 s lang inkubiert, und dann wurden 20 μL des Chemilumineszenz-Indikators, enthaltend 12 nM NSP-DMAE4-BSA-Konjugat, 0,20 M Glycin, 1,0 % (G/V) BSA, pH = 7,4, zur endgültigen Inkubation zur endgültigen Inkubation bei 37°C über 5 min gegeben. Da der Assay homogen abläuft, wurden die Wäschen 1 und 2 sowie die Vakua 1, 2 und 3 weggelassen. Die Reaktionsmischungen wurden der Reihe nach mit den Bayer Diagnostics ACS-Reagenzien 1 (0,1 N HNO₃, 0,5 % (G/V) H₂O₂) und 2 (0,25 N NaOH, 0,5 % (G/V) N,N,N,N-Hexadecyltrimethylammoniumchlorid-Oberflächenmittel) vermischt, um die Chemilumineszenz-Reaktion auszulösen. Die Chemilumineszenzdaten wurden 5 s lang als mit einem ACS-Luminometer nachgewiesene Fotonen gesammelt und in relativen Lichteinheiten (RLUs) ausgedrückt.
Beispiel 8
Homogener chemiluminometrischer Enzym-Assay für Ethanol mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
In diesem automatisierten, homogenen Enzym-Assay wird Ethanol aus der Patientenprobe zu Acetaldehyd durch die spezifische Katalysewirkung einer festgelegten Menge von Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH) unter konkurrierender Hydrid-Reduktion des Cofaktors Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) zu NADH oxidiert. Das Gleichgewicht zu Gunsten der Oxidation von Ethanol zu Acetaldehyd wird noch weiter durch die Zugabe eines Hydrazidaldehyd-Fängers verschoben. Das Hydrid wird chemisch aus dem NADH auf das an BSA konjugierte NSP-DMAE übertragen. Infolgedessen steht die Ethanol-Konzentration in Korrelation zur NADH-Bildung und in umgekehrter Korrelation zur Rest-Chemilumineszenz der Assay-Reaktion.
Der folgende Assay wurde insgesamt mit dem Bayer Diagnostics ACS:180® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) durchgeführt. Die Küvetten wurden in ein Gestell und dann 10 μL von Standards, hergestellt durch Reihenverdünnung von Ethanol in Serum, in ihre jeweiligen Küvetten in Replikaten von 3 gegeben. Die Standards enthielten Ethanol in Konzentrationen von 0,00, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 und von 0,40 % (G/V). In jede Küvette wurden 150 μL Ethanol-Assay-Reagens A, enthaltend 0,15 M Natriumphosphat, 0,15 M Hydrazincarboxamid-Hydrochlorid, pH = 9,0, gegeben und bei 37°C 2 min und 40 s lang inkubiert. Dazu wurden 150 μL Ethanol-Assay-Reagens B, bestehend aus 22 mM Glycin, 12 mM NAD, 14 μM ADH, 1,0 mg/mL BSA, pH = 7,0, gegeben. Die Küvetten wurden bei 37°C weitere 2 min und 40 s lang inkubiert, und dann wurden 20 μL des Chemilumineszenz-Indikators, enthaltend 12 nM NSP-DMAE₄-BSA-Konjugat, 0,20 M Glycin, 1,0 (G/V) BSA, pH = 7,4, zur endgültigen Inkubation bei 37°C über 5 min gegeben. Da der Assay homogen abläuft, wurden die Wäschen 1 und 2 sowie die Vakua 1, 2 und 3 weggelassen. Die Reaktionsmischungen wurden der Reihe nach mit den Bayer Diagnostics ACS-Reagenzien 1 (0,1 N HNO₃, 0,5 % (G/V) H₂O₂) und 2 (0,25 N NaOH und 0,5 % (G/V) N,N,N,N-Hexadecyltrimethylammoniumchlorid-Oberflächenmittel) vermischt, um die Chemilumineszenz-Reaktion auszulösen. Chemilumineszenzdaten wurden 5 s lang als mit einem ACS-Luminometer nachgewiesene Fotonen gesammelt und in relativen Lichteinheiten (RLUs) ausgedrückt.
Berechnungsverfahren für Assay-Parameter
Arithmethische Mittelwerte für die RLUs aus einer spezifischen Analyt-Konzentration, hierin dargestellt als μ, wurden aus 3 Replikaten berechnet. Eine umgekehrte, nicht-lineare Beziehung besteht zwischen der im Standard vorhandenen Analyt-Konzentration und den nachgewiesenen RLUs:
worin x die Analyt-Konzentration und y das als RLUs erzeugte beobachtete Signal sind (David Rodbard; Ligand Analysis; (1981); J. Langon; J. Clapp (Hsg.); Masson Publishing Inc., New York; S. 45–101) (Barry Nix; The Immunoassay Handbook; (1994); David Wild (Hsg.); Stockton Press Inc., New York; S. 117–123) (Frederick Van Lente, Robert S. Galen; Enzymeimmunoassay; (1980), Edward T. Maggio (Hsg.); CRC Press Inc., Boca Raton; S. 135–153).
Außerdem gibt es 4 Parameter, nämlich die Regressionskonstante b, den Regressionskoeffizient m, das asymptotische Limit bei unendlicher Dosis y_∞ und das asymptoptische Limit für die Null-Dosis y₀. Die letzteren 3 dieser Parameter werden direkt mit der iterativen Standard-4-Parameter-Logistik (4PL-STD)-Analysenfunktion des DOSECALC.EXE Rev. 1.73-Programms (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA) berechnet. Das arithmetische Mittel der Regressionskonstante b wurde über den gesamten Bereich der Analyt-Konzentrationen bestimmt und aus dem Dosis-Reaktion-Ausdruck berechnet, umgeschrieben als:
Analyt-Konzentrationen unbekannter Mengen wurden anschließend mit der Dosis-Reaktion-Gleichung berechnet, aufgestellt aus
Theophyllin-, Chinidin- und Valproat-Assay-Standardkurven mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
Die Auftragung der RLUs gegen die Analyt-Konzentration stellt die umgekehrte, nicht-lineare Beziehung zwischen der Chemilumineszenz und der Analyt-Konzentration dar. Die Genauigkeit war mit unter 5 % C.V. für alle Punkte gut.
Ganz klar, fungieren Acridiniumverbindungen als chemilumineszierende Hydrid-Indikatoren entweder als freie Indikatoren, gelöst in organischen Lösungsmitteln, oder als hydrophile Konjugate, wenn sie kovalent an Protein gebunden sind.
Assay-Genauigkeit der Bestimmung von Theophyllin- und Valproat-Konzentrationen
Analyt-Konzentrationen wurden für die Ligand-Vergleiche mit der Standard-4PL-Funktion ermittelt. Die ermittelten Werte wurden mit erstellten Bereichen, aufgestellt in der einschlägigen Produktliteratur, wie dargestellt in 21, verglichen.
Abweichungen in spezifizierten Analyt-Bereichen zwischen unterschiedlichen Assaykonstrukten sind für eine Anzahl von Multi-Niveau-Ligand-Vergleichen wegen der unterschiedlichen Eignung für den Matrixeffekt beachtlich. Da akzeptable Bereiche von Analyt-Konzentrationen bisher noch nicht für das in der vorliegenden Erfindung beschriebene neue Assay-Format aufgestellt worden sind, sind Differenzwerte zu erwarten. Die ermittelten Werte sind genügend ähnlich zu berichteten Vergleichsgrenzwerten, so dass die Eignung einer Acridiniumverbindung als chemilumineszierender Hydrid-Indikator für die quantitative Bestimmung von Theophyllin und Valproat in einem homogenen Enzym-Immunoassay belegt ist.
Beispiel 9
Ethanol-Assay-Standardkurven mit Acridinium-Ester als Chemilumineszenz-Hydrid-Indikator
Die Auftragung der RLUs gegen die Analyt-Konzentration (siehe 22) stellt die umgekehrte, nicht-lineare Beziehung zwischen der Chemilumineszenz und der Analyt-Konzentration dar. Wie bei den chemiluminometrischen Emit^®-Assays war die Genauigkeit im Ethanol-Assay mit unter 5 % C.V. für alle Punkte gut.

Claims

Chemilumineszenz-Assayverfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Hydrid, wobei der genannte Assay die Messung der Chemilumineszenz-Menge umfasst, die aus einer chemilumineszierenden Verbindung in einer Reaktion erzeugt wird, in welcher die genannte chemilumineszierende Verbindung mit einem aus einer chemischen, biochemischen oder Enzym-katalysierten Reaktion erzeugten Hydrid reagiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die genannte chemilumineszierende Verbindung eine Acridinium-, Benzacridinium-, Phenanthridinium-, Chinolinium- oder eine Lucigeninverbindung oder das Konjugat der genannten Acridinium-, Benzacridinium-, Phenanthridinium-, Chinolinium- oder Lucigeninverbindung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das Hydrid mit dem Kern der genannten chemilumineszierenden Verbindung reagiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das genannte Hydrid mit dem Konjugat der genannten chemilumineszierenden Verbindung reagiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das genannte Hydrid mit einem Ester- oder Sulfonylamidderivat der genannten chemilumineszierenden Verbindung reagiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem das genannte Hydrid mit der genannten chemilumineszierenden Verbindung reagiert, enthaltend (a) ein verlängertes elektronisches Konjugationssystem, (b) ein Hydrid-reduzierbares Löschmittel, (c) eine oder mehrere Elektron-Spendergruppen oder (d) einen fluoreszierenden Resonanz-Energie-Akzeptor.
Verfahren zur Bestimmung der Menge von in einer Reaktion erzeugtem Hydrid, umfassend (a) Zugabe einer bekannten Menge einer fluoreszierenden Verbindung zur genannten Reaktionsmischung, (b) Messung der Chemilumineszenz-Menge, die aus der genannten Reaktionsmischung nach der Zugabe der Reagenzien abgegeben wird, welche die genannte Chemilumineszenz freisetzen, (c) Vergleich der erzeugten Chemilumineszenz-Menge mit der in Abwesenheit von Hydrid erwarteten Chemilumineszenz und (d) Berechnung der vorhandenen Menge des genannten Hydrids durch Vergleich mit einer Standardkurve.
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das genannte Hydrid in einem Assayverfahren für einen Analyt erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, in welchem die genannte chemilumineszierende Verbindung eine Acridinium-, Benzacridinium-, Phenanthridinium-, Chinolinium- oder Lucigeninverbindung oder das Konjugat der genannten Acridinium-, Benzacridinium-, Phenanthridinium-, Chinolinium- oder Lucigeninverbindung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, in welchem die genannte Acridinium- oder Benzacridiniumverbindung ein Acridinium-Ester oder Benzacridinium-Ester, ein Acridinium-Sulfonylamid oder Benzacridinium-Sulfonylamid sind.
Verfahren gemäß Anspruch 7, in welchem das genannte Hydrid in einer biochemischen Redox-Reaktion eines Enzym-Cofaktors erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, in welchem der genannte Cofaktor NAD⁺, NADP⁺, FMN oder FAD ist.
Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Analyts in einer Probe durch Bestimmung der in einer Reaktion erzeugten Hydrid-Menge, umfassend (a) Zugabe einer bekannten Menge einer chemilumineszierenden Verbindung zur genannten Reaktionsmischung, (b) Messung der Chemilumineszenz-Menge, die aus der genannten Reaktionsmischung nach der Zugabe von Reagenzien abgegeben wird, die die genannte Chemilumineszenz freisetzen, (c) Vergleich der erzeugten Chemilumineszenz-Menge mit der in der Abwesenheit von Hydrid erwarteten Chemilumineszenz und (d) Berechnung der vorhandenen Menge des genannten Analyts durch Vergleich mit einer Standardkurve.
Verfahren gemäß Anspruch 13, in welchem der genannte Analyt Theophyllin, Valproat, Chinidin oder Ethanol und die genannte Probe Serum sind.
Verfahren zur Chemilumineszenz-Bestimmung eines Analyts in einer Probe, umfassend (a) der Reihe nach erfolgende Zugabe zur genannten Probe der Reagenzien aus einem kolorimetrischen Assay für Hydrid und eines Chemilumineszenz-Hydrid-Indikators, (b) Messung der erzeugten Chemilumineszenz, und (c) Vergleich der erzeugten Lumineszenz mit einer Eichkurve zur Bestimmung der Analytmenge in der genannten Probe.
Kit, umfassend (a) die Reagenzien für einen kolorimetrischen Assay für Hydrid und (b) einen chemilumineszierenden Hydrid-Indikator.
Verfahren gemäß Anspruch 15, in welchem die genannte erzeugte Chemilumineszenz an einem automatisierten Chemilumineszenz-Analysengerät oder -Diagnosesystem gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13 zur Eliminierung der Interferenz aus dem Vorliegen von Gesamtblut, umfassend, vor der Chemilumineszenz-Messung, (a) die Zugabe einer festen Phase, die mit einem für eine Acridiniumverbindung spezifischen Antikörper überzogen ist, (b) Inkubation der Reaktionsmischung zum Einfangen der genannten Acridiniumverbindung, (c) Abtrennung der genannten festen Phase und Waschen der genannten abgetrennten festen Phase zur Entfernung der genannten interferierenden Substanzen.
Verfahren gemäß Anspruch 15 zur Eliminierung von Interferenz aus dem Vorliegen von Gesamtblut, umfassend, vor der Chemilumineszenz-Messung, (a) die Zugabe einer festen Phase, die mit einem für eine Acridiniumverbindung spezifischen Antikörper überzogen ist, (b) Inkubation der Reaktionsmischung zum Einfangen der genannten Acridiniumverbindung, (c) Abtrennung der genannten festen Phase und Waschen der genannten abgetrennten festen Phase zur Entfernung der genannten interferierenden Substanzen.