DE2913551A1

DE2913551A1 - Verfahren zur bestimmung eines analyten und reagens zu dessen durchfuehrung

Info

Publication number: DE2913551A1
Application number: DE19792913551
Authority: DE
Inventors: Zvi Harel; David J Litman; Edwin F Ullman
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1978-04-05
Filing date: 1979-04-04
Publication date: 1979-10-25
Also published as: AU4562979A; EP0022768B1; SE444086B; CA1140033A; SE7910042L; JPH0114541B2; FR2435716A1; GB2019562A; EP0022768A1; GB2019562B; IT1198432B; WO1979000882A1; FR2435716B1; IL57042A0; IL57042A; DE2966245D1; EP0022768A4; ES479278A1; AU531777B2; IT7948641A0

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Reagentien zur Durchführung von Proteinbindungstests, bei denen ein aus Ligand und Rezeptor für den Liganden bestehendes homologes Paar beteiligt ist. Beim erfindungsgemässen Verfahren wird ein an einen Bestandteil des homologen Paars gebundener Marker und eine gleichmässig dispergierte, diskontinuierliche Phase von diskreten Teilchen in einer kontinuierlichen wässrigen Phase verwendet, wobei die diskreten Teilchen Hikroumgebungsbereiche schaffen, die eine Unterscheidung zwischen dem mit den Teilchen markierten Harker (in einer diskontinuierlichen Phase) und dem Harker in der kontinuierlichen Phase erlauben. Erfindungsgemäss werden verschiedene Konjugate und Teilchen zur Verfügung gestellt, die für die Bestimmungsverfahren geeignet sind*

Die Messung von Spurenmengen verschiedenartiger organischer Verbindungen ist auf den Gebieten der Medizin, Ökologie, Qualitätskontrolle und dergleichen von grosser Bedeutung. Eine Gruppe von entsprechenden Bestimmungsverfahren, die im allgemeinen als Immunoassay oder Immuntest bezeichnet wird, hängt von der Verwendung einer Verbindung oder eines Rezeptors ab, der spezifisch eine andere Verbindung mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation bindet. Die Verbindung und ihr Rezeptor bilden ein homologes Paar,das als Ligand und Rezeptor bezeichnet wird, wobei es sich beim Rezeptor im allgemeinen um einen Antikörper handelt. Einer der Bestandteile des homologen Paars wird an einen Marker

909843/0705

Γ

gebunden, der zur Bildung eines nachweisbaren Signals in der Lage ist.

Bei der Entwicklung von Immuntests sind verschiedene Gesichtspunkte zu berücksichtigen, nicht zuletzt die Empfindlichkeit derartiger Tests. Zum Messen äusserst geringer Ligandenmengen ist es entweder notwendig, einen Marker zur Verfugung zu haben, der bei sehr geringen Konzentrationen mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann, oder für eine Mehrzahl von Ereignissen, die in Zusammenhang mit einem einzelnen Liganden stehen, zu sorgen. Ferner sind Störungen durch vorhandene Fremdbestandteile sowie das Ausmass, in dem diese Störungen verringert oder beseitigt werden können,, in Betracht zu ziehen.

Eine weitere Schwierigkeit bei Immuntests besteht in der Markierung, insbesondere wenn der Ligand oder Rezeptor unrein ist. Der "Hintergrund", der sich aus einer Bindung des Markers an Verbindungen, die nicht Bestandteil des homologen Paars sind, ergibt, muss möglichst gering gehalten werden, um eine ausreichende Empfindlichkeit des Tests zu erzielen. Weitere wichtige Gesichtspunkte sind die Einfachheit der Durchführung, die Leichtigkeit der Messung, die Reproduzierbarkeit sowie die Empfindlichkeit gegenüber Fremdfaktoren.

Nachstehend findet sich ein kurzer Überblick über den Stand der Technik:

Engasser und Horvath, berichten in Applied Biochem. Bioengineering, Academic Press, Bd. 1 (1976), S. 127 über kinetische und Diffusionseffekte auf die Immobilisierung von Enzymen.

In der US-PS 3 817 837 ist ein homogener Snzymimmuntest beschrieben. Die US-PS 3 996 3^5 betrifft einen homogenen Immuntest unter Verwendung von zwei Chromophoren, die als Fluoreszenzerreger und Quencher miteinander in Beziehung stehen. In der DE-OS ist ein homogener Immuntest

unter Verwendung einesnicht-enzymatischen Katalysators als Marker beschrieben. Aus der DE-OS geht ein homogener Immuntest unter Verwendung eines Enzymsubstrats als

L 909843/0705 J

γ -ι

Marker hervor. Die US-PS 3 853 98? beschreibt Teilchen, an die radioaktive und fluoreszierende Marker und Antikörper gebunden sind; vgl. auch US-PS 4· 001 400.

Erfindungsgemäas werden Verfahren und Reagentien zur Bestimmung eines Analyten, der ein Bestandteil eines spezifischen bindenden Paars (Ligand und homologer Rezeptor) ist, zur Verfügung gestellt, wobei zur Bestimmung keine Abtrennung erforderlich ist. Das erfindungsgemässe Verfahren beruht nicht auf einer Massenwirkung, bei der die Summe der Signale von Markern assoziierter Bestandteile beobachtet werden. Vielmehr beruht dieses Verfahren auf einer Verstärkung oder Verringerung des Signals als Ergebnis einer Assoziation. Beim erfxndungsgemassen Verfahren wird eine im wesentlichen gleichmässig dispergierte diskontinuierliche Phase von diskreten, festen (unter Einschluss von mit Lösungsmittel gequollenen) Teilchen (Perlen) in einem wässrigen Testmedium verwendet. Die Teilchen sind mit einem der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars markiert.

Die Teilchen schaffen eine physikalische oder chemische Umgebung, die von der kontinuierlichen wässrigen Phase deutlich verschieden ist. Ein signalbildendes System wird zur Verfügung gestellt, das ein wesentlich unterschiedliches Ausmass eines nachweisbaren Signals in Abhängigkeit davon, ob das signalbildende System in der festen oder flüssigen wässrigen Phase arbeitet,hervorruft. Setzt man die Verteilung zwischen der festen und flüssigen Phase des signalbildenden Systems zur Analytenmenge im Testmedium in Beziehung, so ist das beobachtete Signal eine Punktion der Analytenmenge im Testmedium.

Ferner werden erfindungsgemäss !Conjugate an Teilchen sowie Reagentien und Testpackungen zur Verfügung gestellt, die beim erfxndungsgemassen Verfahren verwendet werden können. Ferner betrifft die Erfindung auch spezielle Verbindungen, die sich als Substrate im erfxndungsgemassen Verfahren eignen.

^L 909843/0705 -i

Das erfindumgsgemässe Verfahren lässt sich zur Bestimmung von organischen Verbindungen in geringen Konzentrationen in verschiedensten Medien und insbesondere zur Bestimmung von Verbindungen mit physiologischer Aktivität, die entweder natürlich in physiologischen Flüssigkeiten vorkommen oder an Vertebraten verabfolgt werden, anwenden. Beim erfindungsgemässen Verfahren vrird als Testmedium eine kontinuierliche flüssige wässrige Phase und eine diskontinuierliche feste Phase aus diskreten, kleinen Teilchen mit relativ langsamen Absetzgeschwindigkeiten, die in der Lage sind, eine Umgebung zu schaffen, die sich von der Umgebung der kontinuierlichen Phase unterscheidet, verwendet.

Bei den Teilchen handelt es sich um diskrete, feste Perlen, die eine Umgebung für einen Marker schaffen, die sich von der Umgebung des Grossteils der Lösung unterscheidet. Vorzugsweise sind die Teilchen porös und weisen Kanäle oder Einkerbungen auf der Oberfläche von wesentlicher Tiefe auf, wobei die flüssige Umgebung im Kanal oder in der Einkerbung durch die diese Umgebung im wesentlichen einschliessende feste Phase deutlich beeinflusst wird. Ferner wird erfindungsgemäss ein signalbildendes System zur Verfügung . gestellt, das ganz oder teilweise zwischen den beiden Phasen verteilt ist, wobei der Verteilungsgrad von der Menge des im Testmedium vorhandenen Analyten abhängt. Da das beobachtete Signal in Abhängigkeit von dem Ausmass, von dem das signalbildende System zwischen der flüssigen und der festen Phase verteilt ist, sich stark unterscheidet, lässt das gemessene Signal einen Rückschluss auf die Analyten-

³⁰ menge im Testmedium zu.

Der Analyt ist ein Bestandteil eines spezifischen bindenden Paars, das aus dem Liganden und seinem homologen Rezeptor besteht. Die Teilchen oder Perlen der festen Phase sind direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent an einen der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars

909843/0705

γ -ι

gebunden. Eine Ausnahme ist dann gegeben, wenn es sich, beim Analyten um eine spezielle Art von Rezeptor für einen speziellen Liganden handelt. In diesem Fall sind drei spezifische bindende Bestandteile erforderlich, nämlich Rezeptor, Antirezeptor oder Ligand, gegebenenfalls an die Teilchen gebunden, und Ligand bzw. Antirezeptor, zur weiteren Markierung . Somit ermöglicht der Rezeptor als Analyt eine Anzahl von alternativen Konjugaten. Ferner ist einer der Bestandteile des signalbildenden Systems an den reziproken Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebunden oder wird daran gebunden. Durch entsprechende Wahl der speziellen !Conjugate des bindenden Paars, kann die Menge des an die Teilchen gebundenen signalbildenden Bestandteils in Beziehung zur Analytenmenge im Testmedium

¹⁵ gebracht werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden eine analythaltige Probe, die markierten Teilchen, der markierte Bestandteil des spezifischen bindenden Paars sowie beliebige weitere Reagentien vereinigt, worauf das im Testmedium entstehende Signal bestimmt wird. Durch. Vergleich des beobacb-teten Signals mit einem Signal, das in einem Testmedium mit bekannter Analytenmenge erhalten wird, lässt sich eine qualitative oder quantitative Bestimmung des in Frage stehenden Analyten durchführen. Die Eigenschaften der diskreten Teilchen können auf verschiedene Weise ausgenutzt werden. Es wird eine willkürliche Einteilung in zv/ei Gruppen vorgenommen: (1) Diffusion und (2)

physikalische Effekte. 30

Durch, entsprechende Wahl der porösen Teilchen lässt sich, die Geschwindigkeit, mit der sich ein Molekül oder eine molekulare Anordnung durch das Volumen der flüssigen Phase in der Uähe der Oberfläche der festen Teilchen bewegt, beeinflussen. Die räumliche Ausdehnung und die engen Kanäle der Teilchen bewirken eine Verringerung der Wanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls oder einer molekularen An-

^L 909843/0705 -J

Γ "1

Ordnung in Richtung zu und von den Oberflächen der Teilchen weg, verglichen mit der Wanderungsgeschwindigkeit im Grossteil der Lösung. Diese Geschwindigkeitsverringerung beruht auf physikalischen Zwängen. Somit lässt sich ein wesentlicher Konzentrationsgradient zwischen dem Grossteil der flüssigen wässrigen Phase und dem Flüssigkeitsanteil in der Nähe der Oberfläche der festen Phase schaffen. Ein signalbildendes System, das gegenüber der Konzentration einer Spezies empfindlich ist, ergibt im Grossteil der flüssigen Phase ein Signal, das sich von dem in der festen Phase deutlich unterscheidet.

Aufgrund der Tatsache, dass zwei kooperierende Bestandteile des signalbildenden Systems vorhanden sind, d.h. dass ein Bestandteil eine Verbindung bereitstellt, die mit dem zweiten Bestandteil zusammenwirkt, lässt sich die lokalisierte Konzentration der Verbindung in der festen Phase im Vergleich zum Grossteil der flüssigen Phase stark erhöhen. In diesen Fällen ist das Teilchen nicht nur mit einem Bestandteil des spezifischen bindenden Paars markiert, sondern auch ein Bestandteil des signalbildenden Systems.

Die zweite Wirkung ist eine physikalische, aufgrund der chemischen Natur der Teilchen. Die physikalische Wirkung macht sich im pH-Wert, den spektroskopischen Eigenschaften und dergleichen bemerkbar. Tatsächlich ist für ein Nolekül die durch die Teilchenoberflächen, insbesondere in den Kanälen oder Poren, geschaffene Umgebung wesentlich von der Umgebung im Grossteil der Lösung unterschieden. Wenn der signalbildende Bestandteil gegenüber dieser Umgebung empfindlich ist, ergibt sich ein wesentlicher Unterschied im Signal, je nachdem, ob der signalbildende Bestandteil in der festen Phase oder im Grossteil der Lösung ist. Beispielsweise ist die Aktivität eines Enzyms pH-abhängig. Bei entsprechender Wahl von Puffer oder einem Ionenaustauscherharz kann der pH-Wert an der Oberfläche der festen Phase sich stark vom pH-Wert im Grossteil der Lösung unterscheiden. Die enzymatische

L 909843/0705 -J

γ -ι

Aktivität hängt somit von der Verteilung des Enzyms zwischen den beiden Phasen ab.

Bei Verwendung von hydrophoben Teilchen kann die Polarität zwischen den Teilchen und dem Grossteil der Lösung stark variieren. Der hydrophobe Charakter kann ein Enzym oder ein Chromogen, beispielsweise einen Fluoreszenzerreger, aktivieren oder inaktivieren.

Ein Beispiel für die Spektroskop is ehe Wirkung besteht in der Verwendung von undurchsichtigen, durchsichtigen oder teilweise durchsichtigen (innerhalb eines begrenzten Wellenlängenbereichs) Teilchen. Man kann somit das eingetretene oder die Teilchen im angeregten Zustand verlassende Licht kontrollieren. Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung von mit Phosphoreszenzerregern markierten (einschliesslich eingebetteten) Teilchen, oder Teilchen mit Markern, die in der Lage sind, Energie auf ein Chromogen zu übertragen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind mindestens zwei ßeagentien vorhanden: Das Teilchenkonjugat und das Konjugat des Bestandteils des spezifischen bindenden Paars. Diese Konjugate variieren je nach der Art des Analyten, der Art des signalbildenden Systems und der Art der Teilchen. Ferner lässt sich durch kovalent bindende Moleküle, insbesondere durch Bindung von Enzymen an die Teilchen, ein Konzentrationsgradient herstellen, wobei der Grossteil der Lösung eine relativ geringe Konzentration an der speziellen Verbindung oder dem Enzymprodukt aufweist. Diese Moleküle können zum signalbildenden System gehören oder lediglich eine Umgebung erzeugen, die das signalbildende System beeinflusst.

Nachstehend werden kurze Definitionen für hier verwendete Ausdrücke gegeben:

909843/0705

Analyt:

Zm messende Verbindung oder Zusammensetzung. Es kann sich VM einen mono- oder polyepitopen, antigenen oder haptenisclien Liganden, eine oder mehrere Verbindungen, die minder stens ein gemeinsames epitopes Zentrum aufweisen, oder einen Hezeptor handeln.

Spezifisches bindendes Paart

Zwei verschiedene Moleküle, von denen ein Molekül einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung aufweist, der eine spezifische Bindung zu einer bestimmten räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls eingeht. Die Bestandteile des spezifischen bindenden Paars werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet.

Ligaad;

Beliebige Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.

²⁰ Rezeptor (Antiligand);

Beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines Moleküls, beispielsweise ein epitopes Zentrum, zu erkennen. Beispiele für natürlich vorkommende Rezeptoren sind Thyroxin bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Pragmente und Lectine.(epitopes Zentrum = "epitopic site" - epitope Stelle).

Ligandenanaloges s

Modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation die Möglichkeit zur Bindung eines Ligandenanalogen an ein anderes Molekül ermöglicht. Das Ligandenanaloge unterscheidet sich vom Liganden im allgemeinen stärker als durch Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, die das

Ligandenanaloge an einen "hub"-Kern oder Marker bindet.

909843/0705

Γ Π

t P oly-(ligandenanaloge s):

Eine Mehrzahl von kovalent aneinander gebundenen Liganden oder Ligandenanalogen, in der Regel an einen "huV-Kern, d.h. eine Verbindung mit einer Mehrzahl von funktionelien Gruppen, wie Hydroxyl-, Imino-, Mercapto- und äthylenisehe Gruppen, als Bindungsstellen. Der hub-Kern kann wasserlöslich oder unlöslich (vorzugsweise wasserlöslich) sein und weist im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens etwa 35 000 bis 10 Millionen oder mehr auf. Vorzugsweise liegt das Molekulargewicht unter 600 000 und insbesondere unter 300 000. Beispiele für hub-Kerne sind Polysaccharide, Polypeptide, einschliesslich Proteine, Nucleinsäuren und Ionenaustauscherharze. Als wasserunlösliche hub-Kerne kommen die gleichen Kerne,die vorstehend bei den Teilchen ange-

15 geben sind, in Frage.

Teilchen (feste Phase);

Bei den Teilchen handelt es sich um diskrete, feste Teilchen, die durch die flüssige Phase in einen gequollenen Zustand übergehen können oder ungequollen bleiben können.

Die Teilchen können aus verschiedenen hydrophoben oder hydrophilen Bestandteilen bestehen. Die Teilchen sind fest, hohl oder porös, weisen eine im wesentlichen glatte oder unregelmässige Oberfläche auf, haben eine vorwiegend konkave oder konvexe Oberfläche, sind vorzugsweise porös und haben Kanäle oder Einkerbungen, die stark in bezug auf die Grosse des Moleküls oder der Anordnung, die ausgeschlossen wird,/ * und definieren eine vom Medium, in dem die Teilchen dispergiert sind, unterschiedliche Umgebung. Die Teilchen lassen sich leicht in einem wässrigen Medium dispergieren. Sie sind entweder polyfunktionell oder es besteht die Möglichkeit, ' eine Mehrzahl von polyfunktionellen Gruppen zur Bindung an andere Moleküle einzuführen (Polyfunktionalisierung). Je nach dem signalbildenden System können die Teilchen für Licht in einem beträchtlichen Wellenlängenbereich von bis 800 run, vorzugsweise innerhalb des ganzen Bereichs, durchlässig sein oder sie können im gesamten UV- oder sicht-

^L ' 909843/0705

Γ "I

* baren Bereich undurchlässig sein.

Signalbildendes System:

Das signalbildende System kann einen oder mehrere Bestandteile aufweisen, wobei mindestens ein Bestandteil an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebunden ist. Das signalbildende System erzeugt ein messbares Signal, das durch äussere Mittel, üblicherweise durch Messung von elektromagnetischer Strahlung, nachweisbar ist. Das Signal hängt vom verwendeten System ab. Die Stärke bzw. das Ausmass des Signals variiert in dem Mass, als sich das signalbildende System in der Umgebung der Teilchen der festen Phase befindet. In den meisten !Fällen sind am signalbildenden System Enzyme und Chromophoren beteiligt, wobei zu den Chromophoren Farbstoffe, die Licht im UV- oder sichtbaren Bereich, absorbieren, phosphoreszierende, fluoreszierende und chemilumineszierende Verbindungen gehören. In den meisten Fällen handelt es sich bei dem Signal zweckmässigerweise um die Absorption oder Emission von elektromagnetischer Strahlung, im allgemeinen im UV- oder sichtbaren Bereich, es können jedoch auch elektrochemische Änderungen, thermische Änderungen, nephelometrische Änderungen und dergleichen Anwendung finden.

²⁵ Marken

Beim Marker kann es sich um ein beliebiges Molekül handeln, das an ein anderes Molekül gebunden ist. Zu welchem Molekül der Marker gehört, unterliegt einer willkürlichen Wahl. Erfindungsgemäss handelt es sich bei den Markern um das Molekül des spezifischen bindenden Paars, das an die Teilchen konjugiert ist, oder um ein Molekül, das Teil des signalbildenden Systems ist und das an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars oder an Teilchen gebunden ist.

³⁵ Teilchenkon,jugat;

Die Teilchen, an die direkt oder indirekt ein Bestandteil des spezifischen bindenden Paars und gegebenenfalls einer

^L 909843/0705

Γ ■ ■

oder mehrere Bestandteile des signalbildenden Systems gebunden sind. Ein wesentlicher Anteil der an die Teilchen gebundenen Marker wird durch die Teilchenoberf lache, im allgemeinen innerhalb von Kanälen und Poren der Teilchen₉ beeinflusst, wenn diese anwesend sind, so dass bei einer Bindung des signalbildenden Bestandteils an die Seuchen sich eine Eigenschaft des Kongugats ergibt, die eine Differenzierung des von den Teilchen erhaltenen Signals im Vergleich zum Signal vom Grossteil der Lösung ermöglichte

Bindendes Paar-Marker;

Ein Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, der zur Bindung des homologen Bestandteils an die Teilchen, der direkt an die Teilchen gebunden ist^ verwendet wird»

Signal-Marker:

Ein Bestandteil des signalbildenden Systems, der direkt oder indirekt (durch die Bindung eines spezifischen bindenden Paars) an einen Bestandteil des bindenden Paars oder

20 an die Teilchen gebunden ist»

Bestandteil des bindenden Paars-Kon.jugat oder Signal-Marker-Kon_tjugat;

Konjugat des Bestandteils des bindenden Paars mit einem Bestandteil des signalbildenden Systems (Signal-Marker)»

Markierter Ligand;

Konjugat des Ligandenbestandteils des spezifischen bindenden Paars mit einem Bestandteil des signalbildenden Systems, entweder kovalent oder nicht-kovalent gebunden, wobei bei kovalenter Verbindung eine Verknüpfung über eine Bindung, eine verknüpfende Gruppe oder einen hub-Kern vorliegt. Der markierte Ligand kann einen oder mehrere Liganden (unter Einschluss von Ligandenanalogen) oder einen oder mehrere Marker oder eine Mehrzahl von beiden aufweisen, wobei die letztgenannte Möglichkeit als Poly-(ligandenanaloges^Polymarker bezeichnet wird.

L 908S43

Γ I

^ Markierter Heaiaptor;

Das Konjugat des Eezeptors mit einem Bestandteil des signal- Mldenden Systems, wobei beide entweder !covalent oder nichtkovalent gebunden sind, im allgemeinen !covalent über eine verknüpfende Gruppe, wobei einer oder mehrere Eezeptoren an den Marker gebunden sein können, aber im allgemeinen einer oder mehrere Marker an den Rezeptor gebunden sind.

Makromolekulares Reagens:

Ein Reagens,das in der Lage ist, mit einem Bestandteil des signalbildenden Systems unter Modulierung des Signals zu reagieren und das zumindest teilweise sterisch an einer Wechselwirkung mit einem Bestandteil des signalbildenden Systems in der Umgebung des Teilclienkonjugats durch sterisehe Hinderung oder durch verminderte Diffusionsgeschwindigkeiten gehindert ist. Das Reagens weist im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens etwa 20 000, vorzugsweise mindestens etwa 40 000 und insbesondere mindestens etwa 100 000 auf. Das Reagens kann bereits auf natürliche Weise über ein derartiges Molekulargewicht verfugen oder es kann eine aktive Verbindung an einen hub-Kern gebunden werden, um das gewünschte Molekulargewicht zu erreichen.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird in einer wässrigen Zone bei einem massigen pH-Wert, im allgemeinen in der Sfähe des pH-Werts, der eine optimale Testempfindlichkeit ermöglicht, ohne Abtrennung der Testbestandteile oder Produkte durchgeführt. Die Testzone zur Bestimmung eines Analyten wird unter Verwendung folgender Bestandteile hergestellt: Ein entsprechendes wässriges Medium, das normalerweise gepuffert ist, die unbekannte Probe, die einer Vorbehandlung unterzogen worden sein kann, das Teilchenkonjugat, das Konjugat des Bestandteils des bindenden Paars, sämtliche für das signalbildende System zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals erforderlichen Bestandteile sowie je nach Bedarf die Bestandteile des spezifischen bindenden

909843/070$

Γ . I

1 Paars oder deren Analoge.

Die Gegenwart eines Liganden oder von dessen homologem Rezeptor (Antiligand) in der unbekannten Probe "beeinflusst die Verteilung des signalbildenden Systems zwischen den Teilchen oder der festen Phase und dem Grossteil der Lösung im Testmedium.

Bei der Durchführung des Tests wird im allgemeinen ein wässriges Medium verwendet. Es können auch andere polare Lösungsmittel vorhanden sein, im allgemeinen sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und insbesondere mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen, wie Alkohole und Äther. Im. allgemeinen sind diese Kolösungsmittel in Konzentrationen von weniger als etwa 40 Gewichtsprozent und insbesondere weniger als etwa 20 Gewichtsprozent vorhanden.

Der pH-Wert des Mediums liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 4- bis 11, vorzugsweise etwa 5 bis 10 und insbesondere etwa 6,5 bis 9»5· Der pH-Wert wird so gewählt, dass ein signifikantes Ausmass an spezifischer Bindung durch den Rezeptor aufrechterhalten wird, während die signalbildende Wirkung optimiert wird. In einigen Fällen wird ein Kompromiss zwischen diesen beiden Gesichtspunkten eingegangen. Zur Einstellung des gewünschten pH-Werts und zur Aufrechterhaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele für entsprechende Puffer sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer. Die Art der verwendeten Puffer ist nicht kritisch, jedoch können bei bestimmten Tests bestimmte Puffer bevorzugt sein.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Tests werden im allgemeinen massige Temperaturen angewendet. Die Temperatüren bleiben im allgemeinen während der Messdauer, insbesondere bei Geschwindigkeitsbestimmungen, konstant. Vorzugsweise liegen die Temperaturen bei etwa 10 bis 50⁰C und

.9-09*43/6706-

Γ . ■

1 insbesondere bei etwa 15 Ms 40⁰C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Analyten beträgt im allgemeinen etwa 10" bis 10" ^m und insbesondere etwa 10 bis 10" ^ m. Diese Gesichtspunkte, die beispielsweise die qualitative, halb-quantitative oder quantitative Versuchsdurchführung, das spezielle Nachweisverfahren und die Analytenkonzentration betreffen, beeinflussen im allgemeinen die Konzentration der anderen Reagentien. 10

Obgleich die Konzentrationen der verschiedenen Eeagentien im Testmedium im allgemeinen durch den Konzentrationsbereich des in Präge stehenden Analyten bestimmt wird, wird die endgültige Konzentration der einzelnen Eeagentien normalerweise empirisch festgelegt, um die Empfindlichkeit des Tests im in Frage stehenden Bereich zu optimieren. Die Gesamtzahl der bindenden Stellen der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars, die zum Analyten reziprok sind, beträgt mindestens etwa das 0,1-fache der interessierenden Minimalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen des Analyten,und im allgemeinen höchstens etwa das 1000-fache der in Frage stehenden Maximalkonzentration, bezogen auf analytenbindende Stellen, vorzugsweise das etwa 0,1- bis 100-fache und insbesondere das etwa 0,3- bis 10-fache der interessierenden Maximalkonzentration. Unter Konzentration ist die zur Verfugung stehende Konzentration zu verstehen, d.h. die Konzentration bei Sättigung und nicht notwendigerweise die tatsächliche Konzentration, wobei Bestandteile des spezifischen bindenden Paars möglicherweise nicht in glei-

30 chem Umfang zur Bindung zur Verfugung stehen.

Je nach dem speziellen signalbildenden System sowie nach der Art, in der die Bestandteile des spezifischen bindenden Paars verwendet werden, kann die Menge der verschiedenen Κοη,-jugate stark variieren. Beispielsweise können grosse Überschüsse des bindenden Paar-Markers im Teilchenkonjugat vorliegen, indem man das Konjugat des Bestandteils des

L J

909843/0705

Γ "J

-²⁹~ . 2913531

"bindenden Paars zunächst mit der unbekannten Probe reagieren lässt und anschliessend mit dem Teilchenkonjugat vereinigt. Bei Am-rendung einer kompetitiven Verfahrensweise, bei dem das Teilchenkonjugat und das Konjugat des Bestandteils des bindenden Paars gleichzeitig zur unbekannten Probe gegeben werden, können grosse Überschüsse des bindenden Paar-Markers die Testempfindlichkeit verringern. Wie bereits erwähnt, erhält man bei Verwendung von verschiedenen Konzentrationen der verschiedenen Reagentien bei Vorliegen des Analyten in Konzentrationen innerhalb des interessierenden Bereichs Verhältnisse, die die Testempfindlichkeit optimieren.

Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Eeagentien kann stark variieren und hängt von den speziellen Markern, der Verbindung, an die der Marker gebunden wird, der Art der !Conjugate, der Art des Analyten und den relativen Konzentrationen von Analyt und Reagentien ab. Die Reihenfolge der Zugabe kann auch dadurch beeinflusst werden, ob eine Gleichgewichts- oder eine Geschwindigkeitsmessung vorgenommen wird.

Da bei vielen Rezeptoren die Assoziation der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars während der Testdauer fast irreversibel ist, vermeidet man im allgemeinen eine Kombination des Teilchenkonjugats mit dem signalbildenden Konjugat vor der Analytenzugabe, wenn die beiden Könjugate sich von reziproken Bestandteilen des spezifischen bindenden Paars ableiten. Leiten sich im Gegensatz dazu die beiden Konjugate vom gleichen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars ab, so können die beiden Konjugate vor Einbringen der unbekannten Probe in das Testmedium vereinigt werden. Unabhängig von der Art des Analyten können sämtliche Reagentien gleichzeitig zugesetzt und entweder mit Hilfe einer Geschwindigkeits- oder Gleichgewichtsmessung bestimmt werden.

909843/0705

Γ -Ι

_ 30 -

Bei der Herstellung des Testmediums können eine oder mehrere Inkubationsstufen vorgenommen, werden. Beispielsweise kann es erwünscht sein, einen Antigenanalyten mit markiertem Eezeptor zu inlcubieren. Ferner kann es erwünscht sein, eine ^s zweite Inkubation nach Zusatz der Teilchenkonjugate vorzunehmen. Die Durchführung einer Inkubation und die Länge der Inkubationsdauer hängen wesentlich von der Bestimmungsart (Geschwindigkeits- oder Gleichgewichtsbestimmung) und der Bindungsgeschwindigkeit von Eezeptor an Ligand ab. Im allgemeinen variiert die Dauer der Inkubationsstuf en von etwa 0,5 bis 6 Stunden und vorzugsweise von etwa 5 Minuten bis 1 Stunde. Die Inkubationstemperatüren liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 4 bis 50⁰C und insbesondere etwa 15 bis 37°C

Mach der Kombination der Eeagentien wird das Signal bestimmt Als Bestimmungsverfahren kann die Beobachtung von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere UY- oder sichtbares Licht, dienen. Es können aber auch Absorptions- oder Emissionsverfahren-, colorimetrische, elektrochemische, nephelometrische oder ähnliche Verfahren herangezogen werden. Vorzugsweise wird das Signal als elektromagnetische Strahlung im UV- oder sichtbaren Bereich, vorzugsweise von etwa 250 bis 750 nm und insbesondere von etwa 350 bis 650 nm, abgelesen.

Die Temperaturen, bei denen das Signal beobachtet wird, liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 50⁰C und

insbesondere etwa 15 bis A-O⁰C.
30

Eichtestmedien mit bekannter Analytenkonzentration lassen sich herstellen. Die bei diesen Eichtestmedien beobachteten Signale werden dann aufgetragen, um eine Relation zwischen Konzentration und Signalintensität herzustellen. Nach Aufstellung einer derartigen Eichkurve kann ein Signal direkt mit der entsprechenden Analytenkonzentration in Beziehung gesetzt werden.

L _

909843/870S

γ -ι

Die Zeit für die Messung des Signals hängt davon ab, ob eine Geschwindigkeits- oder Gleichgewichtsbestimmung vorgenommen wird. Ferner hängt die Messzeit von der erforderlichen Empfindlichkeit und der Art des signalbildenden Systems und von ahn liehen Faktoren ab. Bei einer Geschwindigkeitsbestimmung variiert die Zeitdauer zwischen den Ablesungen von etwa 5 Sekunden bis 6 Stunden und im allgemeinen etwa 10 Sekunden bis 1 Stunde. Bei Gleichgewichtsmessungen wird eine Messung nach Erreichen eines stationären Zustande vorgenommen. Hierfür kann eine einzige Messung ausreichen. Es können aber auch zwei Messungen innerhalb eines entsprechenden Zeitraums vorgenommen werden.

Der Ligand kann mono- oder polyepitop sein. In den meisten Fällen beeinflusst dieser Unterschied die Art der Testdurchführung nicht. Handelt es sich bei dem Analyten um einen Liganden, so kann der Bestandteil des spezifischen bindenden Paars im Teilchenkonjugat entweder ein Ligand oder ein Eezeptor sein. Das Konjugat des Bestandteils des bindenden Paars (enthält den Signalmarker) kann entweder einen Liganden oder einen Eezeptor aufweisen. Wenn jedoch sowohl das Teilchenkonjugat als auch das Konjugat des Bestandteils des bindenden Paars einen Rezeptor aufweist, muss der Ligand polyepitop sein oder in diesen Zustand gebracht werden, indem man ein Poly-(ligandenanaloges) als zusätzliches Reagens verwendet. Das heisst, es wird ein Sandwich-Verfahren angewendet, bei dem der Ligand eine Bindung mit dem Teilchenkonjugat eingeht und epitope Zentren zur Bindung des Konjugats des Bestandteils des bindenden Paars an das Teilehenkonjugat zur Verfügung stellt.

Handelt es sich bei dem Analyten um den Rezeptor, so können das Teilchenkongugat und das Kongugat des Bestandteils des bindenden Paars die gleichen oder verschiedene Bestandteile des spezifischen bindenden Paars aufweisen, mit der Massgabe, dass der Rezeptor polyvalent ist, wenn der Ligand in beiden Konjugaten beteiligt ist.

9098437Ö705 ~*

Pur den Pall, dass der Analyt und die beiden Kongugate den gleichen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars aufweisen oder diesen enthalten, muss der homologe Bestandteil zugesetzt und in polyepitoper lorm zur Verfugung gestellt werden, entweder in Porm eines Antikörpers oder in Form eines polyvalenten Rezeptors, falls es sich um den Rezeptor handelt, oder in Form eines Polyhaptens (PoIy-(Iigandenanaloges)), sofern es sich um einen Liganden handelt.

Wenn ein einziger Bestandteil des signalbildenden Systems als Marker verwendet wird, beeinflussen eine oder mehrere Eigenschaften des Teilchens dac Ausmass des Signals. Wenn zwei Enzyme oder ein Enzym und eine Kombination von verwandten Chromophoren beteiligt sind, üben die Teilchen, wenngleich auch deren andere Eigenschaften eine gewisse Wirkung haben, ihre Hauptwirkung auf die Diffusionsgeschwindigkeit eines Enzymprodukts aus. In ähnlicher Weise liegt bei Beteiligung eines grossen Substrats oder eines grossen Inhibitors oder Quenchers die Hauptwirkung der Teilchen in der Beeinflussung der Geschwindigkeit, in der Substrat, Inhibitor oder Quencher zum Signal-Marker-Kongugat, das an die Teilchen gebunden wird, diffundieren.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich auch zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit einer Mehrzahl von Analyten, d.h. von zwei oder mehr, wenn das signalbildende System mindestens eine gleiche Anzahl von Bestandteilen aufweist, die in einer additiven oder sukzessiven Weise in Wechselwirkung treten. Die Situation lässt sich für zwei Antigenanalyten erläutern. Durch Bindung von Antikörpern für die Antigenanalyten an die Teilchen und durch Konjugation des Antikörpers für einen Antigenanalyten an.Enz^ sowie durch Konjugation des Antikörpers für den anderen Antigenanalyten an Enzo, wobei Enz^ und Enzo Enzyme sind und das Substrat von Enz2 das Produkt von Enz^ ist, und durch Messen des Produkts von Enz2_? ergibt sich eine verstärkte Bildung des

909843/Q70S

^f -33 - ^π

Enz2~I⁾rodukts, wenn beide Enzyme durch die Vermittlung der Antigene an die Teilchen gebunden sind. Die beiden Enzyme können nur an die Teilchen gebunden werden, wenn beide Antigene im Testmedium vorhanden sind. Die Situation lässt sich mit polyvalenten Eezeptoranalyten oder bei Verwendung verschiedener Kombinationen umkehren.

Diese Verfahrensweise kann auch von dem Gesichtspunkt aus betrachtet werden, dass der zweite Analyt, der Signalmarker und die assoziierten Reagentien Teiledes signalbildenden Systems darstellen, das mit den Bestandteilen des signalbildenden Systems, das mit dem ersten Analyten unter Bildung eines Signals assoziiert ist, zusammenwirkt. Es ist jedoch festzuhalten, dass diese Anwendungsart die Anwesenheit von beiden Analyten nachweist, ohne dass die einzelnen Konzentrationen der beiden Analyten bestimmt werden.

Besteht die Hauptwirkung der Teilchen darin, eine Umgebung für das signalbildende System zu schaffen, die sich deutlieh vom Grossteil der Lösung unterscheidet, ist nicht nur auf die Wirkung der unterschiedlichen Umgebung auf das signalbildende System, sondern auch auf die Assoziierung des spezifischen bindenden Paars zu achten. In den meisten Fällen variiert der Assoziationsgrad oder die Bindungskonstante über relativ breite pH-Bereiche und dergleichen nicht signifikant. Obgleich die Wirkung der Umgebung der Teilchen auf die Assoziation des spezifischen bindenden Paars die Ergebnisse nicht signifikant beeinflusst, sollte diese Wirkung

nicht vernachlässigt werden. 30

Zur Testdurchführung werden folgende Bestandteile verwendet: Das Teilchenkonjugat, das oder die Konjugate der Bestandteile des bindenden Paars und die restlichen Bestandteile des signalbildenden Systems sowie der Analyt und gegebenenfalls Poly-Cligandenanaloges) und polyvalenter Rezeptor.

Zur Herstellung der Reagentien werden Teilchen oder Kügelchen (Perlen) und Bestandteile des signalbildenden Systems verwendet.

909843/Q705

Γ I

¹ Analyt;

Die erf indungsgemässen Ligandenanalyten können monoepitop oder polyepitop sein. Bei den polyepxtopen Ligandenanalyten handelt es sich normalerweise tun Polyaminosäuren, d.h. PoIypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und Kombinationen davon. Beispiele für entsprechende Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.

In den meisten Fällen weisen die polyepxtopen. Ligandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 und insbesondere mindestens etwa 10 000 auf. In der Gruppe der Polyaminosäuren beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen etwa 5000 bis 5 Million und vorzugsweise etwa 20 000 bis 1 Million. Bei den Hormonen liegt das Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von etwa 5000 bis 60 000.

Das Molekulargewicht von monoepitopen Ligandenanalyten beträgt im allgemeinen etwa 100 bis 2000 und insbesondere bis 1000. Beispiele für in Frage kommende Analyten sind Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltverschmutzende Substanzen. Beispiele für Arzneistoffe sind Alkaloide, insbesondere Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte, Kokainalkaloide, wie Kokain und Benzoylecgonin sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte, Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediäthylamid, Steroidalkaloide, Iminazoylalkaloide, Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide, Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin, Diterpenalkalo-

³⁰ ide sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Steroide, zum Beispiel die Östrogene, Gestagene, Androgene, Eebennierenrindensteroide, Gallensäuren, cardiotone Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte.

909843/6705 "*

Hierzu gehören auch die mimetischen Steroidsubstanzen wie D iäthyl st i-lbö strol.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit 5 oder 6 Ringatomen, beispielsweise die Barbiturate, wie Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Äthosuximid und deren Stoffwechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoff en sind die Aminoalkylbenzole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, wie die Amphetamine, Catecholamine, zum Beispiel Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin und deren Stoffweehselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Eenzheterocyclen, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin und deren Derivate und Stoffwechselprodukte. Als heterocyclische Ringe liegen dabei Azepine, Diazepine und Phenothiazine vor.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Purine, wie Theophyllin, Goffein und deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind von Marihuana abgeleitete Verbindungen, wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol. Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Vitamine, beispielsweise die Vitamine A, B, insbesondere

B^o, C., D, E und K, Folsäure und. Thiamin. 30

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Prostaglandine, die sich in bezug auf Anzahl und Stellung von Hydroxylgruppen und. Doppelbindungen unterscheiden.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Antibiotika, wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

909843/6705

γ -ι

* Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und Phosphatsubstituenten.

Beispiele für verschiedene einzelne Arzneistoffe sind Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, VaIpronsäure, Butyrophenone, Anti— histaminica, anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind Aminosäuren und kleine Peptide, wie Polyjodthyronine, zum Beispiel Thyroxin und Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, Met- und Leu-enkephalin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Beispiele für pathogene Stoffwechselprodukte sind Spermin, Galactose, Pheny!brenztraubensäure und Porphyrin vom Typ

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoglycoside, wie Gentamycin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.

In Frage kommende Pestizide sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

Das Molekulargewicht der Rezeptoranalyten beträgt im allgemeinen 10 000 bis 2 χ 10 und insbesondere 10 000 bis 10⁶. Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen etwa 160 000 bis etwa 10 . Das Molekulargewicht von Enzymen liegt im allgemeinen bei etwa 10 000 bis 600 000. Das Molekulargewicht von natürlichen Rezeptoren schwankt stark und beträgt im allgemeinen

909843/0705

mindestens etwa 25 000, kann aber 10 erreichen und darüberhinausgehen. Entsprechende Beispiele sind Avidin, thyroxin— bindendes Globulin, thyroxinbindendes Präalbumin und Transcortin.

Ligandenanaloge s

Das Ligandenanaloge unterscheidet sich vom Liganden entweder durch Ersatz eines Wasserstoffatoms oder einer funktionellen Gruppe durch eine Bindung oder eine bindende Gruppe, die eine funktioneile Gruppe zur Bildung einer kovalenten Bindung zu einem anderen Molekül mit einer aktiven funktioneilen Gruppe, beispielsweise einer Hydroxyl-, Amino-, Aryl-, Thio- oder Olefingruppe, aufweist, wobei die erhaltene Verbindung sich vom Liganden um mehr als durch einen Ersatz eines Wasserstoffatoms durch das Molekül, an das er gebunden ist, unterscheidet. Die verknüpfende Gruppe weist im allgemeinen 1 bis 20 sich von Wasserstoff unterscheidende Atome auf, bei denen es sich um Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Stickstoffatome sowie um Halogenatome mit ftiner Ordnungszahl von 17 bis 35 handeln kann. Beispiele für beteiligte funktionelle Gruppen sind Carbonylgruppen, sowohl Oxo- als auch Nicht-oxo-Gruppen, aktive Halogenatome, Diazogruppen* Mercaptogruppen, Äthylengruppen, insbesondere aktivierte Ithylengruppen, und Aminogruppen. Die Anzahl der Heteroatome beträgt im allgemeinen etwa 0 bis 6, vorzugsweise etwa 1 bis 6 und insbesondere etwa 1 bis 4. Eine Beschreibung von verknüpfenden Gruppen findet sich in der US-PS 3 817 837.

³⁰ Signalbildendes System

Das signalbildende System weist mindestens einen und im allgemeinen zwei Bestandteile auf. Es liefert ein nachweisbares Signal im Testmedium. Das Ausmass des beobachteten Signals wird durch die Verteilung des signalbildenden Systems zwischen den Teilchen und dem Grossteil der Lösung, die feste Umgebung der Teilchen und die flüssige Umgebung

909843/07QS

1 des wässrigen Mediums beeinflusst. Deshalb müssen die

Eigenschaften der Teilchen das Ausmass des beobachteten Signals im Vergleich zu einem Signal, das vom signalbildenden System in der Lösung in Abwesenheit der Teilchen erzeugt wurde, beeinflussen. Ferner ist es erwünscht, dass das signalbildende System mehrere messbare Ereignisse als Reaktion auf die Bindung zwischen den Bestandteilen eines spezifischen bindenden Paars hervorruft (Verstärkung).

Signalbildende Systeme von besonderem Interesse enthalten Katalysatoren, entweder enzymatische oder nicht-enzymatische (vorzugsweise enzymatische) oder Chromophore , die Licht absorbieren oder emittieren, insbesondere Fluoreszenz- und Chemilumineszenzerreger, sowie Kombinationen der beiden Systemtypen. Obgleich die vorerwähnten Marker sehr häufig angewendet werden, können auch andere Arten von Markern Verwendung finden, wie stabile freie Radikale (unter Beteiligung von deren Bildung und Beseitigung), Marker für potentiometrische Be stimmungs verfahr en und dergleichen.

Bei der ersten in Betracht kommenden Art von Systemen sind Enzyme beteiligt.

Enzyme

Am signalbildenden System kann ein einziges Enzym beteiligt sein. Bei Verwendung eines Enzyms, bei dem die Teilchenumgebung die Turnover-Geschwindigkeit beeinflusst (Erhöhung oder Verringerung der Turnover-Geschwindigkeit) variiert das beobachtete Signal mit der Verteilung des Enzyms zwischen den Teilchen (feste Phase) und der Lösung. Da Enzyme gegenüber dem pH-Wert, hydrophoben Oberflächen, Ionenstärke und dergleichen, insbesondere gegenüber dem pH-Wert, empfindlich sind, kann die enzymatische Turnover-Geschwindigkeit modifiziert werden, indem man entsprechen-

^ de Teilchen zur Verfügung stellt.

909843/0705

Γ "I

Die Wahl eines Enzyms wird abgesehen von der Wirkung der Teilchen auf die enzymatische Turnover-Geschwindigkeit auch von anderen Gesichtspunkten beeinflusst. Dazu gehören die Stabilität des Enzyms, der Vunsch nach einer hohen Turnover-Geschwindigkeit, die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch Veränderungen in der physikalischen Umgebung, die Art der Substrate und Produkte, insbesondere die Fähigkeit zur Messung von Substraten oder Produkten (insbesondere Produkten), die leichte Zugänglichkeit des Enzyms, die Virkung der Konjugation des Enzyms auf die enzymatischen Eigenschaften, die Wirkung von Materialien, die in den Probenlösungen vorhanden sein können, auf die enzymatische Aktivität, das Molekulargewicht der Enzyme und ähnliche Faktoren.

Von besonderem Interesse sind Oxidoreduktasen der Klasse 1 (Klassifikation gemäss International Union of Biochemistry) und Hydrolasen der Klasse 3i wenngleich auch Transferasen der Klasse 2, Lyasen der Klasse 4- und Isomerasen der Klasse 5 in. speziellen Situationen ebenfalls Verwendung finden

²⁰ können.

In der nachstehenden Tabelle sind spezielle Unterklassen von Enzymen und spezielle Enzyme innerhalb dieser Unterklassen aufgeführt, die erfindungsgemäss vorzugsweise in Betracht kommen. Unter den Oxidoreduktasen kommen besonders «solche Enzyme in Betracht, bei denen MAD oder NADP, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid beteiligt sind.Unter den Hydrolasen kommen besonders solche Enzyme in Betracht, bei denen

Phosphat und Glycoside beteiligt sind. 30

1. Oxidoreduktasen

1.1 Wirkung auf CH-OH-Gruppen von Donoren 1.1.1 mit KAD oder HADP als Akzeptor

1. Alkoholdehydrogenase

³⁵ 6. Glycerindehydrogenase

27. Lactat-dehydrogenase 37- Malat-dehydrogenase 4-9. Glucose-6-phosphat-dehydrogenase

909843/0708 ^J

1.1.3 mit Og als Akzeptor

4. Glucose-oxidase

Galactose-oxidase

1.2 Wirkung auf Aldehyd- oder Ketogruppen von Donoren 5 1.2.1 mit NAD oder NADP als Akzeptor

12. Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase 1.2.3 mit 0~ als Akzeptor
2. Xanthin-oxidas e

Luciferase 1.4 Wirkung auf CH-NH^-Gruppen von Donoren 1.4.3 mit Oo als Akzeptor

2. L-Aminosäure-oxidase

3. D-Aminosäure-oxidase

1.6. Wirkung auf reduziertes NAD oder NADP als Donor ¹⁵ I.6.99 mit anderen Akzeptoren

Diaphorase

1.7 Wirkung auf andere stickstoffhaltige Verbindungen als Donoren

1.7-3 mit Oo als Akzeptor 3- Fricase

1.11. Wirkung auf H₂O₂ als Akzeptor 1.11.1

6. Katalase 7- Peroxidase

2. Transferasen

2.7 Übertragung von phosphorhaltigen Gruppen

2.7-1 Phosphotransferasen mit CH-OH als Akzeptor

1. Hexokinase

2. Glueokinase 15. Ribokinase

28. Triokinase 40. Pyruvat-kinase 2.7.5 1. Phosphoglucomutase 3- Hydrolasen
3-1 Wirkung auf Esterbindungen

3-1.1 Carbonsäureester-hydrolasen

7. Cholinesterase

8. Pseudocholinesterase

^L 909843/0705 ^J

¹ 3·1.3 Phosphorsäuremonoe ster-hydrolasen

1. alkalische Phosphatase

2. saure Phosphatase

9· Glucose-6-phosphatase 11. Fructose-diphosphatase

3.1.4 Phosphorsäurediester-hydrolasen

1. Phosphordiesterase 3· Phospholipase C

3.2. Wirkung auf Glyc ο sy !verbindungen 3-2.1 Glycosid-hydrolasen

1. oc-Amylase

2. ß-Amylase

4. Cellulase 17· Muramidase

^ 18. Meuraminidase

21. ß-Glucosidase

23. ß-Galactosidase

31. ß-Glucuronidase

35- Hyaluronidase ²⁰ 3.2.2 Hydrolyse von N-Glycosylverbindungen

5. DPNase
4. Lyasen¹

4.1 C-C-Lyasen

4.1.2 Aldehyd-lyasen 13. Aldolase

4.2.1 Hydro-lyasen

1. Carboanhydrase 5- Isomerasen

5.4 Intramolekulare Transferasen

³⁰ 5.4.2 Übertragung von Phosphorylgruppen

Triosephosphat-isomerase

909843/0705

Die vorstehend aufgeführten Enzyme können einzeln, in

Kombination untereinander oder zusammen mit anderen Enzymen verwendet werden, wobei die anderen Enzyme Teil des signalbildenden Systems sind und als Konjugate beteiligt sein können oder nicht-konjugiert sein können, wenn sie mit einem Produkt des konjugierten Enzyms reagieren oder ein Produkt zur Verfügung stellen, das mit einem Produkt des konjugierten Enzyms reagiert, oder mit einem Signalmarker, der ein Substrat darstellt, reagieren. 10

Von besonderem Interesse beim erfindungsgemässen Verfahren ist die Verwendung von gekoppelten Katalysatoren, im allgemeinen zwei oder mehrere Enzyme, wobei das Produkt eines Enzyms als Substrat für das andere Enzym dient oder beide Enzyme ein Produkt bilden, das im signalbildenden System reagiert. Wenn das erste Enzym an ein Teilchen gebunden ist und das Signal-Marker-Konjugat ein zweites Enzym aufweist, stellen die Teilchen eine Umgebung zur Verfügung, die die lokalisierte Konzentration des Produkts des ersten Enzyms in der Umgebung des zweiten Enzyms im Vergleich zum Grossteil der Lösung verstärkt. Aus diesem Grund ist der Turnover des Produkts des ersten Enzyms durch das zweite Enzym an der festen Oberfläche der Teilchen grosser als im Grossteil der Lösung. Dies führt zu einer Verstärkung des beobachteten Signals, wenn das Signal-Marker-Konjugat durch die Wechselwirkung des spezifischen bindenden Paars an die Teilchenoberfläche gebunden ist.

Es können verschiedene Kombinationen von Enzymen verwendet werden. Gemäss einer Kombinationsart wird die Messung von KAD und I¹JADP oder von deren reduzierten Produkten angewendet. Bei diesen Kombinationen werden von MAD abhängige Oxidoreduktasen mit einem Enzym, das ein Substrat für die Oxidoreduktasen zur Verfügung stellt, verwendet. Zur Herstellung des Substrats können verschiedenartige Enzyme und Reaktionen angewendet werden, wobei viele dieser Enzyme

909843/0705

Bestandteile des Kohlenhydratstoffwechsels sind. Eine beträchtliche Anzahl dieser Enzyme ist an der Bildung und Umwandlung von Phosphatestern beteiligt. Beispiele für andere Reaktionen, die beteiligt sein können, sind die Spaltungvon CC-Bindungen durch Lyasen, die Isomerisierung unter Beteiligung von Keto-Aldehyd-Umwandlungen und die Decarboxylierung.

Von besonderem Interesse sind Kombinationen, bei denen Zucker beteiligt sind. Dabei erzeugt in einer ersten Stufe eine Transferase, Bydrolase, Lyase oder Isomerase, insbesondere unter Beteiligung eines Phosphatesters, ein Produkt einer NAD (P)-abhängigen Oxidoreduktase. Besonders wertvoll sind Monophosphat- monosaccharide mit 3 bis 6 ^ Kohlenstoffatomen als Enzymsubstrate in den Oxidoreduktase -Reaktionen.

In der nachstehenden.Tabelle sind eine Anzahl von Beispielen aufgeführt, in denen Vorläuferverbindungen gebildet werden und der Reaktionsverlauf der HAD-abhängigen Enzyme durch Umwandlung von. NAD oder NADP zu oder von ihren reduzierten Formen verfolgt wird. In den einzelnen Beispielen werden beide Enzyme als Signalmarker verwendet.

909843/0705

ω . ■ ω ro Ns -» -»

οι ο οι ο οι ο οι

Einteilung

gemäss I.U.B._| Enzym Reaktionsbeispiel

1. 2.7.Λ Hexokinase Glucose + A(EP —^ Glueose-6-phosphat + ADP

1.1.1 Glucose-6-phosphat- Glucose-6-phosphat + MADP —^ 6-P-Glucuronat + HADPH dehydrogenase

2, 4.1.2 Aldolase ]?ructose-1,6-diP —^ Dihydroxyaceton-P + Glycerin-

aldehyd-3-P

1.2.1 Glycerinaldehyd-

P-dehydrogenase Glycerinaldehyd-3-P + ITAD -^. 3-Phpsphoglycerat + NADH

_o 3· 3.1.3 alkalische Phospha- Dihydroxyaceton-diphosphat —^ Dihydroxyaceton-phosphat

cp tase

^ 1.2.1 Glycerin-3-P- Dihydroxyaceton-phosphat + ITADH —^ Glycerylpho sphat +

ο» dehydrogenase HAD

4. 2.7.I Pyruvat-kinase Phosphoenolpyruvat + ADP —> Pyrurat + ATP 1.1.1 Lactät-dehydroge- Pyruvat + HÄ.DH-^ Lactat + HAD

nase

5* 3*1·3 alkalische Phospha- 1,6-Glucosyldiphosphat ·—> G-6-P '

tase

1.1.1 Glucose-6-phosphat- G-6-P + HADP -> 6-P-Glucuronat + HADPH

dehydrogenase

6. 5Λ.2 Triosephosphat- Glycerinaldehyd-3-'P -^ Dihydroxyaceton-phosphat

isomerase

1.2.1 α-Glycerin-3-P- Dihydroxyaceton-phosphat + HADH —> Glycerylpho sphat + dehydrogenase HAD ¹^

7. 3.1.3 alkalische Phos- D-Sorbitphosphat —> D-SorMtal -*

phatase ' co

1.1.1 a-D-Hexitdehydro- D-Sorbital + HADP -^ a-D-Glucopyranose + HADPH J^ genäse ^_x

Γ	8.	ω cn	5Λ.2	ω ο	Ν» cn
				Phosphogluco-
		1.1.1		mutase
				Glucose-6-phosphat
	9·	4.1.1		dehydrogenase
				Pyruvat-decarboxy-
		1.1.1		lase
				Alkohol-dehydro-
	10.	4.2.1		genase
(O		1.1.1		Fumarase
ο (O				Malat-dehydro-
α»	11.	4.2.1		genase
■Ρ* Ca»		1.1.1		Aconitase
>·				Isocitrat-dehydro-
VMP				genase
O
cn

cn

oc-Giucose-1-phosphat -^ Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat + MD -^ 6-P-Glucuronat + MDH
Pyruvat —^ Acetaldehyd

Acetaldehyd + MDH -^ Äthanol + MD

Pumarat —^ Malat

Malat + MD -^ Oxalacetat + NADH

cis-Aconitat —^ Isocitrat

Isocitrat + MD -^- α-Oxoglutarat + MDH

Bei einer weiteren Kombination von Enzymen ist die Bildung von Wasserstoffperoxid beteiligt, wobei die peroxidasekatalysierte Umsetzung des Wasserstoffperoxids mit einem chemilumineszierenden Material, wie Luminol, zur BiI-dung von Licht führt. Abgesehen von Luminol können auch andere 2,3-Dihydro-1,4~phthalazindione verwendet werden. Beispiele dafür sind die 5-Amino-6,7»8-trimethoxy- und Dimethylamino/~ca__7-benzanalogen. V/eitere entsprechende Verbindungen sind die 2,4-,5-Triphenylimidazole. Der Trivialname für das Ausgangsprodukt ist Lophin. Ferner können durch p-Dimethylamino- und -Methoxygruppen substituierte Verbindungen verwendet werden. Die chemilumineszierende Verbindung kann die direkte Lichtquelle darstellen oder kann mit einem Akzeptor, wie 9*10~Dibromanthracen, in Wechselwirkung treten, der sodann Licht emittiert. Es können auch eine Reihe von Farbstoff-Vorläuferverbindungen zur Verfügung gestellt werden, die mit Wasserstoffperoxid enzymatisch katalysierte Reaktionen unter Bildung einer nachweisbaren gefärbten Form eingehen. In der folgenden Tabelle sind eine Anzahl von derartigen Reaktionen aufgeführt, in denen beide Enzyme Signalmarker sind.

909843/Q705

Γ	1.	ω ω σι ο	σ.
		Enzymgruppe	Enzyme
	2,	1.1.5	GlucQse-oxidase
		1.11.1	Peroxidase
	■ 3-	1.7.5	Uricase
		1.11.1	Peroxidase
	4.	1Λ.5	D-Aminosäure-oxidase
		1.11.1	Katalase
co		1.2.5	Xantnin-oxidase
ο co α» ■		1,11,1	Cytochrom C-oxidase
O
ο cn

cn

Reaktionsbeispiel

Glucose + O2 —>

H₂O₂ + Luminol

Glucuronat Produkte + h ν Urat + O₂ —> Allantoin + H₂O₂ H₂O₂ + 0-Dianisidin —> Farbstoff'

D-Alanin + 0« —^ Pyruvat + —4

H₂O₂ + Pe(CN)₆"^ -^ Pe(CU)₆""⁵ Xanthin + O₂ ■—^ Harnsäure + H₂O₂ H₂O₂ + Pyrogallol —> Hydroxychinon

Eine weitere Gruppe von Reaktionen beruht auf zwei Reaktionen unter Beteiligung von Wasser, im allgemeinen zwei Reaktionen unter Beteiligung von Hydrolasen, wenngleich auch Synthetasen ebenfalls verwendet werden können.

909843/0705

Γ	1.	ω cn	CO to NS O Cn O
		Enzym^ruppe	Enzyme
	2.	3.1.3	alkalische Phosphatase
		3.2.1	ß~Galactosidase
	3.	3.1.1	Acetylesterase
		3.2.1	ß-Glucosidase
	4=	3.2.1	Glucoamylase
co	3.2.1	ß-Glucosidase
19843 /O¹ BAD ORfQ	3.1.1 3.2.1	Cholinesterase ß~Glucuronidase

cn

3.4.1 Prolin-iminopeptidase

3.4.1 Aminopeptidase

3.5-1 Urease

6.3.5 NAD-Synthetase

3.1.3 alkalische Phosphatase Peroxidase

Reaktionsbeispiel

i-Umbelliferyl-ß-galaetosid-6-P -> 1-Umbelliferyl-

ß-galactosid

1-TJmbelliferyl-ß-galactosid ·—> Umbelliferon i-Alizarinyl-ß-glucosid-monoacetat -^ 1-Alizarinyl-

ß-glucosid

1-Alizarinyl-ß-glucosid —^ Alizarin + Glucose 1 - (p-Nitrophenyl )-4-0-a-D-glucopyranosyl-ß-D-glucose —^- 1-(p-Nitrophenyl)-ß-D-glucosid

1-(p-Nitrophenyl)-ß-D-glucosid —^ p-Nitrophen-

oxid + Glucose

Phenolphthalein-ß-glucuronid-cholin-chlorid-ester ^.

—^. Phenolphthalein-ß-glucuronid ^°

Phenolphthalein-ß-glucuronid —^ ß-Glucuronid +

Phenolphthalein L-Prolyl-L-leucin-p-nitroanilid —^ L-Leucin-

p-nitroanilid

L-Leucin-p-nitroanilid —^ L-Leucin + p-lTitroanilin Harnstoff + H₂O —> CO₂ + HH₅ ATP + DesamidoNAD + NH₅ + H₂O -^ ADP + NAD +

Pyrophosphat

2,6-Dichlorphenolindophenol-P -^ 2,6-Dichlor-

phenolindophenol _^

2,6-Dichlorphenolindophenol + H₂O₂ —^ Farbstoff⁰

^Γ - 50 -

. Eine weitere Gruppe von Kombinationen umfasst die Herstellung eines Enzymsubstrats in einer ersten Stufe, das Elektronen an einen Akzeptor abgibt oder von einem Donor aufnehmen kann, wobei sich eine wesentliche Veränderung im Absorptionsspektrum des Rezeptors oder Donors ergibt.

In den meisten Fällen handelt es sich bei dem zweiten Enzym um eine Oxidoreduktase, insbesondere um eine Dehydrogenase oder Oxidase. Hierbei handelt es sich bei beiden Enzymen um Signalmarker.
10

909843/0705

Γ	1.	ω cn	ω ίο μ ο οι ο	Cholinesterase ]
		Enzymp;ruppe Enzym	Cholin-dehydrogenase
	2.	3.1.1	Glycerin-kinase
		1.1.99	Glycerinphosphat- dehydrogenase
	3.	2.7.1	Glucose-dehydrogenase
		1.1.99	Glucinat-dehydrogenase
	4.	1.1.1	Alkohol-dehydrogenase
		1.1,99	Cytochrom b,--reduktase
co ο	5.	1.1.1	Desoxyriboaldolase
co 00		1.6.2	Aldeliyd-oxidase
-P- OJ	6.	4.1.2	Alkohol-dehydrogenase
O <<! O		1.2.3	MADP (reduziert)- dehydrogenase
cn	1.1.1
	1.6.99

cn

Cn

Reaktionsbeispiel
Butyrylcholin-chlorid -^- Cholin Cholin + Phenazinmeth.0sulfat —> Betain -

aldehyd + Farbstoff (H)

ATP + Glycerin -> L- Glyc er in- 3-P L-Glycerin-3-P + Methylenblau —=> Dihydroxyaceton-

phosphat + Farbstoff (H)

ß-D-Glucose + NADP -> D-Glucono-^-lacton + HADPH D-Gluconat + Resazurin —^ 2-Keto-D-gluconat +

Farbstoff (H)

Äthanol + NAD

Acetaldehyd + NADH

NADH + Indigotetrasulf onat —^ NAD + Indigotetra sulf onat (H)

2-Desoxy-D-ribose-5-phosphat —> D-Glycerinalde-

hyd-3-P + Acetaldehyd

Acetaldehyd + 2,6-Iichlorphenol-indophenol

Essigsäure und Farbstoff

Äthanol + NADP -^ Acetaldehyd + NADPH NADPH + Trichlorphenolindophenol ^

NADP + Trichlorphenolindophenol (reduziert)

Erfindungsgemäss können deshalb Kombinationen verwendet werden, bei denen eine erste enzymatisch^ Reaktion unter Bildung eines Substrats für eine zweite enzymatisch^ Reaktion beteiligt ist. Bei der zweiten enzymatisehen Reaktion wird eine Verbindung gebildet, die spektrophotometrisch aufgrund von Lichtabsorption, insbesondere über 300 nm und vorzugsweise über 350 nm und insbesondere über 400 nm, aufgrund von Fluoreszenz, wobei das emittierte Licht eine Wellenlänge von über 350 nm, vorzugsweise über

aufweist, 400 nm und insbesondere über 450 nm/oder aufgrund von Chemilumineszenz bestimmt werden kann. Der Extinktionskoeffizient soll bei den vorstehend angegebenen Wellenlängen mehr

■Ζ Λ _Λ h

als 10^ Mol χ cm und insbesondere mehr als 10 betragen.

Anstelle eines ersten Enzyms, dessen Produkt das Substrat für ein.zweites Enzym darstellt, kann ein Enzym verwendet werden, das ein Produkt bildet, welches mit einer zweiten Verbindung reagiert. Die zweite Verbindung kann im Medium ursprünglich als Marker vorgesehen sein, sie kann durch eine enzymatische Reaktion gebildet werden oder sie kann durch die Vermittlung eines nicht-enzymatischen Katalysators reagieren. Bei den beiden Erscheinungen ist im allgemeinen entweder (1) eine Energieübertragung von einem angeregten Molekül auf ein anderesMolekül, das dadurch angeregt wird, wobei das zweite Molekül Licht emittiert, oder (2) eine Bildung einer zweiten Verbindung beteiligt, die durch die Vermittlung eines nicht-enzymatischen Katalysators unter Bildung einer Verbindung reagieren kann, welche im allgemeinen Licht bei relativ langen Wellenlängen absorbiert.

Die nachstehende Tabelle erläutert eine Anzahl von derartigen Kombinationen, wobei das Enzym und die unterstrichene Verbindung die Signalmarker darstellen.

909843/0705

to

co

IO

Cn cn

Enzymgruppe 1. 3.2.1

1.11.1

1.1.1

Katalysator ß-Galactosidase

alkalische Phosphatase

Peroxidase

Reaktionsbeispiel

Di-(ß-galactosidyl)-fluorescein -^- Mono-(ß-galactosi-

dyl)-fluorescein

Umbelliferon + hy -^ Umbelliferon* Umbelliferon* + Mono-(ß-galactosidyl)-fluorescein —^ Umbelliferon + Mono-(ß-galactosidyl)-fluorescein* Mono-(ß-galactosidyl)-fluore scein* —^ Mono-(ß-galactosidyl)-f luorescein + hl/ Pluorescein-di-phosphat —^ Pluorescein-mono-phosphat

Amino-

Glycerin-3-P-deliydrogenase

Meldolablau

Lactat-dehydrogenase

(Phenazinmethosulfat)

3-Hydroxybutyratdehydrogenase

(Pyocyanin) Luminol + HoOo —^ Aminophthalat* Aminophthalat* + Fluorescein-mono-phosphat phthalat + Pluorescein-mono-phosphat* Pluorescein-mono-phosphat* —^ Fluorescein-mono-

phosphat + h·/* Glycerin-3-P + NAD ~> Dihydroxyaceton-P + NADH

NADH + Jodnitrotriphenyltetrazolium (INT) -^ NAD +

Jodnitrotriphenylformazan·

Lactat + NAD -^· Pyruvat + NADH

NADH + Methylviologen -^- NAD + Farbstoff (H) 3-Hydroxybutyrat + NAD —^· Acetoacetat + NADH

NADH + INT -> NAD + Jodnitrotriphenylformazan

(JD OJ

co cn

co

to cn cn

cn

Enzymgruppe Katalysator Reaktionsbeispiel

6.

1.11,1

Mkroperoxidase Luminol + E^Og —> Aminopnthalat*

Aminophtnalat*+ Fluorescein —» Fluorescein* + Amino-

phthalat
Fluorescein* —^ Fluorescein + h V

Obgleich die vorstehenden beispielhaften Kombinationen auf zwei Bestandteile als Marker beschränkt sind, ist es offensichtlich, dass auch drei oder mehr Bestandteile verwendet werden können. Die Vermehrung der Anzahl der Marker im signalbildenden System bringt Vorteile und Nachteile mit sich. Bei Vorhandensein von drei Markern, beispielsweise von drei Enzymen, kann das zweite und dritte Enzym, sofern das Produkt des einen Enzyms das Substrat für das nächste Enzym darstellt, als Teil des Teilchenkonjugats und das erste Enzym als an den Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebundener Marker vorliegen. Auf diese Weise wird als Ergebnis des ersten Enzyms im Grossteil der Lösung anfänglich ein geringeres Signal hervorgerufen. Es ist jedoch festzuhalten, dass die Konzentrationen der Produkte der Enzyme an den Oberflächen der Teilchen in den nachfolgenden Reaktionen fortschreitend kleiner werden, je grosser die Anzahl der Reaktionen, die ablaufen muss, ist. Je langsamer also die Gesamtreaktion und je grosser die Anzahl der Reaktionen, die ablaufen muss, ist, desto langer ist die Reaktionsdauer, die zum Erhalt eines messbaren Signals erforderlich ist. Deshalb muss in einem gewissen Ausmass ein Kompromiss zwischen einer Verringerung des Hintergrunds und einer Verringerung der zur Erzeugung eines messbaren Signals erforderlichen Zeit getroffen werden.

Im signalbildenden System können entweder eines oder mehrere Enzyme verwendet werden. Die Eigenschaften der Teilchen können auf verschiedene V/eise zur Beeinflussung der Enzymreaktionen eingesetzt werden.

Bei einem einzigen Enzym können die Teilchen eine "Umgebung erzeugen, die eine deutliche Wirkung auf die enzy- "" matische Turnover-Geschwindigkeit hat, was auf die Natur der Teilchen zurückzuführen ist. Dies kann auf Unterschieden im pH-Wert, in der Ionenstärke, in der hydrophoben Umgebung und in ähnlichen Eigenschaften im Bereich der

909843/0705

Teilchen, verglichen mit dem Grossteil der Lösung, beruhen. Deshalb können Salze, Puffer, ionische Polymerisate, Hilfslösungsmittel oder dergleichen zugesetzt werden oder es können die Teilchen in entsprechender Weise gewählt werden, um ein wesentliches Gefälle in den Eigenschaften zwischen dem Grossteil der Lösung und der Teilchenumgebung zu schaffen.

Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Teil— chen, die eine verschiedene Diffusionsgeschwindigkeit hervorrufen« Das signalbildende System bedient sich sodann eines Konjugats , eines enzymsiarkierten Bestandteils des bindenden Paars und eines makromolekularen Enzymsubstrats oder Inhibitors, wie Antienzym, Pseudosubstrat oder irreversibler Inhibitor. Besonders wertvolle Enzyminhibitoren sind solche, die als irreversible Inhibitoren das aktive Zentrum angreifen. Beispiele für derartige Inhibitoren sind Fluorophosphonate, die mit Cholinesterase reagieren,und Arylquecksilbersalze, die mit Sulfhydrylgruppen von Hydrolasen reagieren. Es können auch nicht-kompetitive Inhibi—

Sulfonamide für

toren verwendet werden, wie/Carboanhydrasen. Die entsprechenden Inhibitoren sind kovalent an ein grosses Makromolekül in einer Stellung gebunden, die die Hemmwirkung des Inhibitors nicht beeinträchtigt. Das Konjugat des enzymmarkierten Bestandteils des bindenden Paars, das an die Teilchen gebunden \<ri.rd, reagiert nicht in wesentlichem Umfang mit der makromolekularen Spezies, während dies beim Enzym im Grossteil der Lösung der Fall ist.

Die Wirkung der Assoziation des Enzyms mit den Teilchen sollte mindestens eine 2-fache, vorzugsweise eine 10-fache und insbesondere eine 100-fache Geschwindigkeitsdifferenz im Vergleich zum Enzym im Grossteil der Lösung hervorrufen.

Die vorgenannten Verfahrensweisen können auch angextfendet werden, wenn mehr als ein Enzym in der Umgebung der Teil-

9098U/0705

chen beteiligt ist. Beispielsweise kann "bei Beteiligung von zwei nacheinander reagierenden Enzymen ein Enzymrezeptor, zum Beispiel ein Antienzym, verwendet werden, der bei Bindung an ein Enzym die enzymatisch^ Turnover-Geschwindigkeit wesentlich verringert. Das Enzym im Grossteil der Lösung wird gehemmt, während das Enzym in der Umgebung der Teilchen geschützt wird- Als Wirkung ergibt sich im wesentlichen eine Beseitigung des Hintergrunds!— gnals. Ferner kann das Testmedium mit Reagentien versetzt werden, die sterisch vom Teilchenkonjugat ausgeschlossen sind und als "Fänger" zur Verringerung des im Grossteil der Lösung erzeugten Signals dienen. Beispiele dafür sind Reagentien, die das Produkt des ersten Enzyms im Grossteil der Lösung abfangen, das entweder durch das erste

^ Enzym im Grossteil der Lösung gebildet wird oder den Teilchen, an die das erste Enzym gebunden ist, entkommt. Zu derartigen Reagentien gehören Enzyme, die sich vom ersten und zweiten Enzym unterscheiden, Rezeptoren für das Produkt des ersten Enzyms oder chemische Reagentien, die mit

²^ diesem Produkt reagieren.

Der nicht-enzymatische Katalysator verwendet als Reaktanten ein erstes Produkt, das durch Übertragung von 1 Elektron und eine zweite Verbindung, die durch Übertragung von 2 Elektronen reagiert, wobei die beiden Reaktanten in Abwesenheit des Katalysators langsam oder gar nicht miteinander reagieren. Abgesehen von Enzymen können auch chromogene Materialien als Marker dienen, insbesondere Verbindungen, die fluoreszieren oder chemilumineszieren. Durch Bindung des chromogenen Markers an einen Bestandteil des spezifischen bindenen Paars und durch Bindung des homologen Bestandteils an die feste Phase assoziieren die beiden Bestandteile, wobei der chromogene Marker in die feste Phase eingeführt wird. Wenn die Umgebung der festen Phase die .

Fluoreszenz beeinflusst, steht das beobachtete Signal in Beziehung zur Verteilung des Fluoreszenzerregers zwischen

90S843/070S

der festen und flüssigen Phase. Eine andere Möglichkeit besteht darin, als makromolekulares Reagens einen Rezeptor für den chromogenen Bestandteil (Antichromogen), der gegebenenfalls an einen Quencher gebunden sein kann, oder ein makromolekulares Reagens zuzusetzen, das mit dem chromogenen Bestandteil reagiert, wobei die Geschwindigkeit der Diffusion des zugesetzten Reagens in die Teilchen wesentlich geringer als die Geschwindigkeit der Diffusion im Grossteil der Lösung ist. Beispiele hierfür sind chemische Reagentien, wie Persäuren, beispielsweise Percarbonsäuren und undurchsichtige Absorptionsmittel, wie Aktivkohle. Wenn die Reaktion der makromolekularen Reagentien mit dem chromogenen Bestandteil zu einer Quenchung desselben führt, so ist die Geschwindigkeit, mit der das beobachtete Signal verschwindet, umso langsamer, Je mehr chromogener Bestandteil sich an der festen Phase befindet. Eine ähnliche Verfahrensweise unter Verwendung von Antikörpern zur Hemmung der Bindung des Antichromogens an den chromogenen Bestandteil ist in der US-PS 3 998 943 erläutert.

ITeben fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen können auch solche Moleküle verwendet werden, die Energie auf einen Akzeptor übertragen, der sodann fluoresziert. Da die chemilumineszierende Reaktion durch Bindung eines Enzyms als Signal-Marker-Konjugat an die Teilchen auf die feste Phase beschränkt werden kann, wobei das Enzym für die Chemilumineszenzreaktion sorgt und ein Akzeptor als an den Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebundener Marker vorliegt, kann die erhöhte lokalisierte Konzentration der chemilumineszierenden Spezies an der festen Phase, die durch Assoziation des Signal-Marker-Kon jugats mit den Teilchen entsteht, festgestellt werden. In Frage kommende Eluoreszenzerreger fallen in verschiedene Verbindungskategorien mit bestimmten primären funktionellen Gruppen. Zu diesen primären funktionellen Gruppen gehören 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p'-Diaminostilbene,

909843/0705

Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoacridine, ρ,ρ'-Diaminobenzophenonimine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoäquilenin, Perylen, Bis-benzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3-Aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol. Benzimidazylphenylamin, 2-0xo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hyd.roxycumarin, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane und Flavin.

Spezielle fluoreszierende Verbindungen, die funktionelle Gruppen für eine Bindung aufweisen oder in die entsprechende funktionelle Gruppen eingeführt werden können, sind DansylChlorid, Fluoresceine, wie 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol, Ehodaminisothiocyanat, N-Phenyl-i-amino-8-sulfonatonaphthalen, N-Phenyl^-amino-G-sulfonatonaphthalen, ^--Acetamido-^-- isothiocyanatostilben-2,2 · -disulf onsäure, Pyren-3-sulfonsäure, 2-Toluidinonaphthalen-6-sulfonat, K-Phenyl, IT-Methyl^-amino-naphthalen-e-sulfonat, Ethidiumbromid, Atebrin, Auromin-0,2-(9^l-anthroyl)-palmitat, Dansylphosphatidyläthanolamin, ΪΓ,Ν'-OiQctadecyloxacarbocyanin, ΙΓ,Ν¹ -Dihexyloxacarbocyanin, /4-(3' -Pyrenyl)-butyrat, d-3-Aminodesoxyäquilenin, 12-(9^l-Anthroyl)-stearat_i 2-Methylanthracen, 9-Vinylanthracen, 2,2'-(Vinylen-p-phenylen)-bisbenzoxazol, p-Bis-/~2-(^—methyl-5-phenyloxazolyl)_7_benzol, 6-Dimethylamino-1,2-benzophenazin, Retinol, Bis-(3'-aminopyridinium)-1,10-decandiyl-dijodid, SuIfonaphthylhydrazon von Hellebrigenin, ChI or tetracyclin, H-(7-Dimethylamino-^z)~methyl-2-oxo-3-chromenyl )-maleinimid, H-/~p-(2-benzimidazoyl )-phenyl_7-maleinimid, N-C^Pluoranthyl)-maleinimid, Bis-(homovanillinsäure), Resazarin, 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol, Merocyanin 5^» Resorufin, Bengalrosa und 2,4-I)iphenyl-3(2H)-furanon.

Festzuhalten ist, dass die Absorptions- und Emissionseigenschaften des gebundenen Farbstoffs sich von den entsprechenden Eigenschaften des ungebundenen Farbstoffs

9098^-3/0705

γ -ι

unterscheiden. Die Hinweise auf die verschiedenen Wellenlängerbereiche und Eigenschaften der Farbstoffe beziehen sich auf die Farbstoffe in der angewendeten Form und nicht auf Farbstoffe in nicht-konjugierter Form und in einem

⁵ beliebigen Lösungsmittel vorliegende Farbstoffe.

Als Lichtquelle für ein nachweisbares Signal kann auch eine Chemilumineszenzquelle verwendet werden. An der Chemilumineszenzquelle ist eine Verbindung beteiligt, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und sodann Licht emittiert, das als nachweisbares Signal dient oder die Energie an einen Fluoreszenzakzeptor abgibt.

Von einer Anzahl von Verbindungsgruppen wurde festgestellt, dass sie unter verschiedenen Bedingungen chemiluminesziereh. Bei einer Gruppe von Verbindungen handelt es sich um 2,3-Dihydro~1,4-Phthalazindione. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, d.h. die 5-Aininoverbindung. Weitere Verbindungen sind die 5-Amino-6,7»8-trimethoxy- und die Dimethylamino/~ca_J7-benzanalogen. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit und einer Base zum Lumineszieren gebracht werden. Eine xtfeitere Gruppe von Verbindungen sind die 2,4-,5-Triphenylimidazole, wobei das Ausgangsprodukt den Trivialnamen Lophin trägt. Zu den chemilumineszierenden Analogen gehören die durch p-Dimethylamino- und -Methoxygruppen substituierten Verbindungen.

Wenngleich die vorerwähnten Marker im allgemeinen bevorzugt werden, können auch andere Arten von Markern Verwendung finden, wie stabile, freie Radikale (einschliesslich deren Bildung und Abbau). Ferner können Marker für potentiometrische Bestimmungen und ähnliche Verbindungen verwendet

werden. 35

909843/0705

1 Teilchen

Erfindungsgemäss können eine Reihe von Teilchen eingesetzt werden. Die Teilchen sind vorzugsweise porös oder von einem feinen Netz durchzogen, d.h. sie weisen Bereiche auf, die zur Lösungsmasse hin offen sind. Diese Bereiche machen mehr als etwa 50 Prozent des durch das Teilchenmaterials eingeschlossenen Volumens aus. Diese Bereiche können als tiefe Poren, Kanäle, Risse, Einkerbungen oder dergleichen vorliegen.
10

Die zum Einsa.tz kommenden Teilchen werden so gewählt, dass sie für einen oder mehrere Beb Landteile des signalbildenden Systems eine Umgebung schaffen, die eine Unterscheidung zwischen dem an die Teilchenoberfläche gebundenen Signalmarker und dem in der Lösungsmasse (Grossteil der Lösung) vorhandenen Signalmarker ermöglichen. Durch entsprechende Anwendung von makromolekularen Reagentien lässt sich der Zutritt eines Signalmarkers an der Teilchenoberfläche zum makromolekularen Reagens beschränken. Die Poren oder Kanäle der Teilchen werden so gewählt, dass ein Zutritt von mindestens einem Bestandteil des signalbildenden Systems ermöglicht \tfird und häufig der Zxitritt von mindestens 1, im allgemeinen 1, Bestandteil des signalbildenden Systems gehemmt wird.

Die porösen Teilchen können verschiedene Porengrössen aufweisen. Die Porengrösse wird in Übereinstimmung mit der Beschaffenheit der zu verwendenden Teilchen gewählt. Sofern die Diffusionsgeschwindigkeit einen signifikanten Faktor darstellt, wird eine Ausschlussgrösse ("cut-off size") zwischen den Molekülen, die in die Poren diffundieren müssen und den Molekülen, die an einer Diffusion in die Poren gehemmt werden, festgelegt. Die Ausschlussgrössen können von einigen 10 000, zum Beispiel 20 000 und insbesondere 40 000,bis zu einigen Millionen Molekulargewichtseinheiten, zum Beispiel 20 Millionen und insbe-

909843/010S

^Γ 62

sondere 10 Millionen, variieren. Derartige Produkte sind in verschiedenen Bereichen im Handel erhältlich.

Die Teilchengrösse unterliegt aufgrund folgender Gesichtspunkte einer Beschränkung. Die Teilchen sollen während der Testdauer und vorzugsweise darüberhinaus in relativ stabiler Dispersion vorliegen. Eine unbegrenzte Stabilität im Testmedium ist nicht erforderlich. Die Teilchengrösse soll ausreichend klein sein, so dass eine grosse Anzahl der Teilchen in der Lösung vorliegt. Dies bedeutet, dass grosse Schwankungen des Signals nicht erwünscht sind, wenn 1 oder einige Teilchen, die den Lichtweg passieren, eine wesentliche Veränderung des beobachteten Signals bewirken. Deshalb liegt der Teilchendurchmesser in den meisten Fällen im Bereich von etwa 50 nm bis 100 μ und insbesondere 500 nm bis 25 n. Die Porengrössen variieren im allgemeinen von etwa 0,1 nm bis unter 750 nm, im allgemeinen nicht mehr als etwa 500 nm.

Die Teilchengrösse kann variieren. Durch Zerkleinern von grösseren Teilchen durch mechanische Massnahmen, wie Mahlen, Ultraschallbehandlung und Bewegen, wird die Teilchenoberfläche vergrössert.

Die Teilchen können aus verschiedensten Materialien bestehen. Viele derartige Materialien sind handelsüblich. Es können auch handelsübliche Materialien modifiziert werden, so dass sie die gewünschten Eigenschaften erreichen. Die Teilchen können aus natürlichen Materialien, natürlichen Materialien, die künstlich modifiziert sind, und aus synthetischen Materialien bestehen. Von besonderem Interesse sind Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, wie Agarose (Sepharose), Dextran (Sephadex und Sephacyl), Cellulose, Stärke und dergleichen.

Beispiele für weitere Materialien sind Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol, Copolymerisate von Hydroxy-

909843/0705

äthylmethacrylat und Methylmethacrylat, Silicone, Gläser (Bioglas) und Aktivkohle.

Die Teilchen sollen polyfunktionell sein oder es muss die Möglichkeit bestehen, sie zu polyfunktionalisieren. Teilchen mit den verschiedensten funktionellen Gruppen sind erhältlich oder derartige funktionelle Gruppen können eingeführt werden. Beispiele für funktionelle Gruppen sind Carbonsäure-, Aldehyd-, Amino-, Cyano-, Äthylen-, Hydroxy1-Ί0 und Mercaptogruppen. Die Art der Verknüpfung der verschiedensten Verbindungen an die verschiedenen Teilchen ist bekannt; vgl. beispielsweise Cuatrecases, J. Biol. Chem., Bd. 2-4-5 (1970), S. 3059.

Die Länge der verknüpfenden Gruppen variiert stark in Abhängigkeit von der Art der zu verknüpfenden Gruppe, des Einflusses des Abstands zwischen dem Marker und dem Teilchen auf die Markereigenschaften, dem Vernetzungsvermögen des Markers und dergleichen. Die Teilchen (entweder durch das wässrige Medium gequollen oder nicht-gequollen) definieren im wässrigen Medium ein Volumen, wobei die Flüssigkeitsumgebung in der Teilchenumgebung sich von der Flüssigkeitsumgebung im Grossteil der Lösung unterscheidet. Dies bedeutet, dass die Flüssigkeit in den Poren und/oder Kanälen und/oder an der Oberfläche der Teilchen den chemischen und physikalischen Einflüssen der Teilchen ausgesetzt ist.

Sofern die Bildung eines pH-Gradienten erwünscht ist, können die Teilchen mit positiv oder negativ geladenen Gruppen, wie Ammonium-, SuIf onat- oder Carboxylatgrupp en ,substituiert werden, oder es können Enzyme an die Teilchen gebunden werden, deren Produkte eine von ihren Substraten unterschiedliche Azidität aufweisen. Bei Verwendung eines Puffers mit einer relativ schwachen Pufferkapazität wird die Bildung eines pH-Gradienten zwischen den Teilchen und dem Grossteil der Lösung erreicht.

909843/070S

Γ "I

Je nach. Art der Teilchen kann die Diffusionsgeschwindigkeit, verglichen mit der Diffusionsgeschwindigkeit im Grossteil der Lösung, gehemmt werden. Die Grosse der Kanäle, die Art der Kanäle (gerade oder gebogen) und die chemische Natur der Teilchen kann ebenfalls zur Beeinflussung der Diffusionsgeschwindigkeit eines Moleküls in einen Kanal oder eine Pore herangezogen werden.

Teilchenkonjugat

Das Teilchenkonjugat ist immer an einen der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars konjugiert. Die Konjugation kann direkt oder indirekt sein. Unter direkter Konjugation ist eine kovalente Bindung des Markers (Bestandteil des spezifischen bindenden Paars) an die Teilchen zu verstehen.

Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung eines Rezeptors für den Bestandteil des spezifischen bindenden Paars. Wenn der Bestandteil des spezifischen bindenden Paars mehrwertig ist, kann ein unreines Präparat eines komplementären Bestandteils kovalent an die Teilchen gebunden werden. Eine nicht-kovalente Bindung des ungereinigten Bestandteils des spezifischen Paars ergibt sodann Teilchen, die mit dem signalmarkierten oder nicht-markierten homologen Bestandteil des Paars frei von Verunreinigungen markiert sind. Das erhaltene Teilchenkonjugat

²^ kann sodann beim Test mit dem entsprechenden komplementären Signal-Marker-Konjugat verwendet werden.

Eine in bezug auf die vorstehende Ausführungsform modifizierte Verfahrensweise kann angewendet werden, wenn es sich beim Analyten um einen Rezeptor, wie Human-IgE handelt. Man kann ein durch das IgE erkanntes Allergen kovalent an die Teilchen binden. Als Bestandteil des Signal-Marker-Konjugats lässt sich Schaf-anti-(human IgE) verwenden. Beim Test geht der Human-IgE-Analyt eine Bindung an das Allergen an den Teilchen ein, während das Signal-Marker-Konjugat (anti-(.human. _IgE)) eine Bindung an das an die

909843/0705

Teilchen gebundene Human IgE eingeht. Diese Situation unterscheidet sich von der allgemeinen Situation, da die Bindung des Analyten an die Teilchen während des Tests die Entstehung des Produkts, das als Teilchenkonjugat definiert ist, hervorruft. In ähnlicher Weise können auch andere Rezeptoren, wie IgA, IgG, IgM, Enzyme und spezifische Rezeptoren, wie für östriol, Biotin und andere Arzneistoffe verwendet werden.

Somit ergeben sich zwei spezifische bindende Paare, wenn die gleiche Verbindung die Rolle des Antigens in einem Paar und des Rezeptors im anderen Paar spielt, während die komplementären Bestandteile des Analyten der einzelnen spezifischen bindenden Paare keine Beziehung von Ligand

¹⁵ und Rezeptor aufweisen müssen.

Das Verhältnis des Bestandteils des spezifischen bindenden Paars zum Molekulargewicht der Teilchen kann stark variieren und hängt von der Art der Teilchen, der zur Verfügung stehenden Oberfläche, den zur Verfugung stehenden bindenden Stellen und ähnlichen Faktoren ab. Im Durchschnitt ist mindestens 1 Bestandteil des spezifischen bindenden Paars pro Teilchen und im allgemeinen mindestens etwa 1 pro 1 χ 1CK Molekulargewichtseinheiten und insbesondere mindestens 1 pro 1 χ 10' Molekulargewichtseinheiten vorhanden.

Für viele signalbildende Systeme werden einer oder mehrere Signalmarker, die sich vom Signal-Marker-Konjugat unter-

scheiden, verwendet, im allgemeinen kovalent an die Teilchen gebunden. Wie bereits erwähnt, kann es sich bei diesen Markern um Enzyme, Katalysatoren, chromogene Elektronenübertragungsmittel, Phosphore und dergleichen handeln.

Das Verhältnis von Signalmarker zum Molekulargewicht der

Teilchen kann stark variieren und hängt von der Art des Markers und der Art des signalbildenden Systems ab. Im

909843/Θ705

Durchschnitt ist mindestens etwa 1 Signalmarker pro Teilchen und im allgemeinen mindestens etwa 1 pro 1 xiO* Molekulargewichtseinheiten und insbesondere mindestens etwa 1 pro 1 χ 10 Molekulargewichtseinheiten vorhanden. 5

Bei den Teilchenkonjugaten kann es sich um neue Präparate handeln. Insbesondere können beliebige der vorstehend aufgeführten haptenischen oder antigenen Liganden oder beliebige Rezeptoren an die Teilchen zusammen mit einem Bestandteil des signalbildenden Systems gebunden werden.

Von besonderem Lüteresse sind Kongugate mit Teilchen aus Polyaminosäuren, wie Albumine, Globuline, insbesondere Immunglobuline, Hormone, antigene Substanzen zur Diagnose von Krankheiten, wie CEA, Lipoproteine und Glycoproteine, sowie Polysaccharide, wie Aminoglycoside, Lipopolysaccharide und Heuraminsäuren, zusammen mit Markern, wie Enzymen und Chromogenen, wie Fluoreszenzerreger und Quencher.

Beispiele für Teilchenkonjugate, die erfindungsgemäss Anwendung finden können, sind Polysaccharidteilchen, wie Agarose, Dextran und Cellulose, die mit mindestens 1 PoIyaminosäure-Antigenmolekül und mindestens 1 Bestandteil des signalbildenden Systems, wie einem Enzym, Chromogen, Chemilumineszenzerreger, Elektronenüberträgersubstanz oder Phosphor (Phosphoreszenzerreger) konjugiert sind. Bezüglich der bevorzugten Enzyme wird auf die vorstehenden Erläuterungen verwiesen. Wie bereits erwähnt, bilden die Enzyme ein Produkt, das als Substrat für das nächste Enzym dient oder umgekehrt. Insbesondere finden Hydrolasen, wie Phosphatasen, Glycosidasen und Esterasen, Transferasen, wie Kinasen, und Oxidoreduktasen, wie Dehydrogenasen und Peroxidasen,Anwendung. Als chromogene Substanzen finden insbesondere Fluoreszenzerreger, Quencher und Chemilumineszenzerreger Anwendung. Beispiele für bevorzugte Katalysatoren sind Meldolablau, während als Phosphore insbesondere

909843/0705

Γ '

polycyclische aromatische Produkte und Chelate von seltenen Erdmetallen von Interesse sind.

Kon_tjugat des Bestandteils des bindenden Paars Die Konjugation von Markern an Liganden und Rezeptoren wird in der Literatur ausführlich erläutert, insbesondere in den vorstehend erwähnten Literaturstellen. Die Molverhältnisse von Markern zum Bestandteil des spezifischen "bindenden Paars können stark variieren, je nach Art des Markers sowie je nach Art des Bestandteils des spezifischen "bindenden Paars.

Spezielle Beispiele sind Enzym-Ligand- oder -Rezeptor-Konjugate, Substrat- oder Kofaktor-Ligand oder -Rezeptor-Konjugate, Chromogen-Ligand oder -Rezeptor und Katalysator-Ligand- oder -Rezeptor-Konjugate, wobei im Konjugat einer oder mehrere Marker vorhanden sein können. Die Liganden und Marker wurden vorstehend erläutert. Die Konjugation erfolgt auf an sich übliche Weise. Hierzu wird auf die ausführlichen Erläuterungen in der Literatur verwiesen.

Hilfsmaterialien

Beim erfindungsgemässen Test können verschiedene Hilfsmaterialien verwendet werden. Insbesondere können Enzymsubstrate, Kofaktoren und Inhibitoren an die hub-Kerne so gebunden werden, dass sie ihre Wirksamkeit beibehalten, aber an einem Eintritt in die Poren der Teilchen gehemmt werden. Bei Bindung eines Enzymsubstrats an einen hub-Kern findet die Enzymreaktion grossenteils im Grossteil der Lösung statt, so dass das Enzym in den Teilchen relativ inaktiv ist. Auf diese Weise ergibt sich bei Verwendung eines enzymspezifischen Konjugats des Bestandteils des bindenden Paars ein umso geringeres nachgewiesenes Signal,

je stärker das Konjugat an die Teilchen gebunden ist. 35

Im Gegensatz dazu wird bei Verwendung von Enzyminhibitoren

909843/Θ705

das Enzym im Grossteil der Lösung im wesentlichen gehemmt, wobei das Enzym in oder an den Teilchen gegenüber dem Inhibitor geschützt wird.

Verschiedene hub-Kerne können verwendet werden. Es kommen

sowohl die vorstehend in bezug auf die Teilchen beschriebenen hub-Kerne sowie andere hub-Kerne, wie Polypeptide, Proteine, Nucleinsäuren und andere synthetische Polymerisate, in Frage.
10

Eine Aufzählung von potentiellen Inhibitoren findet sich in der DE-OS

Te stpackungen

Aus Zweckmässigkeitsgründen können die Reagentien in Form von Testpackungen zur Verfugung gestellt werden, wobei die einzelnen Reagentien in vorbestimmten Verhältnissen vorhanden sind, so dass die Testempfindlichkeit in dem in Präge kommenden Bereich im wesentlichen optimiert ist.

Nach dem Ansetzen der Reagentien wird das Teilchenkonjugat im allgemeinen in einem wässrigen Medium einer Dichte, die im wesentlichen der Dichte der Teilchen entspricht, dispergiert, so dass die Teilchen im wesentlichen gleichmässig dispergiert oder dispergierbar bleiben. Durch Verwendung

25 von Additiven hoher Dichte oder durch Einstellung der

Dichte der Teilchen, kann die gewünschte Dichte erreicht werden.

Von besonderem Interesse sind zusätzliche Reagentien im signalbildenden System: Bei Verwendung von Enzymen können makromolekulare Fängerreagentien (scavenger) tragende Enzyme, Enzyminhibitoren oder Substrate und Antienzyme verwendet werden. Bei Verwendung von Chromogenen können Antifluoreszenzerreger, die gegebenenfalls Quencher tragen, Antichemilumineszenzerreger, makromolekulare Fängerreagentien, die Quencher tragen, sowie chromogene Reaktanten verwendet werden, die die chromophore Funktionalität schaffen oder zerstören.

909843/0705

Das Signal-Marker-Konjugat kann mit dem Teilchenkonjugat gleich oder von diesem verschieden sein, je nachdem ob die Bestandteile des spezifischen bindenden Paars gleich bzw. verschieden sind. Beide Konjugate können lyophilisiert werden oder in einem wässrigen Medium, das Stabilisatoren, wie Bacteriostatica, Bacteriöcide und Proteine enthält, eingeengt werden. Eines oder beides der Eeagentien können Puffer, Bestandteile des signalbildenden Systems, wie Enzymsubstrate und Kofaktoren oder dergleichen enthalten. 10

In einigen Fällen kann es erwünscht sein, als ein einziges Reagens, wobei die Bestandteile des spezifischen bindenden Paars nicht-kovalent aneinander gebunden sind, das Teilchenkonjugat und das signalbildende Konjugat bereitzustellen. Die Kombination kann vorher vorbereitet oder in situ hergestellt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozent- und Teilangaben auf das Gewicht, mit der Ausnahme, dass die entsprechenden Angaben für Flüssigkeitsgemische sich auf das Volumen beziehen. Folgende Abkürzungen werden verwendet: G6PDH = Glucose-G-phosphat-dehydrogenase; HK = Hexokinase; HIgG- = Human- ^-globulin; EDTA = Äthylendiaminotetraessigsäure; NHS = N-Hydroxysuccinimid; NADH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduziert); R-anti-HIgG = Kaninchen-anti-(human-IgG); ONPG = o-Nitrophenylgalactosid; r.t. = Raumtemperatur; RIgG = Kaninchen-IgG; RSA = Kaninchenserumalbumin; OAc = Acetat; AP = alkalische Phosphatase; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; ß-He = ß-Mercaptoäthanol; EDOI = Äthyldimethylaminopropylcarbodiimid.

9O9843/07OS

Γ ~

1 Beispiel 1

Herstellung eines Sepharose 4B-Kon,jugats mit G6PDH und HIgG

In einen Reaktionskolben werden 2,5 mg G6PDH, 16 mg GIucose-6-phosphat, 90 mg HADH, 0,19 mg HEgG und 0,25 S mit feuchtem Bromcyan aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, gewaschen mit 200 ml 1 millimolarer HCl) in 0,1 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 8,1 mit einem Gehalt an 0,5 m NaCl gegeben. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 4°C und anschliessend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird sodann mit 0,25 ml 1 m 2-Aminopropanol vom pH-Wert 8,0 versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Facht bei 4-⁰C gerührt. Anschliessend wird durch Zentrifugieren 3 mal mit je 2 ml 0,1 m Borat vom pH-Wert 8,5 mit einem Gehalt an 1 m NaCl und hierauf 2 mal mit je 2 ml 0,1 m Natriumhydrogencarbonat vom pH-Wert 8,1 mit einem Gehalt an 0,5 m NaCl und 0,05 Prozent Azid gewaschen. Nach Bestimmung der Enzymaktivität werden die Proben wieder gewaschen und in 0,1 m Natriumhydrogencarbonat, 2 mg/ml

Rinderserumalbumin und 0,05 Prozent Azid suspendiert. Es 20

werden jeweils Aliquotmengen von 2,5 ul von einem Gesamtvolumen von 1,4 ml mit etwa 0,5 ml gepackten Kügelchen verwendet. Die Enzymaktivität beträgt 12,1 U/ml. Die HIgG-Menge beträgt 129 ^g/ml oder 10,6 ^g/U des Enzyms.

Beispiel 2 Konjugation von Kaninchen-anti-HIgG mit HK

In einen Reaktionskolben werden 10,2 mg Kaninchen-anti HIgG in 1,2 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 10 pillimolar EDTA, 0,2 ml Dimethylformamid und 50/U-I (zugesetzt in 25 ,ul-Aliquotanteilen) einer 10 mg/ ml-Lösung von m-Maleinimidobenzoesäure-NHS-ester gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch an einer G50-Säule der Abmessungen 2,5 x 25 cm chromatographiert. Die Säule ist vorher mit mit Stickstoff gespültem 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 mit einem Gehalt an 10 mülimolar EDTA äqui-

S098A3/070S

libriert worden. Es werden Fraktionen von einem Volumen von 2 ml aufgefangen. Die Fraktionen 14 bis 16 werden vereinigt. 3,7 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»5 mit einem Gehalt an 10 millimolar EDTA und 13,5 mg HK werden mit 50jal 2 m Glucose und 0,4 ml DMF versetzt. Das Gemisch wird unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird mit 100 ul (in 4 Aliquotanteilen) einer 20 mg/ml-Lösung von S-Acetylmereap^bernsteinsäureanhydrid in DMF innerhalb von etwa 1 Stunde versetzt. Nach beendeter Zugabe und einer Reaktionszeit von 10 Minuten werden 0,4 ml

1 m Hydroxylamin vom pH-Wert 7i5 "unter Rühren und unter Stickstoff zugesetzt. Das Gemisch wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.

Anschliessend wird das Reaktionsgemisch an einer G50-Säule der Abmessungen 2,5 x 25 cm in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 (mit Stickstoff gespült) mit einem Gehalt an 10 millimolar EDTA chromatographiert und in Fraktionen von 2 ml Volumen aufgefangen. Die Fraktionen 16 bis 19 werden vereinigt. Das Gesamtvolumen der vereinigten Fraktionen beträgt 7,5 ^und der Proteingehalt 8,96 mg. Die Analyse ergibt 5,7 SH-Gruppen pro Hexokinase. Da die Hexokinase 4 SH-Gruppen enthält, wurden pro Hexokinase etwa 2 zusätzliche SH-Gruppen eingeführt. 7,3 ml der vorstehend hergestellten Hexokinaselösung werden mit 3,5 ml des behandelten Kaninchen-anti-HIgG (5,25 mg) versetzt, wobei das wässrige Medium aus 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 mit einem Gehalt an 10 millimolar EDTA und 30 millimolar Glucose besteht, das mit Stickstoff gespült worden ist. Das Ge-

³⁰ misch wird 48 Stunden bei 4°C umgesetzt.

Anschliessend wird das Reaktionsgemisch an einer Biogel A5M-Säule mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 mit einem Gehalt an 10 millimolar EDTA und 2 millimolar ß-Me und 0,02 Prozent Azid chromatographiert, wobei die Säule mit Stickstoff gespült und das Gemisch in einem Volumen von 6 ml auf die Säule aufgesetzt und in 3,5 ml-Fraktionen

909843/0705

Γ Ι NACHSEREICHT

1 eluiert wird. Die Fraktionen 4-5 "bis 68 werden vereinigt

und auf etwa 8 ml eingeengt. Das erhaltene Konjugat weist etwa 0,36 U/^ug auf. 2,9 mg HK und 2,50 mg Anti-HIgG sind gekuppelt.

Beispiel 3

Markierung von EIgG (Kaninchen- f -Globulin) mit C -Bernsteinsäureanhydrid

2 ml ElgG-Lösung xverden gegen 350 ml 0,1 m Katriumphos-phatpuffer vom pH-Wert 7 »6 48 Stunden ohne Austausch der Dialyseflüssigkeit dialysiert. Die dialysierte Lösung weist eine Konzentration von 13_?0 mg/ml BIgG (bestimmt durch UV-

14-Spektroskopie) auf. C -Bernsteinsäureanhydrid (50 μο. ,

0,7 mg) werden mit "kaltem" Bernsteinsäureanhydrid im Verhältnis 1 : 10 verdünnt und in Aceton zu einer 0,1 m Lösung (2,10 cpmy/uMol) verdünnt. 30^uI dieser Lösung werden bei Baumtemperatur unter Bühren zu 0,88 ml (11,4- mg) der dialysierten BIgG-Lösung gegeben. Nach 4-0-minütigem Eühren werden 155 P-I 2 m Hydroxylamin-HCl vom pH-Wert 8,0 zuge-

setzt. Nach einer weiteren Eührzeit von 2 Stunden wird das Beaktionsgemisch bei 4-⁰C gegen 350 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 72 Stunden bei 6-maligem Austausch der Dialyseflüssigkeit dialysiert. Die dialysierte Lösung (1,07 ml) weist eine Konzentration von 11,0 mg/ml EIgG und 1,37 ^χ 10 cpm/ml (10 Bernsteinsäureanhydridreste pro EIgG) auf.

Beispiel 4-

Einfuhren von Sulfhydrylgruppen in BIgG 30 —

1,85 mg S-Acetylmercaptobernsteinsäure werden in 25 ^uI wasserfreiem Dimethylformamid bei Eaumtemperatur langsam zu einer gerührten Lösung von 5,5 mg EIgG (vorstehendes Beispiel) in 1,0 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,02 m EDTA gegeben. Hierbei wird unter Stickstoff gearbeitet. Nach 10-minütigem Eühren werden 0,1 ml 1,0 m Hydroxylamin-HCl vom pH-Wert 7,5 zu-

909843/0705

γ -ι

OQI orrrj

gesetzt. Nach, einer weiteren Rührzeit von 10 Minuten wird das Reaktionsgemisch an einer mit Sephadex G-25 fein gepackten Säule der Abmessungen 0,9 x 10,5 cm (entgast und mit Argon gesättigt) unter Verwendung von 0,05 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 5₅O mit einem Gehalt an 0,02 m EDTA (entgast und mit Argon gesättigt) Chromatograph!ert. Fraktionen mit einem Volumen von 0,8 ml werden hei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,125 ml/min aufgefangen. Die Fraktionen 5 "bis 7 werden vereinigt. Man erhält 2,5 ml Lösung mit einem Gehalt an 4-, 3 mg RIgG ("bestimmt aufgrund der Radioaktivitätszählung).

Beispiel 5 Einführen von Maleinimidogruppen in alkalische Phosphatase

1 ml (5»0 mg, 5075 I.U.) einer Suspension von alkalischer Phosphatase wird zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt. Das abgeschiedene Enzym wird in 1,0 ml 0,05 m. Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen 500 ml des gleichen Puffers 4-8 Stunden unter 4-maligem Wechsel der Dialyseflüssigkeit in der Kälte dialysiert. Die dialysierte Lösung wird gerührt und mit 0,4- mg m-(N-Maleinimido)-benzoesäure-N-hydroxysuccinimidester in 4-0^1 wasserfreiem Dimethylformamid versetzt. Nach 30-minütigem Rühren wird die Umsetzung durch Zugabe von 0,4- ml 1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,0 beendet. Das Reaktionsgemisch wird an einer mit Sephadex G-25 fein gepackten Säule der Abmessungen 0,9 x 25 cm unter Verwendung von 0,02 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5_s0 chromatographiert. Fraktionen von 1,0 ml werden bei einer Strömungs ge schwindig-

keit von 0,125 ml/min aufgefangen. Nach Vereinigung der Fraktionen 6 und 7 erhält man 2,15 ml Lösung mit einem Gehalt an 2,5¹^ &g alkalischer Phosphatase (berechnet aufgrund von UV-Messung).

1 Beispiele

Konjugation von RIgG und alkalischer Phosphatase

Die Lösung der alkalischen Phosphatase wird in einer Konzentration von 0,02 m mit EDTA versetzt und auf den pH-Vert 6,5 eingestellt. Anschliessend wird die Lösung unter Stickstoff gerührt und langsam mit der RIgG-SH-Lösung von Beispiel 4 versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,7 gebracht. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden "bei Raumtemperatur und

sodann über Nacht bei 4°C gerührt. Fach Zugabe von 0,2 ml 10

einer 0,01 m Mercaptoathanollosung und 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reakti.onsgemisch 72 Stunden bei 4°C stehengelassen. Sodann wird die Lösung auf 1 ml in Amicon unter Verwendung eines PM30 Diaflo-Ultrafilters eingeengt und an einer 1,5 ^m Biogel Α-Säule der Abmessungen 1,5 x 87 cm unter Verwendung von 0,1 m Tris-HCl vom pH-Wert 7»6 mit einem Gehalt an 0,05 m NaGl und 1 millimolar MgCIo chromatographiert. Fraktionen von 1,0 ml werden bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml/Stunde aufgefangen.

Die Fraktionen 46 bis 48 (RIgG-AP-I) und 49 bis 60 (RIgG-20

AP-II) werden zu einem Volumen von 2,75 ^ml bzw. 12,1 ml vereinigt. Nach Bestimmung der Eigenschaften des Konjugats werden die Lösungen durch Zusatz von 0,05 Prozent NaN-. und 1 mg/ml Hühnereialbumin stabilisiert. Nachstehend

sind die Eigenschaften des Produkts, die aufgrund der 25

Radioaktivitätszählung und der UV-Absorption ermittelt

sind, zusammengestellt.

% enzjma-

Gesamt- AP/RIgG % Enzym tische Konjugat menge, mg Mo 1 verhältnis gebunden Aktivität

RIgG-AP-I 1,16 1,75 100% 4,0% RIgG-AP-II 3,16 0,85 100% 6,0%

1 Beispiel?

Konjugation von ß-D-Galactosidase und HIgG (Human IrG) an Sepharose 4-B-Kügelchen

1,0 mg (300 I.U.) ß-D-Galactosidasewerden in Form einer Suspension (0,2 ml) zentrifugiert, sodann in 1,0 il 0,1 m Natriumhydrogencarbonatpuffer mit einem Gehalt an 0,5 m KaCl gelöst und sodann 24 Stunden ohne Austausch der Dialyseflüssigkeit gegen 1 Liter dieses Puffers bei 4°C dialysiert. 100 mg mit Bromcyan aktivierte Sepharose 4B-Kügel- _5

chen werden 15 Minuten mit 10 ^ m HCl-Lösung gequollen

und gewaschen- Die gequollenen Kügelchen werden mit 1,0 mg ß-D-Galactosidase und 1,0 mg HIgG in 5 ml 0,1 m Natriumhydrogencarbonatpuff er mit einem Gehalt an 0,5 m NaCl versetzt. Diese Massnahme wird in einem Reagenzglas durch-15

geführt, d.as insgesamt 2 Stunden bei Kaumtemperatur gedreht wird. Ungebundenes Material wird mit Kupplungspuffer ausgewaschen. Die verbleibenden aktiven Gruppen werden 2 Stunden mit 1 m 2-Propanolamin beim pH-Wert 8,0 umgesetzt. 3 Waschvorgänge werden durchgeführt, um nicht-kovalent absorbierte Proteine zu entfernen, wobei jeder Zyklus aus einer Waschung mit 0,1 m Natriumacetatpuffer mit einem Gehalt an 0,5 n NaCl und einer anschliessenden Waschung mit 0,1 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,05 m NaCl und 1 millimolar MgCIp besteht. Die Kügelchen werden in 1,5 ml 0,1 m Tris-HGl-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 m IaCl, 1 millimolar MgCl₂ und 0,05 Prozent NaN, suspendiert.

Beispiel 8 30

Herstellung von 4-Methylumbelliferyl-ß-D-(-)-galacto-

pyranos id-6-pho sphat

a. 4-Methylumbellif eryl-tetra-O-(trimeth,ylsilyl)-ß-D-(-)-galactopyranosid (4-MUG-tetra-OTMS)

3,0 g 4-Methylumbelliferyl-ß-D-(-)-galactapyranosid, 18 ml Hexamethyldisilazan und 12 ml Chlortrimethylsilan werden

909843/0705

Γ ~

über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon in 80 ml wasserfreiem Pyridin gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Die nach Zusatz von Diäthyläther gebildeten weissen Kristalle werden abfiltriert. Der Überstand wird eingedampft, wobei weisse Kristalle entstehen. Die Kristalle werden über Nacht aus 30 ml Hexan in der Kälte umkristallisiert. Man erhält ^,75 S (80 Prozent d. Th.) feine weisse Kristalle vom Έ. 135 "bis 137,5°C. Der R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxid unter Verwendung eines Gemisches aus Äther und Hexan (2 ; 1) als Laufmittel beträgt 0,67-

b. 4-Methylumbelliferyl-2,3,^-tri-O-Ctrimethylsilyl)-ß-D-(-)-galactopyranosid (4-MUG-tri-OTMS)

^,7 S 4-MÜG-tetra-OTMS werden in 200 ml kaltem, v/asserfreiem Methanol suspendiert. Die auf 0⁰C gekühlte Suspension wird unter Rühren mit 50 ml wasserfreiem Methanol behandelt, das mit 220 mg K^CO^ geschüttelt worden ist. Die Suspension

wird innerhalb von 45 Minuten unter Rühren gelöst. Die Lö-20

sung wird sorgfältig mit einer verdünnten Lösung von Eisessig in wasserfreiem Methanol neutralisiert. Der nach dem Entfernen des Methanols bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Diäthyläther aufgenommen. Nach dem Filtrieren des Äthers und Eindampfen erhält man 3,2 mg weisse Kristalle mit einem R~-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Diäthyläther und Hexan (2:1) als Laufmittel von 0,28.

c. 4-Me bhylumbelliferyl-ß-D-(-)-galactopyranosid-6-

cyano äthyIpho sphat

3,2 g 4-MUG-tri-OTMS, 2-Cyanoäthy!phosphorsäure (hergestellt aus 3,3 g des Dihydrate des Bariumsalzes) und 10 g Dicyclohexylcarbodiimid werden 60 Stunden in 50 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur gerührt. Sodann werden 26 ml Wasser zugesetzt. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt.

909843/0705

r ■ ' -ι

Anschliessend wird das Gemisch zur Trockne eingedampft und mit 750 ml Methanol, 130 ml Wasser und 5i3 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Methanol unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 8 g eines kautschukartigen Öls, das an einer mit Kieselgel gepackten, trockenen Säule der Abmessungen 3,5 x 80 cm unter Verwendung von CHGl^/ CH-OH/HgO (50 : 35 : 5) chromatographiert wird. Die Säule wird in 8 gleiche Abschnitte geschnitten. Das Produkt wird aus dem dritten Abschnitt von oben mit Methanol extrahiert. Die trübe Methanollösung wird auf ein geringes Volumen eingeengt. Nach Entfernung der Trübung durch Zentrifugieren wird die Lösung zu 2,1 g eines gelblichen Öls eingeengt. Das Öl wird in 5 ^l Äthanol gelöst und mit 100 ml Aceton versetzt. Man erhält 1,5 g eines weissen Pulvers.

Bei der UV- und NMR-Spektroskopie ergibt sich eine 50-prozentige Reinheit. Bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Vervrendung eines Gemisches aus CHCl,,, CiL₅OH und H₃O (50 : 35 : 5) ergibt sich ein R_f-¥ert von

²⁰ 0,45.

d. 4-Methylumbelliferyl-ß-D-(-)-galactopyranosid-6-phosphat

1,5g der rohen CyanomethyIverbindung werden in einer Lösung aus 4-2 ml 58-prozentigem NIL₊OH und 18 ml V/asser gelöst und 2 1/2 Stunden auf 55°C erwärmt. Die Lösung wird zentrifugiert. Der Überstand wird zu einem gelblichen Öl eingedampft, der nach Zusatz von 12 ml Methanol kristallisiert. Die weissen Kristalle werden 2 mal mit Aceton gewaschen. Man erhält 0,85 g Material, das der präparativen 30

Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus CHCl,, CH^OH und H₅O (60 : 35 : 5) als Laufmittel unterzogen und mit Methanol extrahiert wird. Die extrahierte Lösung wird auf ein geringes Volumen eingeengt und mit Aceton versetzt. Es fallen 0,51 g weisse Kristalle aus. Bei der DünnschichtChromatographie an Siliciumdioxid unter Verwendung von iPrOH-58% NEL₄OH-HpO (60 :

309843/070S ^J

^Γ " 78

5 :35) als Laufmittel ergibt sich ein R„-Wert von 0,64-, Die Verbindung erweist sich aufgrund der UV-Spektroskopie sowie aufgrund der enzymati sehen Hydrolyse durch alkalische Phosphatase und ß-D-Galactosidase zu y? Prozent rein

Beispiel 9
Konjugation von HIgG und ß-Galactosidase

Ein Eeaktionsgemisch wird durch Vereinigen von 4- ml HIgG (8,34- mg/ml, ^O millimolar'Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0)

2,17 ml Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und 20 μΐ DHF-Lösung von m-(I\T-Maleinimidyl)-benzoesäure-ii-hydroxysuccinimidester (10 mg/ml) hergestellt, wobei mit hoher Geschwindigkeit gerührt wird. Nach 30-minütigem Stehenlassen unter Stickstoff bei Baumtemperatur wird das Reaktionsgemisch zur Einstellung des pH-Werts auf 5 mit 1 ml 1 ι DTaOAc versetzt. Sodann wird das Gemisch an Sephadex G-25-F (2,4 χ 20 cm) chromatographiert, mit 20 millimolarem HaOAc vom pH-Wert 5,0 mit einem Gehalt an 0,15 m HaCl mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/Stunde chromatographiert, xrobei Fraktionen

mit einem Volumen von 6,6 ml aufgefangen werden. Die !Fraktionen 5 bis 7 werden vereinigt. Die Cysteinanalyse ergibt etwa 7 Maleinimidgruppen pro HIgG.

Das mit Maleinimid modifizierte HIgG wird mit Phosphat-25

puffer verdünnt und anschliessend mit 2 ml einer ß-Galactosidaselösung in 50 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (0,67 g/ml) versetzt, wobei ein endgültiges Reaktionsvolumen von 14-,1 ml entsteht. Die nachstehende Aufstellung

gibt die verschiedenen Lösungsmengen, mit denen die 3 Prä-30

parate versetzt werden, an.

909843/070S

Γ "I

Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 0,5 m 0,05 m.

Konjugat	Maleinimid- HIgG	SS.
	ml	2,54
1	1,5	8,45
2	5,0	20,03
3	11,85

ml ml

0,15 10,45

0,50 7,60 1,25

Die Reaktion wird 21 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur durchgeführt. Die restlichen Maleinimidgruppen werden mit Cystein-HCl umgesetzt. Die Lösungen werden unter Stickstoff einer Amicon-Ultrafiltration an einer PM30-Membran (Konjugate 1 und 2) bzw. an einer PM10-Membran (Konjugat 3) auf ein endgültiges Volumen unter Einschluss von Waschflüssigkeit von etwa 2 ml eingeengt. Die 3 Proben werden sodann an Biogel A5M (82 χ 1,5 cm) mit PBS mit einem Gehalt an 0,05 Prozent NaH, und 1 millimolar Mg(OAc^ chromatographiert. Es werden 4 bis 8 ml/Stunde eluiert. Fraktionen von etwa 2,5 ml werden aufgefangen. Beim Kon-

jugat 3 werden beispielsweise die Fraktionen 25 bis 3^ vereinigt und bestimmt. Etwa 67 Prozent der Enzymaktivität werden als konjugiertes Produkt gewonnen. Bezogen auf die radioaktive Zählung von radioaktiv markiertem HIgG v/erden insgesamt etwa 81 Prozent HIgG gewonnen. Die Snzym-

konzentration beträgt 31,45 ;ug/ml während die HlgG-Kon-

zentration 83,4 ug/ml beträgt.

Bei s.p i e 1 10

Herstellung von Kaninchen-anti(HIgG) (R-anti (HIgG)), gebunden an Sepharose 4B-Kügelchen

In ein Reaktionsgefäss werden 2 ml Lösung mit einem Gehalt an 7,5 Kg Kaninchen-anti(HIgG) in 0,1 m ITaHCO^ vom pH-Wert 8,1 mit einem Gehalt an 0,5 m NaGl sowie 0,9 g GlTBr-aktivierte Sepharose 4B-Kügelchen gegeben. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 4°C und anschliessend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird das Gemisch mit

909843/0705

Γ "I

0,1 Volumteilen 1 m 2-Aminopropanol vom pH-Wert 8,0 versetzt. Das Gemisch wird sodann über Nacht bei 4°C gerührt. Bei Verwendung von radioaktivem R-anti-(HIgG) lässt sich feststellen, dass 6,6 mg eine Kopplung eingegangen sind. 5

Die Kügelchen (Proteingehalt etwa 5 mg/ml gepackte Kügelchen) werden durch einmaliges 30-minütiges Suspendieren in PBS gewaschen und sodann 3 mal zentrifugiert. Nach Suspendieren in etwa 1/3 Vol./Vol. PBS werden etwa 0,5 ml der suspendierten Kügelchen (etwa 0,2 ml Kügelchen) in etwa 1,5 ml PBS verdünnt. Die Lösung wird in das kleine Probengefäss des Modell V/185 Systems, Ultrasonics Inc., mit einer Leistung von 60 Watt, Einstellung etwa 1,5» gegeben, wobei die Probe in einem Eisbad gekühlt wird. Sodann wird 3 Minuten mit Ultraschall behandelt. Hierauf wird zentrifugiert und xtfeitere 2 Minuten Ultraschallbehandlung durchgeführt .

Beispiel 11

Herstellung eines Kon_;jugats aus o-Nitrophenyl-ß-galactosid und Dextran

a. 7 ml 1,8 η Natriumchloracetatlösung und 3 ml Wasser v/erden zu 2 g Dextran T2000 (Pharmacia) gegeben. Anschließend werden 10 ml 2,5 n. wässriges Natriumhydroxid zuge-

²⁵ setzt. Das Gemisch wird 1 1/2 Stunden auf 70 bis 75°C

erwärmt und sodann über Nacht stehengelassen. Das Gemisch wird hierauf mit 2 ml Eisessig versetzt und anschliessend gegen 10 Liter 5-prozentige wässrige Essigsäure (4- χ 24 Stunden) und schliesslich gegen 10 Liter entionisiertes Wasser (4· χ 24· Stunden) dialysiert. Bei Verwendung von radioaktiv markiertem Chloracetat ergibt sich, dass pro 1 mg Dextran etwa 1,21 juMol Carboxymethylcellulose gebunden sind.

909843/0705

Γ

b. 80 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 1,96^uMoI Carboxymethyldextran (vorstehend hergestellt) werden mit 8 ml (40 mMol) K",E"^l-Bis-(3-aminopropyl)-piperazin und 18 g (90 mMol) SDCI versetzt. Die Lösung wird 24 Stunden "bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgemisch gegen 12 Liter entionisiertes V/asser mit einem Gehalt an 150 g K₂HPO₄ und 73 g KR₂^⁰M- ^ ^{mal 24} Stunden) dialysiert. Die Anzahl der Aminogruppen wird unter Verwendung von Trinitrobenzolsulfonsäure bestimmt. Das Ergebnis ist 68 Prozent der zur Verfügung stehenden Carb oxygrupp en.

c. 10 ml DMP werden mit 387 mg 2-Nitro-5-carboxyphenylß-galactosid, 249 mg EDCI und I5I mg K-Hydroxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. 10 ml einer wässrigen Lösung des vorstehend hergestellten aminosubstituierten Dextrans (9>2 Millimolar in bezug auf Aminogruppen) werden mit 2,5 ml des vorstehend hergestellten NHS-Esters versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Gemisch 4 mal gegen Wasser dialysiert. Das Produkt wird auf o-Nitrophenyl-ß-galactosidgruppen (OHPG) analysiert. Durch UV-Spektroskopie ergibt sich ein Gehalt von 7»0 mMol/ ml.

Zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine Bestimmung auf HIgG durchgeführt. Nachstehend sind die verwendeten Reagentien zusammengestellt.

30 Te stbe standteile

1) Sepharose 4B-(G-6-PDH)-HIgG-Kon;jugat (Beispiel 1)

^..20 mg Kügelchen/ml 16,3 U/ml G-6-PDH 8,0 ng/ml HIgG

909843/0705

2) Kaninchen-anti-(ffigG)-hexokinase-Konjugat (Beispiel 2)

14-1,5 ,ug/ml Konjugat 65 ^ig/ml Kaninchen-anti-(KEgG)

⁵ HK/Kaninchen-anti(HIgG) Molverhältnis 1,7

3) Inkubationspuffer

50 Millimolar Tris χ HCl, 200 millimolar

NaCl, 3 ndllimolar HAD®, 3 millimolar ATP, 10

100 millimolar Glucose, 6 millimolar MgCl ,

20 % Gew./Vol. (g/ml) Saccharose, 0,05 %

₅, pH-Wert 8,0

Zur Durchführung des Tests werden 8 yl Kügelchen zu 50 ^uI Inkubationspuffer mit unterschiedlichen Gehalten an Human-IgG gegeben. Das Inkubationsgemisch wird mit 8 ^uI Kaninchen-anti(HIgG)-HK-Kon₍jugat versetzt. Die Proben werden 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Anschliessend wird das

Gemisch mit 1 ml Testüuffer versetzt. Das Gemisch wird 20

etwa 3 Sekunden heftig durchgemischt und sofort in einen Stasar Ill-Spektrophotometer aufgesaugt. Die Geschxvindigkeit der NADH-Bildung wird 2 Minuten bei 37°C und 3^0 nm festgehalten. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

Probe ng HIg "^4(Z^{2 min} Ave SD CV%

³⁰ 2 416 129, 133 131 2,8 2,1

1,5 1,1

1,4 I₇O

7,0 4,5

15,5 9,3

35 7 ι 7i i7fi uc ΙΛΟ 2,8 1 7

1	1248	123,	128	128	125,5
2	416	129,	133		131
3	139	129,	131,	157	129,3
4	46,2	147,	149		148
5	15,4	151,	165,		157,7
6	5,14	177,	155	166
7	1,71	170,	166	168

909843/0705

Die vorstehenden Werte ermöglichen die Aufstellung einer Eichkurve zur Bestimmung eines Antigens (Human-IgG) in einer unbekannten Probe.

Der folgende Test erläutert die Verwendung von gekuppelten Enzymen, alkalische Phosphatase und ß-Galactosidase, zur Bildung einer fluoreszierenden Verbindung aus einer nichtfluoreszierenden Verbindung.

Testbestandteile

Inkubationspuffer: 0,1 m Tris-HCl vom pH-Wert 8,0,

50 millimolar HaCl, 1 millimolar MgCIp, 0,05% NaN^, 1 mg/ml Eialbumin

Substratlösung: 0,75 mg/ml 4-MUG-6-P in 0,1 m Tris-HCl

vom pH-Wert 8,0, 50 millimolar ITaCl, 1 millimolar MgCIp

Quenchlösung: 0,4 m Glycin-NaOH, pH-Wert 10,3 Sepharose 4B-ß-D-Galactosidase-HIgG: Verdünnung 1:4 mit

Inkubationspuffer ohne Eialbumin

EIgG-AP-II: . Verdünnung 1:4 mit Inkubationspuffer HIgG und nicht-immunogenes EIgG: Verdünnungen in Inkubationspuffer.

1. Vorinkubation:

Probe

1	0
2	24
3	48
4	150
5	300
6	600
7	1200

Te stergebni sse

EIgG-AP-II (2O_-Ul) wird zu 100^uI Inkubationspuffer mit einem Gehalt an HIgG in den nachstehend angegebenen Mengen gegeben:

ng

Die Proben werden 1 Stunde bei Eaumtemperatur gerührt.

9139843/0705

Γ J NACHGEREiC; Π « Π

_ 84 - *— —J

2. Inkubation: 20 ,μΐ Kügelchen-Suspension werden zugesetzt. Die Proben werden 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

3- Reaktion: 0,35 ml Substratlösung werden zugesetzt,

gründlich vermischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rühren stehengelassen.

4. Quenchen: 0,5 ml Quenchlösung werden zugesetzt, gründlich vermischt und die Fluoreszenz (\_ex-365i X_em-W) wird gemessen.

Die nachstehenden Fluoreszenzwerte werden für die Proben 1 bis 7 ermittelt:

i 15

Probe	ngHIgG	10"¹M HIgG	F
1	0	0	457,404
2	24	1,5	411
3	48	3	372
4	150	9,4	303,300
5	300	18,8	231
6	600	37,5	211
7	1200	75	228,203

Aus diesen Daten lässt sich eine Eichkurve für die Be-25

Stimmung eines Antigens (HIgG) mit einer unbekannten Probe

aufstellen.

Ein [Test für HIgG wird folgendermassen unter Verwendung

von ultraschallbehandelten Sepharose 4B-Kügelchen, die mit 30

R-anti-HIgG konjugiert sind, durchgeführt. Folgende

Materialien werden verwendet: Sepharose 4B-R-anti-HIgG, suspendiert in einer Menge von 0,1 ml/ml in Puffer (PBS, 5 millimolar N,), ONPG-Dextran (2M Molekulargewicht), 10 millimolar NaN_x, 0,1 Prozent RSA, das HIgG-ß-Galactosi- -^

dase-Konjugat (1) (4 millimolar) in PBS, 0,1 Prozent RSA, 5 millimolar N^, 0,1 millimolar Mg(OAc)₂ (9^g/ml ß-Galac-

909843/0705

OftKalNAL INSPECTED

tosidase) und EIgG oder HIgG (50 mg/ml) in PBS, 10 millimolar

Das Verfahren wird folgendermassen durchgeführt: 50 JiI Kügel chen oder 50 pl Puffer werden mit 500 ^l EIgG oder HIgG oder Puffer kombiniert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend werden 50 p.1 des Enzymkonjugats zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 0,1 ml des ONPG-Dextransubstrats und 0,8 ml Puffer mit einem Gehalt an 0,1 Prozent ESA und 0,1 millimolar Mg zugesetzt. Das Endvolumen beträgt 1,05 ml. Diese Lösung wird. sofort in eine Spektrophotometerzelle gesaugt. Die Ablesung des Reaktionsgemisches wird bei 37°C 10 und 40 Sekunden nach der Substratzugabe bei 420 nm vorgenommen. Die Ergebnisse sind als /^ODmin" nachstehend zusammengestellt.

Röhrchen Kügelchen RIgG HIgG Puffer

20 2 - -

1. + Anwesenheit; - Abwesenheit

2. % Aktivität des Enzymkonjugats in Puffer mit Substraten

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die Kügelchen die Reaktion des Galactosidasekonjugats mit dem makromolekularen Substrat hemmen, wenn das Konjugat an die Kügelchen gebun-

den ist, während keine Wirkung auf die Galactosidase eintritt, wenn das Konjugat nicht an die Kügelchen gebunden ist. Wenn HIgG zugesetzt wird, um die Bindung des HlgG-ß-Galactosidasekonjugats an die Kügelchen zu blockieren, so behält die

Galactosidase ihre Aktivität= 35

Ein ähnlicher Test, wie vorstehend beschrieben, wird unter

90 9'8 43/07O

Geschwxn- digkeit	% Aktivi tät²
0,920	103
0,894	100
0,428	48
0,906	101

- 86 -

Verwendung der nachstehend aufgeführten Reagentxen durchgeführt :

Puffer: PBS, 0,1 Prozent RSA, 5 Millimolar HaN₅, 0,1 Millimolar Mg(OAc)₂

Teilchen: R-anti HIgG in Puffer in einer Konzentration von 0,02 ml/ml

Konjugat: Konjugat von Beispiel 9 in Puffer in einer Menge von 9 Jig ß-Galactosidase/ml

HIgG: 5_?0 mg/ml in PBS, 5 millimolar NaN^, weiter verdünnt, wie angegeben

Substrat: OMPG-Dextran (2M Molekulargewicht), 4- millimolar OKPG in FBS, 5 millimolar

Das Verfahren wird folgendermassen durchgeführt: Jeweils

der Konjugatlösung, 50 ^l der HIgG-Lösung und 50 ,μΐ der Teilchen mit 100 ^uI Puffer werden vereinigt. Die verdünnten Reagentien werden in der angegebenen Reihenfolge zugesetzt. Die Inkubation wird 3 Stunden bei Raumtemperatur vorgenommen 0,1 ml Substrat und 0,4 ml Puffer werden zugesetzt. Das Gemisch wird in eine Spektrophotometerzelle gesaugt. Bei 37⁰C wird 10 und 4-0 Sekunden nach der Sub st rat zugabe abgelesen. Nachstehend sind die Ergebnisse zusammengestellt.

	HIgG ₂_	Geschwin	Aktivität
	Verdünnung	digkeit min" '	*
Röhrchen Teilchen	unendlich	0,776	(100)
1	unendlich	0,186	24
2 +	16384	0.150	19
3 +	4096	0_r196	25
4 +	1024	0,328	42
5 +	256	0,548	71
6 +	64	0,702	90
7 +	16	0,762	98
8 ' +	4	0,768	99
9 +	1	0,762	98
tLO +

1. - Puffer; + Teilchen;

2. unendlich: HIgG-Lösung durch Puffer ersetzt; HIgG-Lösung in einer Verdünnungsreihe jeweils 4-fach verdünnt-

909843/0705

Die vorstehenden Ergebnisse erläutern einen Test für HIgG über einen sich um den Eaktor 10 unterscheidenden Konzentrationsbereich von etwa 3 bis 0,03 Mikromolar.

Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt eine genaue Messung von äusserst geringen Konzentrationen einer grossen Anzahl von Liganden, sowohl haptenischen und antigenen, und von Rezeptoren. Das Verfahren ist rasch, benötigt nur eine kurze Messdauer und kann mit den verschiedensten Instrumenten, die im Handel erhältlich sind, durchgeführt werden, Ferner ist beim erfindungsgemässen Verfahren kein reines Antigen oder reiner Antikörper zur Herstellung der verschiedenen Reagentien erforderlich. Solange eine signifikante Anzahl von Bestandteilen des spezifischen bindenden Paars an die Teilchen gebunden sind, wirkt die Anwesenheit von anderen Fremdbestandteilen, die an die Teilchen gebunden sind, beim Test nicht störend. In ähnlicher Weise wird in bezug auf den homologen Bestandteil, der markiert ist, eine wesentliche Vergrösserung des beobachteten Signals festgestellt, was auf eine Kombination der Bestandteile des signalbildenden Systems in den Teilchen zurückzuführen ist, wodurch die Wirkung des Hintergrunds des Grossteils der Lösung verringert wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist äusserst vielseitig und erlaubt eine grosse Anzahl von verschiedenen Kombinationen zur Erzeugung von Signalen. Ferner kann durch eine Variation der Art der Teilchen die Empfindlichkeit des Systems weiter erhöht werden. Ausserdem ermöglicht das System eine wesentliche Verringerung des Hintergrunds, indem makromolekulare Materialien zur Verfugung gestellt werden, die mit den Materialien im Grossteil der Lösung in Wechselwirkung treten können, so dass deren Fähigkeit zur Beeinträchtigung des nachweisbaren Signals verringert wird. Beispielsweise kann bei Verwendung von Enzymen in Kombinationen ein Inhibitor für das ünzym im Grossteil der Lösung angewendet werden, der ausreichend gross ist, dass er im wesentlichen zu einer Hemmung des Enzyms in den Teilchen nicht in der Lage ist.

908843/0705 ORIGINAL INSPECTED

Claims

VOSSIUS . VOSSIUS · HILTL · TAUCHNER · HEUNEMANN

PATENTANWÄLTE

SI E BE RTSTRASS E 4· · 8 O OO MÖNCHEN 86 - PHONE: (O89) 47 4.O 7 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 4-5 3 VOPAT D

u.Z.: P Case: 3652-121 L SYVA COMPANY Palo Alto, California, V.St.A.

"Verfahren zur Bestimmung eines Analyten und Reagens zu
dessen Durchführung"

Priorität: 5. April 1978, V.St.A., Nr. 893

24. Nov. 1978, V.St.A., Nr. 964

Patentansprüche

. 1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, der Bestandteil

^s^_y eines aus Ligand und dessen homologen Rezeptor bestehen-25 den spezifischen bindenden Paars ist,

gekennzeichnet durch die Verwendung
eines

(a) kontinuierlichen wässrigen Mediums,

(b) diskreter, dispergierbarer, fester Teilchen, an die
30 ein Bestandteil des Paars unter Bildung eines Teil-

chenkonjugats gebunden ist, wobei das Teilchenkonjugat um den konjugierten Bestandteil des Paars eine vom wässrigen Medium verschiedene Umgebung definiert und

35 (c) eines signalbildenden Systems, das zur Bildung eines messbaren Signals in der Lage ist, wobei das Ausmass

9Q98U/07QS

ORIGINAL iNSPECTEO

des Signals dadurch beeinflusst wird, inwieweit sich. ·■ das signarbildende System innerhalb der Umgebung der Teilchen befindet,

(d) wobei mindestens ein Bestandteil des signalbildenden Systems an einen Bestandteil des Paars unter Bildung

eines Signal-Marker-Konjugats gebunden ist, und wobei die Menge des an das Teilchenkonjugat gebundenen Signal-Marker-Konjugats mit der Menge des Analyten im

wässrigen Medium in Beziehung steht, 10

wobei man zur Durchführung des Verfahrens in einem wässrigen Testmedium folgende Bestandteile vereinigt

(a) die Probe,

(b) das im wesentlichen gleichmässig im Medium dispergierte Teilchenkonjugat,

(c) das Signal-Marker-Konjugat,

(d) den homologen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, wenn es sich bei Analyt, Teilchenkonjugat und Signal-Marker-Konjugat um den gleichen Bestandteil

²⁰ des spezifischen bindenden Paars handelt und

(e) restliche Bestandteile des signalbildenden Systems,

mit der Massgabe, dass ,wenn es sich beim Analyt um einen ersten Rezeptor handelt, der an die Teilchen gebundene Bestandteil des Paars der homologe Ligand oder Rezeptor für den ersten Rezeptor sein kann und der Bestandteil des Signal-Marker-Konjugats der Rezeptor für den ersten Rezeptor bzw. den homologen Liganden sein kann, und

das Ausmass des Signals unter Vergleich mit einem Testmedium mit bekannter Analytenmenge bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Testmedium eine Temperatur von etwa 10 bis 50⁰C und einen pH-Wert von etwa 5 bis 10 aufweist.

909843/0705

Γ "I
3. Verfahren nach. Anspruch 2, dadurch.gekennzeichnet, dass das signalbildende System mindestens ein erstes Enzym aufweist.
4-, Verfahren nach Anspruch. 3, dadurch gekennzeichnet, dass das messbare Signal auf einer Verbindung beruht, die durch Lichtabsorption bei einer Wellenlänge über 300 nm nachgewiesen wird.
5« Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das messbare Signal auf einer Fluoreszenzlichtemission bei einer Wellenlänge über 350 nm beruht.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch geke η nzeichnet dass das signalbildende System ein Ligand-Enzym-Konjugat enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das signalbildende System ein

Rezeptor-Enzym-Konjugat enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h- gekennzeichnet, dass das signalbildende System ein makromolekulares Substratreagens für das erste Enzym enthält.
9- Verfahren nach einem der Ansprüche 3bis8, dadurch. g e k e nnz e i chnet, dass es sich bei dem ersten Enzym um eine Oxidoreduktase handelt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennze ichnet, dass es sich bei dem ersten Enzym um eine Hydrolase handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem signalbildenden

^L 909843/070S -i

* System um ein zweites Enzym handelt, das mit dem ersten

Enzym in Beziehung steht, wobei das Produkt eines der Enzyme das Substrat für das andere der Enzyme darstellt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym und der Ligand an die Teilchen und das zweite Enzym an den Rezeptor gebunden sind.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym und der Rezeptor an die Teilchen und das zweite Enzym an den Liganden gebunden sind.

^
14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch geken nzeichnet, dass das signalbildende System einen Fluoreszenzerreger enthält, der Licht bei einer Wellenlänge von über 350 nm emittiert.

15- Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzerreger an einen Bestand teil des spezifischen bindenden Paars gebunden ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15,dadurch gekenn-ζ e i c h η e t, dass das signalbildende System einen

Antifluoreszenzerreger enthält.

17. Verfahren nach Anspruch I5, dadurch geken nz e i ebnet, dass es sich bei dem Teilchenkonjugat um einen an die Teilchen gebundenen Liganden handelt.

18. Verfahren zur Bestimmung eines Ligandenanalyten in einer Probe, wobei der Ligand mit seinem homoIonen Antiliganden ein npnr.if i sohes bindendes Paar definiert., gekennzeichnet d u r c h die Verwendung

909843/0705

Γ "I

^ (1) eines Mediums, enthaltend eine wässrige, auf einen pH-Bereich von etwa 6,5 bis 9i5 gepufferten, kontinuierliche . Phase und eine diskontinuierliche , feste Phase von diskreten, porösen, dispergierbaren Teilchen, an die ein Bestandteil des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Teilchenkonjugats gebunden ist, und

(2) eines signal"bildenden Systems, das zur Bildung eines messbaren Signals in der Lage ist, wobei mindestens ein Bestandteil des Systems an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Signal-Marker-Konjugats gebunden ist und wobei das Teilchenkonjugat eine Umgebung definiert, die das Ausmass des messbaren Signals in einer vom wässrigen

^ Medium unterschiedlichen Weise beeinflusst, so dass

das messbare Signal in Abhängigkeit zur Verteilung des signalbildenden Systems zwischen den Teilchen und dem wässrigen Medium variiert und diese Verteilung in Beziehung zur Analytenmenge im Medium steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt

(a) die Probe,

(b) das im wesentlichen gleichmäcsig dispergierte Teilchenkonjugat ,

²⁵ (c) das Signal-Marker-Konjugat,

(d) den homologen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, wenn der Analyt, das Teilchenkonjugat und das Signal-Marker-Konjugat den gleichen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars aufweisen, und

(e) zusätzliche Bestandteile des signalbildenden Systems,

wobei das Signal-Marker-Konjugat zwischen dem wässrigen System und dem Teilchenkonjugat in einem Ausmass, das von der Ligandenmenge in der Probe abhängt, verteilt und

909843/0705

Γ Π

das Ausmass des Signals unter Vergleich mit einem Testmedium mit "bekannter Ligandenmenge bestimmt.

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Teilchenkonjugat einen Liganden als Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, das Signal-Marker-Konjugat einen Antiliganden als Bestandteil des spezifischen bindenden Paars und das signalbildende System ein Enzym als Bestandteil aufweist. 10

20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, dass das signalbildende System ein makromolekulares Enzymsubstrat als Bestandteil aufweist.

21. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, dass das signalbildende System ein zweites Enzym als Bestandteil aufweist.

22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch ge ken n-

zeichnet, dass das Teilchenkonjugat einen Liganden als Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, das Signal-Marker-Konjugat einen Antiliganden als Bestandteil des spezifischen bindenden Paars und das signalbildende System einen Fluoreszenzerreger mit einer Lichtemission bei einer Wellenlänge über 350 nm als Bestandteil aufweist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das signalbildende System einen an einen Antiliganden gebundenen Fluoreszenzerreger enthält.

2M-. Verfahren zur Bestimmung eines Ligandenanalyten, wobei der Ligand mit seinem homologen Antiliganden ein spezifisches bindendes Paar definiert,

gekennzeichnet durch die Verwendung

^L 9098A3/070S

(1) eines Mediums, enthaltend eine wässrige, auf einen pH-Bereich von etwa 6,5 Ms 9,5 gepufferte, kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche, feste Phase von dispergierbaren, porösen, diskreten Teil— chen, an die einer der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars und ein erstes Enzym unter Bildung eines Teilchenkonjugats gebunden sind, und (2) eines signalbildenden Systems,das zur Bildung eines messbaren Signals in der lage ist und ein an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Signal-Marker-Konjugats gebundenes zweites Enzym aufweist, wobei das erste und das zweite Enzym mit entsprechenden Substraten und Kofaktoren das signalbildende System definieren und das erste und das zweite Enzym dahingehend miteinander in Beziehung stehen, dass das Produkt eines Enzyms das Substrat des anderen Enzyms darstellt, wobei das Teilchenkonjugat eine Umgebung definiert, die die Bildung eines vom wässrigen Iledium unterschiedlichen Signals beeinflusst, so dass das messbare Signal in Beziehung zur Verteilung des Signal-Marker-Konjugats zwischen den Teilchen und dem wässrigen Medium variiert und die Verteilung in Beziehung zur Analytenmenge im Medium steht,

wobei man zur Durchführung des Verfahrens in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt

(a) die Probe,

(b) das im wesentlichen gleichmässig im wässrigen Medium dispergierte Teilchenkon_tjugat,

³⁰ (c) das Signal-Marker-Konjugat,

(d) den homologen Bestandteil des spezifischen bindenden Paare, wenn der Analyt, das Teilchenkonjugat und das Signal-Marker-Konjugat den gleichon Bestandteil aufweisen und

(e) zusätzliche Bestandteile dos si pjnaibi Idendon Systems,

909843/0705

wobei das Signal-Marker-Konjugat zwischen dem wässrigen Medium und dem Teilchenkonjugat in einem Ausmass verteilt ist, das von der Ligandenmenge in der Probe abhängt - und

das Ausmass des Signals im Vergleich zu einem Testmedium mit bekannter Ligandenmenge bestimmt.

25. Verfahren nach Anspruch 24·, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen aus einem vernetzten

Polysaccharid bestehen.

26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennz e ichne t, dass die Teilchen aus Glas bestehen.

27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Enzym um eine Hydrolase handelt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zweiten Enzym um eine Hydrolase handelt.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Enzym um eine alkalische Phosphatase, beim zweiten Enzym um eine Glycosidase und beim Substrat um einen phosphorylierten Glycosidyläther einer fluoreszierenden Hydroxylgruppen enthaltenden Verbindung, die unter den Testbedingungen nur dann fluoresziert, wenn sie freie Hydroxylgruppen aufweist, handelt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Glycosidase um ß-Galactosidase und bei der fluoreszierenden Verbindung um Umbelliferon handelt.

909843/0705

31» Verfahren nach Anspruch. 24 ,dadurch ge Iz en nseichnet, dass es sieb, bei dem ersten Enzym vm eine Transferase handelt»

32. Verfahre» nach. Anspruch 31* dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zweiten Enz;pa um eine Oxidoreduktase handelt·«,

33» Verfahren nach Anspruch 32 „dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Transferase um eine Hexokinase und bei der Oxidoreduktase um eine NAD-abhängige Dehydrogenase handelt»

34, Verfahren nach Anspruch 33? dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der NAD-abhängigen Dehydrogenase um Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und beim Substrat für die Hexokinase um Glucose handelt»

35· Verfahren zur Bestimmung eines Ligandenanalyten in einer Probe, wobei der Ligand mit einem homologen Antiliganden ein spezifisches bindendes Paar definiert, gekennzeichnet durch die Verwendung

(1) eines Mediums, enthaltend eine wässrige, auf einen pH-Bereich von etwa 6,5 bis 9?5 gepufferte„ kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche, feste Phase von diskreten, porösen, dispergierbaren Teilchen, an die ein Ligand unter Bildung eines Teilchenkon jugats gebunden ist, und

(2) eines signalbildenden Systems, das zur Bildung eines messbaren Signals in der Lage ist und ein an den

Antiliganden unter Bildung eines Signal-Marker-Kongugats gebundenes erstes Enzym aufweist, wobei das Teilchenkonöugat eine Umgebung definiert, die das Ausmass des messbaren Signals unterschiedlich vom ³^ wässrig'en Medium beeinflusst, so dass das messbare Signal in Beziehung zur Verteilung des signalbildenden Systems zwischen den Teilchen und dem wässrigen

^L 909843/070S

Hfeditiii variiert und die Verteilung in Beziehung zur

Analyteamenge im Medium steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens in einem ifässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt (a) die Probe,

(b) das im wesentlichen gleichmassig dispergierte Teilchenkonjugat,

(c) das Signal-Marker-Konjugat,

(d) zusätzliche Bestandteile des signalbildenden Systems, wobei das Signal-Marker-Konjugat zwischen dem wässrigen Medium und dem Teilchenkonjugat in einem Ausmass, das von der Ligandenaaenge in der Probe abhängt, verteilt ist, und

das Ausmass des Signals unter Vergleich mit einem Testmedium mit bekannter Analytenmenge bestimmt.

36. Verfahren nach Anspruch 35» dadurch gekennzeichnet, dass das signalbildende System ein 2ö makromolekulares Enzymsubstrat enthält.

37- Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym ß-Galactosidase und als makromolekulares Substrat o-Nitrophenyl-ß-galactosid, das an Dextran mit einem Molekulargewicht von mindestens 40 000 gebunden ist, vorliegt.

38. Reagens, enthaltend diskrete, poröse, feste Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 50 nm bis 100 ^u, an die im Durchschnitt mindestens etwa 1 Ligandenmolekül und mindestens etwa 1 Enzymmolekül kovalent gebunden ist, wobei es sich bei dem Liganden nicht um ein Enzym handelt.

39· Reagens nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Agaroseteilchen handelt.

909843/070S -J

vossius . vossius - HiLTL 0 Q »λ , "-.„ ^ ²⁹- i^{3 551}·¹

TAUCHNER.HEUNEMANN ^£ "· ^-3/ 1973 ^Syva Company

Patentanwälte ' P 122 - 3652-121L

SIiBERTSTH. 4, 8OOO MÜNCHEN S6 '

. _. 11 _ - j NAOHQERBCHTi

40. Reagens nach Anspruch 39? dadurch gekennzeichnet, dass es sich "bei dem Liganden "um eine Polyaminosäure und bei dem Enzym um eine Transferase handelt.

41. Reagens nach Anspruch 391 dadurch geke η nzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um eine Polyaminosäure und bei dem Enzym um eine Hydrolase handelt.

42. Reagens nach Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennz eichne t, dass es sich bei der Polyaminosäure um ein /"-Globulin handelt.

43. Reagens, enthaltend diskrete, poröse, feste Agaroseteilchen mit einem Durchmesser von etwa 500 nm bis 25,Ji, an die mindestens etwa 1 Molekül eines /"-Globulins und mindestens etwa 1 Molekül Hexokinase kovalent gebunden

ist. 20

44. Reagens, enthaltend diskrete, poröse, feste Agaroseteilchen mit einem Durchmesser von etwa 500 nm bis 25^,

an die im Durchschnitt mindestens 1 Molekül ^-Globulin * * und mindestens 1 Molekül alkalische Phosphatase kovalent gebunden ist.

45. Reagens, enthaltend diskrete, poröse, feste Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 500 nm bis 100^i, an die im Durchschnitt mindestens etwa 1 Molekül Antikörper und "mindestens 1 Molekül eines Enzyms kovalent gebunden ist.

46. Testpackung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an den nachstehend aufgeführten Bestandteilen in solchen Mengen, dass eine im wesentlichen optimale

909843/0705

¹ Empfindlichkeit des Tests erreicht wird:

ein Teilchenkonjugat, bei dem ein Bestandteil des spezifischen bindenden Paars an diskrete, poröse, feste Teilchen gebunden ist, und

einen Bestandteil des signalbildenden Systems aus der Gruppe der Enzyme und Fluoreszenzerreger, der an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Signal-Marker-Konjugats gebunden ist.

47. Testpackung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes Enzym an das Teilchenkonjugat und ein zweites Enzym an den Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebunden ist, wobei die Enzyme so miteinander in Beziehung stehen, dass das Pro-

^ dukt des einen Enzyms das Substrat des anderen Enzyms darstellt.

48. Testpackung nach Anspruch 4-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Teilchenkonjugat einen an die Teilchen gebundenen Liganden und das Signal-Marker-Konjugat ein an den Rezeptor gebundenes Enzym aufweist.

49. Testpackung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand an die Teilchen und

²⁵ das erste Enzym an den Antiliganden gebunden ist.

50. Testpackung nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Liganden um ein J^- Globulin und beim Enzym um ß-Galactosidase handelt und dass an einen hub-Kern kovalent gebundenes o-Nitrophenylgalactosid enthalten ist.

51. Verfahren zur Bestimmung eines Antiligandenanalyten in einer Probe, wobei der Antiligand mit seinem homologen Liganden ein spezifisches bindendes Paar definiert, gekennzeichnet durch die "Verwendung

909843/070S

■ (Ό eines Meditims, enthaltend eine wässrige, auf einen pH-Bereich von etwa 6,5 his 9,5 gepufferte, kontinuierliche Phase und eine diskontinuierliche feste Phase von diskreten, porösen, disp er gierbaren Teilchen, an die einer der Bestandteile des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Teilchenkonjugats gebunden ist, und

(2) ein signalbildendes System, das zur Bildung eines messbaren Signals in der Lage ist und bei dem mindestens ein Bestandteil des Systems an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars unter Bildung eines Signal-Marker-Konjugats gebunden ist, wobei das Teilchenkonjugat eine Umgebung definiert, die das Ausmass des messbaren Signals unterschiedlich vom wässrigen Medium beeinflusst, so dass das messbare Signal in Beziehung zur Verteilung des signalbildenden Systems zwischen den Teilchen und dem wässrigen Medium variiert und die Verteilung in Beziehung zur Analytenmenge im Medium steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt

(a) die Probe,

(b) das im wesentlichen glexchmassig dispergierte Teilchenkon jugat,

²⁵ (c) das Signal-Marker-Eonjugat,

(d) den homologen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars, wenn der Analyt, das Teilchenkonjugat und das Signal-Marker-Konjugat den gleichen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars aufweisen, und

(e) zusätzliche Bestandteile des signalbildenden Systems, wobei das Signal-Marker-Konjugat zwischen dem wässrigen Medium und dem Teilchenkonjugat in einem von der Antiligandenmenge in der Probe abhängigen Ausmass verteilt ist, und
35

das Ausmass des Signals unter Vergleich mit einem Testmedium mit bekannter Antiligandenmenge bestimmt.

^L 909843/0705 ^J

52. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass der Antiligand und sein homologer Rezeptor (Anti-(antiligand)) ein zweites spezifisches bindendes Paar definiert und das Signal-Marker-Konjugat einen Bestandteil des signalbildenden Systems, der an den Anti-(antiliganden) konjugiert ist, aufweist.

53· Durch Phosphat substituierte Glycosidyläther von Umbelli-

feronen. 10

5^. Verbindungen nach Anspruch 53? dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Glycosid um eine Hexose und beim Umbelliferon um 4-Methylumbelliferon

handelt. 15

55· 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galactopyranosid-ö-phosphat.

56. Reagens, enthaltend diskrete, poröse Teilchen, an die ein erstes Enzym und mindestens ein Molekül eines Bestandteils eines spezifischen bindenden Paars, das aus Ligand und Antiligand besteht, konjugiert ist, und ein zweites Enzym, das ein Bestandteil eines signalbildenden Systems, das kovalent an einen Bestandteil des spezifischen bindenden Paars gebunden ist, wobei der Bestandteil des signalbildenden Systems durch Vermittlung der nicht-kovalenten Bindung von Bestandteilen des spezifischen bindenden Paars an die Teilchen gebunden ist und das erste und zweite Enzym insofern miteinander in Beziehung stehen, dass das Produkt von einem der Enzyme

³⁰ das Substrat des anderen Enzyms darstellt.

909843/0705 -J