DE2618419C2 - Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man a) das flüssige Medium mit Reagentien zusammenbringt, umfassend ein markiertes Konjugat mit einem spezifisch bindenden Teil, der an einen markierenden TeU mit einer vorbestimmten Eigenschaft gebunden ist, wobei die Reagentien und der Ligand ein Bindungs-Reaktionssystem bilden unter Entstehung 1, einer gebundenen Phase aus dem markierten Konjugat, in dem der spezifisch bindende Teil an einen spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, und 2. einer freien Phase des markierten Konjugats, in dem der spezifisch bindende Teil nicht an den spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, wobei die Menge der Markierungssubstanz in einer Phase eine Funktion ist von der Menge des in der zu bestimmenden Probe vorhandenen Liganden, b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt und c) die vorbestimmte Eigenschaft in der gebundenen oder freien Phase bestimmt

Der Bedarf an einem bequemen zuverläsvgen und nicht gefährlichen Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten, ist offensichtlich. Das ist besonders der Fall auf dem Gebiet der klinischen Chemie, wo Bestandteile von Körperflüssigkeiten in so geringen Konzentrationen, wie 10-" molar pathologische Bedeutung besitzen können. Die Schwierigkeit derartig geringe Konzentrationen nachzuweisen, tritt besonders auf dem Gebiet der klinischen Chemie auf, wo die Probengröße üblicherweise sehr begrenzt ist

Klassisch werden Substanzen in Flüssigkeiten nachgewiesen aufgrund eines Reaktionsschemas, bei dem die nachzuweisende Substanz ein notwendiges Reagens ist Das Vorhandensein der unbekannten Substanz wird angezeigt durch das Auftreten eines Reaktionsproduktes oder das Verschwinden eines bekannten Reagens. In einigen Fällen kann ein solches Bestimmungsverfahren quantitativ sein aufgrund der Messung von entweder der Geschwindigkeit, mit der das Produkt auftritt oder das Reagens verschwindet oder durch Messung der Gesamtmenge an entstandenem Produkt oder verbrauchtem Reagens bei Erreichung des Gleichgewichts, jedes Bestimmungs-Reaktionssystem ist notwendiger· weise entweder auf die Anwendung zum Nachweis nur einer kleinen Gruppe von Substanzen beschränkt oder es ist nicht spezifisch.

Die Suche nach Bestimmungsverfahren, die hochspezifisch aber auf den Nachweis eines weiten Bereiches von Substanzen anwendbar sind, hat zu den radioimmunologischen Bestimmungsverfahren geführt Bei diesem System läßt man eine bekannte Menge einer radioaktiv markierten Form der nachzuweisenden Substanz mit der unbekannten Substanz bzw. unbekannten Menge der Substanz um eine begrenzte Menge von Antikörper, der zu der nachzuweisenden Substanz spezifisch ist, in Konkurrenz treten. Die Menge an markierter Form, die an den Antikörper gebunden wird, ändert sich umgekehrt mit der Menge an der nachzuweisenden Substanz. Bei radioimmunologischen Bestimmungsverfahren ist es unumgänglich notwendig, die markierte Form der nachzuweisenden Substanz, die an den Antikörper gebunden ist — die gebundene Phase — von dem nicht gebundenen Teil *· der freien Phase - zu trennen. Während verschiedene Wege entwickelt worden sind, diese erforderliche Trennung zu erreichen (US-PS 35 05 019, 35 55 143, 36 46 346, 37 20 760 und 37 93 445) ist bei allen ein getrennter Schritt, wie Filtrieren, Zentrifugieren, Waschen oder Abziehen des flüssigen Anteils aus einer Säule erforderlich, um eine

wirksame Trennung der gebundenen von der freien Phase sicherzustellen. Eine solche Trennung wird häufig erreicht durch Bildung eines Systems, umfassend einen unlöslichen Anteil, enthaltend die gebundene Phase, und einen flüssigen Anteil, enthaltend die freie Phase, so daß s die Menge an radioaktiv markierter Substanz in jedem Anteil eine Funktion des Ausmaßes der Bindung der markierten Substanz ist und damit eine Funktion der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Menge an Liganden. Der Ausdruck »heterogen«, wie er allgemein in der wissenschaftlichen Literatur verwendet wird und hier angewandt wird, bezeichnet diejenigen spezifischen Bindungsbestimmungen, bei denen eine Trennung der gebundenen von der freien Phase durchgeführt wird. Eine solche Trennung ist erforderlich, um eine is spezifische Bindungsbestimmung durchzuführen, bei der die markierte Substanz in der gebundenen Phase nicht unterscheidbar ist von derjenigen in der freien Phase.

Aufgrund der gefährlichen und schwierigen Handhabung von radioaktiven Substanzen sind zahlreiche Versuche unternommen worden, bequeme spezifische Bindungs-Bestimmungssysieine zu entwickeln, die ebenso empfindlich und schnell sind wie radioimmunologische Bestimmungen, aber die andere Eigenschaften als die Radioaktivität als Mittel zum Nachweis bzw. zur zs Überwachung der Bindungsreaktion anwenden. Wie näher diskutiert wird, umfassen Substanzen, die als Markierungssubstanz anstelle von radioaktiven Atomen oder Molekülen angewandt worden sind, verschiedene Substanzen, wie Enzyme, Fluoreszens-Moleküle und Bacteriophagen.

Beispiele für Verfahren, bei denen ein Enzym als Markierungssubstanz verwendet ν/^:τα\ sind beschrieben in den US-PS 36 54 090,37 91 932,38 39 153, 38 50 752 und 38 79 262 und in Journal of immunological Methods I, 247 (1972) und in Journal of Immunology 109, 129 (1972). Bei jedem: dieser beschriebenen Verfahren wird ein Enzym chemisch entweder an den nachzuweisenden Liganden oder einen Bindungspartner davon gekuppelt und dadurch ein entsprechendes heterogenes spezifisches Bindungs-Reaktionsschema gebildet, wodurch nach der Inkubation mit einer Probe die Menge an Enzymaktivität, die entweder mit dem unlöslichen Teil oder mit dem flüssigen Teil verbunden ist, eine Funktion ist der Ligandenmenge in der Probe. Die mit der «s Synthese und Charakterisierung von Enzymkonjugaten verbundenen Probleme sind ernste Nachteile dieser Verfahren.

Interessant ist das in der US·PS 38 17 837 beschriebe' ne immunologische Bestimmungsverfahren, bei dem mit w Enzym markierte Substanzen angewandt werden. Bei diesem Verfahren wird kein zweiteiliges (partitioned) (d.h. unlöslicher Teil/flüssiger Teil) spezifisches Bin* dungsreaktionssystem angewandt und dadurch das Trennungsverfahren vermieden, da der mit Enzym « markierte LJgand so ausgewählt ist, daß er nach Umsetzung mit dem bindenden Partner des Liganden die Enzymaktivität hemmt. Dadurch kann das Verhält* nis von gebundener markierter Substanz zu derjenigen in freier Form bestimmt werden, indem man die eo Änderungen der Ensymaktivität nachweist, Bei diesem Verfahren tritt jedoch trotzdem die Schwierigkeit auf, gut charakterisierte enzymmarkierte !Conjugate herzustellen und Enzyme zu finden, die für dieses System geeignet sind.

In den GB-PS 13 92 403 und FR-PS 22 01 299 sind spezifische Bindungsbestimmungen beschrieben, bei denen eine nichtaktive Vorstufe einer spektrophotometrisch aktiven Substanz als Markierungssubstanz angewandt wird. Nach Inkubation der Probe mit dem spezifischen Bindungsreaktionssystem werden der unlösliche und flüssige Teil voneinander getrennt und die in dem flüssigen Teil vorhandene Menge der Markierungssubstanz, die eine Funktion der nachzuweisenden Ligandenmenge in der Probe ist, bestimmt durch Durchführung von Reaktionsstufen, die die inaktive Markierungssubstanz in eine chromogen oder fluorometrisch aktive Substanz umwandeln, die dann auf übliche Weise gemessen wird.

Andere spezifische Bindungs-Bestimmungsverfahren, bei denen unterschiedliche Arten von Markierungssubstanzen angewandt werden, sind in der US-PS 38 50 578 beschrieben, bei der die Elektronen-spin.-Resonanz als Markierung angewandt wird. In der US-PS 39 01 654 wird die Anwendung von fluoreszenzauslöschenden und verstärkenden Substanzen zur Markierung beschrieben. In dem Report Nr. PB-224 875 des National Technical Information Service (NTIS) des United States Department of Commerce (1973) ist ein erfolgloser Versuch beschrieben, Hämmchlorid als Markierungssubstanz in einem heterogenen Bestimmungssystem anzuwenden, das durch Chemilumineszenz überwacht wird. In Nabire, 219, 186 (1968), sind sehr im Detail besümmte radioimmunologische Bestimmungsverfahren beschrieben und sehr allgemein die Möglichkeit, Coenzyme und Viren anstelle von Radioisotopen als Markierungssubstanzen zu verwenden, erwähnt Es ist jedoch nichts darüber ausgesagt, wie ein Bestimmungsverfahren mit Hilfe dieser alternativen Markierungssubstanzen durchgeführt werden kann oder darüber, ob ein derartiges Verfahren tatsächlich durchführbar ist. Ferner wird auf Principles of Competitive Protein-Bindung Assays, Hcrausg. Odell und Daughaday (J. B. Lippincott Co, Philadelphia, 1972), verwiesen, wo die verschiedenen bekannten Bestimmungsschemata ausführlich diskutiert werden und einige unterschiedliche Substanzen und Eigenschaften, die zur Markierung von spezifischen Bindungsbestimmungen angewandt weiden.

Obwohl viele neue Arten von spezifischen Bindungsbestimmungen beschrieben und untersucht worden sind, bleiben die radioimmunologischen Bestimmungen und die verschiedenen immunologischen Bestimmungen mit Hilfe enzymmarkierter Substanzen, die am weitesten angewandten und verbesserten. Beide Systeme besitzen jedoch offensichtlich Nachteile, und zwar die radioimmunologischen Bestimmungen durch die Anwendung von radioaktiven Substanzen, die gefährlich sind und eine vorsichtige Handhabung erfordern und die mit Enzym markierten immunologischen Bestimmungen durch die Schwierigkeit, geeignete enzymmarkierte Konjugate herzustellen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues Verfahren und Mittel zum Nachweis eines Liganden in einer Flüssigkeit zu entwickeln, bei dem keine unbequemen radioaktiven Substanzen oder modifizierten Enzyme als Markierungssubstanz angewandt werden. Das heterogene spezifische Bindungsbestimmungsverfahren und die dafür verwendeten Mittel sollen vielseitiger anwendbar sein und bequemer als die bekannten; dabei soll eine Markierungssubstanz verwendet werden, die mit dem Liganden oder einem spezifischen Bindungspartner davon leichter gekuppelt werden kann als ein Enzym und leichter nachgewiesen werden kann mit Hilfe einer Vielzahl empfindlicher Nachweis- bzw. Überwachungsreaktionssysteme als ein Enzym.

Diese Aufgabe wd gelöst durch ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man a) das flüssige Medium mit Reagentien zusammenbringt, umfassend ein markiertes Konjugat mit einem spezi- s fisch bindenden Teil, der an einen markierenden Teil mit einer vorbestimmten Eigenschaft gebunden ist, wobei die Reagentien und der Ligand ein Bindungs-Reaktions-5ystem bilden unter Entstehung 1. einer gebundenen Phase aus dem markierten Konjugat, in dem der spezifisch bindenden Teil an einen spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, und 2. einer freien Phase des markierten Konjugats, in dem der spezifisch bindende Teil nicht an den spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, wobei die Menge der Markierungssubstanz in einer Phase eine Funktion ist von der Menge des in der zu bestimmenden Probe vorhandenen Liganden, b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt und c) die vorbestimmte Eigenschaft in der gebundenen oder freien Phase bestimmt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die vorbestimmte Eigenschaft des markierenden Teils des KonjugMts eine vorbestimmte Aktivität als Substrat in einer enzyro!catalyrierten Reaktion oder als Reaktionspartner in einer Chemilumineszenzreaktion ist Die Menge der entweder in gebundener oder freier Form vorliegenden Markierungssubstanz wird bestimmt, indem man eine der Phasen mit mindestens einem Reagens zusammenbringt, das mit der Markierungssubstanz, das vorher bestimmte Reaktionssystem bildet, das als Mittel zum Nachweis der spezifischen Bindungsreaktion dient Quantitative Bestimmungen können durchgeführt werden, indem man die Aktivität der Markierungssubstanz, die in einer Phase gemessen wird, mit derjenigen vergleicht, die bei dem gleichen Bestimmungsverfahren bei einem flüssigen Medium erhatlen wird, das bekannte Mengen des zu bestimmenden Liganden enthält

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 — 11 beschrieben.

!m folgenden wird die Erfindung näher erläutert Dabei wurden die folgenden Ausdrücke entsprechend den angegebenen Definitionen angewandt: Ligand ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; spezifisch bindender Partner zu dem Liganden ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt und spezifisch bindendes Analoges des Liganden ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, so die sich in Beziehung fluf die Bindungsaktivität zu dem spezifisch bindenden Partner zu dem Liganden im wesentlichen genauso verhält wie der Ligand.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagentien für den nachzuweisenden Liganden umfassen im allgemeilren zwei grundlegende Bestandteile, und zwar (1) einen spezifisch bindenden Partner des Liganden und (2) einen markierten Bestandteil, der üblicherweise die markierte Form, von (a) dem Liganden, (b) einem spezifisch bindenden Analogen des Liganden oder (c) dem spezifischen Bindungspartner ist Die Bestandteile der Bindungsreaktion werden gleichzeitig oder in einzelnen Stufen zusammengegeben, und innerhalb einer geeigneten Inkubationszeit oder -zeiten wird der markierte Bestandteil an seinen entsprechenden konkurrierenden Bindungspartner gebunden, so daß das Ausmaß der Bindung, d. h. das Verhältnis der Menge an markieren! Bestandteil, die an den Bindungspartner gebunden ist, zu der ungebundenen Menge eine Funktion der Menge des vorhandenen Liganden ist Die unterschiedlichen Bindungsreaktionsschemata, die zur Durchführung eines heterogenen spezifischen Bindungsverfahrens angewandt werden können, sind bekannt und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden.

Während bei den üblichen heterogenen spezifischen Bindungsbestimmungsverfahren, wie den radioimmunologischen Bestimmungen und heterogenen Enzyme, verwendenden immunologischen Bestimmungsverfahren die Markierungseigenschaften in dem markierten Konjugat, wie die Radioaktivität oder enzymatische Aktivität im wesentlichen gleich sind für die gebundenen und freien Formen des Konjugats wird erfindungsgemäß die Aktivität der Markierungssubstanz in bestimmten Fällen beeinflußt durch die Bindung des markierten Konjugats. In einer solchen Situation zeigt die Nachweisreaktion einen verhältnismäßig konstanten Charakter, wenn der Ligand in dem flüssigen Medium nicht vorhanden oder in einer unbedeutend kleinen Menge vorhanden ist W(^i der Ligand in dem flüssigen Medium vorhanden ist, wird an Charakteristikum oder eine Eigenschaft der Nachweisreaktion verändert Allgemein ist die Aktivität der konjugierten Markierungssubstanz das Ausmaß oder die Geschwindigkeit, mit der die Markierungssubstanz imstande ist, an der Nachweisreaktion teilzunehmea So wird der Charakter der Nachweisreaktion verändert durch das Vorhandensein des Liganden in dem flüssigen Medium, üblicherweise entweder in Beziehung auf die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit oder die Menge an einem oder mehreren Reaktionsprodukten, die im Gleichgewichtszustand vorhanden sind. Üblicherweise wird in einem solchen Fall die Fähigkeit der konjugierten Markierungssubstanz an der Nachweisreaktion teilzunehmen, durch Reaktion zwischen der spezifisch bindenden Substanz, mit der es konjugiert ist, und einem spezifisch bindenden Partner einer solchen spezifisch bindenden Substanz verringert, d. h. das Konjugat ist in freier Form reaktionsfähiger in der Nachweisreaktion als in gebundener Form.

Die Bestimmung der Aktivität der konjugierten Markierungssubstanz als Bestandteil des vorher bestimmten Nachweisreaktionssystems entweder in der gebundenen oder in der freien Ph?se wird bequem erreicht, indem man diese Phase mit mindestens einer Substanz zusammenbringt, die mit der konjugierten Markierungssubstanz die Nachweisreaktion bildet und ein Charakteristikum dieser Reaktion mißt Das Nachweisreaktionssystem kann eine einzelne chemische Umwandlung oder eine Vielzahl oder Reihe von chemischen Umwandlungen umfassen.

Wenn ein enzymkatalysiertes Reaktionssystem angewatidv wird, umfaßt es neben der konjugierten Markierungssubstanz mindestens ein Enzym und kann auch ein oder mehrere enzymatische Reigentien, wie Substrate und Coenzyme umfassen. Bin derartiges enzymkatalysiertes Reaktionssystem kann eine einzelne einfache enzyttiPtische Reaktion oder eine komplexe Reihe von enzymatischen und nichtenzymatischen Reaktionen umfassen. Zum Beispiel kann das enzymkatalysierte Reaktionssystem aus einem einzigen enzymkatalysierten Abbau oder einer Dissoziationsreaktion bestehen. In einem solchen System ist die konjugierte Markier.mgssubst ?„nz das Enzymsubstrat, das abgebaut oder dissoziiert wird und die einzige Komponente des Reaktionssystems, die mit der gebundenen oder freien

Phase in Berührung gebracht werden muß, ist ein Enzym, das den Abbau oder die Dissoziationsreaktion katalysiert. Ein komplexeres enz>mkatalysiertes Reaktionssystem kann aus einer einzelnen enzymatischen Reaktion bestehen, umfassend zwei oder mehrere Reaktionsteilnehmer, oder es kann aus einer Reihe von Reaktionen bestehen, umfassend verschiedene Reaktionsteilnehmer, von denen mindestens eine Reaktion enzymkatalysiert ist In einem solchen System wäre die konjugierte Markierungssubstanz einer der enzymatischen Reaktionsteilnehmer der enzymkatalysierten Reaktion, und die gebundene oder feste Phase würde mit dem entsprechenden Enzym und den anderen Komponenten der Reaktion außer dem Konjugat zusammengebracht, die erforderlich sind, um das gewünschte enzymkatalysierte Reaktionssystem zu ergeben.

Die entsprechenden Reaktionsbestandteile, die zusammen mit der Markierungssubstanz in dem Konjugat

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uas naktiwcisi cafviiisiias/stciii i/iiucii, imsiiiicii um ucin Gemisch der abgetrennten Phase einzeln oder in irgendeiner Kombination vorher, gleichzeitig oder anschließend an die Auslösung der spezifischen Bindungsreaktion zusammengebracht werden. Nach Beginn der spezifischen Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch, das irgendeine oder alle der erforderlichen Bestandteile für die Nachweisreaktion enthalten kann, üblicherweise eine vorherbestimmte Zeit inkubiert, bevor eine Änderung der Aktivität des Reagens in dem Konjugat bestimmt wird. Nach der Trennung werden irgendwelche Bestandteile, die für die Nachweisreaktion erforderlich sind und die nicht schon in ausreichenden Mengen in dem Reaktionsgemisch vorhanden sind, zugegeben und die Aktivität der Markierungssubstanz bestimmt als Zeichen für das Vorhandensein oder die Menge des Liganden in dem flüssigen Medium.

Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit der Nachweisreaktion das Charakteristikum ist, das angewandt wird, um die Aktivität der Markierungssubstanz in der gebundenen oder freien Phase zu bestimmen, wie es bevorzugt ist, wird eine derartige Geschwindigkeit üblicherweise bestimmt durch Messung der Geschwindigkeit, in der ein Reaktionspartner verschwindet oder der Geschwindigkeit, mit der ein Reaktionsprodukt auftritt. Eine derartige Messung kann durch viele verschiedene Verfahren durchgeführt werden, wie die üblichen chromatographischen, gravimetrischen, potentiometrisehen, spektrophotometrischen, fluorometrischen Trübungsmessungen und volumetrischen Bestimmungen. Da das erfindungsgemäße Verfahren in erster Linie bestimmt ist zum Nachweis geringer Konzentrationen an Liganden, wurden sehr empfindliche Reaktionssyste-

i; me entwickelt zur Anwendung im Zusammenhang mit dem neuen spezifischen Bindungsreaktionssystem.

Eine bevorzugte Form der Nachweisreaktion umfaßt ein Chemilumineszenzreaktionssystem, vorzugsweise enzymkatalysiertes wie eine Reaktion, die Biolumines-Ϊ6ΠΖ ergibt. Die mäf ki6rürigS5uu5iänZ in dem rCoiijugai kann entweder ein Reagens in der lichterzeugenden Reaktion sein oder in einer Reaktion, die einer enzymatischen oder nichtenzymatischen Lumineszenzreaktion vorausgeht. Die Aktivität der konjugierten Markierungssubstanz kann bestimmt werden durch Messung der Geschwindigkeit der Lichtbildung oder der Gesamtmenge, Spitzenintensität oder dem Charakter des entstehenden Lichtes. Beispiele für Chemilumineszenzrei.ilionssysterne sind in Tabelle A angegeben, bei der die folgenden Abkürzungen angewandt werden: ATP — Adenosintriphosphat,
AMP - Adenosinrnonophosphai,
NAD - Nicotinamidadenin-dim/cleotid,
NADH ·· reduziertes Nicotinamid-adenin-

dinucleotid,

FMN — Flavinmononucleotid,
FMNH₂ - reduziertes Flavinmononucleotid,
fr» - elektromagnetische Strahlung, üblicher

weise im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich.

Tabelle A Lumineszenz-Reaktionssystem

konjugierte
Markierungssubstanz

A. ATP + reduziertes Luciferin

Luciferase
(Leuchtkäfer)

hv + AMP + oxidiertes Luciferin

ATP oder reduziertes Luciferin

B. FMNH₂+ langkettiger Aldehyd + O₂
Luciferase

(P. fisheri)

Av + FMN + langkettige Säure + H₂O

FMNH₂oder langketliger Aldehyd

C. 1) NADH + FMN + H* _{NAD + FMN}h₂ 2) FMNH₂+ langkettiger Aldehyd + O₂

^{hv + FMN + lan}8kettige Säure + H₂O

NADH oder FMN Fortsetzung

Lumincszenz-Reiiktionssyslem

D. 1) 3',5'-Adenosin-diphosphat + reduziertes Luciferin-sulfat Sulfattransferace

konjugierte
Markierungssubstanz

3',5'-Adenosindiphosphat oder reduziertes Luciferin

■ Adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat + reduziertes Luciferin

2) reduziertes Luciferin + O₂ > hv + oxidiertes Luciferin

E. reduziertes Luminol + H₂O₂ hv + oxidiertes Luminol + H₂O reduziertes Luminol F. reduziertes Pyrogallol + H₂O₂ hv + oxidiertes Pyrogallol + H₂O reduziertes Pyrogallol

G. reduziertes Luminol + O₂ —» hv + oxidiertes Luminol reduziertes Luminc! H. reduziertes Pyrogallol + O₂ Av + oxidiertes Pyrogallol reduziertes Pyrogallol I. Isoluminol + H₂O_{2 hv +} Aminophthalat + N₂ Isoluminol

J. Isoluminol + KO₂ ► hv + Aminophthalat + N₂ Isoluminol

*) oder Catalase.

Weitere Einzelheiten und Diskussionen bezuglich von Lumineszenzreaktionssystemen, die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden können, sind angegeben in:

J.Biol.Chem, 236:48(1961).

J. Amer. Chem. Soc, 893944 (1967). Cornier et al. Bioluminescence in Progress, Ed. Johnson et al, Princeton University Press (New Jersey, 1966), S. 363 - 84. Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, doctoral thesis University of Georgia (1967). Am.J.Physiol,41:454(1916).

Biol.Bull,51:89(1926).

J. Biol. Chem, 243:4714 (1968).

45 wobei X eine enzymatisch spaltbare Bindung oder Bindungsgruppe ist, wie eine Ester- oder Amidogruppe und Z eine spezifisch bindende Substanz, die in Abhängigkeit von der angewandten spezifischen Bindungsreaktion der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist Spezifische Konjugate, die für ein derartiges Reaktionssystem angewandt werden können, sind verschiedene durch Enzym spaltbere Derivate von Fluorescein, Umbelliferon, 3-lndol, 0-Naphthol, 3-Pyridol, Resorufin usw.; Beispiele für mögliche Strukturformen derartiger Derivate sind:

Derivat Formel

50

Eine andersartige bevorzugte empfindliche Nachweisreaktion umfaßt das Phänomen der Fluoreszenz und ist enzymkatalysiert Bei einem solchen Reaktionssystem ist die Markierungssubstanz in dem Konjugat ein Substrat für eine enzymatische Reaktion, die ein ss Produkt liefert, das Fluoreszenzeigenschaften besitzt, die es von dem konjugierten Substrat unterscheiden. jede auftretende Änderung in der Aktivität des konjugierten enzymatischen Reagens, die durch die spezifische Bindungsreaktion bewirkt wird, führt zu einer Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften des Reaktionsgemisches. Ein allgemeines Reaktionsschema für eine derartige enzymkatalysierte Reaktion ist das folgende:

Fluorescein Umbelliferon

65

enzymatisches ,_c„, „,,
Reagens-X-Z Produkt
(Substrat)

Fortsetzung

Derivat
3-Indol

jS-Naphthol

3-Pyridol

Resorufin

Formel

wobei

R¹ -OH oder —X—Z(wie oben angegeben),

RJ -X-Z und

RJ -H oder-CH₃ ist

Ein Reaktionssystem, das besonders bevorzugt ist zur Bestimmung der Aktivität des konjugierten Reagens in der ausgewählten Phase ist ein cyclisches Reaktionssystem (Ringreaktion). Bei einem derartigen Reaktionssystem wird ein Produkt einer ersten Reaktion in einer zweiten Reaktion umgesetzt, wobei in der zweiten Reaktion ein Produkt entsteht, das auch ein Reagens für die erste Reaktion ist.

Pas folgende Diagramm zeigt ein Modell für ein derartiges cyclisches Reaktionssystem:

Produkte A
REAKTION A

Reagentien A

cyclisiertes Material
(Form 1)

cyclisiertes Material
(Form 2)

Reagentien B

REAK'i ION B Produkte B

Bei dem oben angegebenen Modell eines cyclischen Reaktionssystems bildet eine kleine Menge des cyclisierten Materials, wenn ihr ausreichende Mengen der Reaktionspartner A und B zur Verfügung stehen, große Mengen an Produkten A und B. Da die Reaktionsgeschwindigkeit und Menge an Produkten, die durch die Reaktionen entstehen, die das cyclische Reaktionssystem bilden, sehr empfindlich sind gegenüber der vorhandenen Menge an cyclisiertem Material, ist es besonders bevorzugt dieses cyclisierte Material als Reagens in dem erfindungsgemäßen Konjugat zu verwenden. Beispiele für cyclische Reaktionssysteme, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsreaktionssystem angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle B angegeben.

Tabelle B

ff-Ketcglutarat

cc- Aminosäure

Transaminase L-Aminosäureoxidase

Glutamat

ff-Ketosäure

H,O,

Ί ortsetzung

Ascorbat

oxidiertes Glutathion

Dehydroascorbatreduclase.

ülutathionreductase

Dehydroascorbat

reduziertes Gl'jtathion NADPH

NADP

oxidiertes Glutathion ♦--. -· Ascorbat ^ .... O₂

\ ι ι

Dehydroascorbatreductase Ascorbatoxidase

reduziertes Glutathion - ^ Dehydroascorbat ♦—-' ^-» H₂O

H₂O ^ ^_» oxidiertes Cytochrom-C -^ ^- NADPH

Cytochrom-C-preoxidase Cytochrom-C-reductase

H₂O₂ ' ^- reduziertes Cytochrom-C - " ^- NADP

NADPH

NADP

oxidiertes Ferridoxin

Pyridinnucleotid-reductase

Hydrogenase

reduziertes Ferridoxin

Bei Bildung irgendeines der in der Tabelle B angegebenen cyclischen Reaktionssysteme, wenn eine der Komponenten des Reaktionssystems in ionischer Form vorliegt, kann sie natürlich in Form des Salzes oder der Säure vorliegen, wenn diese bei Berührung mit dem flüssigen Medium ionisieren. Ein wasserlösliches Salz oder eine Säure ist natürlich bevorzugt

Es kann auch ein exponentiales cyclisches Reaktionssystem bei der Nachweisreaktion angewandt werden.

Eine solche cyclische Reaktion ist autokatalytisch in dem Sinne, daß während jedes Cyclus die Menge an zurückgeführtem (cyclisiertem) Material verdoppelt wird. Die Cyclisierungsgeschwindigkeit nimmt daher exponential mit der Zeit zu und ergibt eine sehr hohe Empfindlichkeit Weitere Einzelheiten und eine nähere Diskussion bezüglich derartiger cyclischer Reaktionen findet sich in J. BioL Chem, 247,3558-70 (1972).

Wenn ein cyclisches Reaktionssystem angewandt wird als Mittel zur Bestimmung der Aktivitätsänderung der konjugierten Markierungssubstanz kann die Geschwindigkeit, mit der ein Reagens verschwindet oder ein Reaktionsprodukt auftritt, durch übliche Verfahren bestimmt werden oder nvt Hilfe, eines oder mehrerer cyclischer Systeme und anschließende übliche Bestimmung der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit

Die Anwendung eines cyclischen Reaktionssystems in Verbindung mit dem heterogenen System der spezifischen Bindungsre.ik';cn ergibt eine breite Anwendbarkeit sowie hohe c.mptinci!<chkd«_ Fin einziges markiertes Konjugat kann für eine Vielzahl von Reaktionen angewandt werden, um c^lische Systeme zu bilden mit Empfindlichkeiten, die über einen weiten Bereich variieren und zu einer Vielzahl von Umwandlungen, die mit Hilfe der Sinne oder künstlicher Mittel nachgewiesen werden können. Eine derartige vielseitige Anwendbarkeit besitzen bekannte Bestirnmungssystenie nicht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden auf den Nachweis irgendeines Liganden, zu dem es einen spezifisch bindenden Partner gibt Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, so daß es einen spezifisch bindenden Partner in biologischen Systemen gibt oder ein solcher synthetisiert werden kann. Der Ligand wird — allgemein gesprochen — ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten (Stoffwechselprodukten) und pharmakologischen Mitteln und ihren Rezeptoren und bindenden Substanzen.

Spezifische Beispiele für Liganden, die erfindungsgemäß nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin, Choriongonadotropin, Thyroxin, Liothyronin und Östriol, Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinnin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene, Vitamine, wie Biotin, Vitamin Bn, Folsäure, Vitamin E und Ascorbinsäure, Metaboliten, wie anöphosphai und 3'i'-Guanosinmonophaifi;akologische Mittel, wie Dilantin,

η, Digitoxin und Barbiturate, Antikörper, wie mikrosome Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene und spezifisch bindende Rezeptoren, wie thyroxinbindendes Globulin, Avidin, Intrinsicfaktor und Transcobalamia

Bei dem erfindungsgemäß zu verwendenden Konjugat ist die Markierungssubstanz an eine spezifisch bindende Substanz gekuppelt oder gebunden, die der Ligand, ein spezifisch bindendes Analoges des Liganden oder ein spezifisch bindender Partner des Liganden ist, je nach dem ausgewählten Bestimmungsverfahren, so daß eine meßbare Menge an Aktivität der Markierungssubstanz erhalten bleibt Die Bindung zwischen der Markierungssubstanz und der spezifisch bindenden Substanz ist üblicherweise im wesentlichen unter den Bestimmungsbedingungen irreversibel, wobei die Nachweisreaktion, in der die Markierungssubstanz Aktivität besitzt nicht so gestaltet ist, um eine solche Bindung chemisch zu zerstören. In einigen Fällen wird jedoch eine solche Bindung zerstört oder auf andere Weise angegriffen durch die ausgewählte Nachweisreaktion als Mitte! zur Bestimmung der Aktivität der markierungssubstanz. Ein solcher Fall liegt vor bei dem obenerwähnten enzymatischen Fluoreszenz-Substrat-Reaktionssystem.

Die Markierungssubstanz kann direkt an die spezifisch bindende Substanz gekuppelt sein, so daß das Molekulargewicht des Konjugates geringer ist als oder gleich so groß ist wie das Gesamtmolekulargewicht der Markierungssubstanz und der spezifisch bindenden Substanz. Üblicherweise sind jedoch die Markierungssubstanz und die spezifisch bindende Substanz über eine Brückengruppe, enthaltend 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome oder Heteroatome, wie Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphoratome usw., miteinander verbunden. Beispiele für eine Brückengruppe, umfassend ein einziges Atom, ist die Methylengruppe (ein Kohlenstoffatom) und die Aminogruppe (ein Heteroatom). Die Brückengruppe besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 1000 und vorzugsweise weniger als 200. Die Brückengruppe umfaßt eine Kette von Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen oder eine Kombination von beiden und ist mit der Markierungssubstanz und der spezifisch bindenden Substanz oder einem aktiven Derivat davon über eine verbindende Gruppe gebunden, Üblicherweise in Form einer Ester-, Amido-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Acetal-, Methylen- oder Aminogruppe.

Wenn ein Substrat in einer enzymkatalysierten Reaktion als konjugiertes Reagens angewandt wird, beträgt das bevorzugte Molekulargewicht vorzugsweise weniger als 9000 und besonders weniger als 5000. Substrate solcher Größe sind aufgrund ihres Mangels an Molekularkomplexität besonders bequem für die Herstellung eines solchen Konjugats. Beispiele für Enzymsubstrate, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, umfassen die enzymatisch spaltbaren Fluoreszenzsubstrate, die oben erwähnt sind, wie Fluorescein· und Umbelliferonderivate, pH-Indikatoren und spektrophotometrische Indikatorfarbstoffe, besonders chromogene Farbstoffe.

Bei einer Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion, die mit dem flüssigen Medium, in dem der Ligand vermutet wird, zusammengegeben werden sollen, in flüssiger oder fester Form vor. Das Bestimmungsverfahren kann in einem Standardlaborgefäß, wie einem Reagensglas, durchgeführt werden, wobei die Bestandteile der spezifischen Bindungsreaktion und die Komponenten des Reaktionssystems in fester oder flüssiger Form zugegeben werden.
Es ist auch möglich, daß eine oder mehrere der Komponenten der spezifischen Bindungsreaktion und/oder eine oder mehrere der Komponenten der Nachweisreaktion zusammen mit einem Träger zugegeben werden. Der Träger kann ein Flüssigkeitsbehälter, wie ein Reagensglas oder eine Kapsel, enthaltend eine

ίο solche Komponente oder Komponenten in einem unteren Teil, z. B. in Form einer Flüssigkeit oder eines losen Feststoffs oder eines Überzugs auf der Innenseite des Gefäßes, sein. Der Träger kann auch die Form einer Matrix besitzen, die unlöslich und porös ist und

vorzugsweise in Beziehung auf das zu untersuchende nüssige Medium absorbierend ist Eine solche Matrix kann in Form von saugfähigen Papieren, polymeren Filmen, Folien, Membranen, Flächen oder Blöcken. Gelen usw. vorliegen. Bei einer solchen Form würde das Prüfmittel bzw. die Vorrichtung ein bequemes Mittel darstellen, um das zu untersuchende flüssige Medium zur Durchführung der spezifischen Bindungsreaktion und/oder der Nachweisreaktion, Durchführung der erforderlichen Trennung und zur Beobachtung der

auftretenden Veränderung zusammenbringen.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Flüssigkeit sein, von der angenommen wird oder bekannt ist, daß sie den Liganden enthält und ist

üblicherweise eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnung oder andere Behandlung einer solchen biologischen Flüssigkeit entsteht Biologische Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, umfassen

JS Serum, Plasma, Urin und amniotische Flüssigkeit, CerebralflOssigkeit und Spinalflflssigkeit Andere Sub- »ianzen, wie Feststoffe,, z. B. Gewebe oder Gase, können untersucht werden, indem man sie irr flüssige Form überführt, z. B. durch Lösen des Feststoffs oder Gases in einer Flüssigkeit oder durch die Flüssigkeitsextraktion des Feststoffes.

Im Gegensatz zu den bekannten Bestimmungssystemen können auch biologische Flüssigkeiten, die Substanzen enthalten, die eine ähnliche oder identische Reagensaktivitlt besitzen wie diejenige der konjugierten Markierungssubstanz, auf den Liganden untersucht werden, und zwar ohne Störung durch Hintergrundreaktionen. Endogene Hintergrund-Aktivität der Markierungssubstanz kann leicht auf verschiedene Weise

so eliminiert werden. So kann biologische Flüssigkeit mit einem Mittel behandelt werden, das chemisch die endogene Aktivität selektiv zerstört Anschließend wird dann die zerstörende Wirkung eines solchen Mittels inaktiviert

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

näher.

Beispiel I

Herstellung von Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)-purin-dinucleotid

2 g Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) wurden in 10 ml Wasser gelöst und 0,6 ml Äthylenimin zugetropft und der pH-Wert durch Zugabe von 1 m-Perchlorsäure < 7 gehalten. Nach vollständiger Zugabe des Äthylenimins wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt und die Reaktion bei 20 bis 25⁰C inkubiert. In Intervallen von 24 h wurden 0,6 ml Äthylenimin zugegeben und der

230 266/139

pH-Wert erneut auf 4,5 eingestellt Nach 96 h wurde die Lösung in 10 Volumina Aceton von -10⁰C gegossen. Das entstehende öl wurde gesammelt, mit Äther gewaschen und in ungefähr 50 ml Wasser in einem Kolben gelöst

Die entstehende Lösung wurde mit 1 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 gebracht und 1 g Natriumbicarbonat zugegeben. Dann wurde 4 bis 5 min lang Stickstoff durch die Lösung geleitet und 1 g Natriumhydrosulfit zugegebea Der Kolben wurde dicht verschlossen und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann 15 min mit Sauerstoff behandelt und mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 113 gebracht Die Lösung wurde lh auf 75"C erhitzt Dann wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, 0,6 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan zugegeben und anschließend 5 n-Salzsäure, um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen. Zu der entstehenden Lösung wurden 1000 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase und 1 ml Acetaldehyd gegeben. Die \bnahme der optischen Dichte des Reaktionsgemii^hes wurde bei 340 mn überwacht, und als keine weitere Abnahme beobachtet wurde, wurde der pH-Wert auf 3,5 eingestellt Die Lösung wurde in 10 Volumina Aceton von —10° C gegossen. Das entstehende Öl wurde abgetrennt und mit Äther gewaschen und anschließend in 10 bis 15 ml Wasser geiöst

Die entstehende Lösung wurde in eine 2£x90-cm-Säule von Sephadex G-10 der Pharmacia AB, Uppsala, Schweden, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt Die Wellenlänge der maximalen optischen Absorption im UV-Bereich und die optische Dichte bei einer derartigen Wellenlänge wurden für jede Fraktion bestimmt Au&ärdem wurde die optische Dichte bei 340 nm für jede Fraktion nach Reduktion mit Alkoholdehydrogenase bestimmt Die Fraktionen, die ein optisches Absorptionsmaximum bei 264 nm besaßen und ein Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 264 nm von mehr als 0,05 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 15 bis 20 ml auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und durch eine 24 x 28-crn-Säule mit Dowex 1-X8 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, die mit Wasser äquilibriert war, gegeben. Es wurde weiteres Wasser zugegeben, um die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule zu waschen und Fraktionen von 10 ml gesammelt Die Fraktionen, die ein Verhältnis von optischer Dichte bei. 340 nm zu optischer Dichte bei 264 nm von mehr als 0,1 besaßen, wurden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Substanzen wurden durch eine 5 χ 45-cm-Säule mit Dowex 50-X2 der Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, die mit Wasser äquilibriert war, geleitet Es wurde weiteres Wasser zugegeben und die zusammengegebenen Substanzen durch die Säule gewaschen und 20-ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen mit einem Maximum der optischen Absorption bei 264 nm und einem Verhältnis der optischen Dichte bei 340 nm zu derjenigen bei 265 nm von mehr als 0,18 wurden zusammengegeben. Die zusammengegebenen Substanzen wurden auf 4 bis 5 ml eingeengt und folgendermaßen durch Elektrophorese gereinigt:

Die konzentrierten Substanzen wurden auf ein Blatt Whatman 3MM-Papier der Reeve Angel, Clifton, New Jersey, in 1 bis 2 cm breiten Streifen senkrecht zu der Richtung des Stromes aufgebracht. Das Papier wurde dann mit 0,02m Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 6,0 bebandelt Die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Durrum mit hängendem Papier (Science, 121,829 [1955]) 4 bis 7 h mit einem Potentialgradienten

ί von ungefähr 8,5 V/cm durchgeführt Die Lage des gewünschten Pyridinnucleotidderivats wurde bestimmt durch die Fluoreszein, die sich nach Besprühen eines Teststreifens des Papiers mit 0,5 m-Natriumcyanid entwickelte (J. BioL Chem, 191,447 [1951]). Der Bereich,

i'i der das gewünschte Derivat enthielt wurde aus dem Papier ausgeschnitten und mit 3 χ 50 ml Wasser extrahiert Die entstehenden Auszüge, enthaltend

N"icotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid wurden zusammengegeben, auf 3 bis 4 ml eingeengt und

r. bei -20⁰C gelagert

Beispiel 2

Herstellung von Nieotinamidadenindinucleotid-Biotin-Konjugat

16 mg Biotin wurden in 1 ml Wasser, enthaltend 22 mg Nicotinamid-6-(2-aminoäthylamino)purindinucleotid, entsprechend Beispiel 1, suspendiert Zur Erleichterung der Lösung des Biotins wurden einige

r> Tropfen 0,1 η-Natriumhydroxid zugegeben. Dann wurden 240 mg l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat zu der entstehenden Lösung zugegeben und durch Zutropfen von 0,1 η-Salzsäure in Lösung gebracht Das Reaktionsgemisch

:o wurde 5 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann in 10 ml Aceton von — 10⁰C gegossen. Das entstehende öl wurde abgetrennt 2mal mit 5 bis 10 ml Äther gewaschen und und in 1 bis 2 ml Wasser gelöst Die entstehende Substanz wurde durch Elektrophorese auf

<< Papier, entsprechend Beispiel 1, gereinigt Es erschienen zwei Fluoreszensbänder nach Besprühen mit Nairiumcyanid. Das eine wanderte gegen die Kathode und das andere gegen die Anode. Das zuletzt genannte enthielt das NAD-Biotin-Konjugat und wurde mit Wasser

.•η eluiert und bei—20°C gelagert

Beispiel 3 Herstellung von Bioiin-Umbclliferon-Konjugat

(2-Oxo-2-H-l-benzof>yran-7-yl)-5-[cis-hexahydro-

2-oxo*lH-thieno-(3.4-d-)-imidazol]valcriansäiJreesier

Eine Lösung von 300 mg (15 mMol) wasserfreiem Biotin in 20 ml trockenem Dimethylformamid wurde bei -IO"C unter trockenem Stickstoffgas gerührt und 0,17 ml (U mMol) trockenes Trialhytanin zugegeben. Eine Lösung von frisch destilliertem Äthylchlorformiai (0,Kl ml in 3 ml trockenem Äther) wurde zugetropft. Nach 30 min laiigem Inkubieren unier Rühren wurde

« der entstehende Niederschlag unter trockener Stickstoffatmosphäre abfiltriert und sofort auf -1(T⁵C gekühlt und zu dem filtrierten Rückstand wurde eine Lösung von 197 mg (1.2 mMol) wasserfreiem 7-Hydroxycumarin in 3 ml trockenem Pyridin zugegeben und 1 h

t«> bei - WC und anschließend 20 h bei 25"C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Hochvakuum bei 40" C abdestilliert. Nach dom Kühlen wurde der verbleibende Feststoff filtriert und aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt das gewünschte Produkt. Fp. 216 bis 218°C.

Analyse:

Berechnet für C_|oIUNjP,S:C48.75 H 4.19 N 7.21 Gefunden: C 58.4 H 5.12 N 6.86

19 20

BeispieU

Bmdungs-Biolumineszens-Bestimmungsverfahren für IConkurrenz-Biotin; Wirkung verschiedener Geh'alte an Biotin auf die Spitzenlichtintensität

Das Biolumineszenz-Reaktionssystem dieses Beispiels beruhte auf folgenden Gleichungen:

(a) NAD-Ligand + Äthanol

dehydrogenase

NADH-Ligand + Acetaldehyd

(b) NADH-Ligand + FMN«) + Η⁵*

(c) FMNH₂ + langkettiger Aldehyd + O₂
*) Flavinmononucleotid.

dehydrogenase

Luciferase

♦ NAD-Ligand + FMNH₂

FMN + langkettige Säure + H₂O + /iv A. Herstellung einer Licht erzeugenden Lösung

Eine Licht erzeugende Lösung zur Durchführung der Reaktionen (b) übd (c) wurde folgendermaßen hergestellt Ein Reagensgemisch wurde hergestellt, enthaltend 0,13m Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,67 Gew.-% Rinderserumalbumin, 15,7 um Flavinmononucleotid (FMN), enthaltend 133 mm Natriumacetat und dieses : ■ ' Gemisch in der Dunkelheit bei -20"C aufbewahrt Eine Emulsion von 5 μΐ Dodecanal in 5 ul Wasser wurde an dem Tag hergestellt, an dem die lichtentwickelnde Lösung angewandt werden sollte. Lyophilisierte Luciferase, extrahiert aus Photobacterium ftsheri (Worthing- :·> ton Biochemical Corp, Freehold, New Jersey) wurde zu 0,013m Phosphatpnffer, pH 7,3, bis zu einer Konzentration .von 20 mg/ml zugegeben. Nach 30 min wurde die entstehende Suspension mit 7500 g -.<> min zentrifugiert und die Perle verworfen. Die hch'.entwickelnde Lösung f. wurde dann 5 min vor Anwendung ;,ergestellt durch Zusammengeben von 75 μΐ des Resgensgemisches, 5 μΙ Dodecanalemulsion und 20 μΐ Luciferaselösung.

B. Herstellung von unlöslich _w

gemachtemBindungspartner

Avidin, das eine Bindungsaffinität gegenüber Biotin besitzt, wurde unlöslich gemacht, indem es folgendermaßen kovalent an wasserunlösliche Polymerperlen gebunden wurde. Eine Menge Sepharose 4B (Pharmacia ' '■ AB, Uppsala, Schweden) wurde aktiviert zur Bindung mit Avidin nach dem Verfahren von March et al. Analytical Biochemistry, 60, 149 (1974). Ungefähr 4 ml der aktivierten Sephdfose 4B wurden in 8 ml 0,1m Citratpuffer, pH 7,0, suspendiert. Zu der Suspension '>·> wurden 6 mg Avidin mit iener Aktivität von 9,9 Einheiten pro mg in 3 ml Wasser zugegeben. Eine Einheit Ayidinaktivität ist die Menge an Avidin, die imstande ist, 1 μg Biotin zu binden. Das entstehende Reaktionsgemisch wurde 6 h bei 7'C geröhrt Die "» Sepharose 4B, an die das Avidin gebunden war, »vurde filtriert, mit 100 ml 0,1m Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9,0, gewaschen und erneut in 240 ml 0,1m Tris-(hydroxymethylJaminomethanhydrochlarid-Puiier, pH 8.0, suspendiert.

C Vergleichsversuche

Es wurden neun spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,19 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyfy-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, 0,6m Äthanol, 0,01m Semicarbazidhydrochlorid und jeweils die in Tabelle I angegebenen Mengen bzw. Konzentrationen an NAD, NAD-Biotin-Konjugat, Suspension von an Sepharose 4B gebundenem Avidin (entsprechend Teil B dieses Beispiels) und Sepharose-4B-Suspension (hergestellt durch Suspendieren von 1 ml [packed] Sepharose 4B in 6OmI 0,1m Tris-(hydroxyäthyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0). Die Reaktionsgemische wurden 15 min bei Raumtemperatur leicht geschüttelt Dann wurden 0,22 internationale Einheiten Alkoholdehydrogenase zu jedem R^aktionsgemisch gegeben, um die Reaktionsreduktion einzuleiten. Das Semicarbazid verband sich mit dem in Reaktion (a) gebildeten Acetaldehyd unter Bildung eines Semicarbazone, wodurch die Reaktion (a) in die gewünschte Richtung geführt wurde.

Die Reaktionsgemische wurden erneut 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. 10 μΙ der Oberstehenden Flüssigkeit jedes Reaktionsgemisches wurden dann in eine getrennte Küvette injiziert, die in einem DuPoM-Modell 760 Bioluminescence Photometer (E I. DuPont de Nemours, Willmington, Delaware) befestigt war und 100 μΙ der vorher hergestellten lichterzeugenden Lösung enthielt, die vorher 2 bis 3 min bei 25°C inkubiert worden war. Man erhielt die in Tabelle I angegebenen Ergebnisse.

Tabelle 1

Reaklionsgemisch

NAD-Konzentraiion

(nm)

NAD-Biolin-Konjugal-

Konzenlralion

(nm)

Suspension von
an Sepharose 4B
gebundenem
Avidin

Sepharose-4B-Suspension

Spitzenlicht
intensität

1,2
159

>26.1«i4:19

22

gemisch

3
4
5
6
7
8
9

ΝΛΠ-Κηη-/entrcilmn

(nrni

ΝΑΠ-Uimin-

KtinjugBt-

Κοηκηίπιΐίηη

(nmi

10
21
21

21

Suspension von ;in Sephüiose AW gebundenem AviUin

Seplmroscml·
Suspension

(rill

10
10

Spiuenlieht-

147

45,9
110

28,5
154
114
1,6

Die Ergebnisse der Vergleichsreaktionen 1 und 9 zeigen, daß in Abwesenheit von NAD und dem NAD-Biotin-Konjugat nur sehr wenig Licht erzeugt wurde. Die Reaktionen 2 und 3 führten zu Ergebnissen, die zeigen, daß die lichterzeugende Reaktion eintrat, wenn freies NAD zugegeben wurde, und daß eine derartige Reaktion im wesentlichen nicht beeinflußt wurde durch das Vorhandensein von an Sepharose 4B gebundenem Avidin. Die Ergebnisse der Reaktionen 4,5 und 6 zeigen, daß das NAD-Biotin-Konjugat in der lichterzeugenden Reaktion aktiv war, daß die Spitzenlichtintensität zunahm, je mehr NAD-Biotin-Konjugat vorhanden war und daß das Vorhandensein von .in Sepharose 4B gebundenem Avidin die Lichterzeugung hemmte. Ein Vergleich der Ergebnisse der Reaktionen 3 und 5 mit denjenigen der Reaktionen 7 und 8 zeigt, daß die lichterzeugende Reaktion durch das Vorhandensein von purer Sepharose 4B nicht bet >Jlußt wurde.

D. Bestimmungsverfahren

Es wurden fünf weitere spezifische Bindungsreaktionigemische hergestellt jeweils mit einem Volumen von 0,19 ml und jeweils enthaltend 0,1m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0,0,6m Äthanol, 0,01m Semicarbazid und jeweils die in Tabelle II angegebenen Mengen bzw. Konzentrationen an NAD-Biotin-Konjugat, freiem Biotin und an Sepharose 4B gebundenem Avidin in Suspension. Jedes Reaktionsgemisch wurde auf die gleiche Weise behandelt wie die Vergleichsreaktionsgemische in Teil C dieses Beispiels. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II	NAD-Biotin- Konjugat-Konzen- t ration	Biotm-Konzen- tration	Suspension von an Sepharose 4B gebundenem Avidin	Spitzen- licht- intensität
Reaktionsgemisch	(nm)	(nm)	(μΐ)
	21	_	—	79,1
10	21	-	20	17,4
11	21	79	20	43,1
12	21	158	20	59,9
13	21	158	—	79,7
14

Die Ergebnisse der Reaktionen 11,12 und 13 zeigen, daß freies Biotin und das NAD-Biotin-Konjugat wirksam um die bindenden Stellen des unlöslich gemachten Avidins in Konkurrenz treten, da die Spitzenlichtintensität abhängt von der Menge an freiem vorhandenen Biotin. Die Reaktionen 10 und 14 führten zu Ergebnissen, die zeigen, daß in Abwesenheit von unlöslich gemachtem Avidin die Spitzenlichtintensität for stark unterschiedliche Konzentrationen an freiem Biotin konstant ist

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die in der flüssigen Phase vorhandene Menge an NAD-Biotin-Konjug?t umgekehrt proportional ist der

eo

65 Menge an vorhandenem freien Biotin und das erfindungsgemitfe Verfahren und Mittel daher geeignet sind zur Bestimmung eines Liganden in einer unbekannten Flüssigkeitsprobe.

Beispiel5 Spezifische Bindungsbestimmung für Avidin und Biotin unter Verwendung eines Erzyinsubstrats

als Markierungssubstanz

Die in diesem Beispiel angewandten spezifischen Bindungssysteme beruhten auf der folgendun Reaktionsgleichung:

Ο —C—(CH₂)₄—I

\ς/

Biotin-Umbelliferon-K.onjugat

A. Herstellung von unlöslich gemachtem
Bindungspartner

Avidin wurde unlöslich gemacht, indem es !covalent an wasserunlösliche Polymerperlen gebunden wurde entsprechend Teil B von Beispiel 4 mit der Ausnahme, daß nach dem Waschen mit iOOmi Ö.im Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9,0, die das Avidin gebunden enthaltene Sepharose 4B in 12 ml 0,1m Tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer, pH 8,0, suspendiert und 1:1 mit 0,1m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0, verdünnt wurde.

B. Konkurrenz-Bindungsbestimmung von Biotin; Wirkung verschiedener Biotingehalte auf die

freigesetzte Umbelliferonmenge

Es wurden acht spezifische Bindungsreaktionsgemische hergestellt, jeweils mit einem Gesamtvolumen von 0,2 ml und jeweils enthaltend 0,1m Bis-hydroxyäthylglycinhydrochlorid-Puffer, pH 7,0,03 μπι Biotin-Umbelliferon-K.onjugat (entsprechend Beispiel 3), 15 μΙ der das Avidin gebunden enthaltenen Sepharose-4B-Suspension entsprechend Teil A dieses Beispiels und Biotin in den in Tabelle HI angegebenen Konzentrationen. Die Reaktionsgemische wurden unter leichtem Schütteln 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert u.:d 100 μΙ der überstehenden Flüssigkeit mit 2 ml 0,1m Bis-hydroxyäthylglycirbydrochlorid-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1,08 Einheilen Schweivieesterase, zusammengegeben. Nach 5 min lan-

+ Η® + Biotin

(max. Fluoreszens bei 448 nm)

gem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Intensität der Fluoreszens in jedem Reaktionsgemisch bei 448 nm mit einer Anregung von 364 nm mit Hilfe eines Amico-Bowman-Spektrophotofluometers gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 111 angegeben.

25

JO

35

Tabelle IH	B iolin-Konzent ration	Fluoreszens-
Reaktionsgemisch	(im)	intensität
	0,00	0,355
1	0,10	0,495
2	0,20	0,469
3	0,30	0,503
4	0,40	0,547
5	0,50	0,502
6	0,75	0,580
7	1,00	0,688
8

Es konnte so in diesem Beispiel gezeigt werden, daß die in der flüssigen Phase vorhandene Umbelliferon-Biotin-Menge direkt proportional war der Menge an vorhandenem freien Biotin und damit das Bestimmungsverfahren und die Mittel geeignet sind zur Bestimmung eines Liganden in einer unbekannten flüssigen Probe.

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Claims (11)

Patentansprüche:

1. Heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmungjeines Liganden in einem flüssigen Medium, wobei man a) das flüssige Medium mit > Reagentien zusammenbringt, umfassend ein markiertes Konjugat mit einem spezifisch bindenden Teil, der an einen markierenden Teil mit einer vorbestimmten Eigenschaft gebunden ist, wobei die Reagentien und der Ligand ein Bindungs-Reaktionssystem bilden unter Entstehung 1. einer gebundenen Phase aus dem markierten Konjugat, in dem der spezifisch bindende Teil an einen spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, und 2. einer freien Phase des markierten Konjugats, in dem der is spezifisch bindende Teil nicht an den spezifisch bindenden Partner dazu gebunden ist, wobei die Menge der Markierungssubstanz in einer Phase eine Funktion ist von der Menge des in der zu bestimmenden Probe vorhandenen Liganden, b) die gebundene Phase von der freien Phase trennt und c) die vorbe. jnmte Eigenschaft in der gebundenen oder freien Phase bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Eigenschaft des markierendenTeils des Konjugats eine vorbestimmte Aktivität als Substrat in einer enzymkatalysierten Reaktion oder als Reaktionspartner in einer Chemilumineszenzreaktion ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine Gruppe enthält, die durch ein Enzym unter Bildung eines nachweisbaren Moleküls abgespalten werden kann.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine durch eine Esterase abspaltbare Estergruppe enthält κ

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül ein fluoreszierendes Molekül ist

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Molekül Umbelliferon, Fluorescein oder ein Derivat davon ist

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein bei Einwirkung eines Enzyms seine Farbe ändernder Farbstoff ist

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Chemolumineszenzreaktion die Gesamtmenge oder die Spitzenintensität des entstehenden Lichtes gemessen wird

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn· w zeichnet, daß der markierende Teil des Konjugats Luminol oder Isolutninol oder ein Derivat davon ist

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch ein Enzym katalysiert wird. SS

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymkatalysierte Reaktion und/oder die Chemolumineszenzreaktion eine cyclische Reaktion ist

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn- m> zeichnet, daß die cyclische Reaktion autokatalytisch abläuft.