JPS604939B2 - 液体中のハプテンヌは抗原を分析するための均一系免疫分析方法及びそれに用いる試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中のハプテン又は抗原（対象物質）の存
在を、特定（又は、特異的）結合の相手物質に対する該
対象物質の親和性に基づいて測定するための方法及び試
薬に関するものである。

更に詳しくは、本発明は分離工程を必要とせず、かつ標
識物質として放射性物質もしくは部分変形した酵素を用
いない特定結合による分析に用いる方法及び試薬に関す
るものである。なお、本明細書中では、「特定」と「特
異的」とは同義に用いている。液体中の低濃度の物質の
存在を検出するための便利かつ信頼性が高く、更に危険
性のない方法への要望があることは明白である。このこ
とは、１０‐１１モル濃度程度の低濃度で体液中に存在
する成分が病理学上重大である臨床化学の分野に於いて
は、特に該当する。そのような低濃度の物質を検出する
ことの困難さは、通常は試料の量が非常に制限される臨
床化学の分野に於いて増加する。以前に於いては、物質
は、その検出される物質が必ず反応体であるような反応
系に基づいて、液体中で検出されていた。未知物質の存
在は、反応生成物の出現もしくは既知反応体の消失によ
って検出されている。ある場合に於いては、そのような
分析方法は、生成物の出現もしくは反応体の梢失の速度
あるいは生成した生成物もしくは平衡に達した際に費や
された反応体の総量の測定を行なうことにより、定量的
にもなり得た。それぞれの分析の反応系は必然的に小さ
なグループの物質の検出のみに限定されるか、あるいは
個別性（特異性）のないもののいずれかである。個別性
が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用できる分析系の
研究により、放射性免疫分析法が生み出された。

この方法によると、検出対象の物質の放射性標識を付さ
れたものの量は、未知のものに個別性を有する限られた
量の抗体について、禾知のものと競い合わされるように
される。そして、抗体に結合されるようになる標識を付
されたものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本来、抗
体に結合されるようになる標識を付された形の検出対象
の物質を、そのような結合を起さない物質と分離するこ
とが必要となる。この必要とされる分離を遂行するため
の種々の手段が、例えば米国特許第３５０５０１９号、
３５５５１４３号、３６４６３４６号、３７２０７６ぴ
号、及び３７９３４４５号に示されるように開発されて
きた。しかし、それらの手段は全て、結合一被標識付与
体の非結合−被標識付与体からの効率的な分離を確実に
するために炉過、遠心分離もしくは洗浄などの少なくと
も一つの人手による操作工程を必要としている。分離操
作を不要にすることができれば分析方法が非常に簡単に
なり、臨床試験室に於いて更に有用となることであろう
。免疫分析に於いて放射性物質を用いることは、放射性
物質の代わりに酵素を付けた物質を用いることによりあ
る程度避けることができるようになった。

米国特許第３６５４０９び号及び３７９１９３２号‘こ
例示されているように、酵素を付けた免疫分析を遂行す
るために必要な人手による操作工程は大体に於いて放射
性免疫分析に於いて必要とされることと同じで、煩わし
い分離工程を必要とする。酵素を付けた物質を用いるこ
とについては、付けられる各々の酵素が付された結合体
の形成に用いられるために個別に化学的な変形が加えら
れなければならないといった他の不利益もある。付けら
れる他の物質、例えば橘酵素もしくはビールス（ネィチ
ャー、２１９１８６（１９６８））を使用することが提
案され、更に蟹光標識を用いること（フランス国特許第
２２１７３５ぴ号）も提案されている。放射性標識もし
くは付けられた酵素による免疫分析方法は、検出可能物
質の幅を広げること、もしくは操作を簡素化させること
により将釆に於て改良されうるにしても、その本質とし
て、これらの方法はある種の分離工程が必ず必要となる
。最近になり、分離工程を必要としない別種の方法が公
表された。従ってこの方法は、分離が必要である不均一
系との対照として、均一系と言われる。米国特許第３８
１７８３７号には、検出対象物質（リガンド）に共有結
合する標識物質としての酵素と対象物質用の可溶性受容
体（通常は抗体）から成る可溶性複合体を分析対象の液
体と結合させる工程及び複合体中の酵素活性に対する対
象物質の効果を測定する工程を含む競合結合分析方法が
開示されている。この方法は、酵素−結合−リガンドの
複合体と受容体との反応により複合体中の酵素の酵素活
性が抑制される結果になるため、分離工程が不必要とな
り、この点有利であるが、それにもかかわらずこの方法
はその能力について厳しい制限があるため広範囲な分析
の要求には応じられない。

例えば、酵素−結合−リガンドの複合体の製造に於いて
、検出対象の物質もしくはリガンドは酵素に、その結合
位置が酵素の酵素的に活性な位置に近接するように注意
深く制御された方法により結合されなければならないこ
とは、明らかに必須である。このことは複合体とされた
りガンドと受容体との間の反応により酵素的に活性な位
置を封鎖する目的で必要とされる。酵素は、その大きさ
が、分子量約１００００から１００００００の範囲で大
きく変動する。こうして、分子量が５０００００もしく
はそれ以上の平均的酵素の活性位置を物理的に封鎖する
ことができるように、１５００００と３０００００の間
の分子量を有する抗体の形の受容体の結合位置は厳密に
制御されなければならない。酵素の化学構造は複雑であ
るため、そのような化学的結合を厳密に制御することは
実際困難であり、種々広範囲の酵素をふるいわけること
によっても、わずか少数のみの酵素がこの均一系分析方
法に於いて使用できるものと考えられるであろう。更に
、定量的な試験結果を得るためには、各々の酵素−結合
−リガンド複合体について酵素の数とＩＪガソドの数を
厳密に制御することが必須となる。

この点でもまた、酵素の複雑なべプチド構造のためにこ
のような制御が困難となる。従ってやはり、リガンドと
酵素の比の必要な制御が確実に行なえるような適当な分
子構造を有する酵素はわずか少数であろうと考えられる
。先行技術の均一系分析方法は酵素による増幅を含んで
おり、このため非常に鋭敏であるとされている。

しかし、標識物質である酵素がそれ自身先行技術の分析
方法の鋭敏性を決定する制限要素となっているため、こ
の方法の応用性は非常に限定されたものとなる。この鋭
敏性は明らかに酵素−結合ーリガンド結合体に於ける特
定の酵素の触媒的活性に制限される。従って先行技術方
法の応用性は、有用な結合体の形成のための結合への要
求のみならず、そのような結合体を使用する分析の鋭敏
性の、特定の結合体の酵素への依存性によっても制限さ
れる。先行技術の均一系の分析方法は、尿がリンパ液の
ような生物の液体の試験に応用する際にも更に不利益が
ある。

酵素−結合ーリガンド結合体中に含まれる酵素種が試験
対象の液体試料中にかなりの量存在するので、それによ
り分析方法の精度に相当な影響を与える制御不可能の活
性が背景（バックグラウンド）として現われるようにな
る。従って、人間もしくは動物の生物学的液体を試験す
る際に使用できる分析方法を形づくるためには、そのよ
うな液体に対して内因性ではない外部的な酵素を選んで
これを用いて酵素−結合ーリガンド結合体を形成するよ
うにする必要があり、そのため、この分析方法の応用性
は更に制限を受けることになる。従って本発明の目的は
、分離工程を必要とせず、かつ不便な放射性物質もしく
は部分変形酵素を標識物質として使用しない、液体中の
ハプテンタ又は抗原（対象物質）を検出するための新規
な方法及び試薬を提供することである。

更に、先行技術の方法よりも更にその応用範囲が広く便
利な均一系免疫分析方法及びその系を提供することも目
的の一つである。

０ 対象物質もしくはその特定結合の相手物質に先行技
術方法の酵素よりも更に都合よく結合することのできる
藤識物質を用いる均一系免疫分析方法及びその系を提供
することも本発明の目的の一つである。

特定の結合反応によって、先行技術方法の酵素よりも更
に容易に影響を受けやすい活性を有する標識物質を含む
結合体を用いる均一系免疫分析方法及びその系を提供す
ることもまた本発明の目的の一つである。

種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることにより、先行
技術方法に於ける酵素の活性のいかなる変化よりも更に
都合よくいかなる活性の変化についても検出できる標識
物質を含む結合体を用いた均一系免疫分析方法及びその
系を提供することもまた本発明の目的の一つである。

更に、先行技術の方法よりも更に容易に生物の液体の試
験に応用できる均一系免疫分析方法及びその系を提供す
ることも本発明の目的の一つである。

本発明の均一系免疫分析方法は、液体中のハブテン又は
抗原を分析するための：ゆ 液体を、 ○｝ 予め定められた特性を有する標識物質とハプテン
又は抗原との結合体、及び（２｝ 標識化された結合体
の抗体−束縛相及び抗体一遊離相を生成する、ハプテン
又は抗原に対する抗体からなる試薬と接触させる工程；
及び ｛ｂ’束縛相と遊離相を分離することなく、液体中のハ
プテン又は抗原の指標としての特性を測定する工程から
なる均一系免疫分析方法であって、 結合体中の標識物質が、酵素触媒反応におけるヌクレオ
チド補酵素であることを特徴とするものである。

又、本発明の均一系免疫分析試薬は、液体中のハフ。

テン又は抗原を均一系免疫分析方法により分析するため
の：‘１｝ 予め定められた特性を有する標識物質とハ
プテン又は抗原との結合体、及び｛２｝ ハプテン又は
抗陳に対する抗体 からなる試薬であって、 試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合体の抗体−
束縛相及び抗体−遊離相を生成する結合反応系を形成し
、かつ、束縛相又は遊離相のどちらかにおける特性が液
体中のハブテン又は抗原の量の関数であって、結合体中
の標識物質が、酵素触媒反応におけるヌクレオチド補酵
素であることを特徴とするものである。

本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ鋭敏な均
一系免疫分析方法及びその系を、前以つて決められた反
応の成分として賦与された反応活性を示す物質を標識物
質として使用することに基礎を置いて提供するものであ
る。

そのような物質はここに置いて「反応体」として示され
る。この方法は、部分的には、ハプテン又は抗原（対象
物質）とその特定結合の相手物質（このうちの一つに反
応体が結合される）との間の反応が前以って決められた
反応に於いて反応体の活性を変化させるという事実に基
づいている。この反応が、特定結合反応を監視検出する
ための手段として働く。この基本的現象により、本発明
の方法を実施する場合に種々の試験組成物及び装置を含
む種々の操作工程が採用される。好ましい基本的な操作
案は、直接結合技術と競合結合技術である。直接結合技
術に於いては、検出対象のハプテソ又は抗原を含んでい
ると推定される液体は、該対象物質の特定結合の相手物
質と結合している反応体を含有する結合体と接触せしめ
られ、次いで反応体の活性の何らかの変化が分析される
。

競合結合技術に於いては、液体は対象物質の特定結合の
相手物質と接触せしめられ、また対象物質（リガンド）
もしくはその特定の結合に関する類似物質の一方もしく
は両方に結合している反応体を含有する結合体と接触せ
しめられ、次いで反応体の活性の何らかの変化が分析さ
れる。両方の技術に於いて、反応体の活性は、前以つて
決められた監視検出反応を反応体と共に形成する少なく
とも一種の試薬を液体と接触させることにより測定され
る。液体中の対象物質の定性的な測定は、得られた反応
と、対象物質を含まない液体中に於ける監視検出反応を
その特性（通常は反応速度）について比較することによ
り行なわれる。その両者の差異が反応体の活性の変化を
指示している。液体中の対象物質の定量的測定は、得ら
れた反応と既知量の対象物質を含有する液体中での監視
検出反応を比較することにより行なわれる。監視検出反
応は酵素触媒が用いられることが好ましい。

通常は、監視検出反応は、結合体中の反応体に対して高
度に鋭敏なものから選ばれる。この点に於いて、発光も
しくは後光発光反応系は非常に有用である。特に好まし
いのは循環反応系で、反応体が循環する物質である反応
系が特別に好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵
素を触媒として利用する系が特に有利である。本発明に
おける結合体中の反応体は酵素系の反応体、即ちヌクレ
オチド補酵素であり、９０００より小さい分子量を有す
るものが好ましい。本明細書に於いて用いられる用語は
以下のように定義される。

「リガンドハ「対象物質」もしくは「対象物質（リガン
ド）」は、物質もしくは一群の物質で、その液体中の存
在もしくは量が測定されるものである。「対象物質（リ
ガンド）の特定結合の相手物質Ｊとは、物質もしくは一
群の物質で、他の物質を排除して対象物質に対して特定
の結合の親和性を示すものである。「対象物質の特定の
結合に関する類似物質」とは、物質もしくは一群の物質
で、対象物質への特定結合の相手物質の結合親和性に関
して対象物質と本質的に同じ挙動をとるものである。一
般には、特定結合反応の各成分、例えば、リガンド又は
抗原（対象物質）を含有すると推定される液体、結合体
及び／又は対象物質の特定結合の相手物質は、分析の目
的にとって有意な量もしくは濃度の対象物質が液体に含
まれている時に結合体中の反応体の活性が測定できる程
度に変化するのであれば、いかなる量、方法及び順序で
も結合し得るものである。

特定結合反応の全ての成分は液体に可溶であることが好
ましく、そうであれば均一分析系となる。しかし、対象
物質の特定結合の相手物質もしくは結合体が不溶性であ
る不均一分析系も所望により利用することができる。直
接結合技術を用いる場合、特定結合反応の成分は、対象
物質を含有すると推定される液体と、対象物質の特定結
合の相手物質と結合している反応体を含有するある量の
結合体である。結合体の反応体が液体に接触した時の活
性は、液体中の対象物質と結合体中の特定結合の相手物
質との間の結合の量に逆比例して変化する。すなわち、
液体中の対象物質の量が増加すれば、結合体の反応体の
活性は低下する。定量的な結果を得るためには、液体に
接触する特定結合の相手物質の量は常に、結合体の反応
体の活性に何らかの変化の評価が完了する前の結合体と
液体が接触している間、液体中に存在すると考えられる
対象物質の全部と結合できる量より多くされる。実際に
は、特定結合の相手物質の量は、液体中に存在すると考
えられる対象物質の最大予測量に基づいて、上述した規
準に従い選ばれる。直接結合技術は特に、自身より小さ
な特定結合の相手物質を持つ高分子量対象物質を検出す
るのに有用である。競合結合技術を用いる場合、特定結
合反応の成分は、対象物質を含有すると推定される液体
、対象物質（リガンド）もしくは対象物質の特定の結合
に関する類似物質に結合されている反応体を含むある量
の結合体、及びある量の対象物質の特定の結合の相手物
質である。

特定結合の相手物質は結合体と液体の両方に実質的に同
時に接触せしめられる。液体中のいかなる対象物質（リ
ガンド）も、特定結合の相手物質と結合するために結合
体中のりガンドもしくはその特定の結合の類似物質と競
争するので、液体と接触した時の結合体の反応体の活性
は、液体中の対象物質と特定結合の相手物質との間の結
合の量に正比例して変化する。即ち、液体中の対象物質
の量が増加するにつれ、結合体の反応体の活性は増加す
る。定量的な結果を得るためには、結合体中の反応体及
び液体と接触している特定結合の相手物質は通常、結合
体の反応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前の
特定結合の相手物質、結合体そして液体が接触している
間、液体中に存在すると考えられる対象物質の全てと結
合体の形をした対象物質もしくはその類似物質の全てと
に結合することのできる量よりも少なくされる。実際に
は、特定結合の相手物質の量は、液体中に存在すると考
えられる対象物質の最大予測量に基づいて、上述した規
準に従い選ばれる。通常、液体に接触する結合体の形の
対象物質（リガンド）もし〈はその類似物質の量は、液
体中の試験される対象物質の最少量を超えてはならない
。競合結合技術は特に、自身より大きな特定結合の相手
物質を持つ対象物質を検出するのに有用である。競合結
合技術の変形としては置換結合技術があり、この技術で
は結合体が先ず特定結合の相手物質に接触せしめられ、
次いで液体に接触する。

特定結合の相手物質に対する競争はその時に起こる。こ
のような方法に於いては、特定結合の相手物質に接触す
る結合体の量は、対象物質を含有すると推定される液体
との接触の前の結合体と特定結合の相手物質との接触の
間存在している特定結合の相手物質の量と結合すること
のできる量より多い量の対象物質（リガンド）もしくは
その類似物質を含む量である。この接触の順序は二種類
の便利な方法のいずれによっても達成できる。一つの方
法によれば、結合体は、対象物質を含有すると推定され
ている液体との接触の前に、液性環境下で特定結合の相
手物質と接触せしめられる。第二の方法によれば、対象
物質を含有すると推定される液体は、結合体と特定結合
の相手物質を含む複合体と接触せしめられる。この場合
、結合体中の特定結合物質と特定結合の相手物質は互い
に相対して結合している。第一の方法に於いて特定結合
の相手物質と結合するようになる結合体の量、これは第
二の方法に於ける複合体の形に於ける結合体の量になる
が、この量は通常、結合体の反応体の活性の何らかの変
化の評価の完了する前の特定結合の相手物質（又は複合
体）と液体が接触している時に液体中の対象物質の全て
と置き換わることのできる量よりも多くされる。競合結
合技術の他の変形としては順次飽和技術がある。

この技術では特定結合反応の成分は競合結合技術で用い
られるものと同じであるが、添加の順序あるいは各成分
の組合せ及び各成分の相対比が競合結合技術の場合と異
なっている。順次結合技術によると、対象物質の特定結
合の相手物質は、液体と結合体の接触の前の期間に、対
象物質を含有すると推定される液体と接触せしめられる
。液体に接触する特定結合の相手物質の量は通常、液体
が結合体と接触する前の、特定結合の相手物質と液体が
接触する時に、液体中に存在していると考えられている
対象物質の全てと結合できる量よりも多くされる。更に
、結合体の形の対象物質もしくはその類似物質の量は通
常、結合体の反応体の活性の何らかの変化の評価が完了
する前の液体と結合体が接触する間、残存する禾結合の
特定結合の相手物質の量と結合できる量よりも多くされ
る。実際には、特定結合の相手物質及び結合体中の対象
物質もしくはその類似物質の量は、液体中に存在すると
思われる最大予測量に基づき、上述した基準に従い選ば
れる。他の添加順序及び特定結合反応の成分の他の相対
比を含む操作工程もまた、ここに述べた発明概念から逸
脱せずに均一系免疫分析を行なうために考案されるであ
ろうことは予測されることである。

前以つて決められた監視検出反応の成分の結合体の反応
体の活性の何らかの変化を評価する工程は、特定結合反
応の反応混合物を、監視検出反応を結合体の反応体と共
に形成する少なくとも一種の物質と接触させ、次いでそ
の反応の特性に対する特定結合反応の影響を測定するこ
とにより、都合良く達成される。

監視検出反応は一つのあるいは一連の複数の化学的に変
形もしくは転換する反応から成る。特に記さない限り、
本明細書に託す「反応系」の用語は、前以つて決められ
た監視検出反応の全体もしくは一部を意味する。酵素触
媒の反応系が利用される場合、その系は結合体の反応体
と更に少なくとも一種の酵素を含むものであり、本発明
においては、またヌクレオチド補酵素の如き酵素反応体
の一種もしくは数種を含むものである。

そのような酵素触媒反応系は単一の簡単な酵素反応を含
むか、又は複雑な一連の酵素反応及び非酵素反応を含む
であろう。例えば、酵素反応系は単一の酵素触媒による
劣化もしくは解離反応から成るかもしれない。そのよう
な系に於いて結合体の反応体は、劣化もしくは解離を起
こす酵素基質であり、特定結合反応の反応混合物と接触
するために必要な反応系の唯一の成分は、劣化もしくは
解離反応に触媒作用を及ぼす酵素である。更に複雑な酵
素触媒の反応系は二種もしくはそれ以上の反応体が関与
する単一の酵素反応でも良く、あるいは数種の反応体が
関与していても良い（但し、この反応の内の一つは酵素
触媒によるものである）。そのような系に於いて、結合
体の反応体は酵素触媒による反応の酵素反応体の一つで
あり、特定結合反応の反応混合物は、結合体中のものと
は別で選ばれた酵素触媒反応系を形成するのに必要な適
当な酵素及び反応成分と接触せしめられる。この酵素触
媒反応系は、微生物の如き生物体の細胞の生態系のよう
に複雑な生化学系を含むこともまた意図されている。

例えば、特定な微生物の成長に必須な栄養物質が結合体
中の反応体として選ばれてもよい。反応体の活性に於け
る何らかの変化は、唯一の反応体である栄養物質源が結
合体である環境内にそのような微生物が置かれた場合、
その微生物の成長特性の変化をももたらすであろう。即
ち、例えば特定結合反応の反応混合物に接触したときの
微生物の成長速度の変化は、その中に対象物質が存在し
ていることを示すものであろう。結合体中の反応体と共
に監視検出反応を形成する適当な反応成分は、特定結合
反応の開始の前、又はそれと同時に、あるいはそれに引
き続き、単独で或は結合した形で特定結合反応の反応混
合物に接触せしめられる。

特定結合反応の開始後、監視検出反応の必須成分の一部
もしくは全てを含む反応混合物は、通常、結合体中の反
応体の活性の何らかの変化を評価する前の前以つて決め
られた時間培養される。培養期間の後、監視検出反応に
必要で、未だ反応混合物中に充分な量存在していない成
分をこれに加える。そして監視検出反応に対する何らか
の影響を評価して、液体中の対象物質の存在もしくは量
の指標とする。対象物質が液体に存在しないか、又は有
意ではない量しか存在しない状況に於いては、前以つて
決められた監視検出反応は相対的に一定の性質を示す。

液体中に対象物質が存在する場合には、監視検出反応の
少なくとも一つの特性もしくは性質が変化する。一般に
は結合体の反応体の活性は、その反応体が監視検出反応
に関与することのできる量もし〈は速度と規定される。
即ち、監視検出反応の性質は液体中の対象物質の存在に
より、通常は全反応速度もしくはその反応により生成す
る一もしくは数種の反応生成物の平衡量について変化す
る。通常の場合に於いては、結合体中の反応体の監視検
出反応への関与の能力は、該反応体が結合している特定
結合物質とその特定結合物質の特定結合対応物質との間
の反応により低下する。即ち、遊離状態の結合体は、束
縛された状態の場合よりも監視検出反応に対して更に活
性である。特定結合反応の培養後に存在する遊離の結合
体及び束縛された結合体の相対量は液体中の対象物質の
量の関数となり、監視検出反応への影響を決定するもの
となる。監視検出反応の全反応速度の変化が、対象物質
の存在を決定するのに用いられる特性である時（これが
好ましい）には、その速度は通常、反応体の消失速度も
しくは反応生成物の出現速度を測定することにより決め
られる。

そのような測定は、通常のクロマトグラフ、重量分析、
電位差滴定、分光光度測定、蟹光測定、濁度測定、容量
測定等の分析技術を含む広範囲の種々の方法により行な
われる。本方法は第一として低濃度の対象物質の検出を
目的として考えられているので、非常に感度の良い反応
系が本発明の新規な特定結合反応系と組合わせて用いる
ように開発された。監視検出反応の一つの好ましい形態
としては、生物発光もしくは化学発光の現象を示す反応
のように、好ましくは酵素触媒による発光反応系がある
。結合体中の反応体は、光発生反応もしくは酵素による
か又はよらない発光反応の準備段階である反応の反応体
であっても良い。特定結合反応の結果得られる結合体の
反応体の何らかの変化が、発生する光の全量、ピーク強
度もしくは性質の変化を引き起こす。発光反応系の例と
してはＡ表に記されたものが挙げられ、この表に於いて
は以下のような省略形が用いられている。ＡＴＰ：アデ
ノシン三燐酸 ＡＭＰ：アデノシンー燐酸 ＮＡＤ：ニコチンアミド。

アデニン・ジヌクレオチドＮＡＤＨ：還元型のニコチン
アミド・アデニン・ジヌクレオチドＦＭＮ：フラビン・
モノヌクレオチド ＦＭＮＱ：還元型のフラビン・モノヌクレオチドｈレ：
電磁波放射、通常は赤外、可視或は紫外領域のものＡ表 本発明方法で利用することができる発光反応系に関する
更に詳細な事項及び議論は、次の文献に見られる。

ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２
３６：４８（１９６１）ジヤーナル・オプ・アメリカン
・ケミカル・ソサエテイ、８９：３９４４（１９６７）
コルニア（Ｃｏｍｊｅｒ）他、生物発光の進歩、ジョン
ソン他編、プリンストン大学出版部（ニュー・ジャージ
ー、１９６６）３６３−８４頁ピー・クライス（Ｋｒｉ
ｅｓ）、レニラ・ルシフエラーゼ（ＲｅｎｉｌｌａＬｗ
ｉｆｅｒａｓｅ）の精製と性質、ジョージア大学博士論
文（１９６７）アメリカン・ジヤーナル・オプ・フイジ
オロジー、４１：４５４（１９１６）バイオロジカル・
ビユレタン、５１：８９（１９２６）ジヤーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリ−、２４３：４７１４（
１９６８）本発明の新規な特定結合反応を監視検出する
のに用いられる特に好ましい反応系は循環系の、あるい
は循環反応系である。

そのような反応系は、第一の反応の生成物が第二の反応
の反応体となり、その第二の反応が第一の反応の反応体
ともなる物質をその生成物として持つものの一つである
。循環反応系の一つのモデルは次の図式により表わされ
る。上記のモデルの循環反応系に於いて、仮に充分な量
の反応体ＡとＢが存在するとすれば、少量の循環物質に
より多量の生成物ＡとＢを生成することができる。

循環反応系を構成する反応により生成する生成物の速度
と量は、存在する循環物質の量に対して高度に影響を受
けやすいので、該循環物質を本発明の結合体中の反応体
として用いるのが特に好ましい。本発明の新規な特定結
合反応系に組合せて用いられるように意図される循環反
応系の例を、Ｂ表、Ｃ表及びＤ表に示す。Ｂ 表 ＊ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド＊＊還
元型ＮＡＤＣ 表 ＊ ニコチンアミド・アテニン・ジヌクレオチド燐酸＊
＊ 還元型ＮＡＤＰＢ表及びＣ表に記載された循環反応
系は、各表に列記された反応のいずれかの一つと表中に
列記された他の反応のいずれかとの組合せを、全て含む
ことに留意すべきである。

例えばＢ表の反応１は、２から８までの反応のいかなる
ものの一つとも組合せることができ、これにより有用な
循環反応系を形成することができる。従って、Ｂ表及び
Ｃ表はそれぞれ本発明に用いられる５６及び２０の可能
な循環反応系を表わしている。Ｂ表及びＣ表に表わされ
ている循環反応系に加えて更に、分光光度分析指示薬（
好ましくは比色分析用のもの）の酵素によるか又はよら
ない変化を含む循環反応系の一つも、本発明によって意
図されている。

そのような系に於いては、反応速度もしくは循環速度の
何らかの変化は指示薬の分光光度測定に現われる性質の
変化に反映を及ぼすことになる。好ましい比色分析用指
示薬を使用した場合は、その変化は色の変化となるであ
ろう。指示薬の変化を含む循環反応系の例としては、Ｂ
表の反応体Ｂと生成物Ｂとの反応の一つと、酸化−還元
指示薬と電子移動型試薬とを含む反応とを組合わせて得
られた系を挙げることができる。電子移動型試薬として
は、フェナジンメトサルフェートを用いることができる
。有用な指示薬には、ニトロテトラゾリウム、チアゾイ
ル・ブルー及びジクロルフェノールィンドフェノールの
酸化型が含まれる。聡 ○ Ｂ表、Ｃ表及びＤ表に記された循環反応系に於いて、各
成分はイオン、酸もしくは塩の形で示されているが、そ
れらの表のいかなる反応系を形成する際にも、当然、各
成分は液体と接触することによりイオン化する塩もしく
は酸の形で加えることも可能である。

監視検出反応系には、また指数級数的循環反応系が含ま
れるように意図されている。

指数級数的循環反応系の例は次の通りである。ＡＭＰ＋
ＡＴＦミオキナーゼ２ＡＤＰ ＡＤＰ＋ＰＥＰピルビン酸（塩）キナーゼ； ＡＴＰ十
ピルビン酸（塩）このような循環反応は、各循環の間に
循環物質の量が２倍になるという意味に於いて自触反応
である。

従って循環速度は時間と共に指数級数的に増加し、高い
感度をもたらす。このような循環反応に関する詳細な事
項及び議論はジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、２４７：３５＄−７０（１９７２）に見られ
る。結合体の反応体の活性の何らかの変化を評価する手
段として循環反応系が用いられる場合、反応体の消失速
度もしくは反応生成物の出現速度は、更に一種もしくは
それ以上の循環系を用い、次いで全反応速度を通常の方
法により測定することにより測定することができる。

特定結合反応系に組合わせた循環反応系を用いることに
より、高い分析感度とともに高度な応用性がもたらされ
る。

単一の反応体の特定結合物質の結合体を多数の反応と共
に用いて、広範囲で感度を変えることができ、かつ感覚
器官もしくは人工的手段により検出可能な広範囲の応答
が得られる循環系を形成させるのも良い。このような応
用性は、先行技術の均一系酵素分析方法に於いて欠けて
いたものである。本発明の好ましい実施態様に於いては
必要性はないが、液体中の対象物質の存在が結合体の反
応体の活性に影響を与えるような場合でも不均一系分析
技術を用いることが望ましいこともある。

そのような状況は、不均一系方法が特に都合の良い場合
にあらわれる。ある不均一系方法によれば分析系中の対
象物質の有効濃度を増加することができ、これにより感
度を増加させることができる。このような不均一系方法
の例としては、本発明の結合体もしくは対象物質の特定
結合の相手物質（これは、選ばれた特定の操作の型に従
い選ばれる）のいずれかより成る不溶性マトリックスを
含むカラム装置を用いたものがある。標識物質として放
射性標識もしくは酵素付加された物質を用いる全ての他
の不均一系分析方法もまた、本発明の反応体を標識物質
として用いて、同様に行なわれる。本発明は、特定結合
の相手物質が存在するいかなるハプテン又は抗原（対象
物質）の検出にも適用することができる。

対象物質は通常、ベプチド、蛋白質、炭水化物、糟蛋白
質、ステロイド、又は生物系内に特定結合の相手物質が
存在するか或は相手物質を合成することができる他の有
機分子である。この対象物質は、機能面の用語で言えば
、抗原、その抗体、ハプテン（付着体）、その抗体及び
ビタミン並びにそれらの受容体及び結合物質から成る群
より選ばれる。本発明を用いて検出することのできる対
象物質を特に例示すれば、フエリチン、ブラデキニン、
プロスタグランデイン及び腰傷特異性抗原のような抗原
及びハプテン；ピオチン、ビタミンＢ，２、築酸、ビタ
ミンＥ及びアスコルビン酸のようなビタミン；ミクロソ
ーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のような抗体；そ
してチロキシン結合グロブリン、アビジン、内因子及び
トランスコバラミンのような特定結合受容体が挙げられ
る。一般に結合体は、より小さい対象物質（リガンド）
に結合された反応体及びその選ばれた特定結合の相手物
質を含むことが好ましい。

選ばれた特定結合の相手物質の分子量が対象物質の分子
量の約１／１０もしくはそれ以下である場合の対象物質
を検出する場合には、直接結合技術を用いるのが好まし
い。従って、検出される対象物質が抗体もしくは特定結
合受容体である場合には、抗原に結合した反応体或は抗
体もしくは受容体の特定結合の低分子量の相手物質に結
合したハプテンを含む結合体が用いられる直接結合技術
によることが好ましい。選ばれた結合の相手物質の分子
量が検出される対象物質の分子量の１折音もしくはそれ
以上大きい場合、即ち抗原、ハプテンもしくはビタミン
が検出対象である時、より小さな対象物質（リガンド）
に結合された反応体を含む結合体が用いられる競合結合
技術もしくは順次飽和技術を利用することが特に有利で
ある。本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応体
の測定可能な量の活性が維持されるような形で、特定結
合物質（選ばれた分析方法に依り、対象物質、対象物質
の特定の結合に関する類似物質もしくは対象物質の特定
結合の相手物質のいずれかである）に結合もしくは組合
わされる。

反応体と特定結合物質との結合は、活性を有する反応体
を用いる監視検出反応が、上述の発光反応系及び循環反
応系に於けるような結合を化学的に壊すように設計され
ていない分析の条件下では、通常実質的に変更できない
。しかし、ある場合には、そのような結合は、壊される
ように設計されるか、あるいは反応活性の変化を評価す
るための手段としての選ばれた監視検出反応により影響
を与えられる。反応体は特定結合物質に直接に結合して
も良く、その結果、結合体の分子量は反応体と特定結合
物質の全分子量に等しいか、又は小さくなるようになる
。

しかし、通常は、反応体と特定結合物質は、１から５の
固、好ましくは１からＩＭ固の炭素原子もしくは窒素、
酸素、硫黄、燐その他のような複素原子を含む橋かけ基
により連絡されている。１個の原子を含む橋かけ基の例
としは、メチレン基（炭素原子１個）及びアミノ基（複
素原子１個）がある。

橋かけ基は通常１０００を超えない分子量を持っており
、好ましくは２００より小さいものである。橋かけ基は
炭素原子もしくは複素原子の鎖、もしくはそれらを組合
せたものを含んでおり、通常はェステル、アミド、エー
テル、チオェステル、チオエーテル、アセタール、メチ
レンもしくはアミノの如き基の形をした連結基により、
反応体と特定結合物質もしくはその活性誘導体とに結合
されている。本発明の結合体中の反応体は、前以つて決
められた監視検出反応の成分として、賦与された（例え
ば、一定の又は既知の）反応活性を有する物質である。

更に詳しく言えば、本明細書による開示に於ては、「反
応体」及び「反応活性を有する物質」とは、自身とは異
なる一もしくは数個の生成物をもたらす、限定され、か
つ測定可能な化学的な変形（変質）をすることができ、
更にその反応体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そ
のような化学的な変形もしくは変質に関与するような他
の型の物質）の如き反応開始手段との相互作用により、
電磁的放射、熱エネルギー、もしくは音波エネルギーを
もたらす物質を意味する。従って本明細書に於いて「反
応体」と定義した物質群の内には通常の無機及び有機試
薬及び生化学的物質が含まれる。しかし、触媒（酵素を
含む）や放射性アイソトープのように監視検出反応に於
ける反応体でないものは除外される。特定のイＧ学物質
は化学的環境に従って種々の形で機能することができる
ため、一つの化学物質が種々の異なった分類に分類され
ることがあるが、そのような物質が本明細書の開示に於
いていかなる機能を有するかが決定されるのは、本明細
書に記された選ばれた監視検出反応に関するその物質の
反応性によるものであるということが認識されるであろ
う。本発明における反応体はヌクレオチド補酵素もしく
はその活性を有する部分変形物質もしくは誘導体のよう
な酵素反応の反応体である。

ヌクレオチド補酵素は非蛋白系分子で、酵素の触媒機能
が効率良く働くように促進する際に、一方の酵素蛋白質
から他方に移動するものである。既知のヌクレオチド補
酵素は９０００より少ない分子量を有しており、５００
０より少ない分子量を有する補酵素が好ましい。有用な
ヌクレオチド補酵素の例としては、アデノシン燐酸（例
、一、二、及び三燐酸の形）、ニコチンアミド・アデニ
ン・ジヌクレオチドとその還元型、及びニコチンアミド
・アデニン・ジヌクレオチド燐酸とその還元型のように
特にアデニン基を含むもの等が挙げられる。他の有用な
ヌクレオチド補酵素としては、クアノシン燐酸、フラビ
ン・モノヌクレオチドとその還元型、桶酵素Ａとそのチ
オェステル（スクシニル−補酵素Ａを含む）、３′・５
−アデノシン二燐酸、及びアデノシン−３′−ホスフエ
ートー５′ーホスホサルフエートがある。有用な補酵素
活性な結合体には、特定結合物質（例、対象物質（リガ
ンド）、対象物質の特定の結合に関する類似物質もしく
は対象物質の特定結合の相手物質）が前述したような直
接結合又は橋かけ基により結合されているアデニン基を
持つヌクレオチド補酵素が含まれる。

アデノシン燐酸、ニコチンアミド１アデニン・ジヌクレ
オチドもしくはその還元型、又はニコチンアミド・アデ
ニソ・ジヌクレオチド燐酸もしくはその還元型が含まれ
るそのような補酵素活性な結合体は次のような一般式を
有する。上式に於てＲＩは Ｒ２は一〇Ｈ又は Ｒ３は を表わし； Ｒ４は 又は を表わし； Ｒ５は‐Ｙ一Ｚ（Ｙは結合もしくは橋かけ基で、Ｚは対
象物質（リガンド）、対象物質の特定の結合に関する類
似物質もしくは対象物質の特定結合の相手物質である）
を表わす。

上記の式は補酵素活性な結合体のイオン化した形を表わ
しているが、水素付加したもの又は塩の形のものも等し
く有用である。水素付加の量は、その環境のｐＨに依存
する。また、それらの結合体の塩もまた適当な場合に使
用され得る。そのような化合物の合成は種々の方法によ
り行なわれる。

以下に図式的に示す合成経路に従うことが有用な化合物
を製造する場合に有利であろう。合成の図式に於いてア
デニン環構造の位置は次のようにして示されている。ま
た、次のような省略も行なわれる。Ｒｉｂ‘まリボース
部分（下図）を示す。

Ｒｉｂ′は燐酸化リポース部分（下図）を示す。

Ｐｈは燐酸基を示す。Ａｐ誘導体はアデノシン−５−燐
酸の誘導体を示す、例、−燐酸体（ＡＭＰ）、二燐酸体
（ＡＤＰ）、三燐酸体（ＡＴＰ）。

ＮＡＤ誘導体はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドもしくはその還元型の誘導体を示す。

ＮＡＤＰ誘導体はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド燐酸もしくはその還元型の誘導体を示す。Ｒは特
定結合物質もしくはその部分変形物質を示す。

×は解離する基を示す（通常はハロゲン）。

ＡＰの１−位置誘導体ＡＭＰ誘導体 （１） エッチ・ギルフオード他，ケミカ・スクリブタ
，２：１６５（１９７２）（２ アイ・ビー・トレイヤ
−他，バイオケミカル・ジャーナル，１３９：６０９（
１９７４）ＮＡＤの１−位置誘導体Ｇ） エッチ・ジー
・ウインドミュラ‐及びェヌ・オー・カブラン，ジャー
ナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリ−，２３６：
２７１６（１９６１）ＮＡＰＰの１−位置誘導体 ■ シー・アーノし・ロウエ及びケイ・モスバッハ，ョ
ーロビアン・ジャーナル・オプ・バイオケミストリ−，
４９：５１１（１９７４）ＡＰの２−位置誘導体 （Ｓ アール・ェム・アチソン，複秦環化合物化学入門
，インターサイエンス出版（ニューョ−ク，１９６２）
３０８頁（６）イー・フイツシヤ−，ベリヒテ，３０：
２２３９（１８９７）（７） ダボーノし他，ジャーナ
ル・オプ・ケミカル・ソサイテイ（９６７（１９４８）
■ エッチ・ギルフオード他，前述（９） アイ・ピー
・トレイヤ−，前述 ＮＡＤの２−位置誘導体 （１０」 エヌ・エイ・ヒューズ他，ジャーナル・オブ
・ケミカル・ソサイテイ，３７３３（１９５７）ＮＡＤ
Ｐの２−位置誘導体（１１）エヌ・エイ・ヒューズ他９
前述 ＡＰの３−位置誘導体 （１２）・ジェイ・エッチ・リスク−，複秦環化学に於
ける進歩，カフＶ）坪 他編，アカデミック・プレス（
ニューョ【ク，１９６６）＄頁（１３）ヱヌ・ジェイ・
均サード及びテイ・ジェイ・フジイ，ジャーナル・オブ
・アメリカン・グミかいソサイテイ，８５：３７１９（
１９６３）（１４）イー・フィッシャー，前述（１５）
ダボール他？前述 （１６）エッチ・ギルフオード他．前述 （１７））アイ・ピー・トレイヤ−他，前述ＮＡＤの３
−位置誘導体（１８）ェヌ・ェイ・ヒューズ他，前述 ＮＡＤＰの３−位置誘導体 （１９）エヌ・エイ・ヒューズ他，前述 ＡＰの６一位置誘導体 （２０）エッチ・ギルフオード他，前述 （２１）アイ・ピー・トレイヤー他，前述ＮＡＤの６−
位置誘導体 （２２）エッチ・ジー・ウインドミュラー及びェヌ・オ
ー・カブラン，ジャーナル・オブ・′ミイオロジカル・
ケミストリー，２３６：２７１６（１９６１）ＮＡＤＰ
の６−位置誘導体 （２３）シー・アール・ロウエ及びケイ・モスバッハ，
前述ＡＰの８−位置誘導体（２４）アイ・ピー・トレイ
ヤー他，前述ＮＡＤの８−位置誘導体 （２５）シー・ワイ・リ‐他，アルカイフヌ・オブ・ピ
オケミストリ−・アンド・ピオフイジクス，１６３：５
６１（１９７４）ＮＡＤＰの８−位置誘導体（２６）シ
ー・ワイ・リ−他，前述 （２７）シー・アール・ロウェ及びケイ・モスバッハ，
前述ＡＰの９−位置誘導体（２８）ェヌ・ジェイ・レオ
ナード及びテイ・ジェイ・フジイ，前述（２９）ジェイ
・エッチ・リスク−，前述（３０）イー・フィッシャー
，前述（３１）ダボール他，前述 （３２）エッチ・ギルフオード他，前述 （３３）アイ・ピー・トレイヤ−他，前述ＮＡＤの９−
位置誘導体 （３４）エヌ・エイ・ヒューズ他，前述 ＮＡＤＰの９−位置誘導体 （３３ ェヌ・ェイ・ヒューズ他，前述 上述した化合物の他にも、特定結合物質が燐酸基を介し
て結合されているアデ／シン燐酸も有用な酵素活性結合
体に含まれる。

そのような化合物は次の一般式を有する。上式に於てＲ
Ｉは 又は を表わし； Ｒ２は‐Ｙ−Ｚ（Ｙは結合もしくは橋かけ基で、Ｚは対
象物質（リガンド）、対象物質の特定結合に関する類似
物質もしくは対象物質の特定結合の相手物質である）を
表わす。

同様に、水素付加体、酸、適当な場合には塩の型でも用
いることができる。このような化合物の合成は種々の方
法により行なうことができる。

この有用な化合物を製造するに当っては、以下に図示し
た合成経路に従うことが有利であろう。前に示した省略
形は以下の図式にも適用される。ＡＰの誘導体 （３６）アイ・ピー・トレイヤ‐他，バイオケミカル・
ジャーナル，１３９：６０９（１９７４）（３７）アイ
・ピー・トレイャ−他，前述本発明の一形態として、対
象物質が含有されていると考えられる液体と組合わされ
る特定結合反応の成分は液体もしくは固体の形である。

好ましい均一系の分析系に於いては、該成分は通常は溶
液もしくは、液体に容易に溶解することのできる固体の
形である。試験対象の液体は通常、性質上水性であるの
で、該成分は一般には水落性の形態である。即ち水溶液
か、又は粉末か樹脂のような水溶性固体の形である。本
分折方法は、試験管のような標準の実験室用の容器中で
、固体もしくは液体の特定結合反応の成分及びそれに加
えられる反応系の成分により実施される。一もしくは数
種の特定結合反応の成分及び／又は一もし〈は数種の監
視検出反応の成分は、担体に包含されていてもよい。

一つの考え方として坦体は、それらの成分の一種もしく
は数種をその内側部分に例えば液体もしくはゆるい固体
の形で、あるいはその内部表面の被膜の中に、含有する
試験管又はカプセルのような液体保持用容器でもよい。
他の考え方として坦体は、試験対象の液体に関して不溶
性かつ多孔性で、好ましくは吸収性であるマトリックス
の形態であってもよい。そのようなマトリックスは例え
ば吸収性紙；重合体のフィルム、膜、けばもしくは塊状
物；ゲル及びその他の形である。そのような形の場合、
該装置は、試験対象液体を接触させ、特定結合反応及び
／又は監視検出反応を行なわしめ、かつ得られる応答を
観察するために都合のよい手段を提供する。試験対象と
なる液体は天然に存在するか或は人工的に作られたもの
であって、ハプテン又は抗原（対象物質）が存在すると
推定されるものである。通常は生物体の液状物又はそれ
を希釈もしくは他の処理を施して得られた液体である。
本発明方法により分析することのできる生物体の液状物
には、血清、プラズマ、尿、羊水、脳液、せきずし、液
等が含まれる。細胞等の固体材料もしくは気体状のもの
等の他の材料も、固体もしくは気体を溶解させるか又は
固体を抽出する等の方法により液体の形にして分析する
ことができる。先行技術の均一系分析系とは対照的に、
結合体中の標識物質の反応活性と同じか又は類似した反
応活性を有する物質を含有する生物体の液体に於ける対
象物質を、バックグラウンド‘こ邪魔されることなく分
析することができる。

内因性バツクグラウンド反応体活性は種々の方法で容易
に除くことができる。生物体の液体は、内因性反応体活
性を選択的に破壊するように処理することができる。そ
のような処理としては例えば、内因性活性を化学的に破
壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄剤の破壊作用を
不活性にする処理を行なう処理が挙げられる。例えば、
応々にして生物体の液体には本来反応体を劣化させる酵
素が存在する。

特に、反応体がＮＡＤ、ＮＡＤＰもしくはＡＴＰのよう
な補酵素の場合には、これが言える。このような補酵素
の劣化した酵素の阻害剤、例えば酵素から必須の金属イ
オン活性物質を奪う作用をするキレート剤、は多数存在
する。特別の例としては、ＮＡＤ劣化酵素が正常の血清
中に見出され、これは分離した血清から数時間で全ての
内因性ＮＡＤ活性を実質的に除去するに充分な酵素活性
を有する。そのような酵素を劣化させる活性は、エチレ
ンジアミン四酢酸のようなキレート剤を加えることによ
り効果的に阻害することができる。劣化させる活性は、
特定の酵素阻害剤を加えることによっても除くことがで
きる。例えば、ＡＴＰ劣化酵素は８ｙ−メチレンＡＴＰ
もしくはＱＣ−メチレンＡＴＰを加えることにより阻害
することができる。本発明を以下において実施例により
説明するが、これらは本発明を制限するものではない。

実施例 １ニコチンアミド・６一（２ーアミノエチルア
ミノ）・プリン・ジヌクレオチドの製造ニコチンアミド
・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）２夕を１０の‘
の水に溶かし、次いで０．６泌のエチレンイミンを滴下
した。

この際、ＩＭ過塩素酸を加えることによりｐＨを７以下
に維持する。エチレンィミンの滴下が終了した後、餌を
４．５に調整し、２０〜２デ０に保持して反応させた。
２岬時間毎に０．６の‘のエチレンイミンを加え、餌を
４．５に再調整した。

９曲時間後に溶液を１Ｍ音体積量の−１０ｑＣのアセト
ンに注ぎ、生成した油状物を集め、エーテルで洗い、フ
ラスコ中の約５０の【の水に溶解させた。

縛られた溶液をＩＮ水酸化ナトリウムで−７．０〜７．
５に調整し、これに１グラムの重炭酸ナトリウムを加え
た。

この溶液に窒素を４〜５分通し、次いで１グラムのヒド
ロ亜硫酸ナトリウムを加えた。フラスコを密封し、室温
で４流ご間放置した。次に、この溶液を１筋ご間酸素処
理し、水酸化ナトリウムによりｐＨを１１．３に調整し
、７５ｏ０で１時間加熱した。反応混合物を室温に冷却
し、０．６グラムのトリスー（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタンを加え、次いで卵塩酸を用いて班を７．５に
調整した。得られた溶液に１０００国際単位のアルコー
ル脱水素酵素と１の‘のアセトアルデヒドを加えた。反
応混合物の光学濃度の低下を３４瓜肌で監視し、低下が
観察されなくなった時にｐＨを３．５に調整した。溶液
を１針音体積量の−１ｏｏ○アセトンに注ぎ、生成した
油状物を分離し、エーテルで洗い、１０〜１５の上の水
に溶解させた。得られた溶液を、水で平衡にされたセフ
アデックスＧ−１０（スェーデン国、ウプサラのファー
マシア・ェー・ビーより入手）の２．５×９０地のカラ
ムを導入した。

１２の‘のフラクションをそれぞれ集めた。紫外領域の
最大光学吸収の波長と、その波長での光学密度を、各々
のフラクションについて測定した。また、アルコール脱
水素酵素により還元した後の各々のフラクションの乳触
れでの光学密度も測定した。２６４ｎｍで光学吸収の最
大値を有し、かつ３４伽肌での光学密度と２６４ｎｍで
の光学密度との比が０．５より大きいフラクションを集
めた。

集めたものをロータリー・ェバポレーターにより１５〜
２０叫に濃縮し、水で平衡にされたダウェックスヱーＸ
８（米国、カリホルニア、リッチモンドのバイオ・ラド
・ラボラトリーズから入手）の２．５〜２．８伽のカラ
ムに通した。カラムに水を更に加えて集められた物質を
洗い、１０泌のフラクションをそれぞれ集めた。２６４
ｎ机で光学吸収の最大値を有し、かつ３４仇凧での光学
密度と２６４ｎｍでの光学密度との比が０．１より大き
いフラクションを集めた。

集めたものを、水で平衡にされたダウェックス５０一×
２（米国、カリホルニア、リッチモンドのバイオ・ラド
・ラボラトリーズから入手）の５×４＆あのカラムに通
した。

カラムに水を更に加えて集められた物質を洗い、２０の
‘のフラクションをそれぞれ集めた。２６４ｎｍで光学
吸収の最大値を有し、かつ３４仇机での光学密度と２６
叩凧での光学密度との比が０．１８より大きいフラクシ
ョンを集めた。

集めたものを４〜５奴に濃縮し、以下のように露気泳動
法により精製した。濃縮したものを、液の流れの方向に
垂直な幅が１〜２弧の細長いワットマン３ＭＭ紙（米国
、ニュージヤージー、クリフトンのリーフ・エンジェル
から入手）に付けた。

次いで紙をｐＨ６．０で０．０２Ｍ燐酸ナトリウムで湿
らせた。電気泳動法はサイエンス１２１：８２９（１９
５５）に記載されているデュラム（Ｄｕｍｍｍ）懸垂紙
法に従って、電位勾配約８．５ボルト／弧で４〜６時間
実施した。目的のピリジン・ジヌクレオチド誘導体の位
置は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、１９１：４４７（１９５１）に記載されている方法
に従って、０．８Ｋシアン化ナトリウムを試験紙にスプ
レーした後に現われる蜜光により決められる。目的の譲
導体を含む領域を緩から切り取り、５０の上の水で３回
抽出する。ニコチンアミド・６−（２−アミノエチルア
ミ／）・プリン・ジヌクレオチドを含有する得られた抽
出液を集め、３〜４の‘に濃縮し、次いで一２ぴ０に保
持した。実施例 ２ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドとビオチン
との結合体の製造実施例１で得たニコチンアミド・６−
（２−アミノヱチルアミノ）・プリン・ジヌクレオチド
２２夕を含有する１羽の水に１６雌のビオチンを懸濁さ
せた。

数滴の０．１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてビオチンの溶
解を助けた。得られた溶液に２４０雌の１−シクロヘキ
シルー３一（２−モルホリノエチル）ーカルボジイミド
・メト−ｐ−トルエン・スルホネートを加え、０．１Ｎ
塩酸を滴下することにより溶液にした。反応混合物を室
温で５時間放置し、次いで１０の‘の−１０ｑｏのアセ
トンに注いだ。生成した油状物を分離し、５〜１０の‘
のエーテルで２度洗浄し、１〜２の‘の水に溶解させた
。得られたものを、実施例１に述べた紙を用いた函気泳
動法により精製した。シアン化ナトリウムをスプレーす
ると複数の蟹光帯が現われ、一つは隠極に移動し、他は
陽極に移動していた。後者の帯はＮＡＤービオチン結合
体を含んでおり、これを水で抽出し、一２ぴ０に保存し
た。実施例 ３ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと２・４−
ジニトロフェニルの結合体の製造実施例１で得たニコチ
ンアミド・６一（２ーアミノエチルアミノ）・プリン・
ジヌクレオチド２３雌を含有する１．５の‘の水に２６
の２の重炭酸ナトリウムを溶解させた。

得られた溶液に、１７りその２・４−ジニトロフロロベ
ンゼンを含有するエタノールを加え、反応混合物を室温
で階中５時間蝿拝し、次いでこれに４５の‘の−１０ｑ
○のアセトンを加えた。生成した沈殿を分離し、１０の
‘のアセトンで２度洗浄し、５の‘の水と共に蝿拝した
。分離した黄色の可溶性物質を、実施例１に記した紙を
用いて電気縁敷法により５時間かけて精製した。陽極へ
移動した帯はＮＡＤと２・４ージニトロフェニルの結合
体を含んでいた。これを水で抽出し、３〜５の‘に濃縮
した後、一２０午０に保存した。実施例 ４ＮＡＤとＮ
ＡＤ−ビオチン結合体の酵素循環速度に対するアビジン
とビオチンの影響本実施例で用いられる循環反応系は、
次の反応に基礎を置いている。

‘ａ’側−リがド十字Ｌ酸側事Ｌ酸脱醗・側Ｈ−リガン
ド十けしビン酸（塩）‘ｂ’ＮＡＤＨーリガンド＋チア
ゾリルブルー（酸化型）ジアホラーゼＮＡＤ−リガンド
＋チアゾリルプルー（還元型）各々の全量０．５の【で
、ｐＨ７．８の０．１ＭのＮ・Ｎービスー２ーヒドロキ
シェチルグリシン塩酸塩の緩衝液を含み、第１表に示さ
れるような濃度と活性度のＮＡＤ、ＮＡＤービオチン結
合体（実施例２で作られたもの）、ビオチン及びアピジ
ン（後者はビオチンに結合する親和性を有している）を
それぞれ含有する８種類の特定結合反応混合物を調製し
た。

アビジンの活性度の１単位は１一夕のビオチンと結合す
るアビジンの量である。反応混合物を室温で２〜３時間
保存した。

０．１の‘のＩＭ乳酸リチウム、０．０５の‘の１０の
Ｍ酸化型チアゾリルブルー、及び充分な量のＰＨ７．８
の０．１２ＭのＮ・Ｎービスー２−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液（０．３８国際単位の牛の心臓の乳
酸脱水素酵素と１．５国際単位の豚の心臓のジアホラー
ゼを含有）で全体容量を１の【にした溶液を各々の反応
混合物に加えることにより、該反応混合物と酵素／基質
水性混合物とを接触させた。

酵素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で２４分毎
に５７仇凧の各混合物の光学密度の全変化を測定して、
反応混合物各々について還元型のチアゾリルフル−の生
成の相対速度を測定した。全操作を２度繰り返し、結果
の平均を第１表に示す。第１表 反応１、４及び８は対照実験で、ＮＡＤとＮＡＤービオ
チン結合体が存在しない場合には、循環が殆んど起らな
いことを示している。

反応２と３は、ＮＡＤービオチン結合体が未加工のＮＡ
Ｄに比べて著しい酵素活性量を有することを示している
。反応３と６の結果からは、反応混合物中にアビジンが
存在すると、存在するＮＡＤがビオチンと結合している
場合還元型のチアゾリルブルーの生成を阻害することが
わかる。反応６と７の結果を比較すると、遊離のビオチ
ンが存在すればチアゾリルプルーの阻害量が反応混合物
のビオチンの濃度に比例して低減することがわかる。従
って本実施例に於いては、ＮＡＯとビオチンとの結合体
中のＮＡＤの循環反応系に関する活性はアビジンの存在
により低下し、そのような活性の低下の大きさは、更に
ビオチンが存在する場合には低減することが示されてい
る。

実施例 ５ アビジンの直接結合−循環分析；循環速度に対するアビ
ジン量の変動の影響本実施例に於いて用いた循環反応系
は実施例４に示したものと同じである。

各々の全量が０．物‘で、各々ｐＨ７．８の０．１２Ｍ
のＮ・Ｎービス−２ーヒドロキシェチルグリシン塩酸塩
緩衝液と実施例２にて得られたＮＡＤ−ビオチン結合体
（２５仇Ｍ）を含む７種類の特定結合反応混合物を調製
した。また、その反応混合物の内の６種は、第２表に示
した量のアビジンを含有する。反応混合物を室温で２〜
３時間保存した。

０．１の‘のＩＭ乳酸リチウム、０．０５の‘のｌｏｗ
Ｍ酸化型チアゾリルブル−、及び充分な量の餌７．８の
０．１２ＭのＮ・Ｎ−ビスー２ーヒドロキシエチルグリ
シン塩酸塩緩衝液（０．斑国際単位の牛の心臓の乳酸脱
水素酵素と１．５国際単位の豚の心臓のジアホラーゼを
含有）で全体量を１泌にした溶液を各々の反応混合物に
加えることにより、該反応混合物と酵素／基質水性混合
物とを接触させた。

酵素／基質混合物の添加後の最初の１時間以内で２４分
毎に５７仇凧の各混合物の光学密度の全変化を測定して
、反応混合物各々について還元型チアゾリルプルーの生
成の相対速度を測定した。アビジンを含有する各々の反
応混合物の光学密度の変化とアビジンを含有しない反応
混合物の光学密度の変化との比（パーセントで表示）を
計算し、第２表と添付した第１図に相対反応速度として
託す。結果を第２表と、またグラフの形で添付図面中の
第１図に示す。第２表 以上のように本実施例に於いては、循環反応系の相対循
環速度、従ってＮＡＤ−ビオチン結合体中のＮＡＤの活
性は、特定結合反応混合物中に存在するアジビンの量の
逆の関数となることが示されている。

従って本発明によれば、液体中の対象物質であるアビジ
ンの存在を定量的に測定するための直接結合−循環分析
技術を利用する試験用の試薬と方法が提供される。実施
例 ６ ビオチンの競合結合−循環分析；循環速度に対するアジ
ビン量の変動の影響本実施例に於いて用いた循環反応系
は実施例４に示したものと同じである。

各々の全量が０．４５泌で、各々ｐＨ７．８の０．１２
ＭのＮ・Ｎービスー２−ヒドロキシェチルグリシン塩酸
塩緩衝液と実施例２にて得られたＮＡＤ−ビオチン結合
体（１８仇Ｍ）を含有する７種類の特定結合反応混合物
を調製した。反応混合物の６種、即ち第３表の番号１〜
６までには更に０．１１単位のアピジンが含まれている
。また、アピジンを含有する６種類の反応混合物の内５
種、即ち第３表の混合物２〜６には、第３表に示した濃
度のビオチンが含まれている。反応混合物を室温で２〜
３時間保持した。０．１私のＩＭ乳酸リチウム、０．０
５の‘のｌｏｗＭ酸化型チアゾリルフルー、及び充分な
量の岬７．８の０．１２ＭのＮ・Ｎービス−２ーヒドロ
キシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（０．３班国際単位の
牛の心臓の乳酸脱水素酵素と１．５国際単位の豚の心臓
のジアホラーゼを含有）で全体量を１舷にした溶液を各
々の反応混合物に加えることにより、該反応混合物と酵
素／基質水性混合物とを接触させた。

酵素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で２４分毎
に５７瓜仇の各混合物の光学密度の全変化を測定して、
反応混合物各々について還元型チアゾリルプルーの相対
速度を測定した。ビオチンを含有する各々の反応混合物
の光学密度の変化とビオチンもアビジンも含有しない反
応混合物の光学密度の変化との比（パーセントで表示）
を計算し、第３表と添付した第２図に相対反応速度とし
て記す。結果を第３表と、またグラフの形で添付図面中
の第２図に示す。第３表 以上のように本実施例に於いては、循環反応系の相対循
環速度、従ってＮＡＤ−ビオチン結合体中のＮＡＤの活
性は、特定結合反応混合物中に存在するビオチンの量の
直接の関数となることが示されている。

従って本発明によれば、液体中の対象物質であるビオチ
ンの存在を定量的に測定するための、競合結合−循環分
析技術を利用する試験用の試薬と方法が提供される。実
施例 ７ ２・４ージニトロフェニルとその誘導体の抗体の直接結
合−循環分析本実施例に於いては用いた循環反応系は実
施例４に示したものと同じである。

各々、ｐＨ７．８の＊０．１２ＭのＮ・Ｎ−ビスー２ー
ヒドロキシヱチルグリシン塩酸塩緩衝液と、第４表に示
された量と濃度のＮＡＤ、ＮＡＤ−２・４ージニトロフ
ェニル結合体（実施例３で得たもの）、２・４−ジニト
ロフェニルの抗血清及びニコチンアミド・モノヌクレオ
チド（ＮＭ皿）をそれぞれ含有する８種類の０．６の‘
の特定結合反応混合物を調製した。反応混合物を室温で
３〜４時間保存した。０．１泌のＩＭ乳酸リチウム、０
．０５の‘のｌｏｗＭ酸化型チアゾリルブルー、及び充
分な量のｐＨ７．８の０．１２ＭのＮ・Ｎービス−２−
ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（０．３８国際
単位の牛の心臓の乳酸脱水素酵素と１．５国際単位の豚
の心臓のジアホラーゼを含有）で全体量を１叫にした溶
液を各々の反応濠合物に加えることにより、該反応混合
物と酵素／基質水性混合物とを接触させた。

酵素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で２４分毎
に５７仇凧の各混合物の光学密度の全変化を測定して、
反応混合物各々について還元型チアゾリルブル−の生成
の相対速度を測定した。全裸作を２度繰り返し、結果の
平均を第４表に示す。第４表 反応１は対照実験で、ＮＡＤとＮＡＤービオチン結合体
が存在しない場合には、循環が殆んど起らないことを示
している。

反応２は、ＮＡＤ−２・４ージニトロフェニル結合体が
酵素循環系で活性であることを示している。反応３及び
５からは２・４ージニトロフェニルの抗体が存在すると
、ＮＡＤの循環が妨げられることがわかる。反応６の結
果に示されているように、そのような阻害はＮＭＮを添
加することにより逆転する。反応３と４の結果からは、
ＮＭＮが存在すると循環速度は、不存在の場合に比べて
約１５％大きくなることがわかる。この結果は、他の測
定によるとＮＭＮは抗体の不存在下では循環速度に影響
を与えないことが示されているので、恐らく外部のＮＡ
Ｄが混入したためと思われる。しかしながら、抗血清は
ＮＡＤ自体に関してい〈らかの活性を有しており、この
活性はＮＭＮが存在すると阻害される。以上のように本
実施例に於いては、ＮＡＤと２・４ージニトロフェニル
との結合体中のＮＡＤの循環反応系に関する活性は、２
・４−ジニトロフェニルの抗体の存在により低下するこ
とが示されている。従って、本発明によれば、液体中の
対象物質である２・４ージニトロフェニルの存在を測定
するための、直接結合−循環分析技術を利用する試験用
の試薬と方法が提供される。実施例 ８ ２・４ージニトロベンゼンとその誘導体の競合結合−循
環分析；循環速度に対するＮ−（２・Ｚ４ージニトロフ
ヱニル）−６−アミノカプロエート量の変動の影響本実
施例に於いて用いた循環反応系は実施例４に示したもの
と同じである。

各々の全量が０．６の‘で、各々ｐＨ７．８の０．１２
ＭのＮ・Ｎービスー２ーヒドロキシェチルグリシン塩酸
塩緩衝液、３０加ＭのＮＡＤージニトロフェニル結合体
（実施例３で得られたもの）及び５０ｒＭのニコチンア
ミド・モノヌクレオチドを含有する７種類の特定結合反
応混合物を調製した。７種類の反応混合物の内６種、即
ち第５表の１から６にはまた、他の反応混合物の循環速
度を８５％阻害するのに充分な量の２・４ージニトロフ
ェニルの抗体が含まれている。

Ｎ−（２・４ージニトロフエニル）一６ーアミノカプロ
ヱート（バイオケミカル・ジヤーナル、４２：２８７（
１９４８）に記載された方法により製造される２・４−
ジニトロベンゼンの誘導体）が更に、抗体を含有してい
る６種類の反応混合物の内５種、即ち第５表の２〜６に
、該表に示された濃度で含まれている。反応混合物を室
温で約４時間保持した。

０．１の‘のＩＭ乳酸リチウム、０．０５の‘の１０肌
Ｍ酸化型チアゾリルブルー、及び充分な量の解７．８の
０．１２ＭのＮ・Ｎービス−２ーヒドロキシェチルグリ
シン塩酸塩緩衝液（０．３８国際単位の牛のＤ臓の乳酸
脱水素酵素と１．５国際単位の豚の心臓のジアホラーゼ
を含有）で全体量を１地にした溶液を各々の反応混合物
に加えることにより、該反応混合物と酵素／基質水性混
合物とを後触させた。

酵素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で２４分毎
に５７瓜仇の各混合物の光学密度の全変化を測定して、
反応混合物各々について還元型チアゾリルブルーの生成
の相対速度を測定した。Ｎ−（２・４ージニトロフエニ
ル）一６ーアミノカプロエートを含有する各々の反応混
合物の光学密度の変化と、Ｎ−（２・４ージニトロフエ
ニル）−６ーアミノカプロエートも２・４ージニトロフ
エニルの抗体も含有しない反応混合物の光学密度の変化
との比（パーセントで表示）を計算し、第５表と添付し
た第３図に相対反応速度として記す。結果を第５表と、
またグラフの形で添付図面中の第３図に示す。第５表 以上のように本実施例に於いては、循環反応系の相対循
環速度、従ってＮＡＤージニトロフェニル結合体中のＮ
ＡＤの活性は、特定結合反応混合物中に存在するＮ−（
２・４−ジニトロフェニル）−６−アミノカプロェート
の量の直接の関数となることが示されている。

従って本発明によれば、液体中の対象物質であるＮ−（
２・４−ジニトロフェニル）一６−アミノカプロヱート
の存在を定量的に測定するための、競合結合−循環分析
技術を利用する試験用の試薬と方法が提供される。実施
例 ９ アビジンの直接結合一生物発光分析：発生するピーク光
強度に対するビオチンの存在の影響本実施例で用いられ
た生物発光反応系は次の反応に基づいている。

‘Ｃ）側−リガンド＋工タノ→し粛縁蓑Ｎ肌Ｈ」′ガン
ド＋アセトア′レデヒド（ｄ’Ｎ皿Ｈ−ＩＪがド十ＦＭ
Ｎ＊＋Ｈ■豚簾素ＮＡＤ−リガンド＋ＦＭＮＨ２‘ｅ’
ＦＭＮＱ＋長鎖ァルデヒ日０２ルシフェラ一撃洲＋長鎖
酸＋母０十ｈひ＊ フラビン・モノヌクレオチド反応｛
ｄ｝及び｛ｅ）を行なうための光発生溶液は次のように
して調整した。

州７．０の０．１３Ｍ燐酸緩衝液、０．６７重量パーセ
ントの牛の血清アルブミン、１５．７ｒＭのフ ラ ビ
ン・モ ノ ヌクレオチド（ＦＭＮ）及び１３．３のＭ
の酢酸ナトリウムを含む試薬混合物を調製し、この混合
物を鰭中−２０ｑｏで貯蔵した。５４そのドデカノール
を含んだ５の‘の水から成る乳蟹液を、光発生溶液を用
いる日に調製した。フオトバクテリウム・フイシェリ（
米国、ニュージャージー州、フリーホールドのウオーシ
ントン・バイオケミカル・コーポレイシヨンから入手の
酵素）から抽出し凍結乾燥したルシフェラーゼを・ｐＨ
７．３の０．０１９Ｋの燐酸緩衝液に加えて濃度２０腿
′の‘とした。３０分後に、得られた懸濁液を１５０舷
夕で１０分間遠心分離し、塊状物を捨てた。

次いで、７５ムクの試薬混合物、５仏そのドデカノール
乳簿液及び２０仏とのルシフェラーゼ溶液を一緒にして
５分間以内使用の光発生溶液を調製した。反応（ｅ｝で
発生する光を検出するために、光検出器と集光球面内に
置かれた６×５仇舷のキュベツトから成り、キュベット
内で発光した光が光検出器に向けて反射されるようにし
た分光器を製作した。

分光器から発生する電子信号は帯状チャート記録器に送
られる。本明細書中で用いられる「ピーク光強度」は記
録器の記録から測定し、チャート紙の区画に基づいて任
意の単位で記される。各々全量０．２の‘で、各々ｐＨ
８．０の０．１Ｍのトリスー（ヒドロキシメチル）ーア
ミノメタン塩酸塩緩衝液、０．０１Ｍのセミカルバジド
塩酸塩及びそれぞれ第６表に示された量もし〈は濃度の
エタノール、ＮＡＤ、ＮＡＤ−ビオチン結合体（実施例
２で得たもの）、ピオチン及びアビジンを含有する９種
類の特定結合反応混合物を調製した。反応混合物を室温
で１び分間保存した。次いで、０．０２５国際単位のア
ルコール脱水素酵素を各反応混合物に加えて還元反応を
開始させた。セミカルバジドは反応ｔｃ｝で生成するア
セトアルデヒドと結合してセミカルバゾンを形成し、こ
うして反応‘ｃ｝を目的の方向に動かす。反応混合物を
室温で約３分間保存した。

次いで各反応混合物１０仏そ容積を、２８℃に２〜３分
あらかじめ保存した前に調製した光発生溶液を含んだ前
述の分光器に設置した別々のキュベットに注入した。結
果を第６表に示す。第６表 反応１、４及び７は対照実験で、エタノールが存在しな
い場合には、循環が殆んど起らないことを示している。

反応５は、ＮＡＤービオチン結合体が生物発光反応系で
活性であることを示している。反応５及び６の結果から
は、反応混合物中にアビジンが存在すると発光する光の
量が抑えられることがわかる。反応６及び８の結果を比
較すると、遊離ビオチンが存在し、反応混合物中のビオ
チンの濃度が増大すると光発生が阻害される量は低減す
ることがわかる。反応２及び３は、アピジ−ンが遊離Ｎ
ＡＤの活性を阻害しないことを示し、反応５と９は、ビ
オチンだけが存在する場合にはＮＡＤ−ビオチン結合体
の活性が影響を受けないことを示している。以上の如く
本実施例に於いては、ＮＡＤービオチン結合体中のＮＡ
Ｄの生物発光反応系に関する活性がアビジンの存在下で
は低下し、そのような活性の低下は、ビオチンを更に加
えることによって小さくなることが示されている。

実施例 １０ ビオチンの競合結合一生物発光分析；得られるピーク光
強度に対するビオチンの量の変動の影響本実施例に於い
て用いられた生物発光反応系は実施例９に示したものと
同じである。

各々全量０．２の‘で、各々ｐＨ８の０．１Ｍのトリス
ー（ヒドロキシメチル）−アミ／メタン塩酸塩緩衝液、
０．８Ｍのエタノール、０．０１Ｍのセミカルバジド塩
酸塩、３４机ＭのＮＡＤ−ビオチン結合体（実施例２で
得たもの）、０．０２球国際単位のアルコール脱水素酵
素及び０．５５単位のアビジンを含有する７種類の特定
結合反応混合物を調製した。

この７種の反応混合物の内の６種、即ち第７表の２〜７
、には該表に示された濃度のビオチンが加えられた。添
加の順序及び方法は実施例９と同じである。反応混合物
を室温で約３０分間保存した。次いで各反応混合物１０
ムそ容積を、２が０に２〜３分予め保存した１００一そ
の光発生溶液（実施例９の方法により調製したもの）を
含んだ前述の分光器に設置した別々のキュベットに注入
した。全操作を２度繰り返し、平均の結果を第７表及び
グラフの形で添付図面の第４図に示す。第７表 以上の如く本実施例に於いては、生物発光反応系により
発生するピーク光強度の大きさ、即ちＮＡＤ−ビオチン
結合体中のＮＡＤの活性は、特定結合反応混合物中に存
在するビオチンの量の直接の関数であることが示されて
いる。

従って本発明によれ‘よ、液体中の対象物質であるビオ
チンの存在を定量的に測定するための、競合給合一生物
発光分析技術を利用する試験用の試薬と方法が提供され
る。実施例 １１ ２・４ージニトロベンゼンとその誘導体の競合タ 結合
一生物発光分析；得られるピーク光強度に対するＮ−（
２・４ージニトロフェニル）一６−アミノカプロェート
の量の変動の影響本実施例に於いて用いられた生物発光
反応系は実施例９に示したものと同じである。

０ 各々全量０．１の‘で、各々餌８の０．１Ｍのトリ
スー（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液
、０．０１Ｍのセミカルバジド塩酸塩、０．８Ｍのエタ
ノール、３５仏Ｍのニコチンアミド・モノヌクレオチド
及び３６７ｎＭのＮＡＤージニトロフェニル結合タ体（
実施例３で得たもの）を含有する７種類の特定結合反応
混合物を調製した。

この７種の反応混合物のうち６種、即ち第８表の２〜７
、には該表に示した濃度のＮ−（２・４−ジニトロフェ
ニル）−６ーアミノカプロエートを加えた。また、０そ
の６種の反応混合物の各々には、発生するピーク光強度
を、Ｎ−（２・４−ジニトロフェニル）一６ーアミノカ
プロエートと２・４−ジニトロフェニルの抗体が存在し
ない場合に発生するピーク光強度の３９％に低減させる
に充分な量の２・４ータジニトロフヱニルの抗体を添加
した。反応混合物を室温で約３時間保存した。

次いで、各反応混合物に０．０２５国際単位のアルコー
ル脱水素酵素を加えて還元反応を開始させた。そして反
応混合物を約３０分間室温で保存した。各反応０混合物
１０山そ容積を、２が０に２〜３分予め保存した１００
ｒその光発生溶液（実施例９の方法により調製したもの
）を含んだ実施例９に記載した分光器に設置した別々の
キュベットに注入した。全裸作を２度繰り返し、平均の
結果を第８表及びグラフの形で添付図面の第５図に示す
。第８表 以上の如く本実施例に於いては、生物発光反応系により
発生するピーク光強度の大きさ、即ちＮＡＤと２・４ー
ジニトロフェニル結合体中のＮＡＤの活性は、特定結合
反応混合物中に存在するＮ一（２・４−ジニトロフエニ
ル）一６−アミノカプロェートの量の直嬢の関数である
ことが示されている。

従って本発明によれば、液体中の対象物質であるＮ−（
２・４−ジニトロフェニル）−６ーアミノカプロェート
の存在を定量的に測定するための、競合結合一生物発光
分析技術を利用する試験用の試薬と方法が提供される。
実施例 １２ ２・４−ジニトロフェニルとＡＴＰの結合体（６一位置
誘導体）の製造Ｎ６一〔２一（２・４ージニトロフエニ
ル）アミノヱチル〕ーァデノシンー５′一三燐酸Ａ Ｎ
６−（２ーアミノエチル）ーアデノシンー５′−燐酸２
夕（７ミリモル）の６ークロルプリン・リボサイド（米
国、ミズリー州、セ，ントルイス、シグマ・ケミカル・
カンパニーより入手）を１７の‘のトリェチル燐酸と共
に損拝し、ケミカ，スクリプタ、１９：１６５〜７０（
１９７２）に記載されている如く水の存在下で塩化ホス
ホリルと反応させた。

ホスホジクロリデートを加水分解した後、９．５の‘（
１４０ミリモル）のエチレンジアミンを加え、室温で３
時間反応させた。反応混合物を水で希釈して４リットル
とし、水酸化ナトリウムでＰＨを１２とした。この溶液
を酢酸型のダゥェツクス１×８（米国、カリホルニア州
、リツチモンド、ビオ・ラド・ラボラトリーズより入手
）の５×３０伽のカラムに通した。このカラムを３リッ
トルの０．０１Ｍ塩化アンモニウムで洗浄し、クロマト
グラムを３リットルの水と３リットルのＩＭ酢酸により
直線傾斜の方法により展開した。１８００の上と２０５
０の‘の鏡斜の間の紫外線を吸収する物質の主部分を真
空中で濃縮し２５私とした。

この溶液を７℃に一夜放置すると、白色結晶が生成し、
これを集め、乾燥すると生成物が６５％の収率で得られ
た。この一部をとり熱水で再結晶し分析に供した。計算
値（Ｃ，２日，ぶぬ７Ｐ・ＺＬＯとして）：Ｃ、３３．
８：日、５．４５：Ｎ、１９．７、分析値：Ｃ、３４．
３：日、５．２２；Ｎ、１９．７、二種類の溶媒系、即
ち第一のものは０．瓜酢酸アンモニウム４部とエタノー
ル１部を含み、第二はィソ酪酸３部とＩＭ水酸化アンモ
ニウム５部を含むもの、を用いて薄層クロマトグラフィ
ーを別々に行なうと、蟹光を発せず、ニンヒドリンと反
応する一成分が見られた。

この化合物は０．１Ｎの塩酸中で、２６４ｎのに吸収極
大を有し、ミリモル吸光係数は１７．７であった。この
スペクトルの極性はＮ６ーアルキル化アデノシン誘導体
に特徴的なものである。Ｂ Ｎ６一〔２−（２・４−ジ
ニトロフエニル）アミノエチル〕−アデノシンー５′ー
ー燐酸本実施例のＡで得られたＮ６−（２ーアミノェチ
ル）ーアデノシン−５′ーー燐酸２５０双９（０．６５
ミリモル）をｐＨ８の水２０のごに溶かした。次いで１
６８の９の重炭酸ナトリウムを加え、更に０．２の【の
１ーフロロー２・４−ジニトロベンゼン（１．５８ミリ
モルを２のＺのエタノールに溶解）を加えた。反応混合
物を室温階中で４時間蝿拝し、次いで１泌のエタノール
に溶解した０．１の【の１ーフロロ−２・４−ジニトロ
ベンゼンを更に加えた。反応混合物を一夜燭拝した後、
塩酸でそのｐＨを２．０に調整し、次いで２００の‘の
ェタ／ール中に加えた。生成した沈殿を２００私の水に
溶解させ、この溶液を水酸化ナトリウムでＰＨ８．０に
調整し、次いで重炭酸型のＤＥＡＥ−セルロ−ス（米国
、ニュージャージー州、クリフトンのリーフ・エンジェ
ルより入手）の２．５×３０肌のカラムでクロマトグラ
フィーを行なった。このクロマトグラムを１．５リット
ルの水と１．５リットルの０．７Ｍの重炭酸アンモニウ
ムにより直線傾斜の方法により展開した。紫外線を吸収
する黄色物質の宇部分は１２００から１５００の‘の間
の煩斜部分で溶出した。繰り返し蒸発させることにより
重炭酸ナトリウムを除去し、乾固させると目的生成物が
４０％の収率で得られた。この生成物は、本実施例のＡ
に記したと同じ二種類の溶媒で展開した薄層クロマトグ
ラム上、及び斑５．０の０．２９Ｍ酢酸ナトリウム−酢
酸緩衝液で展開したェピクロルヒドリントリェタノール
アミン陰イオン交換紙上で一個の黄色の点として移動し
た。この生成物は０．０州塩酸中で、２６４ｎのと３６
ふれに吸収極大を有し、ミリモル吸光係数はそれぞれ２
１．８と１４．２であった。Ｃ ２・４ージニトロフェ
ニルーＡＴＰ結合体０．３ミリモルのＮ６一〔２一（２
・４−ジニトロフエニル）アミノエチル〕ーアデノシン
−５−一燐酸（本実施例のＢで得たもの）を、ピリジニ
ウム型のダウェツクス５０×２（米国、カリホルニア州
、リッチモンドのビオ・ラド・ラボラトリーズより入手
）の１．５×２０弧のカラムを用いてクロマトグラフィ
ーにかけることによりピリジニウム塩に変えた。黄色の
流出液を濃綾乾固させ、１５のとのジメチルホルムアミ
ドと０．３ミリモルのトリ−ｎ−ブチルアミンを加えた
。この混合物を蒸発乾固させ、残査を更に繰り返し蒸発
させることにより乾燥させた。この一燐酸中間体を次い
で、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイ
テイ、８７：１７８５〜８（１９６５）に記載されてい
る方法を用いて、三燐酸型に変えた。反応生成物（ジメ
チルホルムアミＷこ可溶）を２５０の【の水に加え、次
いでＰＨ８．０に調整した。この溶液を重炭酸型のＤＥ
ＡＥーセルロースの２．５×５８伽のカラムに通し、ク
ロマトグラムを３リットルの水と３リットルの０．８Ｍ
炭酸アンモニウムで直線傾斜の方法により展開した。第
一の溶離ピークの黄色物質は二燐酸誘導体と同定された
。第二のピ−クの黄色物質（４．１５と４．４リットル
の間の傾斜で溶出したもの）を蒸発乾固させると、目的
の結合体が２０％の収率で得られた。分析により、リボ
ース残基当り３．０個の燐酸残基を含むことがわかった
。実施例 １３ ２・４ージニトロフェニルとＡＴＰの結合体（８−位置
譲導体）の製造８一〔２一（２・４−ジニトロフエニル
）アミ／エチル〕アミノアデノシン−５′−三燐酸Ａ
８−（２ーアミノエチル）アミノアデノシン−５′−一
燐酸２．２ミリモルの８−プロムアデノシンー５−一燐
酸（アルカイブス・ピオケミストリー・エンド・ビオフ
イジクス、１６３：５６１〜９（１９７４）に記載され
た方法により製造）、６６ミリモルのエチレンジアミン
及び２５叫の水から成る反応混合物を１４０ｑｏの油裕
中で２時間加熱した。

混合物を冷却し、水酸化ナトリウムでｐＨｉｌ．５に調
整した後、ダウェツクス１×８（２００〜４００メッシ
ュ、重炭酸型）の２．５×５５凧のカラムに通した。こ
のカラムを３００肌【の水で洗浄し、３リットルの水と
３リットルの０．９Ｍ重炭酸アンモニウムにより直線傾
斜の方法により展開した。流出液の２５４ｎｗに於ける
吸収を監視して、４．６と５．８リットルの間の傾斜で
の主ピークの吸収物質を溶出した。重炭酸アンモニウム
を繰り返し真空中で蒸発（５回、各回２０〜３０の‘の
水を使用）させることにより除去し乾固させた。

最終残査を２０の‘の水に、水酸化アンモニウムを加え
てＰＨ８．０にして、溶解させた。この溶液を炉過し、
ギ酸でｐＨ５．０に調整し、次いで５℃で１日放置した
。生成した結晶を集め、ｐＨ８．０で溶解させ、Ｖ ５
．０で再結晶させた。目的の中間体の収率は２７％であ
った。４部の０．８Ｍ酢酸アンモニウムと１部のエタノ
ールから成る溶媒を用いて薄層クロマトグラフィーによ
り調べると、生成物は蟹光を発しない一個のニンヒドリ
ンの明瞭な点として移動した。

０．０が塩酸中の光学吸収極大は２７則机でミリモル吸
光係数は１７．５であった。

このスペクトルの特性はアルキル化された８ーアミノア
デノシン譲導体に特徴的なものである。計算値（Ｃ，２
日のＮ７０７Ｐ・日２０として）：Ｃ、３４．０；日、
５．３３；Ｎ、２３．２．分析値：Ｃ、３４．１：日、
５．２８：Ｎ、２３．９．Ｂ ８一〔２−（２・４ージ
ニトロフエニル）アミノェチル〕アミノアデノシンー５
′ーー燐酸０．６４ミリモルの８−（２ーアミノエチル
）アミノアデノシンー５′ーー燐酸（本実施例のＡで得
たもの）を２０の‘の水に、水酸化ナトリウムを加えて
ｐＨ８．０として、溶解した。これに１６８の２の重炭
酸ナトリウムを加え、次いで０．２舷の１−フロロー４
ージニトロベンゼン（２の‘のエタノールに１．球ミリ
モルを溶かしたもの）を加えた。反応混合物を室温で１
劉時間燈拝し、次に１奴のエタノールに溶かした０．１
の‘の１ーフロロ−２・４−ジニトロベンゼンを加えた
。更に４時間雛拝した後、混合物を塩酸により鮒２．０
に調整し、２００のこの冷アセトン（一１ｏｏｏ）に加
えた。生成した黄色の沈殿を炉過して集め、２００の‘
の水に溶解させ、次いで重炭酸型のＤＥＡＥ−セルロー
スの２．５×４５肌カラムに通した。このクロマトグラ
ムを２リットルの水と２リットルの０．７Ｍ塩化アンモ
ニウムで直線傾斜の方法により展開した。２７軌肌で吸
収極大を有する黄色物質のピーク（主部分）が、２と３
リットルの間の傾斜で溶出した。

重炭酸アンモニウムを、この物質を真空中で蒸発させる
ことにより除去した。目的の中間体の収率は３７％であ
った。０．０州塩酸中で測定した光学吸収極大は２７取
れと３６軌のに現われ、吸光係数はそれぞれ２１．８と
１５．５であった。

更に分析した結果、リボース残基当り１．０７の燐酸残
基があることがわかつた。Ｃ ２・４ージニトロフヱニ
ル−ＡＴＰ結合体０．５ミリモルの一燐酸中間体を、０
．８ミリモルのトリ−ｎーブチルアミンを加えることに
より、トリーｎーブチルアンモニウム塩に変えた。

混合物を乾燥ジメチルホルムアミドを用いて繰り返し蒸
発させる（４回、各回１０〜１５の【）ことにより乾燥
させた。最終残査を１の‘のジメチルホルムアミ日こ溶
かし、同じく１の‘のジメチルホルムアミドに溶かした
２．０ミリモルのカルボニルジィミダゾールと混合した
。次いで室温で４時間反応させた。過剰のカルボニルジ
ィミダゾールを、１５仏〆のメタノールと３０分間反応
させることにより分解した。最後に、４叫のジメチルホ
ルムアミドに溶かした３ミリモルのトリーｎーブチルア
ンモニウムピロ燐酸塩を加えて、２脚時間反応させた。
生成した固体残査を遠心分離により分離し、５の‘のジ
メチルホルムアミドで２度洗浄した。上澄みを集めて２
００の‘の水に加え、次いで餌８に調整し、重炭酸型の
ＤＥＡＥ−セルロースの２．５×２＆均のカラムを用し
、てクロマトグラフイーを行なった。このクロマトグラ
ムを２リットルの水と２リットルの重炭酸アンモニウム
で直線額斜の方法により展開した。２７則のと３６丸仇
で吸収極大を有する黄色物質のピーク（主都分）が、２
．０と２．９リットルの間の傾斜で溶出した。

重炭酸アンモニウムを蒸発により除去すると、２２％の
収率で目的の結合体が得られた。分析結果によるとこの
生成物は、リボース残基当り３．２の燐酸残基を含んで
いた。実施例 １４ ２・４−ジニトロフェニルとＡＴＰの結合体（燐酸末端
譲導体）の製造ＰＩ｛２−〔Ｎ一（２・４ージニトロフ
エニル）アミノ〕エチル｝ユー（５ーアデノシン）四燐
酸Ａ ２一〔Ｎ一（２・４ージニトロフエニル）アミノ
〕エチルホスフエ−ト２０ミリモルのエタノールアミン
ホスフエート、０．４モルの重炭酸ナトリウム、０．２
夕のペンジルトリェチルアンモニウムクロリド及び２０
の‘の水から成る溶液を、２０ミリモルの１ーフロロー
２・４ージニトロベンゼンを滴下しながら燈拝した。

得られた二相の混合物を室温で３日間濃伴した。次いで
６００泌のエタノールを加え、０℃で一夜放置すると黄
色固体が放置した。この固体を５０の‘の水に溶かし、
溶液を洲塩酸で母１．５に調整した。生成した沈殿を炉
過により集め、０℃で２００泌の無水エタノールと一緒
にすりつぶした。固体残査を室温真空中で乾燥させると
４夕の黄色生成物が得られた（理論量の６５％）。この
物質は２００〜２０２０で融解し、７部のエタノールと
３部のトリェチルアンモニゥム・重炭酸塩（ｐＨ７．５
）から成る溶媒で薄層クロマトグラフィーにより展開す
ると１個の黄色の点として移動した。光学吸収スペクト
ルを０．０州塩酸中で測定すると、３５軌の及び２６４
ｎのに吸収極大を有しミリモル吸光係数はそれぞれ１７
．０と９．２であった。中和当量は３２５で、これは一
燐酸体として計算した値である。計算値（Ｃ８日，ｏＮ
３０８Ｐ・日２０として）：Ｃ、２９．５５；日、３．
７２：Ｎ、１２．９２．分析値：Ｃ、２９．３８；日、
２．９４：Ｎ、１２．８１Ｂ ２・４−ジニトロフェニ
ルーＡＴＰ結合体本実施例のＡで製造した中間体を、ユ
ーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー、
２８：４９２〜６（１９７２）に記載されている方法に
よりジフェニルホスホロクロリデートと反応させて活性
ピロ燐酸体を作り、これをＡＴＰと反応させた。

１夕（３．２５ミリモル）の２一〔Ｎ一（２・４−ジニ
トロフエノール）アミノ〕エチルホスフェートを、ピリ
ジニウム型のダウェツクス５０×２の２．５×２５伽の
カラムを用いたクロマトグラフィーによりピリジニウム
塩に変えた。

黄色の流出液を濃縮乾固させ、残査を５０の‘のメタノ
ールに懸濁させ、これに１．４のＺ（３．２５ミリモル
）のトリーｎーオクチルアミンを加えた。固体が溶解す
るまで混合物を蝿拝し、次いで真空中でメタノールを除
去した。残査をピリジン（２０〜２５の‘）に入れ、蒸
発乾固させた。これを２度繰り返した。次に、残査を３
０の‘の乾燥ジメチルホルムアミドーこ溶解させ、蒸発
乾固させた。これを３度繰り返した。乾燥した残査を３
０の，‘のジメチルホルムアミドに溶解させ、次いで０
．９７の【（４．９ミリモル）のジフエニルホスホロク
ロリデートを加え、更に１．６の‘（３．２５ミリモル
）のトリーｎーブチルアミンを加えた。反応混合物を室
温で２時間燈拝し、黍発乾固させた。務査を７０の‘の
乾燥ジェチルェ−テルと共に２分間猿とうし、次に１５
０の‘の石油エーテルを加えた。１時間後に黄色の上澄
みを傾斜により取り、残った黄色油状物を３０叫の乾燥
ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸発乾園した。

残った油状物を１００の【のピリジンージメチルホルム
アミド（１：１、容量比）に溶解させ、この溶液の半分
をＡＴＰのトリーｎ−オクチルァンモニゥム塩と反応さ
せた。０．７ミリモルのＡＴＰを、ピリジニウム型のダ
ウエツクス５０×２の２．５×２５肌のカラムを用いて
クロマトグラフィーによりピリジニウム塩に変えた。

この塩の水溶液を蒸発乾固させ、１５の‘のメタノール
と１．４の‘（１．４ミリモル）のトリ−ｎーオクチル
アミンを加えた。ＡＴＰが溶解するまで混合物を鷹辞し
、溶媒を真空中で除去した。残査をピリジン、次いでジ
メチルホルムアミドを用いて繰り返し蒸発させることに
より乾燥させた。最後に、油状の残査を活性の２一〔Ｎ
一（２・４ージニトロフエニル）アミノ〕エチルホスフ
ェートと一緒にして、反応混合物を室温で一夜燭拝した
。次いで溶媒を真空中で蒸発させて除去し、残査を、水
酸化ナトリウムを加えることによりｐＨを６．５から７
．５に保ちながら、１時間１００泌の水と共に縄拝した
。可溶性の物質を重炭酸型のセフアデツクスＡ−５０（
ＤＥＡＥ）（米国、ニュージヤ−ジー州、ビスカタウエ
イのフアーマシア・フアイン・ケミカルスより入手）の
３×４５弧のカラムにかけた。クロマトグラムを各々２
リットルの０．１Ｍ及び０．０Ｍの炭酸アンモニウムで
直線傾斜の方法により展開した。０．１８と０．２８Ｍ
の間の炭酸アンモニウムで溶出する物質を真空中で蒸発
させることにより濃縮し、水を用いて繰り返し蒸発させ
ることにより炭酸アンモニウムを除去した。

シリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより、７部のエ
タノール及び３部のＩＭトリエチルアンモニウム炭酸塩
（ｐＨ７．５）から成る溶媒を用いて更に精製を行なっ
た。２個の黄色の主バンドが分離するので、各々をプレ
ートから削り取った。

このシリカゲルをメタノールと水の溶液（１：１、体積
比）中で１時間縄拝し、そして各バンドからの可溶物質
を別々に重炭酸型のＤＥＡＥ−セルロースの２．５×２
０伽のカラムに通した。各カラムを水及び０．８Ｍ炭酸
アンモニウムで洗浄した。この塩で溶出する黄色物質を
真空中で濃縮乾固させた。シリカゲル上で速やかに移動
する化合物は未反応２一〔Ｎ−（２・４日ジニトロフエ
ニル）アミノ〕エチルホスフヱートであった。シリカゲ
ルプレートの第２のバンド（Ｒｆ＝０．６４）は２５７
ｎ仇と２５卵肌の光学吸収極大を有しており、ミリモル
吸光係数はそれぞれ２１．１と１６．２であった。

この生成物（目的の結合体）は、リボース残基当り４．
３の燐酸残基を含むことがわかつた。実施例 １５ ２・４−ジニトロフェニルの抗体の直接結合−蟹光分析
；標識物質としてのＡＴＰの利用本実施例で用いられた
生物発光反応系は次の反応に基づいている。

値酵素） ＡＴＰ−リカンド−−一ＡＴＰ＋部分変形リガンドルシ
フエラーゼＡＴＰサ還元型ルシフェリン Ｎ
ＭＰ＋酸イＱ型ルシフエリン＋ｈレＰＨ７．４のｌｏｗ
Ｍのモルホリノプロパン・スルホネート緩衝液、１０ｍ
Ｍの硫酸マグネシウム、０．７のＭのルシフェリン及び
０．１５％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミンを含有する光
発生溶液を調製した。

各々全量が１０ｒそで、各々ｐＨ７．４の２０のＭのト
リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝
液、１０肌Ｍのエチレンジアミン四酢酸、４５のＭの２
・４ージニトロフェニルーＡＴＰ結合体（燐酸末端譲導
体、実施例１４により製造）及び第９表に示した量の２
・４−ジニトロフェニルの抗血清を含有する９種類の特
定結合反応混合物を調製した。２５ｑ０で１．虫時間保
持した後、各反応混合物の１０仏その分別量を２つ取り
、これを前以つて２５ｑｏで少なくとも２分間保持した
上記の光発生溶液で、デュポン７６０型生物発光分光々
度計（米国、デラウエア州、ウイルミントンのイー・ア
イ・デュポン・ド・ヌモール）に設置された試験管に入
れられている０．１の‘体積の溶液に注入した。

ピーク光強度を分光々度計から読み取った。各反応混合
物について、ピーク光強度の平均及び相対強度（抗血清
が存在しない場合に対する試料の平均ピーク光強度の比
を１００％倍したもの）を算出した。結果を第９表及び
グラフの形で添付図面の第６図に示す。第９表 本実施例に於いて、２・４ージニトロフェニル−ＡＴＰ
結合体中のＡＴＰの生物発光反応系に関する活性は反応
混合物中に存在する２・４−ジニトロフェニルの抗血清
の量の逆の関数であることが示されている。

従って本発明によれば、液体中の対象物質である２・４
−ジニトロフェニルの抗体を測定するための、直接結合
一生物発光分析技術を利用する試験用の試薬及び方法が
提供される。実施例 １６２．４−ジニトロフェニルの
誘導体の競合結合−生物発光分析；標識物質としてのＡ
ＴＰの利用本実施例に於いて用いられる生物発光反応系
は実施例１５に記したものと同じである。

各々全量がｌｏｏムそで、各々ｐＨ７．４の２０のＭの
トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液、１０のＭのエチレンジアミン四酢酸、４５肌Ｍの
２・４ージニトロフェニル−ＡＴＰ結合体（燐酸末端誘
導体、実施例１４により製造）及び第１頃表‘こ示した
濃度の２・４−ジニトロフェニルー８ーアラニンを含有
する１３陣類の特定結合反応混合物を調製した。

このｌａ瞳の反応混合物の内の１２種、即ち第１項長の
２〜１３には、他の反応混合物（第１項長の１）に於け
る生物発光反応により得られるピーク光強度を７５％阻
害するのに充分な量の２・４ージニトロフヱニルの抗血
清を加えた。２５ｑ０で２時間保持した後、各反応混合
物の１０仏その分別量を２つ取り、実施例１５と同機に
分析し、ピーク光強度の平均と相対強度を各々について
算出した。

結果を第１項表及びグラフの形で添付図面第７図に示す
。第１０表本実施例に於いて、得られる相対強度は反応
混合物中に存在する２・４−ジニトロフエニル−３−ア
ラニンの量の直接の関数であることが示されている。

従って本発明によれば、液体中の２・４ージニトロフェ
ニルの誘導体のような対象物質を測定するための、競合
結合一生物発光分析技術を利用する試験用の試薬及び方
法が提供される。実施例 １７２・４−ジニトロフェニ
ルの誘導体の競合結合一生物発光分析；標識物質として
のＡＴＰの利用本実施例に於いて用いられた生物発光反
応系は次の反応に基づいている。

ルンフエラーゼ ＡＴＰ−リガント斗還元型ルンフェリン ＡＭＴ‐リガンド＋酸化型ルシフェリン＋ｈレＡ ＡＴ
Ｐの６一位置誘導体を利用した分析各々全量が１００払
そで、各々ｐＨ７．４の２０仇Ｍのトリスー（ヒドロキ
シメチル）ーアミノメタン塩酸塩緩衝液、１０ｍＭのエ
チレンジアミン四酢酸、２０ｒその２・４−ジニトロフ
ヱニルの抗血清、５１かＭの２・４ージニトロフェニル
−ＡＴＰ結合体（６−位置誘導体、実施例１２により製
造）及び第１１表に示した濃度の２・４ージニトロフェ
ニルー８ーアラニンを含有する３種類の特定結合反応混
合物を調製した。

２５００で２時間保持した後、反応混合物の１０山その
分別量を２つ取り、実施例１５と同様に分析し、ピーク
光強度の平均を各々について算出した。

結果を第１１表に示す。第１１表 Ｂ ＡＴＰの８一位置誘導体を利用した分析各々全量が
１００ムそで、各々ｐＨ７．４の２０ｍＭのトリスー（
ヒドロキシメチル）ーアミ／メタン塩酸塩緩衝液、ｌｏ
ｗＭのエチレンジァミン四酢酸、２０ムクの２・４ージ
ニトロフェニルの抗血清、５９４ｎＭの２・４−ジニト
ロフェニル−ＡＴＰ結合体（８一位置誘導体、実施例１
３により製造）及び第１２表‘こ示した濃度の２・４ー
ジニトロフェニル−８−アラニンを含有する４種類の特
定結合反応混合物を調製した。

２ｙｏで２時間保持した後、各反応混合物の１０＃その
分別量を２つ取り、実施例１５と同様に分析し、ピーク
光強度の平均を各々について算出した。

結果を第１２表１こ示す。第１２表 本実施例の結果と実施例１６の結果によれば、標識物質
であるＡＴＰは、本発明の特定結合分析方法に使用する
有用な結合体を作るためには、その構造上種々の位置の
誘導体とされて良いことが示されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、直接結合−循環分析技術に於ける全反応速度
に対する対象物質（リガンド）の量を変動させた場合の
影響をグラフによって示すものである。 第２及び３図は各々、競合結合−循環分析技術に於ける
全反応速度に対する異なった二種の対象物質の量を変動
させた場合の影響をグラフによって示すものである。第
４及び５図は各々、競合結合一生物発光分析技術に於い
て得られるピーク光強度に対する異なった二種の対象物
質の量を変動させた場合の影響をグラフによって示すも
のである。第６及び７図は各々、直酸及び競合結合−生
物発光分析技術に於いて得られる発光の相対強度に対す
る異なった二種の対象物質の量を変動した場合の影響を
グラフによって示すものである。第１図 第２図 第３図 第ム図 第５図 第６図 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体中のハプテン又は抗原を分析するための：（ａ
   ） 液体を、 （１） 予め定められた特性を有する標識物質とハプテ
   ン又は抗原との結合体、及び（２） 標識化された結合
   体の抗体−束縛相及び抗体−遊離相を生成する、ハプテ
   ン又は抗原に対する抗体からなる試薬と接触させる工程
   ；及び （ｂ） 束縛相と遊離相を分離することなく、液体中の
   ハプテン又は抗原の指標としての特性を測定する工程か
   らなる均一系免疫分析方法であつて、 結合体中の標識物質が、酵素触媒反応におけるヌクレ
   オチド補酵素であることを特徴とする分析方法。 ２ 該ヌクレオチド補酵素が、アデノシン燐酸、ニコチ
   ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド若しくはその還元
   型、又はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド燐
   酸若しくはその還元型である特許請求の範囲第１項記載
   の分析方法。 ３ 該ヌクレオチド補酵素がアデノシン三燐酸である特
   許請求の範囲第１項記載の分析方法。 ４ 該ヌクレオチド補酵素がフラビン・アデニン・ジヌ
   クレオチドである特許請求の範囲第１項記載の分析方法
   。 ５ 液体中のハプテン又は抗原を均一系免疫分析方法に
   より分析するための：（１） 予め定められた特性を有
   する標識物質とハプテン又は抗原との結合体、及び（２
   ） ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であつて、 試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合体の抗体
   −束縛相及び抗体−遊離相を生成する結合反応系を形成
   し、かつ、束縛相又は遊離相のどちらかにおける特性が
   液体中のハプテン又は抗原の量の関数であつて、 結合
   体中の標識物質が、酵素触媒反応におけるヌクレオチド
   補酵素であることを特徴とする試薬。 ６ 担体マトリツクス中に包含されてなる特許請求の範
   囲第５項記載の試薬。 ７ 該ヌクレオチド補酵素が、アデノシン燐酸、ニコチ
   ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド若しくはその還元
   型、又はニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド燐
   酸若しくはその還元型である特許請求の範囲第５項記載
   の試薬。 ８ 該ヌクレオチド補酵素がアデノシン三燐酸である特
   許請求の範囲第５項記載の試薬。 ９ 該ヌクレオチド補酵素がフラビン・アデニン・ジヌ
   クレオチドである特許請求の範囲第５項記載の試薬。