SE447510B - Forfarande och reagens for bestemning av en ligand i ett vetskemedium - Google Patents

Description

447 510 2 al Technical Information Service (NTIS) of the United States Department of Commerce (1973) beskrives ett icke framgångsrikt försök att använda heminklorid såsom märkningssubstans i ett heterogent testsystem, där en kemiluminisæns -reaktion användes för indikering. I Nature 2l9:l86 (1968) beskrives i stor detalj vissa_testförfaranden med användning av radioaktiva ämnen, och i förbigáende nämnes också mycket allmänt, att det är möjligt att använda koenzym och virus såsom märkningssubstanser 1 stället för radioisotoper. I artikeln anges emellertid icke hur man skall genomföra ett testförfarande med användning av sådana alternativa märkningssubstanser, och det har alltså icke visats, att ett sådant testförfarande skulle vara genomförbart. Man kan också hänvisa till verket Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), i vilket de olika kända testmetoderna diskuteras med angivande av olika material, som har använtsfsàsom märkningssubstanser. ' I den amerikanska patentskriften 3.817.857 beskrives ett test- förfarande utnyttjande ett enzymmärkt konjugat. Detta förfarande är av homogen typ, eftersom det icke kräver användning av ett uppdelat reak- tionssystem (dvs. en olöslig del och en flytande del) och separation av detta system. Den enzymmärkta liganden har nämligen sådana egenska- per, att den enzymatiska aktiviteten hämmas efter reaktion med ligandens bindningspartner. Förhållandet mellan det märkta materialet i bunden form och det märkta materialet i fri form kan sålunda bestämmas genom mätning av förändringen av den enzymatiska aktiviteten. Nackdelarna med denna metod är svårigheter att framställa väl karakteriserade enzym- märkta konjugat och svårigheten att finna lämpliga enzym. Även om många nya typer av testförfaranden utnyttjande specifika bindningar har föreslagits och undersökts, så har förfaranden utnyttjande radioaktiva ämnen och olika enzym- märkta konjugat hittills varit de mest använda. Båda dessa typer av förfaranden har emellertid uppenbara nackdelar, efter-D som man vid det förstnämnda förfarandet mest använder radio- aktiva ämnen, vilka är farliga och svåra att hantera, och eftersom det är svårt att framställa enzymmärkta konjugat användbara vid det sistnämnda förfarandet.

Föreliggande uppfinning avser ett mångsidigt och käns- ligt, förbättrat testförfarande utnyttjande en specifik bind- ningsreaktion för bestämning av en ligand i ett vätskemedium, 447 510 vilket förfarande innefattar följande steg: (a) vätskemediet bringas i kontakt med ett reagens inne- fattande ett konjugat av en märkningssubstans och en specifik bindningssubstans, varvid reagenset och liganden bildar ett bindningsreaktionssystem innefattande (i) en bunden form av det märkta konjugatet, vari den spe- cifika bindningssubstansen är bunden till en specifik bind- ningspartner därtill, och (ii) en fri form av det märkta konjugatet, vari den speci- fika bindningssubstansen icke är bunden till en specifik bind- ningspartner därtill; (b) märkningssubstansen bestämmes i antingen den bundna formen eller den fria formen såsom ett mått på mängden ligand i vätskemediet. Förfarandet kännetecknas av att märkningssubstan- sen är ett enzymsubstrat och att förfarandet är homogent, dvs man genomför icke någon fysikalisk separation av den bundna formen och den fria formen av det substrat-märkta konjugatet utan substrat-aktiviteten i hela den flytande reaktíonsbland- ningen mätes och sättes i relation till mängden ligand i det provade vätskemediet.

Uppfinningen avser även ett reagens för användning vid bestämning av en ligand i ett vätskemedium, vilket reagens innefattar ett konjugat av en märkningssubstans och en specifik bindningssubstans, och vilket reagens tillsammans med liganden bildar ett bindningsreaktionssystem innefattande en bunden form av det märkta konjugatet, vari den specifika bindningssubstan- sen är bunden till en specifik bindningspartner därtill, och en fri form av det märkta konjugatet, vari den specifika bind- ningssubstansen icke är bunden till en specifik bindningspart- ner därtill, varvid mängden märkningssubstans i antingen den bundna formen eller den fria formen är en funktion av mängden ligand i vätskemediet, och detta reagens kännetecknas av att märkningssubstansen är ett enzymsubstrat, och att det substrat- -märkta konjugatet uppvisar mätbart olika substrat-aktiviteter i den bundna formen och i den fria formen, vilket möjliggör homogen analys.

Nedan definieras några av de i föreliggande beskriv- 447 510 ning använda termerna. Med ligand avses det ämne eller den grupp av ämnen, vars närvaro eller mängd i ett vätskemedium skall bestämmas. Med specifik bíndningspartner för liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som har en specifik bindningsaffinitet till liganden med uteslutande av andra ämnen. Med specifik bindningsanalog till liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som uppför sig på i huvudsak samma sätt som liganden med avseende pà bindnings- affiniteten till ligandens specifika bindningspartner.

Den nya homogena testtekniken enligt uppfinningen är delvis baserad på det faktum, att reaktionen mellan en ligand och en specifik bindningspartner därför, till en av vilka enzymsubstratet är kopplat, förändrar aktiviteten av enzym- substratet i den förutbestämda reaktionen, vilken reaktion sålunda tjänar såsom medel för indikering av den specifika bindningsreaktionen. Pà grund av detta basfenomen kan olika bindningsmetoder omfattande olika testkompositioner och anord- ningar användas vid genomförande av förfarandet enligt upp- finningen. De föredragna grundmetoderna är tekniken med direkt bindning och tekniken med konkurrerande bindning. ' Vid tekniken med direkt bindning bringas ett vätske- medium, som misstänkes innehålla den ligand som skall påvisas, i kontakt med ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till en specifik bindningspartner för liganden, och därefter mätes eventuell förändring i enzymsubstratets aktivitet. Vid tekniken med konkurrerande bindning bringas vätskemediet i kontakt med en specifik bindningspartner för liganden och med ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till liganden och/eller till en specifik bindningsanalog därtill, och där- efter mätes eventuell förändring i enzymsubstratets aktivitet.

Vid båda metoderna bestämmas enzymsubstratets aktivitet genom att vätskemediet bringas i kontakt med åtminstone ett reagens, som med enzymsubstratet ger den förutbestämda indikerings- reaktionen. Kvalitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man jämför en egenskap, vanligen hastigheten, hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i ett vätskemedium fritt från ligand, varvid eventuell skillnad utgör en indikation på en förändring 447 510 i enzymsubstratets aktivitet. Kvantitativ bestämning av ligan- den i vätskemediet kan ske genom att man jämför en egenskap hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indi- keringsreaktionen i vätskemedia innehållande kända mängder av liganden.

Vid den homogena metoden enligt uppfinningen kan kompo- nenterna i den specifika bindningsreaktionen, dvs det vätske- medium som misstänkes innehålla liganden, konjugatet och/eller en specifik bindningspartner för liganden, vanligen kombineras i vilka som helst mängder, på vilket som helst sätt och i vilken som helst ordningsföljd, förutsatt att aktiviteten av enzymsubstratet i konjugatet förändras mätbart, när vätske- mediet inneháller liganden i en mängd eller koncentration, som det är av betydelse att bestämma. Alla komponenterna i den specifika bindningsreaktionen är företrädesvis lösliga i väts- kemediet.

När man använder en homogen teknik med direkt bindning, utgöres komponenterna i. den specifika bindningsreaktionen av det vätskemedium, som misstänks innehålla liganden, och en viss mängd av ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till en specifik bindningspartner för liganden. Vid kontakt med vätskemediet kommer aktiviteten av det konjugerade enzym- substratet att variera omvänt med graden av bindning mellan liganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern i konjugatet. Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av det konjugerade enzymsubstratet att minska.

När man använder en homogen teknik med konkurrerande bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det väts- kemedium, som misstänkes innehålla liganden, en viss mängd av ett kon- JUEšat innefattande eflïifffßubstratet KOPPIät till liganden eller till en spe- cifik bindningsanalog till liganden, och en viss mängd av en specifik bindningspartner för liganden. Den specifika bindningspartnern bringas ' i huvudsak samtidigt i kontakt med både konjugatet och vätskemediet.

Eftersom eventuell ligand i vätskemediet konkurrerar med liganden eller dennas specifika bindningsanalog i konjugatet när det gäller bind- ning till den specifika bindningspartnern, kommer aktiviteten av det _ konjmenakaenmmsubsugmet att efter kontakt med vätskemediet variera direkt 447 510 med graden av bindning mellan liganden 1 vätskemediet och den specifika bindningspartnern, Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av det konjugerade enzynsubstratet att öka.

En variation av den homogena tekniken med konkurrerande bind- ning är den homogena tekniken med förträngningsbindning, där konjugatet först bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern för liganden och därefter bringas i kontakt med vätskemediet. Härvid uppstår konkurr- ens om den specifika bindningspartnern. Vid en dylik metod är den mängd konjugat, som bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern, vanligen så stor, att liganden eller dennas analog i konjugatet före- ligger i överskott över den mängd, som kan bindas till mängden specifik bindningspartner under den tid, som konjugatet och den specifika bind- ningspartnern är i kontakt med varandra före kontakten med det vätske- medium, som misstänkes innehålla liganden. Denna kontaktordning kan uppnås på ettdera av två lämpliga sätt. Enligt den ena metoden brlngas konjugatet i kontakt med_den specifika bindningspartnern i en vätske- miljö före kontakten med'det vätskemedium, som misstänkes innehålla g liganden. Enligt den andra metoden bringas det vätskemedium, som miss- tänkes innehålla liganden, i kontakt med ett komplex innefattande konju gatet och den specifika bindningspartnern, varvid den specifika bind- ningssubstansen i konjugatet och den specifika bindningspartnern är reversibelt bundna till varandra. Den mängd konjugat, som blir bunden till den specifika bindningspartnern, vilken föreligger 1 komplexbund- en form enligt den andra metoden, är vanligen större än den mängd, som kan förträngas av all ligand i vätskemediet under den tid, som den specifika bindningspartnern, eller komplexet, och vätskemediet är 1 kontakt med vamufira före avslutandet av bestämningen av eventuell för- ändring i det konjugerade enzymsubstratets akçivitèt _ En annan variant av den homogena tekniken med konkurre- rande bindning är den homogena tekniken med stegvis mättning, där komponenterna i den specifika bindníngsreaktionen är desamma som användes vid tekniken med konkurrerande bindning, men där ordningen av komponenternas tillsättning eller kombination och de relativa mängderna därav är annor- 447 510 lunda. Enligt tekniken med stegvis mättning bringas den specifika bind- ningspartnern för líganden i kontakt med det vätskemedium, som miss- tänks innehålla liganden, under en viss tid före vätskemediets kontakt -med konjugatet. Den mängd specifik bindningspartner, som bringas i kon- takt med vätskemediet, är vanligen större än den mängd, som kan binda all den ligand, som antages vara närvarande i vätskemediet, under den tid som den specifika bindningspartnern och vätskemediet är i kontakt med_varandra, innan vätskemediet bringas 1 kontakt med konjugatet.

Mängden ligand eller analog därtill i konjugerad form är dessutom van- ligen större än den mängd, som kan bindas till den kvarvarande obundna mängden av den specifika bindningspartnern under den tid, som vätske- mediet och konjugatet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell förändring i det konjugerade enzymsubstratets ak- tivitet.

Bestämningen av eventuellsförändring i det konjugerade enzymsubstratets aktivitet, vilket enzymsubstrat utgör en beståndsdel vid den förutbestämda indíkeringsreaktionen, sker lämpligen genom att den specifika bindningsreaktionsblandningen bringas i kontakt med åtminstone ett ämne, som tillsammans med det konjugerade enzymsubstratet ger den förutbestämda indi- keringsreaktionen, och man bestämmer verkan av den specifika bindningsreaktionen på en egenskap hos en dylik indikerings- reaktion.

De reaktionsbeståndsdelar, vilka tillsammans med enzym- substratet i konjugatet ger den förutbestämda indikerings- reaktionen, kan enligt den homogena metoden bringas i kontakt med den specifika bindningsreaktionsblandningen. Nämnda reak- tionsbeståndsdelar kan tillsättas antingen var för sig eller i vilken som helst kombination och antingen före, samtidigt med eller efter initiering av den specifika bindningsreaktionen.

Efter initiering av den specifika bindningsreaktionen inkuberas 'vanligen reaktionsblandningen, som kan innehålla några av eller alla de nödvändiga komponenterna för indikeringsreaktionen, under en förutbestämd tidsperiod, innan man bestämmer eventuell förändring i aktiviteten av enzymsubstratet i konjugatet. Efter inkuberingsperioden sätter man till reaktionsblandningen even- tuella komponenter, vilka är nödvändiga för indikeringsreak- 447 510 tionen och vilka icke redan är närvarande i tillräckliga mängder i reaktionsblandningen, och indikeríngsreaktionen studeras för indikation av närvaro eller mängd av liganden i vätskemediet.

En föredragen, känslig índikeringsreaktion utnyttjar fluorescensfenomenet och är enzymkatalyserad. I ett dylikt reaktionssystem användes ett substrat i en enzymatisk reaktion, som ger en produkt med andra fluorescerande egenskaper än det konjugerade substratet. Eventuell förändring i aktiviteten av det konjugerade enzymsubstratet till följd av den specifika bindningsreaktionen förorsakar en förändring i reaktionsblandningens fluorescerande egenskaper. Ett allmänt reaktionsschema för en dylik enzym- katalyserad reaktion anges nedan: enzymsubstrat - X - Z ÅÉ2šXEL%>produkt där X betecknar en medelst enzym klyvbar bindning eller sammanbindande grupp, såsom en estergrupp eller en amidogrupp, och Z betecknar en spe- cifik bindningssubstans, som beroende på den använda specifika bindninrs- reaktionstekniken kan vara antingen liganden eller en specifik bindning-- analog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden.

Såsom exempel på specifika konjugat, vilka kan användas i denna typ av reaktionssystem, kan man nämna olika med enzym klyvbara derivat av fluorescein, umbelliferon, 3-indol , p-naftol, 3-Pyridol, resorufin och liknande. Nedan anges exempel på möjliga strukturformler för dylika derivat: Derivat Formel l .

\% C k / ,/'\\// \ IL Ü o v fluorescein .9 H2 //Q§,/ 0 0 umbelliferon | \ï, // // R3 2 l \ R j-indol I // I N,/ \/\ 2 p-naftol U\ | /' ,/ 2 3-pyridol ü;ï%ïï'R / N “ Oe \\«/0 //°§> RQ resorufín | ] \ än / där Rl betecknar -OH eller -X-Z enligt ovanstående definition, R2 beteck- nar -X-Z, och R? betecknar -H eller -Cflñ.

Ett reaktionssystem, som särskilt föredrages för indikering av den nya specifika bindningsreaktionen enligt uppfinningen, är ett cyk- lískt system (kretsloppssystem). I ett dylikt system är en produkt 1 en första reaktion en reaktant 1 en andra reaktion, och i den andra reaktionen är en av produkterna en substans, som också är en reaktant i den första'reaktionen.

Nedanstående diagram illustrerar ett dylikt cykliskt reaktions- system: produkter A kretsloppsgàende material. reaktanter B (form 1) REAKTION A REAKTION B reaktanter A kretsloppsgàende material produkter 6 (form 2) I ovanstående cykliska reaktionssystem alstrar en liten mängd kretsloppsgàende material stora fiängder av produkterna A och B, om till- räckliga mängder av reaktanterna A och B är närvarande. Eftersom reak- " 447 510 JO tionshastigheten och mängden produkt bildad av reaktionerna i det cyk- liska reaktionssystemet är mycket känsliga för mängden kretsloppsgåen- de material, föredrager man att använda det kretsloppsgående materialet såsom reaktant 1 konjugatet enligt föreliggande uppfinning. I nedan- stående tabeller B och C ges exempel pà cykliska reaktionssystem lämpa- de att använda i samverkan med det nya specifika bindningsreaktionssys- 'temet enligt föreliggande uppfinning.

Tabell B produkt A *\\//* NAD* “\\//f' reaktant B enzym enzym u reaktant Ä./ß\\- NADH" \% produkt B reaktant A reaktant B eller eller reaktion produkt B enzym produkt A 1 laktaldehyd alkohol-de- propandiol hydrogenas 2 a-ketoglutar- glutaminsyra- glutamat at + NH; dehydrogenas 3 oxaloacetat äppelsyra-dehy- malat drogenas 4 acetaldehyd a1kohol-de- etanol hydrogenas 5 a-ketoglutar- isocitronsyra- isocitrat at + C02 dehydrogenas 6 dehydroxiace- a-glycerol- L-a-g1ycerol- tonfosfat fosfat-denydro- fosfat genas 7 pyruvat mJölksyra-dehy- laktat drogenas 8 l,3-defosfo- glyceraldehyd- glyceraldehyd- _glycerat 3-fosfat-dehy- 3-fosfat + fosfat drogenas * nikotinamid-adenin-dinukleotid nr reducerad NAD 447 510 .11 Tabell C produkt A NADP' reaktant B enzym enzym reaktant A NADPH" produkt B reaktant A reaktant B eller eller reaktion produkt B enzym produkt A 1 6-fosfoglu- glukos-6- glukos-6- konat fosfat-dehy- fosfat _ drogenas 2" oxiderad glutation- reducerad glu- glutation reduktas tation 3 P-bensokinon kinon-reduk- hydrokinon tas 4 nitrat nitrat-reduk- nitrit tas 5 a-ketogluta- glutaminsyra- glutamat rat + NH; dehydrogenas x nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat xx reducerad NADP Det bör påpekas, att de cykliska reaktionssystemen i tabellerna B och C kan omfatta en kombination av vilken som helst av de i respek- tive tabell angivna reaktionerna med vilken som helst annan angiven reaktion. Reaktion 1 i tabell B kan sålunda kombineras med vilken som helst av reaktionerna 2-9 till bildning av ett användbart cykliskt reak- tionssystem. Tabellerna B och C representerar sålunda 56 respektive 20 möjliga cykliska reaktionssystem.

Förutom de i tabellerna B och C angivna cykliska reaktionssys- temen så kan en av reaktionerna 1 ett cykliskt reaktionssystem inne- fatta enzymatisk eller icke-enzymatisk omvandling av en spektrofotomet- risk indikator, företrädesvis en kolorimetrisk indikator. I ett dylikt system visar sig en eventuell förändring i reaktions- eller kretslopps- hastigheten såsom en förändring i indikatorns spektrofotometriska egen- skaper. Om man använder de föredragna kolorimetriska indikatorerna, så utgöres en dylik förändring av en färgförändring. Ett exempel pá-ett cykliskt reaktionssystem innefattande omvandling av en indikator är ett system bildat genom kombination av en av reaktant B-produkt B-reaktion- erna i tabell B med en reaktion innefattande en oxidations-reduktions- indikator och ett elektronöverförande medel. Såsom elektronöverförande medel kan man använda fenazinmetosulfat. Såsom exempel på användbara 447 510 12 indikatorer kan man nämna de oxiderade formerna av nitrotetrazolium, tiazolylblått och diklorfenolindofenol.

Det indikerande reaktionssystemet kan även innefatta ett expo- nentiellt cykliskt reaktionssystem. Nedan anges ett exempel på ett expc nensieiic cykiiskt reakcionssysnem: ' f” AMP + ATP W-“ïi-r-*íz ADP ADP + PEP Eïïgïâšïßígíë-»ATP + pyruvat Ett dylikt cykliskt reaktionssystem är autokatalytiskt i den meningen, att mängden kretsloppsgàende material fördubblas under varje cykel.'Kretsloppshastigheten ökar därför exponentiellt med tiden, vilkef ger en hög känslighetsgrad. För ytterligare uppgifter om cykliska reak- tioner hänvisas till J. Biol. Chem. 247;}558-70 (1972).

Föreliggande uppfinning kan användas för att påvisa vilken som helst ligand, för vilken det finns en specifik bindningspartner. Ligan- den är vanligen en pcptid, ett protein, ett kolhydrat, ett glykoprotein, en steroid eller någon annan organisk molekyl, för vilken en specifik *öindningspartner existerar i biologiska system eller kan syntetiseras.

Liganden väljes vanligen bland antigener och antikroppar därför; hapte- ner och antikroppar därför; hormoner; vitaminer, metaboliter och farma- kologiska medel, samt receptorer och bindningssubstanser därför. Såsom specifika exempel på ligander, vilka kan påvisas med hjälp av förfaran- det enligt uppfinningen, kan man nämna hormoner, såsom insulin, korion- gonadotropin, tyroxin, liotyronin och estriol; antigener och haptencr, såsom ferritin, bradykinin, prostaglandiner och tumörspecifika antire- ner; vitaminer, såsom biotin, vitamin B12, folinsyra, vitamin E och askorbinsyra; metaboliter, såsom 3',5'-adenosinmonofosfat och 3',5'- guanosinmonofosfat; farmakologiska medel, såsom dilantin, digoxin, morfin, digitoxin och barbiturater; antikroppar, såsom mikrosomala anti- kroppar och antikroppar till hepatit och allergener; och specifika bindningsreceptorer, såsom tyroxinbindande globulin, avidin, hemogenas och transkobalamin.

I konjugatet enligt föreliggande uppfinning är enzym- substratet. kopplat eller bundet till en specifik bindnings- substans, vilken beroende på det valda testsystemet kan ut- göras av liganden, en specifik bindningsanalog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden, så att en mät- 447 510 13 bar mängd reaktantaktivitet kvarhàlles. Bindningen mellan en- zymsubstratet och den specifika bindningssubstansen är vanligen i huvudsak irreversibel under testbetingelserna, t ex i det fall då indikeringsreaktíonen, i vilken enzymsubstratet är aktivt, icke är avsedd att kemiskt förstöra denna bindning såsom vid luminiscerande och cykliska reaktionssystem. I vissa fall förstöres eller påverkas emellertid denna bindning av den valda indikeringsreaktionen såsom ett medel för bestämning av förändringen i enzymsubstratets aktivitet. Ett dylikt fall är det ovan beskrivna enzymatiska, fluorescerande reaktions- systemet.

Enzymsubstratet kan vara direkt kopplat till den speci- fika bindningssubstansen, så att konjugatets molekylvikt är mindre än eller lika med den sammanlagda molekylvikten för enzymsubstratet och den specifika bindningssubstansen. Vanligen är emellertid enzymsubstratet och den specifika bindningssubs- tansen förbundna med varandra genom en brygg-grupp innehållande 1-50, företrädesvis 1-10, kolatomer eller heteroatomer, såsom kväveatomer, syreatomer, svavelatomer, fosforatomer, osv. Såsom exempel pá en brygg-grupp innehållande en enda atom kan man nämnda en metylengrupp (1 kolatom) och en aminogrupp (1 hetero- atom). Brygg-gruppen har vanligen en molekylvikt, som icke överstiger 1 000 och företrädesvis är lägre än 200. Brygg-grup- pen innehåller en kedja av kolatomer eller heteroatomer eller en kombination av bådadera, och den är förbunden med enzym- substratet och den specifika bindningssubstansen, eller ett aktivt derivat därav, genom en sammanbindande grupp, som van- ligen utgöres av en estergrupp, en amidogrupp, en etergrupp, en tioestergrupp, en tioetergrupp, en acetalgrupp, en metylen- grupp eller en aminogrupp.

Ett enzymsubstrat är en förening eller en grupp, som kan undergá en kemisk omvandling katalyserad av ett enzym.

Substratet har lämpligen en molekylvikt lägre än 9 000, före- trädesvis lägre än 5 000. Substrat av denna storlek är lämpli- gast att använda vid framställning av konjugatet, eftersom de saknar molekylär komplexitet. När ett dylikt substrat kopplas till en specifik bindningssubstans, påverkas dessutom lätt substratets aktivitet genom reaktion mellan konjugatet och den 447 510 14 specifika bindningssubstansen. Såsom exempel på enzymsubstrat, vilka kan användas vid förfarandet enligt uppfinningen, kan man nämna. medelst enzym klyvbara fluorescerande substrat såsom E fluorescein och umbelliferon-derivat; pH-indikatorer; och spektrofotometriska indikatorfärgämnen, särskilt av kromogen typ.

Enligt en utföringsform av uppfinningen föreligger de komponen- ter i det specifika bindningsreaktionssystemet, vilka skall kombineras med det vätskemedium som misstänkes innehålla liganden, 1 flytande eller fast form. Enligt den homogena tekniken föreligger komponen- terna vanligen i lösning eller i en fast form, som lätt kan lösas i vätskemediet. Eftersom det vätskemedium som skall testas vanligen är vattenhaltigt, föreligger komponenterna vanligen i vattenlöslig form, dvs. antingen 1 en vattenlösning eller i en vattenlöslig, fast form, såsom ett pulver eller ett harts. Testförfarandet kan genomföras i ett vanligt laboratoriekärl, såsom ett provrör, varvid komponenterna för «den,specifika bindningsreaktionen och komponenterna för indikeringsreak- tionen tillsättes i fast eller flytande form.

En eller flera av komponenterna för den specifika bindningsreak- tionen och/eller en eller flera av komponenterna för indikeringsreaktion- en kan dessutom införlivas med en bärare. En dylik bärare kan vara ett kärl, såsom ett provrör eller en kapsel innehållande en dylik komponent , eller dylika komponenter i en inre del därav, t.ex. i form av en vätska eller ett luckert fast ämne eller en beläggning på kärlets inneryta.

Enligt en annan utföringsform kan bäraren föreligga i form av en matris, som är olöslig och porös, och som företrädesvis kan absorbera det väts- kemedium som provas. En dylik matris kan vara ett fuktighetsabsorberan- 'de papper, en polymerfilm, ett membran, ett flor, ett block, ett gel, etc. I en dylik form utgör matrisen ett lämpligt medium för kontakt med det vätskemedium som skall provas, för genomförande av den specifika bindningsreaktionen och/eller indikeringsreaktionen, och för iakttagande av det resulterande gensvaret.

W Det vätskemedium, som skall provas, kan vara en naturligen före- kommande eller pá konstgjord väg framställd vätska, som misstänkes inne- hälla liganden. Vätskemediet är vanligen en biologisk vätska eller en vätska erhàllen gendm utspädning eller annan behandling av en biologisk 447 510 15 vätska. Såsom exempel på biologiska vätskor, vilka kan testas enligt föreliggande uppfinning, kan man nämna serum, plasma, urin och amnio- tiska, cerebrala och spinala vätskor. Man kan även analysera andra ma- terial, såsom fasta ämnen, t.ex. vävnader, eller gaser, om dessa materi- al först överföres i vätskeform, t.ex. genom upplösning av det fasta ämnet eller gasen i en vätska eller genom vätskeextraktion av det ßasta ämnet.

I motsats till de förut kända homogena metoderna kan biologiska vätskor, vilka innehåller substanser med reaktantaktivitet liknande eller identiska med aktiviteten av den konjugerade märkningssubstanšen, analyseras för bestämning av en ligand utan bakgrundsstörning. Endogen bakgrundsaktivitet kan lätt elimineras på flera sätt. Den biologiska vätskw1knn behandlas för selektiv förstoring av den endogena reaktant- aktiviteten. En dylik behandling kan ske med hjälp av ett medel, vilket kemiskt förstör den endogena aktiviteten, varefter man inaktiverar det använda medlet.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begrän- sande exempel.

Exemnel 1; Framställning av 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-kon- 'jugat. 5 Fluorescein-3',6'-bis-ÅF-(2,4-dinitroanilino)hexanoa§7.

Syntesen innefattade omsättning av syrakloriden av 6-(2,4-oi- nitroan1lino)hexansyra med dinatriumsaltet av fluorescein. 6-(2,4-di- nitroanilino)hexansyra framställdes enligt den metod som har beskrivits i Biochem. J. 42:28?-94 (1948).

En lösning av 1,5 g (5 mmol) 6-(2,4-dinitroanilino)hexansyra omvandlades till syrakloriden genom omsättning med 10 ml varm tionyl- klorid under 15 minuter och efterföljande kylning och utspädning med 20 ml hexan. Den bildade fasta syrakloriden avskiljdes genom filtrering, och efter grundlig torkning sattes syrakloriden till 600 mg av dinatrium saltet av fluorescein i 10 ml torr aceton. Efter 5 timmars àterflödes- kylning avbröts reaktionen genom tillsättning av 2 ml vatten ach 5 ml aceton. Efter 30 minuter vid 2500 koncentrerades reaktionsblandningen till torrhet, och den erhållna återstoden fördelades mellan etylacetat och en vattenlösning av natriumbikarbonat. Den organiska fasen avskilj- des och tvättades med en l proeentig vattenlösning av svavelsyra, var- efter den torkades över vattenfritt magnesiumsulfat och indunstades.

Den erhållna röda oljan kromatograferades på 60 g silikagel 60 (från 447 510 16 E. Merck, Darmstadt, Tyskland), varvid man såsom elueringsmedel anvßnde en blandning av aceton och koltetraklorid i volymförhàllandet 2:8. Nan erhöll härvid 1,2 g oren bis-ester, som kromatograferades pà nytt på 60 g silikagel, varvid man såsom elueringsmedel använde en blandning av aceton och koltetraklorid 1 volymförhàllandet 1:9. De fraktioner, som innehöll den önskade produkten, förenades och indunstades, varvid man erhöll 180 mg av ett gult, glasartat fast ämne.

Beräknat för C¿uH58N6Ol5: C 59.33; H 4.30; N 9,43 x Funnec: c 60,92; H 4,35; N 6,65. ' Produktens IR-spektrum visade den väntade esterkarbonylabsorp- tionen vid 1765 em'1. ' Exempel ¿_. Försök enligt den homogena metoden för påvisande av derivat av 2,4-dinitrofenyl och antikroppar därtill med användning av ett enzymsubstrat (modifierad fluorescein) såsom märkningssubstans.

Det 1 d°tta exempel använda specifika bindningsreaktionssystem- et var baserat pà den 1 nedanstående diagram l visade reaktionen.

Diagram 1 esteras H20, pH 7,0 4 andra produkter 447 510 11 (maximal fluorescens vid 510 nm) R = - (cH2)5- NH-Qnog O2N (A) Homogen fluorescens-metod med direkt bindning för påvisan- de av antikroppar till 2,4-dinitrofenyl; inverkan av olika antikropp- koncentrntioner pá reaktionshastigheten.

Man framställde och analyserade sju bindningsreaktionsblandning- ar. Varje reaktionsblandning framställdes genom att 20/ul 1/uM 2;N i- nitrofenyl-Fluorescein-konjugat (framställt enligt exempel 1) i dimetyl- sulfoxid blandades med en sådan volym antiserum till 2,4-dinitrofenyl som anges i nedanstående tabell 1 och med en tillräcklig volym 0,1 M bis-hydroxietylglycin-hydrokloridbuffert (pH 7,0) för att ge en total volym av 2,0 ml. Hastigheten av bakgrundshydrolysen av esterbindningarna i konjugatet bestämdes under 3 minuter i varje reaktionsblandning genom att man mätte ökningen av fluorescensintensiteten vid 5lO,nm, när fluore- 'metern var anordnad för excitering vid 470 nm. Till varje reaktionsbland- ning sattes därefter 10)pl av en 0,1 M bis-hydroxietylglyein-hydroklorid- buffert (pH 7,0) innehållande 0.54 enheter esteras typ I (E. C. Nr. 3.l.l.l från Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri, USA). Den resulte- rande totala reaktionshastigheten mättes på samma sätt som bakgrunds- hydrolvshastigheten. De erhållna resultaten är sammanställda i nedan- stående tabell 1.

Tahell1.H mängd bakgrunds- total reak- reaktions- antiserum hydrolys- tionshastig- blandning Qul) hastighet het 1 o 0.02 2.68 2 5 0.07 2.48 3 1o 0.11' 1.91 4 20 0.17 1.08 5 30 0.21 0.63 6 110 0.22 0.145 7 60 0.26 0.30 447 510 _ 18 Av ovanstående resultat framgår, att nettohastigheten av hydro- lysreaktionen var en omvänd funktion av mängden antikroppar till 2,4- dinitrofenyl närvarande f bindningsreaktionsblandningen. Av resultaten framgår även, att hastigheten av bakgrundshydrolysreaktiaxen var en direkt funktion av mängden antikroppar närvarande i bindningsreaktions- blandningen. Enligt uppfinningen kan man därför åstadkomma en testkompo- sition och ett förfarande för bestämning av närvaro av antikroppar till 2,4-dinitrofenyl 1 ett vätskemedium med användning-av en fluorescens- teknik med direkt bindning.

(B) Homogen fluoresoens-metod med konkurrerande bindniflß “ör pávisande av derivat av 2,4-dinitrofenyl; verkan av olika halter av 2,4-dinitrofenyl-p-alanin på reaktionshastigheten.

Man framställde tio bindningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av 2,0 ml och innehöll 0,1 M bis-hydroxietylgly- cin-hydrckloridbuffert (pH 7,0) och 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin. fram- ställd enligt den metod som beskrivas i J. Amer. Chem. Soc. 76:l328 (1954), i de 1 nedanstående tabell 2 angivna koncentrationerna. Till reaktionsblandningarna 2-10 i tabell 2 sattes antiserum till 2,4-dinitro- ,fenyl i en mängd, som var tillräcklig för att med 60 procent sänka has- tigheten av den esteras-katalyserade reaktionen i reaktionsblandning 1.

Efter blandning satte man till varje reaktionsblandning 20ffl.l/uM 2,4- dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1) i di- metylsulfoxid. Därefter satte man till varje reaktionsblandning 10 pl av en 0,1 M bis-hydroxietylglycin-hydrokloridbuffert (pH 7) innehållande 0,54 enheter esteras typ I (E. C. nr. 5.l.1.l från Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Den resulterande reaktionshastigheten mättes på samma sätt som har beskrivits under (A) ovan. För reaktionsbland- ningarna 2-10 beräknade man den procentuella reaktionshastigheten, räk- nad pà reaktionshastigheten i reaktionsblandning 1, som icke innehöll några antikroppar. De erhållna resultaten är sammanställda i nedanståen- de tabell 2. 447 510 19 Tabell 2. koncentration av procentuell reak- reaktions- 2,4-dinitrofenyl- reaktions- tionshastighet, räk- blandning ß-alanin (nM) hastighet nad på reaktion 1 1 o ' 2.78 - 2 O 1.04 57 3 5 1.01 36 4 1o 1.04 37 5 20 1 .24 45 6 30 1.51 54 7 5o_ 1.54 56 B 75 - 1.80 65 9 1oo 1 _85 67 10 150 2.}} 84 Av ovanstående resultat framgår, att hydrolysreaktionens has- tighet var en direkt funktion av mängden 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i reaktionsblandningen. Enligt uppfinningen kan man därför åstadkomma en testkomsssition och ett förfarande för bestämning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl i ett vätskemedium med använd- ning av en fluorescens-teknik med konkurrerande bindning.

(C) Homogen spektrofotometrisk metod med konkurrerande bind- ning för bestämning av derivat av 2,4-dinitrofenyl; verkan av olika halter 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin pà reaktionshastigheten.

Man framställde åtta bïndningsreaktionsblandn1ngar, som var och en hade en total volym av 1,0 nl och innehöll 0.1 M tris-(hydroximetyl)- aminometan-hydrokloridbuffert (pH 7,0). Reaktionsblandningarna innehöll dessutom 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i de 1 nedanstående tabell3 angivna koncentrationerna. Till reaktionsblandningarna 2-8 1 tabell3 sattes antiserum till 2,4-dinitrofenyl i en mängd, som var tillräcklig för att med 82 procent sänka hastigheten av den esteras-katalyserade reaktionen i reaktionsblandning 1. Efter blandning satte man till varqe reaktions- blandning 10/ul 0,1 mM 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1) i dimetylsulfoxid. Till varje reaktionsblandning satte man därefter 20/ul av en 0,1 M tris-(hydroximetyl)aminometan- hydrokloridbuffert (pH 7,0) innehållande 2,16 internationella enheter esteras typ I (E. Q. nr. 3.l.l.l från Sigma Chemical Co., St. Louis, 447 510 20 Missouri, USA). Med hjälp av en spektrofotometer Gilford 2000 mätte man i varje reaktionsblandning absorbansförändringen per minut vid 489 nm. De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 3.

Tabell 3. koncentration av reaktions- 2,4-dinitrofenyl- absorbans- blandning p-alanin (PM) förändring l 0 ' 0.026l 2 O 0.004? 3 1.25 0.0llB 4 2.5 0.0l}l 5 5.0 0.0l85 6 7.5 0.0202 7 10.0 0.0l92 8 12.5 0.0223 Av ovanstående resultat framgår, att reaktionshastigneten var en direkt fdnktion av mängden 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i reaktions- blandningen. Enligt uppfinningen kan man sålunda åstadkomma en test- komposition och ett förfarande för bestämning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl 1 ett vätskemedium med använd- ning av en spektrofotometrisk teknik med konkurrerande bindning. _ (D) Homogen fluorescens-metod med konkurrerande bindning för bestämning av derivat av 2,4-dinitrofenyl; användning av en icke-eq:ym- atisk indikeringsreaktion. - Bet använda bindningsreaktionssystemet var detsamma som visas i diagram l med det undantaget, att inget esteras användes för att kata- lysera hydrolysen av esterbindníngarna i konjugitet.

Man framställde åtta blndningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av 2 ml och innehöll 0,1 M tris-(hydroximetv1)- aminometan-hydrokloridbuffert (pH 7,5)- Blandningarna innehöll dessutom 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i de i nedanstående tabell 4 angivna koncen- trationerna. Till varje reaktionsblandning sattes 50/ul antiserum till 2,4-dinitrofenyl. Efter blandning satte man till varje reaktionsbland- 'ning 20/ul 2/uM 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1)i dimetylsulfoxid. Den resulterande reaktionshastigheten mättes på samma sätt som har angivits under (A) ovan. De erhållna resul- taten är sammanställda i nedanstående tabell 4. 447 510 21 Tabell 4._ koncentration av reaktions- 2,#-dinitrofenyl- reaktions- blandning p- alanin (nM) hastighet 1 o 0.96 2 12.5 0.94 3 31.2 0.84 4 62-5 0.78 5 94.0 0.70 6 125 å 0,59 7 187 0.57 8 250 0,55 Av ovanstående resultat framgår, att bakgrundshydrolyshastíg- heten i frånvaro av esteras var en omvänd funktion av mängden 2,4-dí- nitrofenyl-ß-alanin i reaktionsblandningen. Enligt uppfinningen kan man sålunda åstadkomma en testkomposition och ett förfarande för bestäm- ning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl L ett vätskemedium med användning av en fluorescens-teknik med konkurre- rande bindning, där bindningspartnern deltager 1 indikeringsreaktionen efter att ha bundits till liganden 1 konjugatet.

§§§¶Q§l_â¿ Framställning av biotin-umbelliferon-konjugat. (2-oxo-2-H-1-bensopyran-7-yl)-5-[His-hexahydro-2-oxo-lH-tieno- (3,4-d)-imidazolfvalerinsyraester.

En lösning av 300 mg (1,2 mmol) vattenfritt biotin 1 20 ml torr dimetylformamid omrördes vid -lO°C under en atmosfär av torr kvävgas, och 0,17 ml (1,2 mmol) torr trietylamin tillsattes. Man tillsatte sedan droppvis en lösning av nydestillerat etylkloroformiat (O,lÄ1 ml 1 3 ml 'torr eter). Efter inkubering under 30 minuter under omrörning avfiltre- rades den resulterande fällningen under en atmosfär av torr kvävgas och kyldes omedelbart till -lO°C. Till fällningen sattes därefter en lösning av 197 mg (1,2 mmol) vattenfri 7-hydroxikumarin i 3 ml torr pyridin.

Blandningen omrördes under 1 timme vid -10°C och därefter under 20 tim- mar vid 2506. Lösningsmedlen avdunstades sedan under högvakuum vid ÄOCC

Claims (7)

447 510 22 Efter kylning avfiltrerades det bildade fasta ämnet och omkristal1isera~ des i metanol. Man erhöll härvid den önskade produkten med en smältpunkt av 216-218°c. Beräknat för Cl9H2ON2P5S: c 48,75: H 4,19; N 7,21 Funnet: C 58,4; H 5,12; N 5.85- “Patentkrav

1. Testförfarande utnyttjande en specifik bindningsreaktion för bestämning av en ligand i ett vätskemedium, vilket förfarande inne- fattar följande steg: g (al vätskemediet bringas i kontakt med ett reagens innefattande ett konjugat av en märkningssubstans och en specifik bindningssub- stans, varvid reagenset och liganden bildar ett bindningsreaktions- system innefattande (i) en bunden form av det märkta konjugatet, vari den specifika bindningssubstansen är bunden till en specifik bindningspartner därtill, och _ (ii) en fri form av det märkta konjugatet, vari den specifika bind- ningssubstansen icke är bunden till en specifik bindningspartner därtill; (b) märkningssubstansen bestämmes i antingen den bundna formen eller den fria formen såsom ett mått på mängden ligand i vätske- mediet, k ä n n e t e c k n a t av att märkningssubstansen är ett enzym- substrat och att förfarandet är homogent, dvs. man genomför icke nå- gon fysikalisk separation av den bundna formen och den fria formen av det substrat-märkta konjugatet utan substrat-aktiviteten i hela den flytande reaktionsblandningen mätes och sättes i relation till mängden ligand i det provade vätskemediet.

2. Förfarande enligt krav.1, k ä n n e t e c k n a t av att det substrat-märkta konjugatet är ett substrat för ett enzym som kan verka på konjugatet och genom enzymatisk spjälkning frigöra en pro- dukt, vilken har en påvisbar egenskap som skiljer sig från konjugatet. 447 510 23

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n_n e t e c k n a t av att den frigjorda produkten är fluorescerande.

4. Reagens för användning vid bestämning av en ligand i ett vätskemedium, vilket reagens innefattar ett konjugat av en märk- ningssubstans och en specifik bindningssubstans, och vilket reagens tillsammans med liganden bildar ett bindningsreaktionssystem inne- fattande en bunden form av det märkta konjugatet, vari den specifika bindningssubstansen är bunden till en specifik bindningspartner därtill, och en fri form av det märkta konjugatet, vari den speci- fika bindningssubstansen icke är bunden till en specifik bindnings- partner därtill, varvid mängden märkningssubstans i antingen den bundna formen eller den fria formen är en funktion av mängden ligand i vätskemediet, k ä n n e t e c k n att av att märkningssubstansen är ett enzymsubstrat, och att det substrat-märkta konjugatet upp- visar mätbart olika substrat-aktiviteter i den bundna formen och i den fria formen, vilket möjliggör homogen analys.

5. Reagens enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar (1) ett märkt konjugat innefattande märkningssubstansen bunden till liganden eller en specifik bindningsanalog därtill, och (2) en bindningspartner till liganden.

6. Reagens enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att det substrat-märkta konjugatet är ett substrat för ett enzym som kan verka på konjugatet och genom enzymatisk spjälkning frigåra en pro- dukt, vilken har en påvisbar egenskap som skiljer den från konjugatet.

7. Reagens enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att den frigjorda produkten är fluorescerande.