JPS5951354A - 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中のハシテン又は抗原（対象物質）の存
在を、特異的結合（特定結合）の相手物質に対する該対
象物質の親和性に基づいて測定するための方法及び試薬
に関するものである。更に詳しくは、本発明は、標識物
質として放射性物質もしくは部分変形した酵素を用いな
い特異的結合（％定結合）による分析に用いる方法及び
試薬に関するものである。なお、本明細書中では「特異
的」と「特定」とを同義に用いている。

液体中の低濃度の物質の存在を検出するための便利かつ
信頼性が高く、更に危険性のない方法への要望があるこ
とは明白である。このことは、１０−Ｈモル濃度程度の
低濃度で体液中に存在する成分が病理学上重大である臨
床化学の分野に於いては、特に該当する。そのような低
濃度の物質を検出することの困難さは、通常は試料の量
が非常に制限される臨床化学の分野に於いて増加する。

以前に於いては、物質は、その検出される物質が必ず反
応体であるような反応系に基づいて、液体中で検出され
ていた。未知物質の存在は、反応生成物の出現もしくは
既知反応体の消失によって検出されている。ある場合に
於いては、そのような分析方法は、生成物の出現もしく
は反応体の消失の速度あるいは生成した生成物もしくは
平衡に達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの分析の
反応系は必然的に小さなグループの物質の検出のみに限
定されるか、あるいは特異性のないもののいずれかであ
る。

特異性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用できる分
析系の研究により、放射性免疫分析法が生み出された。

この方法によると、検出対象の物質の放射性標識を付さ
れたものの量は、未知のものに特異性をイイする限られ
た量の抗体について、未知のものと競い合わされるよう
にされる。そして、抗体に結合されるようになる標識を
付されたものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例
して変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本来、
抗体に結合されるようＫなる標識を付された形の検出対
象物質（束縛相）ヲ、そのような結合を起さない物質（
遊離相）と分離することが必要となる。この必要とされ
る分離を遂行するための種々の手段が、例えば米国特許
第３，５０５，０１９号、３．５５５，１４３号、３，
６４６，３４６号、３　、７２０　、７６０号及び３　
、７９３　、４４５号に示されるように開発されてきた
。

しかし、それらの手段は全て、束縛相と遊離相の効率的
な分離を確実にするために口過、遠心分離、洗浄もしく
はカラムの溶出などの少なくとも一つの人手による操作
工程を必要としている。そのような分離は応々にして、
束縛相を含む不溶性部分と遊離相を含む液体部分から成
り、各部分中の放射性活性標識の葉が標識化物質の結合
の大きさの関数、従って検査された試料中の対象物質の
量の関数となるようにされている系を形成させることに
より行なわれている。科学の本分野に於いて一般に用い
られ、かつ本明細書に於いて用いられる「不均一系」と
は、束縛相と遊離相の分離が行なわれることが含まれる
特異的結合分析全意味している。このような分離は、束
縛相中の標識化物質が遊離相中の標識化物質と区別がつ
きにくい系の特異的結合分析上行なうときに必要である
。

放射性物質を扱うための危険性及び困難さのために、放
射性免疫分析法と同程度に感度良く迅速で、しかし結合
反応を監視検出するための手段として放射性以外の性質
金利用する使いやすい特異的結合分析系を案出する多く
の試みがなされてきた。本明細書中に以下更に充分に記
述されるように、放射性原子もしくは分子の代りに標識
物質として利用されてきたものとしては、酵素、螢光物
質及びパクテリオファーソのような種々のものが含まれ
る。

標識物質として用いられる酵素を用いて開発された方法
の例としては、米国特許第３，６５４，０９０号、＠３
，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、及び第
３，８５０，７５２号、そしてジャーナル・オブ・イミ
ュノロジカル・メソツズ。

１　　：　　２４７（１９７２）及びジャーナル・オブ
・イミュノロジー。

１０９：１２９（１９７２）に記載された方法が挙げら
れる。記載された各々の方法に於いては、酵素は検出対
象の物質（リガンド）もしくはその結合の相手物質のい
ずれかに化学的に結合されており、試料と共に置いた後
に、不溶部分もしくはりガンＦ部分のいずれかに含まれ
る酵素活性の量が試料中のリガンド（対象物質）の量の
関数となるように適当な不均一系特異的結合反応の図式
が組み立てられる。従って、酵素結合体の合成及び特性
付けに関連する問題が、この解決方向の重大な隘路とな
る。

酵素付加免疫分析として興味あるものが米国特許第３，
８１７，８３７号に記載されている。この方法は分離（
即ち不溶性部分と液体部分）特異的結合反応系を用いる
必要がなく、従ってそれのための分離操作を必要としな
い。これは、酵素付加された対象物質が、対象物質の該
結合の相手物質との反応により酵素活性が阻害されるよ
うに作られているからである。こうして、酵素付加され
た物質の束縛（結合）状態にあるものと、遊離（自由）
状態にあるものとの比を、酵素活性の変化全測定するこ
とにより決定する。しかしながらこの方法には、特性の
優れた酵素付加結合体の調製及びこの系の基本方式に適
合する酵素を見いだすことの困難さがある。

英国特許第１．３９２，４０３号及びフランス国特許第
２．２０１，２９９号には、標識物質として分光々度測
定に於いて活性な物質の不活性な前駆体を用いる特異的
結合分析が記されている。特異的結合反応系と共に試料
を保持した後、不溶性部分と液体部分を分離し、試料中
で検出されるべき対象物質の量の関数であるところの液
体部分に存在する標識物質の量は、不活性な標識物質を
色変化もしくは螢光活性物質に変え、次いでこれを通常
の手段で計測することから成る反応工程により測定され
る。

異なったタイプの標識物質を用いる他の特異的結合分析
方法は以下のように開示されている。即ち、米国特許第
３，８５０，５７８号には標識手段として電子スピン共
鳴を用いることが開示されており；米国特許第３，９０
１，６５４号には標識手段として螢光発光の停止及び増
大を用いることが開示されている。米国商務省の国家技
術情報サービス（ＮＴ　Ｉ　Ｓ　）の報告Ａ　ＰＲ−２
２４，８７５（１９７３）には、化学発光反応により監
視検出する不均一系分析系で標識物質としてヘミン・ク
ロリドを用いた試み（成功していない）が記されている
。ネイチャー、２１９：１８６（１９６８）には、ある
種の放射性免疫分析操作について非常に詳しく記載され
ており、更に標識物質として放射性同位元素の代わりに
補酵素及びビールスを用いることの可能性について、非
常に概括性な性質として付随的に言及している。しかし
著者は、そのような代りの標識物質を用いて如何に分析
を行なうかについて、あるいは実際問題として、そのよ
うな分析法が実施可能であるかどうかの点については教
示していない。更に背景を記せば、［競合蛋白−結合分
析法の原Ｐｒ、）　（Ｐｒ　１ｎ−ｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ
　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ　Ａｓ５ａｙｓ）オデル及びドウディ編（ソニー
・ビー・リッペンコット・カンパニー、フィラディルフ
イア、１９７２）には、種々の既知の分析方法及び特異
的結合分析用の標識として用いられてきた様々な物質や
特性などが広範囲に議論されている。

これまでに多くの新しいタイプの特異的結合分析方法が
示唆され研究されてきたが、放射性免疫分析法と糧々の
酵素付加免疫分析法が最も広く用いられ改良されるもの
として残ってきた。　しかし、両方のタイプのシステム
は明白な欠点を有している。

即ち、放射性免疫分析に於いては、放射性物質の取扱い
が危険で、注意を必要とし、酵素付加免疫分析に於いて
は、有用な酵素付加結合体を調製するのが難しい。

従って本発明の目的は、不便な放射性物質もしくは部分
変形酵素を標識物質として使用しない、液体中の対象物
質（リガンド）を検出するための新規な方法及び試薬を
提供することである。

更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広く便利な
不均一系特異的結合（特定結合）分析方法及び試薬を提
供することも目的の−っである。

対象物質もしくはその特異的結合の相手物質に先行技術
方法の酵素よ′りも更に都合よく組み合わせ結合するこ
とのできる標識物質を用いる不均一系特異的結合分析方
法及び試薬を提供することも本発明の目的の一つである
。

種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることにより、先行
技術方法に於ける酵素の活性のいかなる変化よりも更に
都合良くいかなる活性の変化についても検出できる標識
物質を含む結合体を用いた不均一系特異的結合分析方法
及び試薬全提供することもまた本発明の目的の一つであ
る。

本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ鋭敏な不
均一系特異的結合分析方法及び試薬を、前以って決めら
れた反応の成分として賦与された反応活性を示す物質を
標識物質として使用することに基礎を置いて提供するも
のである。そのような物質はここに於いて「反応体」と
して示される。

本発明の標識物質は、従来のいかなる不均一系特異的結
合分析方法に於いても使用することができる。束縛相及
び遊離相の各々に存在する反応体についての量は、特異
的結合反応を監視検出するための手段として働く前以っ
て決められた反応系を反応体と共に形成する少なくとも
一種の試薬と各相を接触させることにより測定される。

定量的な測定は、既知量の測定対象の対象物質（リガン
ド）全含有する液体で同じ方法により得られた値と一つ
の相で測定された反応体の活性とを比較することにより
行なわれる。

１令 改良された液体中のハブ テン又は抗原を分析するための方法は、一般には、次の
（ａ）　、　（ｂ）及び（ｃ）工程を含んでいる。即ち
、（ａ）試験液体を、予め定められた特性を有する標識
物質とハプテン若しくは抗原、若しくはそれに対する抗
体又はそれに対する特異的結合の相手物質との結合体か
らなる試薬と接触させる工程、ここで、該試薬と結合反
応系を生成する対象物質（リガンド）が標識化された結
合体の束縛相又は遊離相を生ずる： （ｂ）該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び （Ｃ）分離された層の−における、該液体中のノ・ゾテ
ン又は抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であって、結合体中の標
識物質が、化学発光反応の反応体であることを特徴とす
るものである。この後に更に詳しく述べるように、本結
合反応系は、放射性免疫分析系や不拘−系酵素一免疫分
析系に於いて用いられるような既知の通常の技術のいか
なる形をとることもできるであろう。

監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好ましい。

通常は、監視検出反応は、結合体中の反応体に対して高
度に鋭敏なものから選ばれる。この点に於いて、化学発
光もしくは螢光発光反応系は非常に有用である。特に好
ましいのは循環反応系で、反応体が循環する物質である
反応系が特別に好ましい。好ましい循環反応系の中でも
、酵素を触媒として利用する系が特に有利である。本発
明における結合体中の反応体は化学発光反応における反
応体である。

本明細書に於いて用いられる用語は以下のように定義さ
れる。「リガンド」、「対象物質」もしくは「対象物質
（リガンド）」は、物質もしくは一群の物質で、その液
体中の存在もしくは量が測定されるものである。「対象
物質（リガンド）の特異的結合の相手物質」とは、物質
もしくは一群の物質で、他の物質を排除して対象物質に
対して特定の結合の親和性を示すものである。「対象物
質の特異的結合に関する類似物質」とは、物質もしくは
一群の物質で、対象物質への特異的結合の相手物質の結
合親和性に関して対象物質と本質的に同じ挙動をとるも
のである。

本発明の不均一系免疫分析試薬は、液体中のハプテン又
は抗原を分析するための： 予め定められた特性を有する標識物質とハプテン若しく
は抗原、若しくはそれに対する抗体又はそれに対する特
異的結合の相手物質との結合体からなり、かつ、試薬と
ハシテン又は抗原が結合反応系を形成して標識化された
結合体の束縛相又は遊離相を生成し、該束縛相若しくは
該遊離相のいずれかの特性が、該液体中のハシテン又は
抗原の量の関数である不均一系免疫分析用の試薬であっ
て、 結合体中の標識物質が化学発光反応の反応体であること
を特徴とするものである。

特異的結合試薬は種々の形をとり得る。一般に、そのよ
うな試薬は三種の基本成分を含有している。

即ち（１）検出対象物質（リガンド）　、（２）リガン
ドの特異的結合の相手物質、及び（３）、普通は標識化
された形の（ａ）リガンド、（ｂ）リガンドの特異的結
合に関する類似物質もしくは（ｅ）特異的結合の相手物
質である標識化成分、である。この結合反応の成分は同
時に一緒にされるか、あるいは順次添加される。そして
適当々保持（保存）期間の間に、標識化成分は、例えば
結合の相手物質に束縛（結合）された標識化成分の量と
不束縛（不結合）の標識化成分の量との比率のような結
合の量、大きさ等が、存在する対象物質の量の関数とな
るように、対応する競合結合の相手物質に束縛（結合）
される。

以下に本発明の方法を実施する場合に用いられる種々の
結合反応の概要のいくつかについて簡単に記述する。

放射性免疫分析法や不均一系酵素免疫分析法のような通
常の不均一系特異的結合分析法に於いては、放射活性や
酵素活性のような標識化結合体に於ける標識特性は、束
縛（結合）状態及び遊離（自由）状態の結合体にとって
本質的には同じでおる。−万、本発明方法によれば、標
識物質としての反応体の活性は、場合によっては、標識
化結合体の結合に影響會受ける。そのような状況に於い
ては、監視検出反応は、対象物質がり、体中に存在しな
い場合、或は有意でない程度に少ない量で存在する場合
、比較的に一定の性質分示す。液体中に対象物質が存在
する時は、監視検出反応の特性もしくは性質が変化する
。一般には、結合体中の反応体の活性は、反応体が監視
検出反応に関与することができる量もしくは速度となる
であろう。

このようにして、監視検出反応の性質は液体中の対象物
質の存在により、通常はその全反応速度、もしくは一種
もしくは数種の生成する反応生成物の平衡量について変
化する。この場合に於いて一般には、監視検出反応に関
与する結合体の反応体の活性能力は、それが結合する特
異的結合物質と該特異的結合物質の特異的結合の対応物
質との間の反応により低下する。即ち、遊離（自由）状
態の結合体は監視検出反応に於いて、束縛（結合）状態
にある場合よりも活性が大きい。

次に示す概略式には、以下の記号が用いられる。

記号　　　　　　　　　定　　　義 Ｌ　　　検出対象物質 ■　　　対象物質もしくはその特異的結合に関する類似
物質 Ｂ　　　対象物質の結合の相手物質 ＊　　標識物質、例、反応体 ト　　不溶性の相 →　適当な分離に続く保持期間 （ｔｉｍ）　　　限定量：選択された保持期間中に選択
された反応条件下で、結合可能箇所の 全てに結合することのできる量よりも 少なく存在すること：例、他の成分と 結合を競い合う成分 （ａｘｃ）　　過剰量：選択された保持期間中に選択さ
れた反応条件下で、結合可能箇所の 全てに結合することのできる量よりも 多く存在すること ａ）　　Ｌ　＋　Ｏ’　十Ｂ（Ａ！ｉｍ）→＋１３　　
もしくは［Ｆ］の不溶化剤 これは従来からの競合結合方法によるものである。この
不溶化剤の例としては、特異的沈降抗体、特異的不溶化
抗体、Ｂもしくは■が蛋白性物質である場合には硫酸ア
ンモニウムのような蛋白質沈殿剤、Ｂもしくは［Ｆ］ゝ
が小さ力吸収され得る分子である場合には、デキス）　
ＩＪンで被覆したチャコール（木炭）が挙げられる。同
様な系についての記述はバイオケミカル・ジャーナル、
８８：１３７（１９６３）及゛び米国特許第３，８３９
，１５３号に見られる。

ｂ）ｔ、十＄　十　　トＢ　（ｌｉｍ）　　−一−÷こ
の方法は通常固相（ソリッド・７エーズ）技術と呼ばれ
る。同様な放射性免疫分析法及び酵素免疫分析法の技術
についての記述は米国特許第３．５０５，０１９号、第
３，５５５，１４３号、第３．６４６．３４６号、及び
第３，６５４，０９０号に見られる。

ｃ）　　　Ｌ　　十　　Ｂ＊　＋　　　ト■（ｌｉｍ）
　→参考文献：米国特許第３，６５４，０９０号ｄ）　
　Ｌ　十ト■　＋Ｂ＊（Ａ’ｔｍ）　　−→参考文献：
米国特許第３，８５０，７５２号２　順次飽和分析法 ａ）　　Ｌ　　十Ｂ（ｅｘｅ）　〜→十Ｃ１（ｅｘｅ）
　−→十　Ｂもしくは♂の不溶化剤 順次飽和技術に於いては、最初の保持期間後に残存する
Ｂの結合箇所の一部もしくは全部が標識化成分に結合さ
れて−る。

ｂ）　　Ｌ　　十　　ＦＢ　　（ｅｘｅ）　　−−→　
　十　　（ｌＤ＊（ｅｘｅ）　　−−−＋同様な放射性
免疫分析法及び酵素免疫分析法の技術についての記載は
、米国特許第３，７２０，７６０号及びジャーナル・オ
ブ・イミュノロジー、２ｏ９：１２９（１９７２）に見
られる。

ｃ）　Ｌ　十Ｂ　（ｅｘｅ）−＋十ト■（ｅｘｅ）　Ｎ
３　サンドインチ分析法 Ｌ　　十　　　トＢ　　（ｅｘｃ）　　−−÷　　　　
Ｂ＊　（ｅｘｅ）　　　　−一一−ｔサンドインチ分析
法では、不活性化された結合の相手物質に結合したリガ
ンド（対象物質）分子の一部もしくは全部が標識化成分
に結合されている。

参考文献：米国特許第３，７２０，７６０号４　固相希
薄化分析法 Ｌ　＋　ｃ十　　Ｆ（非特異的）　〜→十　　Ｂ（Ａ’
ｉｍ）　　　−−→ この技術に於いて、リガンドと標識化成分は非特異的結
合剤に結合され、その比例する量はその後リガンド及び
標識化成分に更に大きな親和性を示す結合の相手物質と
の結合により解離する。

この技術の最も有用な形としてＵ、米国特許第３　、６
５９　、１０４号に記載された非特異的結合剤のカラム
を用いる方法がある。そのような技術は、除去されない
限り競合結合反応を妨害する試料中の内因性結合物質に
リガンドが結合している場合に有用である。非特異性結
合剤に結合された後、内因性結合物質は適当な洗浄によ
り除去される。

通常の不均一系分析系に含まれる変数に関する記載、例
えば分析方法及び代替できる分離技術の更に詳しい記述
等については、「競合蛋白−結合分析法の原理」（前出
）を参考文献として挙げることができる。

他の添加順序及び他の結合反応の構成もまた、ここに述
べた発明概念から逸脱せずに不均一系特定結合分析を行
なうために考案されるであろうことは予測されることで
ある。

前以って決められた監視検出反応の成分の結合体の反応
体の活性を束縛相もしくは遊離相同で評価する工程は、
監視検出反応を結合体の反応体と共にその相を形成する
少なくとも一種の物質と接触させ、次いでその反応の特
性を測定することにより、都合良く達成される。監視検
出反応は一つのあるいは一連の複数の化学的に変形もし
くは転換する反応から成る。

結合体中の反応体と共に監視検出反応系を形成する適当
な反応成分は、特定結合反応の開始の前、又はそれと同
時に、あるいはそれに引き続き、単独で或は結合した形
で選ばれた分離された相（分離相）に接触せしめられる
。特定結合反応の開始後、監視検出反応の必須成分の一
部もしくは全てを含む厚志混合物は通常、得られた束縛
相及び遊離相の分離の前の前以って決められた時間培養
される０分離の後、監視検出反応に必要で、未だ選ばれ
た分離相中に充分な量存在していない成分をこれに加え
る。そしてその中の反応体の活性を評価測定して、液体
中の対象物質の存在もしくは量の指標とする。

監視検出反応の反応速度が、選ばれた束縛相もしくは遊
離相中の反応体の活性を評価測定するのに用いられる特
性である時（これが好ましい）には、その速度は通常、
反応体の消失速度もしくは反応生成物の出現速度を測定
することにより決められる。そのような測定は、通常の
クロマトグラフ、重量分析、電位差滴定、分光光度測定
、螢光測定、濁度測定、容量測定等の分析技術を含む広
範囲の種々の方法により行なわれる。本方法は第一とし
て低濃度の対象物質の検出を目的として考えられている
ので、非常に感度の良い反応系が本発明の新規な特定結
合反応系と組合わせて用いるように開発された。

監視検出反応の一つの好ましい形態としては、生物発光
もしくは化学発光の現象を示す反応のように、好ましく
は酵素触媒による発光反応系がある。結合体中の反応体
は光発生反応もしくは酵素によるか又はよらない発光反
応の準備段階の反応の反応体であってもよい。結合体の
反応体の活性は、光発生速度（率）、発生する光の全量
、ピーク強度もしくは性質により評価される。発光反応
系の例としてはＡ表に記されたものが挙げられ、この表
に於いては以下のような省略形が用いられている。

ＡＴＰ　：アデノシン三燐酸 ＡＭＰ　：アデノシンー燐酸 ＮＡＤ　：ニコチンアミド・アデニ／・ノヌクレオチＰ ＮＡＤＨ：還元型のニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチド ＦＭＮ　：フラビン・モノヌクレオチドＦＭＮＨｔ　：
還元型の７ラビン・モノヌクレオチドｈν　：電磁波放
射、通常は赤外、可視或は紫外領域のもの Ａ表 ｈシ±ＡＭＰ＋酸化型ルシフェリン ｈν＋ＦＭＮ＋長鎖酸十Ｈ２Ｏ ＮＡＤ　十ＦＭＮＨ２ ２）ＦＭＮＨ２＋長鎖アルデヒド＋０７１１１）　３’
、　５’−７ノ２り瑣酸＋還元型Ｍグエリン硫酸［有］
リン ２）還元型ルシフェリン＋０．→ｈν ＋酸化型ルシフェリン ｈν　＋　アミノフタル酸（（社）十Ｎｈｖ　＋酸化型
ピロガロール＋Ｈ，０ 酸化酵素 Ｇ、ルミノール＋０．　　　　　　　　　　　　　　ル
ミノールｈシ＋アミノフタル酸（塩）十Ｎ ラクト勺りかヤシ９−−ピ ■、イソルミノール＋Ｈ！０．　　　　　　　　　　　
　　　　　イソルミノールｈシ＋アミノフタル酸Ｃり十
Ｎ Ｊ、イソルミノール＋ＫＯ，−一→　　　　　　　イソ
ルミノールｈシ＋アミノフタル酸（ｔｉｉＪ　＋　Ｎｔ
本発明方法で利用することができる発光反応系に関する
更に詳細な事項及び議論は、次の文献に見られる。

ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２
３６：４８（１９６１） ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイティ
、８９：３９４４（１９６７） コル＝７　（Ｃｏｒｎｉｅｒ　）他＋生物発光の進歩、
ジョンソン他編、プリンストン大学出版部にュー・シャ
ーシー・１９６６）３６３−８４頁 ビー・クライス（Ｋｒｉｅｓ）　　、レニン・ルシフェ
ラーゼ（Ｒｅｎ１ｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の精
製と性質、ジョーシア大学博士論文（１９６７） アメリカン・ジャーナル・オブ・フイジオロジー、４１
：４５４　（１９１６） バイオロジカル・ビュレタン、５１：８９（１９２６）
・ツヤ−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
２４３：４７１４（１９６８） 本発明は、特定結合の相手物質が存在するいかなるハプ
テン又は抗原の検出にも適用することができる。対象物
質は通常、ベゾチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、ス
テロイド、又は生物系内に特定結合の相手物質が存在す
るか或は相手物質を合成することができる他の有機分子
である。この対象物質は、機能面の用語で言えば、抗原
、その抗体、ハプテン（付着体）、その抗体及びビタミ
ン並びにそれらの受容体及び結合物質から成る群より選
ばれる。本発明を用いて検出することのできる対象物質
を特に例示すれば、フェリチン、ブラデキニン、プロス
タグランディン及び腫瘍特異性抗原のような抗原及びハ
プテン；ビオチン、ビタミン８１ｔ％　葉酸、ビタミン
Ｅ及びアスコルビン酸のようなビタミン；ミクロソーム
抗体、肝炎抗体、アレルｒン抗体のような抗体；そして
チロキシン結合グロブリン、アビノン、内因子及びトラ
ンスコバラミンのような特定結合受容体等が挙げられる
。

本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応体の測定
可能な量の活性が維持されるような形で、特定結合物質
（選ばれた分析方法に依り、対象物質、対象物質の特定
の結合に関する類似物質もしくは対象物質の特定結合の
相手物質のいずれかである）に結合もしくは組合わされ
る。反応体と特定結合物質との結合は、活性を有する反
応体を用いる前以って決められた監視検出反応が、上述
の発光反応系及び循環反応系に於けるような結合を化学
的に壊すように設計されていない分析の条件下では、通
常実質的に変更できない。しかし、ある場合には、その
ような結合は、壊されるように設計されるか、あるいは
反応活性の変化を評価するための手段としての選ばれた
監視検出反応により影響を与えられる。

反応体は特定結合物質に直接に組み合わされ結合しても
良く、その結果結合体の分子量は反応体と特定結合物質
の全分子量に等しいか、又は小さくなるようになる。し
かし、通常は、反応体と特定結合物質は、１から５０個
、好ましくは１から１０個の炭素原子もしくは窒素、酸
素、硫黄、燐その他のような複素原子を含む橋かけ基に
より連絡されている。１個の原子を含む橋かけ基の例と
しては、メチレン基（炭素原子１個）及びアミノ基（複
素原子１個）がある。橋かけ基は通常１０００を越えな
い分子量を持っており、好ましくは２００より小さいも
のである。橋かけ基は炭素原子もしくは複素原子の鎖、
もしくはそれらを組合わせたものを含んでおり、通常は
エステル、アミＦ１エーテル、チオエステル、チオエー
テル、アセタール、メチレンもしくはアミノの如き基の
形をした連結基により、反応体と特定結合物質もしくは
その活性誘導体とに結合されている。

本発明の結合体中の反応体は、前以って決められた監視
検出反応の成分として、賦与された（例えば、一定の又
は既知の）反応活性を有する物質である。更に詳しく言
えば、本明細書による開示に於ては、「反応体」及ぎ反
応活性を有する物質」とは、自身とは異なるーもしくは
数個の生成物をもたらす、限定され、かつ測定可能な化
学的な変形（変質）をすることができ、更にその反応体
と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのような化学的
な変形もしくは変質に関与するような他の型の物質）の
如き反応開始手段との相互作用により、電磁的放射、熱
エネルギー、もしくは音波エネルギーをもたらす物質を
意味する。従って本明細書に於いて「反応体」と定義し
た物質群の内には通常の無機及び有機試薬及び生化学的
物質が含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射性
アイソトープのように監視検出反応に於ける反応体でな
いものは除外される。特定の化学物質は化学的環境に従
って種々の形で機能することができるため、一つの化学
物質が種々の異なった分類に分類されることがあるが、
そのような物質が本明細書の開示に於いていかなる機能
を有するかが決定されるのは、本明細書に記された選ば
れた監視検出反応に関するその物質の反応性によるもの
であるということが認識されるであろう。

本発明の一形態として、対象物質が含有されていると考
えられる液体と組合わされる特定結合反応の成分は液体
もしくは固体の形である。本分析方法は、試験管のよう
な標準の実験室用の容器中で、固体もしくは液体の特定
結合反応の成分及びそれに加えられる反応系の成分によ
り実施される。

−もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又は−もし
くは数種の監視検出反応の成分は、担体に包含されてい
ても良い。一つの考え方として担体は、それらの成分の
一種もしくは数種をその内側部分に例えば液体もしくは
ゆるい固体の形で、あるいはその内部表面の被膜の中に
、含有する試験管又はカプセルのような液体保持用容器
でもよい。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性であるマ
トリックスの形態であってもよい。そのようなマトリッ
クスは例えば吸収性紙；重合体のフィルム、膜、けばも
しくは塊状物；ダル及びその他の形である。そのような
形の場合該装置は、試験対象液体を接触させ、特定結合
反応及び／又は監視検出反応を行ない、かつ必要な分離
を行なわしめ、そして得られる応答全観察するために都
合のよい手段を提供する。

試験対象となる液体は天然に存在するが或は人工的に作
られたものであって、ハプテン又は抗原（対象物質）を
含むことが知られているが或は推定されるものである。

通常は生物体の液状物又は、それを希釈もしくは他の処
理を施して得られた液体である。本発明方法により分析
することのできる生物体の液状物には、血清、プラズマ
、尿、羊水、脳液、せきすい液等が含まれる。細胞等の
固体材料もしくは気体状のもの等の他の材料も、固体も
しくは気体を溶解させるか又は固体を抽出する尋の方法
により液体の形にして分析することができる。

先行技術の分析系とは対照的に、結合体中の標識付与物
質の反応活性と同じか又は類似した反応活性を有する物
質を含有する生物体の液体に於ける対象物質を、バック
ブラウンＰに邪魔されることなく分析することができる
。内因性パックグラウンド反応体活性は種々の方法で容
易に除くことができる。生物体の液体は、内因性反応体
活性を選択的に破壊するように処理することができる。

そのような処理としては例えば、内因性活性を化学的に
破壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄剤の破壊作用
を不活性にする処理を行なう処理が挙げられる。

本発明を以下において実施例により説明するが、これら
は本発明を制限するものではない。

実施例１ ニコチンアミド・６−（２−アミノエチルアオノ）・プ
リン・ジヌクレオチドの製造 ニコチンアミＰ・アデニン書ジヌクレオチド（ＮＡＤ）
２ｇを１０ｍ１の水に溶かし、次いで０．６７！のエチ
レンイミンを滴下する。この際、１Ｍ過塩素酸を加える
ことによりｐＨｅ７以下に維持する。

エチレンイミンの滴下が終了した後、ｐＨ’ｅ４゜５に
調整し、２０−２５℃に保持して反応させる。

２４時間毎に０．６−のエチレンイミンを加、ｔ、ｐＨ
全４．５に再調整する。９６時間後に溶液を１０倍体積
量の一１０℃のア七トンに注ぎ、生成した油状物ヲ集め
、エーテルで洗い、フラスコ中の約５０−の水に溶解さ
せる。

得られた溶液をＩＮ水酸化す）　ＩＪウムでｐＨ７，０
−７，５に調整し、これに１グラムの重炭酸ナトリウム
を加える。この溶液に窒素を４−５分通し、次いで１グ
ラムのハイＰロサルファイ［−加える。

フラスコを密封し、室温で４５分間放置する。次に、こ
の溶液を１５分間酸素処理し、水酸化ナトリウムにより
ｐＨを１１．３に調整し、７５℃で１時間加熱する。反
応混合物を室温に冷却し、０．６グラムのトリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタンを加え、次いで５Ｎ塩
酸を用いてｐ）［−７Ｊに調整する。得られた溶液に１
０００国際単位のアルコール脱水素酵素と１−のアセト
アルデヒドを加える。反応混合物の光学濃度の低下ｋ　
３４０　ｎｍで監視し、低下が観察されなくなった時に
ｐＨを３．５に調整する。溶液を１０倍体積量の一１０
℃アセトンに注ぎ、生成した油状物を分離し、エーテル
で洗い、１０−１５−の水に溶解させる。

得られた溶液を、水で平衡にされたセファデックスＧ−
１０（スエーデン国、ウプサラのファーマシア・ニー・
ビーより入手）の２゜５×９０（７）のカラムに導入す
る。１２ｍのフラクションをそれぞれ集める。紫外領域
の最大光学吸収の波長と、その波長での光学密度を、各
々のフラクションについて測定する。また、アルコール
脱水素酵素により還元した後の各々の７２クシヨンの３
４０ｎｍでの光学密度も測定する。２６４ｎｍで光学吸
収の最大値を有し、かつ３４０ｎｍでの光学密度と２６
４ｎｍでの光学密度との比がＯ０５より大きいクラクシ
ョンを集める。集めたものをロータリー・エバポレータ
ーにより１５−２０ｍに濃縮し、水で平衡にされたメタ
エックス１−Ｘ８（米国、カリホルニア、リッチモンド
のバイオ・うＰ・ラデラトリーズから入手）の２．５Ｘ
２８ｍのカラムに通す。

カラムに水を更に加えて集められた物質を洗い、１０−
のフラクションをそれぞれ集める。２６４ｎｍで光学吸
収の最大値を有し、がっ３４０ｎｍでの光学密度と２６
４ｎｍでの光学密度との比が０゜１より大きいフラクシ
ョンを集める。

集めたものを、水で平衡にされたダウエックス５Ｏ−Ｘ
２（米国、カリホルニア、リッチモンド、のバイオ・ラ
ド・うがラドリーズから入手）の５Ｘ４５ｗのカラムに
通す。カラムに水を更に加えて集められた物質を洗い、
２０ゴのフラクションをそれぞれ集める。２６４　ｎｍ
で光学吸収の最大値を有し、かつ３４０　ｎｍ　での光
学密度と２６４ｎｍでの光学密度との比が０．１８より
大きいフラクションを集める。集めたものを４−５−に
濃縮し、以下のように電気泳動法により精製する。

濃縮したものを、液の流れの方向に垂直な幅が１−２釧
の細長いワットマン３ＭＭ　紙（米国、ニューシャーシ
ー、クリフトンのり−ブ・エンジェルから入手）に付け
る。次いで紙をｐＨ６゜０で０．０２Ｍ燐酸ナトリウム
で湿らせる。電気泳動法はサイエンス１２１：８２９（
１９５５）に記載されているデュラム（Ｄｕｒｒｕｍ）
懸垂紙状に従って、電位勾配約８．５チル）　／　ｃｍ
で４−６時間実施される。

目的のピリジン・ジヌクレオチド誘導体の位置は、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９１
：４４７（１９５１）に記載されている方法に従って、
０．５Ｍシアン化ナトリウムを試験紙にスプレーした後
に現われる螢光により決められる。

目的の誘導体を含む領域を紙から切り取り、５０ｄの水
で３回抽出する。ニコチンアミド・６−（２−アミノエ
チルアミノ）・プリン・ジヌクレオチドを含有する得ら
れた抽出液を集め、３−４ｍに濃縮し、次いで一２０℃
に保存する１、実施例２ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドとビオチン
との結合体の製造 実施例１で得たニコチンアミド・６−（２−アミノエチ
ルアミノ）・プリン・ジヌクレオチド２２ダを含有する
１−の水に１６■のビオチンを懸濁させる。数滴の０．
Ｉ　Ｎ水酸化ナトＩＪウムを加えてビオチンの溶解を助
ける。得られた溶液に２４０■の１−シクロヘキシル−
３−（２−モルホリノエチル）−カルがソイオド・メト
−ｐ−）ルエン・スルホネートヲ加え、０．ＩＮ塩酸を
滴下することにより溶液にする。反応混合物を室温で５
時間放置し、次いで１０ｍの一１０℃のア七トンに注ぐ
。

生成した油状物を分離し、５−１０−のエーテルで２度
洗浄し、１−２−の水に溶解させる。得られたものを、
実施例１で述べた紙を用いた電気泳動法により精製する
。シアン化ナトリウムをスプレーすると複数の螢光帯が
表われ、一つは陰極に移動し、他は陽極に移動している
。後者の帯はＮＡＤ−ビオチン結合体を含んでおり、こ
れ會水で抽出し、−２０℃に保存する。

実施例３ ビオチンの競合結合−生物発光分析；得られるピーク光
強度に対するビオチンの量の変動の影響本例で用いられ
た生物発光反応は次の反応に基Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−りがン
ド十アセトアルデヒドＮＡＤ−りがンド＋ＦＭＮＨ２ ルシフェラーゼ （ｅ）ＦＭＮ迅　十長鎖アルデヒド＋ｏ、−−−−−→
ＦＭＮ＋長鎖酸＋Ｈ２Ｏ＋　ｈν ＊　フラビンやモノヌクレオチド Ａ、光発生溶液の製造 反応（ｂ）及び（ｅ）　ｅ行なうだめの光発生溶液は以
下のようにして調製した。

ｐＨ７，０の０．１３Ｍ燐酸緩衝液、０．６７重量％の
牛の血清アルジミン、１５．７μＭのフラビン・モノヌ
クレオチド（ＦＭＮ）及び１３．３ｍＭの酢酸ナトリウ
ムを含有する試薬混合物を調製し、この混合物を一２０
℃で暗中に貯蔵する。５μｔのドデカノールを含んだ５
−の水から成る乳濁液を、光発生溶液を用いる日に調製
する。フォトバクテリウム・フィシエリ（米国、ニュー
シャーシー化、フリーホールト”のウオーシントン・バ
イオケミカル・コーポレイションから入手の酵素）から
抽出し凍結乾燥したルシフェラーゼ’Ｉｋｌ）Ｈ７，３
の０．０１３　Ｍの燐酸緩衝液に加えて濃度２０Ｔｎｇ
／ｍｇとする。

３０分後に、得られた懸濁液を１５００ｘｊ’で１０分
間遠心分離し、塊状物を捨てる。次いで、７５μｔの試
薬混合物、５μｔのドデカノール乳濁液及び２０μｔの
ルシフェラーゼ溶液を一緒にして５分間以内使用の光発
生溶液を調製する。

Ｂ、不溶化結合相手物質の製造 ビオチンに結合親和性を有するアビジンは、次のように
水不溶性高分子化合物ビーズに共有結合させることによ
り不溶化される。

適当量のセファローゼ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ
　（スエーデン、ウプサラの７フーマシア・ニー・ビー
より入手）ヲ、マーチ他の方法（アナリティヵル・バイ
オケミストリー、６０：１４９（１９７４））を用いて
アビジンへの結合に関して活性化する。約４−の活性化
されたセファローゼ４Ｂを８ｄの０．１　Ｍ酒石酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に懸濁させる。この懸濁液に、９．９
単位／岬の活性を有するアビジン６■を含有する３−の
水を加える。アビジン活性の１単位とは、１μｇのビオ
チンと結合することのできるアビジンの量である。得ら
れた反応混合物を７℃で６時間攪拌する。次いでアビジ
ン−結合−セファｏ−ゼ４Ｂｔ’Ｐ別し、１００−の０
．Ｉ　Ｍ重炭酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９，０）で
洗浄し、再び２４０−の０．１　Ｍ　）すｘ−（ヒドロ
キシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０
）中に懸濁させる。

Ｃ対照実験 各々全量０．１９−で、各々０．１　Ｍのトリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液（ｐＨ８
，０）、０．６Ｍのエタノール、０．０１　Ｍのセミカ
ルバジド塩酸塩、及び第１表に示された量もしくは濃度
のＮＡＤ、ＮＡＤ−ビオチン結合体、アビジン−結合−
セファローゼ４Ｂ懸濁液（本例のＢで得られたもの）、
そしてセファローゼ４Ｂ懸濁液（固めたセファローゼ４
Ｂを６０ｒｎｌの０．１　Ｍのトリス−（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液（１）Ｈ８，Ｏ）に
懸濁させて得たもの）をそれぞれ含有する９種類の特定
（％異的）反応混合物を調製する。

この反応混合物を室温で１５分分間中かに振とりする。

次いで、各反応混合物に０．２２国際単位のアルコール
脱水素酵素を加えて還元反応を開始させる。セミカルバ
ジドは反応（ａ）に於いては生成するアセトアルデヒド
と結合してセミカルバゾンとなり、こうして反応（ａ）
　ｅ目的の方向に動かす。

反応混合物を再び室温で１５分間振とりする。

各反応混合物の上澄み１ｏμを容積を、２５℃に２−３
分間あらかじめ保存しておいた前に調製した光発生溶液
１００μｔｔ−含んだ別々のキュベツト（これは、デュ
ポン７６０型生物発光分元々度計（米国、プラウエア州
、ウィルミントンのイー・アイ・デュポン・ド・ヌモー
ル）内に設置すれている）に注入する。

結果を第１表に示す。

対照実験の反応１及び９の結果では、ＮＡＤ及びＮＡＤ
−ビオチン結合体が存在しない場合には、非常にわずか
な光しか発生しないことが示されている。反応２及び３
の結果によれば、遊離のＮＡＤが加えられると光発生反
応が起ること、そして、そのよう彦反応はアビジン−結
合−セファローゼ４Ｂが存在しても殆んど影響を受は力
いことが示されている。反応４．５及び６の結果は、Ｎ
ＡＤ−ビオチン結合体が光発生反応に於いて活性である
こと、発生するピーク光強度は存在するＮＡＤ−ビオチ
ン結合体の量が多くなるほど増大するということ、ソシ
てアビソンー結合−セファローゼ４Ｂが存在すると光発
生を阻害すること、を示している。反応３及び５と反応
７及び８の結果を比較すると、光発生反応は無処理のセ
ファローゼ４Ｂの存在によっては影響を受けないことが
わかる。

Ｄ　分析方法 各々全量０，１９−で、各々０．１Ｍのトリス−（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，
０）、０．６Ｍのエタノール、０．０１　Ｍのセミカル
バジド、及び第２表に示した量及び濃度のＮＡＤ−ビオ
チン結合体、遊離ビオチン及びアビジン−結合−セファ
ローゼ４Ｂ懸濁液をそれぞれ含有する５種類の特定（特
異的）結合反応混合物を更に調製する。

各反応混合物を本例のＣに於ける対照実験反応混合物の
場合と同じ方法で処理する。結果を第２表に示す。

反応１１．１２及び１３の結果は、遊離ビオチンとＮＡ
Ｄ−ビオチン結合体は不溶化アビジンの結合箇所に対し
て効果的に競争すること金示している。これは、発生す
るピーク光強度は存在している遊離ビオチンの量に依存
していることから理解される。反応１０と１４の結果は
、不溶化アビジンが存在しない場合に発生するピーク光
強度は、遊離ビオチンの濃度を大きく変えた場合でも一
定であることを示している。

以上により本例では、液相中のＮＡＤ−ビオチン結合体
の量は、存在している遊離ビオチンの量に対して逆の関
係にあることが示されており、従って本発明の分析方法
と試薬は未知の液体試料中の対象物質（リガンｌ″）の
測定のために有用である。

２８９−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　液体中のハプテン又は抗原を分析するための： （亀）液体を、予め定められた特性を有する標識物質と
   ハプテン若しくは抗原、若しくはそれに対する抗体又は
   それに対する特異的結合の相手物質との結合体からなる
   試薬と接触させる工程、ここで、該試薬と結合反応系を
   生成する対象物質（リガンＶ）が標識化された結合体の
   束縛相又は遊離相を生ずる； （ｂ）該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び （ｃ）分離された層の−における、該液体中のハプテン
   又は抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であって、結合体中の標
   識物質が、化学発光反応の反応体であることを特徴とす
   る分析方法。 ２　該特性が、発生する光の全量又は発生する光のピー
   ク強度を測定することにより測定される特許請求の範囲
   第１項記載の分析方法。 ３　該標識物質がルミノール若しくはイソルミノール又
   はそれらの誘導体である特許請求の範囲Ｍ１項記載の分
   析方法。 ４　液体中のハシテン又は抗原を分析するための： 予め定められた特性を有する標識物質とハプテン若しく
   は抗原、若しくはそれに対する抗体又はそれに対する特
   異的結合の相手物質との結合体からなり、かつ、試薬と
   ハプテン又は抗原が結合反応系を形成して標識化された
   結合体の束縛相又は遊離相を生成し、該束縛相若しくは
   該遊離相のいずれかの特性が、該液体中のハプテン又は
   抗原の量の関数である不均一系免疫分析用の試薬であっ
   て、 結合体中の標識物質が化学発光反応の反応体であること
   を特徴とする試薬。 ５（１）標識物質がハプテン又は抗原と結合している標
   識化された結合体及び（２）へブテン又は抗原に対する
   抗体からなる特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６　担体マトリックス中に包含されてなる特許請求の範
   囲第４項記載の試薬。 ７　該標識物質がルミノール若しくはイソルミノール又
   はそれらの誘導体である特許請求の範囲第４項記載の試
   薬。