CN116183901A - 一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于环糊精‑金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法，属于有机铱络合物加氢催化技术在生物荧光传感领域的应用技术，为解决有机铱络合物加氢催化剂在生物应用中面临的易巯基失活等众多生物相容性问题，本发明采取了以下技术方案：（1）高催化加氢活性有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料M的制备，通过调控材料组装过程中，标记抗体、β‑环糊精、封闭剂以及金刚烷功能化金属铱络合物的修饰顺序，成功解决了金属铱络合物在蛋白标记无检测中容易巯基失活的不可逆问题；（2）在载体上包被抗体A；（3）加入被测抗原生物蛋白标记物；（4）加入有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料M；（5）加入含加氢调控探针的荧光检测液，铱络合物能够催化探针分子产生荧光信号变化，通过测试检测液的荧光强度变化可实现对待测生物蛋白标记物的定量检测。本技术实现了对生物蛋白标记物的快速、灵敏分析，具有操作简便、热稳定性好的优点。

Description

一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白 标记物荧光检测方法
技术领域
本发明涉及有机金属络合物催化、功能材料制备及生物荧光传感技术领域，具体地说，涉及有机金属铱络合物催化加氢反应，有机金属铱络合物及超分子化合物β-环糊精对金纳米颗粒的主客体自组装，进而，涉及有机金属铱络合物功能化金纳米颗粒在生物蛋白标记物检测中的应用。
背景技术
面对人类日益复杂的健康安全问题，以及人们对自身健康的高质量追求，开发更多灵敏、稳定的、适应多种复杂情况的新型疾病检测技术显得尤为重要和迫切。在现有疾病检测技术中，酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）由于其检测成本低，操作简便已经被用于几乎所有疾病的临床应用中，尤其适用于疾病的初期定性诊断与大面积体检。虽然ELISA检测方法拥有众多优点，但受限于酶自身催化活性、热稳定性以及催化底物，该方法在检测灵敏度、稳定性方面仍然面临众多不足，特别是对于癌症早期诊断方面应用相对产品匮乏。基于此，在ELISA检测方法的基础上，探寻高活性、高稳定性的酶替代产品，将有望开发更加灵敏、稳定的疾病检测方法。
本发明开发了一系列高稳定、高催化活性的环糊精-金刚烷化铱络合物自组装标记策略标记纳米颗粒，并采用其代替传统ELISA检测方法中的酶，通过对标记抗体和金刚烷功能化铱络合物对纳米材料的修饰顺序进行严格控制，成功解决了金属铱络合物在检测方法构建中容易巯基失活的不可逆问题，进一步结合与金属铱络合物特异性响应的加氢调控荧光探针，并结合传统的ELISA检测技术，构建了一种高稳定的蛋白标记物荧光检测方法。
发明内容
为解决有机金属铱络合物加氢催化剂在疾病标记物检测应用中易巯基中毒的关键技术问题，本发明研究了一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物的自组装标记策略，以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）作为载体，采用有机金属铱络合物后修饰策略，成功解决了常规封闭剂胎牛血清蛋白BSA对催化剂的影响，进一步结合高灵敏响应的加氢调控荧光探针，以及传统的ELISA分析技术，构建了一种新型的疾病标记物荧光检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
一种环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法。
包括以下步骤：（1）、 环糊精-金刚烷化铱络合物、标记抗体Ab1共同标记纳米材料的制备; （2）、 以酶标板或磁珠作为载体，依次采用包被抗体对其进行包被、封闭剂封闭、进而结合相应的待测抗原；（3）、向步骤（2）所的到的抗原载体材料中加入定量且过量的步骤（1）得到的纳米材料，孵化后得到去除过量的纳米材料；（4）、向步骤（3）所得到的标记材料中加入含有加氢调控荧光探针的荧光检测液，金属铱络合物催化剂能够催化荧光探针分子产生荧光信号，进而通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。
步骤（1）环糊精-金刚烷化铱络合物、标记抗体Ab1共同标记纳米材料的制备，包含如下步骤：1）、以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）为载体，首先与标记抗体Ab1以一定比例直接混合修饰或采用缩合剂(1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDCI、N-羟基琥珀酰亚胺NHS)活化后偶联，得到Ab1标记的纳米材料AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1；2）、将AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1进一步与巯基或双硫键或氨基功能化β-环糊精混合振荡2到24小时，接着采用封闭剂胎牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温进行孵化封闭后得到环糊精功能化的Ab1标记的金纳米颗粒 AuNPs-Ab1@CD或AgNPs-Ab1@CD或PS-Ab1@CD或SiO2-Ab1@CD；3）、将AuNPs-Ab1@CD或AgNPs-Ab1@CD 或PS-Ab1@CD或SiO2-Ab1@CD在金刚烷化铱络合物溶液中孵化1-24小时，得到环糊精-金刚烷主客体修饰的铱络合物标记纳米材料AuNPs-Ab1@CD@Ir或AgNPs-Ab1@CD@Ir或PS-Ab1@CD@Ir或SiO2-Ab1@CD@Ir;
相应的蛋白标记物的分析包括如下步骤：
4）、在载体酶标板或磁性纳米颗粒上负载包被抗体Ab2，并用封闭蛋白BSA进行孵化封闭，得到Ab2负载的载体材料S@Ab2；
5）、在一定浓度的S@Ab2缓冲溶液中，加入待测蛋白AG，使待测蛋白AG与载体上的包被抗体Ab2特异性结合得到S-Ab2@AG；
6）、在S-Ab2@AG中加入步骤3）得到的铱络合物标记纳米颗粒AuNPs-Ab1@CD@Ir或AgNPs-Ab1@CD@Ir或PS-Ab1@CD@Ir或SiO2-Ab1@CD@Ir，实现铱络合物对待测蛋白AG的标记。
7）、向步骤6得到的标记材料中，加入含有氧化还原荧光探针和氢源（甲酸或甲酸钠或甲酸钾或甲酸铵或甲酸三乙胺或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（还原型）NADH）的荧光检测液，在0-100摄氏度温度，孵化反应0-120分钟后，测试溶液的荧光强度变化，从而实现对待测蛋白AG的定量检测。
根据权利要求1所述的“一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法”中，其步骤1) 所述纳米颗粒均为单分散型纳米颗粒，直径为1 nm-5000 nm，形貌包括球形或棒状或菱形。纳米材料包括金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2），其中，聚苯乙烯微球和二氧化硅微球表面需包含氨基、羧基、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺等活性官能团。
根据权利要求1所述的“一种环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法”中，其特征在于：步骤3）所述的金刚烷功能化铱络合物，其结构中均包含有金刚烷官能团，能够与β-环糊精形成牢固的主客体结合体。所述金属催化剂的阴离子形式为氟硼酸根离子（BF4-）或六氟磷酸根离子（PF6-）或硫酸根离子（SO4 2-）或硝酸根离子（NO3-）、氟离子（F-）或氯离子（Cl-）或溴离子（Br-）或碘离子（I-），所述金属催化剂配体包括但不限于氮氮类配体（1, 10-菲啰啉或2, 2’-二联吡啶或2, 2’-二联嘧啶或2-吡啶苯酰胺或2-吡啶苯磺酰胺或2-喹啉苯酰胺或2-喹啉苯磺酰胺）和碳氮类配体（1-苯基吡唑或苯基亚胺或苯基吡啶或苯基咪唑或苯并喹啉）。
所述金刚烷金属铱络合物的结构包含如下结构中的一种或几种：
Figure SMS_1
4.根据权利要求1所述的“一种环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法”中，其特征在于，所述荧光信号的产生放大为，铱络合物催化氧化还原型荧光探针发生加氢还原反应产生，所述荧光探针分子中均含有氧化官能团（苯醌或萘醌或蒽醌或硝基或羰基或烟酰胺盐或醛基或吡啶盐），并且当荧光探针分子中的氧化官能团被加氢还原为相应的还原态（苯二酚或萘二酚或蒽二酚或氨基或羟基或烟酰胺盐或甲羟基或二氢吡啶）后，探针会产生明显的荧光增强或减弱。荧光发色团主要包括：香豆素类、罗丹明、氧杂蒽类、萘二甲酰亚胺类、苯并恶唑类、二苯乙烯类、噻吩二羧酸酰胺类、稠环芳烃类、苝四甲酰亚胺类。
所述加氢还原调控荧光探针，主要包含如下所示结构中的一种或几种的组合：
Figure SMS_2
5.根据权利要求1所述的“一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法”中，其特征在于，步骤3与步骤4的顺序不能颠倒，必须保证采用胎牛血清蛋白（BSA）或或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温封闭完成后，方可引入金刚烷功能化金属铱络合物。
6. 根据权利要求1所述的“一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法”中，其特征在于，步骤7）中所述氧化还原荧光检测液的组成为：有机溶剂（包括二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF或乙醇或甲醇或乙腈或二氧六环）10-90%（V/V），水90-10%（V/V），有机溶剂与水的体积和为100%（V/V）；最终浓度在 1-1000 μM的氧化还原荧光探针分子；最终浓度为10-1000 mM的甲酸、最终浓度为10-1000 mM的甲酸钠；pH为1-12。
有益效果
本发明利用金刚烷与环糊精的主客体相互作用，通过调整金属铱络合物催化剂对标记材料的修饰顺序，有效解决了封闭剂对金属催化剂的抑制失活问题。进一步结合加氢调控型荧光探针，以及传统的ELISA检测策略，建立了灵敏、稳定的生物蛋白标记物荧光检测方法。
本发明的目的在于针对传统免疫检测技术中存在的不足，突破有机金属络合物在疾病检测方法构建中的应用技术瓶颈，开发新型的蛋白标记物荧光检测方法。基于传统的蛋白免疫反应，以高加氢活性、高稳定的金属铱络合物标记纳米材料代替商品化方法中的酶，并引入灵敏的加氢还原荧光调控体系，提供了一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法。本检测方法能够实现对检测样品的灵敏、稳定检测，具有操作简便、检测快速、准确性好、成本低的优点，可在生物标记蛋白体外检测及临床研究中发挥重要作用，其优点主要有：
（1）采用环糊精-金刚烷化铱络合物主客体偶联策略，通过金属铱络合物后修饰策略，可成功解决封闭剂导致的络合物催化剂中毒问题。从而突破了金属铱络合物加氢催化剂在疾病检测方法构建中的应用技术瓶颈。
（2）利用稳定、高活性的金属铱络合物催化加氢反应代替传统的酶催化过程，由于金属催化剂具有更好的热稳定性、更小的分子结构，可通过调反应变温度，从而缩短反应时间，在生物蛋白标记物体外检测中发挥重要作用。
本发明以高效、稳定的金属铱络合物催化加氢还原反应为基础，合理引入环糊精-金刚烷化铱络合物主客体偶联策略，解决了封闭剂导致的络合物催化剂中毒问题；进一步结合加氢调控型荧光探针，建立了一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测新方法。
附图说明
图1为有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备流程图，图中的标号分别为：
1、标记纳米材料； 2、标记抗体； 3、标记抗体修饰纳米材料；4、6-单巯基β-环糊精； 5、标记抗体和环糊精共修饰纳米材料； 6、封闭剂；7、封闭的标记抗体和环糊精共修饰纳米材料；8、金刚烷功能化的有机铱络合物；9、有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料。
图2为采用磁珠作为包被抗体、抗原载体，基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法的应用流程图，图中的标号分别为：
1、磁珠； 2、包被抗体； 3、抗原；
4、有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料； 5、加氢调控荧光探针。
图3为采用酶标板作为包被抗体、抗原载体，基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法的应用流程图，图中的标号分别为：
1、酶标板； 2、包被抗体； 3、抗原；
4、有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料； 5、加氢调控荧光探针。
具体实施方式
以下结合附图继续介绍本发明一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法的具体实施方式。应当指出，本发明的实施不限于以下所述的实施方式。
1)图1所示的流程具体为：纳米材料1首先与标记抗体2以一定比例直接混合修饰或采用缩合剂(1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDCI、N-羟基琥珀酰亚胺NHS)活化后偶联，得到标记抗体修饰纳米材料3；进一步与巯基或双硫键或氨基功能化β-环糊精4混合振荡2到24小时得到标记抗体和环糊精共修饰纳米材料5；接着采用封闭剂胎牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温6进行孵化封闭后得到封闭的标记抗体和环糊精共修饰纳米材料7；最后将得到的纳米材料7在金刚烷化铱络合物8溶液中孵化1-24小时，得到有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料9。
2)图2所示的流程具体为：
首先，将包被抗体2通过化学反应连接在磁珠1上；接着，包被抗体2固定的磁珠能够特异性的结合被测抗原3，并进而与有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料4相结合；通过有机铱络合物与抗原的对应关系，越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂，同时单个有机铱络合物又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号，从而实现对抗原的标记及信号放大；最后，向有机铱络合物标记的磁珠1中加入检测液（检测液包含加氢还原荧光“开-关”型探针分子5，氢源甲酸或甲酸钠或甲酸铵），通过检测检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
图3所示的流程具体为：
首先，将包被抗体2通过化学吸附连接在酶标板1上；接着，包被抗体2固定的酶标板能够特异性的结合被测抗原3，并进而与有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料4相结合；通过有机铱络合物与抗原的对应关系，越多的抗原可以结合更多的过渡金属催化剂，同时单个有机铱络合物又可催化大量荧光探针分子产生荧光信号，从而实现对抗原的标记及信号放大；最后，向有机铱络合物标记的酶标板1中加入检测液（检测液包含加氢还原荧光“开-关”型探针分子5，氢源甲酸或甲酸钠或甲酸铵），通过检测检测液的荧光强度可实现对抗原3的定量检测。
以下实施例中，参考以上附图的，其流程与相应附图所示流程相同。
实施例1
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在甲胎蛋白（AFP）检测中的应用（实施流程可参考图1和图2）。参考图1，纳米材料1为直径为5nm至200nm之间的金纳米颗粒，标记抗体为多克隆AFP抗体2，所用组装环糊精4为6-单巯基-β-环糊精，所用封闭剂6为胎牛血清蛋白BSA，所用的金刚烷功能化金属铱络合物为[(η 5-C5Me5)Ir(Adamantan-2yl-picolinamide)Cl]Ir-1。参考图2，所采用磁珠1为50-500 nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等，所用包被抗体2为单克隆AFP抗体，所使用的荧光探针为Probe-1（加氢还原后，探针激发波长为550nm，发射波长为676nm）。抗原3采用AFP抗原，所述检测液为含有加氢调控荧光探针Probe-1的荧光检测液。
以下结合附图1对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备（以金纳米颗粒为例进行说明）
①取2.0 mL金纳米颗粒1转移到5 mL离心管中，分离除去上清液，接着，向装有金纳米颗粒1的离心管中加入50-200μg标记抗体2，25℃孵化2至10小时。
②向上述金纳米颗粒溶液中继续加入2mL 浓度为0.5 mM的6-单巯基-β-环糊精水溶液，继续25℃孵化2-10小时。
③不经分离，继续向上述溶液中加入2mL质量浓度为2%的封闭剂胎牛血清蛋白BSA，继续25℃孵化2小时，后转移至4℃冰箱，保存过夜；
④上述封闭过的金纳米颗粒，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-1水溶液，继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
采用其他金刚烷化铱络合物Ir-2、Ir-3、Ir-4、Ir-5、Ir-6、Ir-7、Ir-8、Ir-9、Ir-10、Ir-11、Ir-12、Ir-13、Ir-14、Ir-15、Ir-16制备有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备流程与上述步骤相同，所不同之处如下：
④上述封闭过的金纳米颗粒，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-2或Ir-3或Ir-4或Ir-5或Ir-6或Ir-7或Ir-8或Ir-9或Ir-10或Ir-11或Ir-12或Ir-13或Ir-14或Ir-15或Ir-16溶液（含10-20 v/v% 二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF的水溶液），继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
以下结合附图2对具体步骤进行说明：
（2）包被抗体偶联磁珠的制备（以氨基磁珠为例进行说明）
① 取500 μL氨基磁珠1转移到1.5 mL离心管中，磁性分离除去上清液，然后加入1.0 mL 10%-20% 戊二醛水溶液，避光条件下，25℃振荡0.5-10小时，期间应保持磁珠1的悬浮状态；
②磁性分离除去过量的戊二醛，并水洗3次后，向装有磁珠1的离心管中加入50-200 μg包被抗体（可添加0.01-0.05 %的Tween 20以提高磁珠1的分散性），轻摇至混匀，并置于25℃条件下，振荡0.5-10小时，期间应保持磁珠1的悬浮状态；
③不经分离，向磁珠溶液中加入100μL -1000μL 牛血清白蛋白（BSA）与磷酸盐缓冲溶液（pH = 7.0-8.0，含1-10 %的BSA）重悬磁珠1，25 ℃条件下反应1.0-24小时，用以封闭磁珠1表面的非特异性反应位点；封闭完成后，将装有磁珠的离心管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，每次用1000μL含有0.1%吐温20的磷酸盐缓冲溶液PBST洗涤3次以上，并重新悬浮于保存液中，于4℃条件下保存备用。
羧基磁珠偶联包被抗体的步骤与氨基磁珠偶联配体的步骤（2）基本相同，不同的是：
①将购买的羧基修饰磁珠混合均匀后，取500 μL羧基磁珠1转移到1.5 mL离心管中，磁性分离除去上清液，用200 μL PBS溶液（50 mM PBS, pH = 7.4）进行磁性分离洗涤2次。然后将新鲜配制的500 μL N-羟基琥珀酰亚胺水溶液（0.1-0.5 M）NHS和500 μL N-羟1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液（0.1-1 M）EDCI加入到离心管中，漩涡混匀使磁珠1充分悬浮，后置于25 ℃条件下反应1-5小时，期间应保持磁珠1的悬浮状态。
步骤②、③的内容与氨基磁珠偶联包被抗体的步骤（2）相同。
环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠偶联配体的步骤相同，与氨基磁珠偶联配体的步骤（2）不同的是，步骤②、③的内容与氨基磁珠偶联包被抗体的步骤（2）相同。
（3）制备检测液。
①以探针Probe-1作为加氢调控荧光探针，探针分子Probe-1的荧光调控机理如下：
Figure SMS_3
，
探针Probe-1因其中结构中氧化态官能团三甲基对苯醌的分子内电子转移作用，导致其荧光团荧光淬灭；然而，当其分子结构中的醌被还原为对苯酚后，探针分子中的酰胺键便会发生断裂，探针分子内荧光底物二氰基异佛尔酮分子内电子转移荧光淬灭效应破坏，分子产生强的荧光信号。
注：探针Probe-2、Probe-4、Probe-5、Probe-7、Probe-8的荧光响应机理与Probe-1类似，不同之处在于探针的荧光底物不同，Probe-2的荧光底物为酚羟基二氰基异佛尔酮、Probe-4的荧光底物为4-甲基-7-氨基香豆素、Probe-5的荧光底物为7-羟基香豆素、Probe-5的荧光底物为罗丹明110、Probe-8的荧光底物为萘二酰亚胺。
②检测液的配置。
将探针分子Probe-1溶于二氧六环dioxane与水的混合溶剂（含10 %-90 %dioxane）中，使探针分子Probe-1的最终浓度保持在 1-1000 μM，接着向混合溶剂中分别加入甲酸或甲酸钠或甲酸铵，保持溶液中甲酸根离子的最终浓度为10-1000 mM之间，调节混合液pH = 3-10，探针液置于4 ℃条件下保存备用。
（4）以甲胎蛋白抗原（AFP）为例进行免疫检测
①取AFP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的抗原AFP 3，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
②用PBST溶液清洗步骤①的磁珠1 2-5次，加入50-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，37 ℃条件下孵育1-3 小时。
③用PBST溶液清洗步骤②的磁珠1 2-5次，加入100 μL步骤（3）配置的检测液，30-60 ℃反应5-60 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行荧光测试。
实施例1中荧光强度的表征意义
（1）甲胎蛋白抗原AFP浓度越高，意味着载体磁珠能够结合更过的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，加入检测液后，在相同条件下，可催化更多的探针分子Probe-1发生加氢还原，荧光打开，产生更强的荧光强度。
（2）当甲胎蛋白抗原AFP浓度较低或者浓度为0时，载体磁珠所结合的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料浓度也会相对较低或者为0，从而只有较少量的探针分子Probe-1能够发生加氢还原或者没有探针分子Probe-1发生还原，检测液产生的荧光强度也会相对较弱或者没有荧光。
（3）因此，本发明能利用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料在对肝癌标记物甲胎蛋白抗原（AFP）的检测中实现用荧光法检测。
实施例2
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在血清实际样本检测中的应用（流程可参考附图2），采用氨基磁珠1为载体材料，所用包被抗体2为单克隆AFP包被抗体，所用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料中标记抗体为多克隆AFP标记抗体，有机铱络合物为Ir-2，所使用探针为Probe-3，抗原3采用人血清样本，所述检测液为含有Probe-3的荧光检测液。以下结合附图2对具体步骤进行说明：
其步骤基本同实施例1。
实施例2与实施例1所不同的是：实施例2步骤（3）、（4）的基本内容为：
（3）制备检测液。
①以探针Probe-3作为加氢调控荧光探针，探针分子Probe-3的荧光调控机理如下：
Figure SMS_4
，
探针Probe-3因其中结构中氧化态官能团N-甲基吡啶盐的分子内电子转移作用，导致其荧光团荧光淬灭；然而，当其分子结构中的N-甲基吡啶盐被还原为N-甲基-4-二氢吡啶后，探针荧光底物分子内电子转移荧光淬灭效应破坏，分子产生强的荧光信号。
②检测液的配置。
将探针分子Probe-3溶于水溶液中，使探针分子Probe-3的最终浓度保持在 1-1000 μM，接着向混合溶剂中分别加入甲酸或甲酸钠或甲酸铵，保持溶液中甲酸根离子的最终浓度为10-1000 mM之间，调节混合液pH = 6-10，探针液置于4 ℃条件下保存备用。
（4）以人体血清样本为例进行免疫检测
①取AFP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的人体血清，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
步骤（4）②、③的内容同实施例1。
检测实施例2中荧光强度的表征意义
（1）阳性样本——当人体血清样本甲胎蛋白含量较高时（>25 µg/L），显示较强的荧光强度，由此可判断该血清样本可能来自肝癌病人。而阴性样本——当人体血清样本甲胎蛋白含量较低时（<25 µg/L），由于甲胎蛋白含量较少，荧光强度非常弱，由此可判断该血清样本应该来自正常人。
（2）通过与甲胎蛋白的浓度标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中甲胎蛋白的含量。
（3）实施例2证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料引起的检测液荧光强度的变化，能实现实际血清样本的检测。
实施例3
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在癌胚抗原（CEA）检测中的应用（流程可参考图3），所用酶标板1为聚苯乙烯材料的酶标板，所用抗体2为单克隆CEA包被抗体，所用封闭剂6为胎牛血清蛋白BSA，所用的金刚烷功能化金属铱络合物为[(η5-C5Me5)Ir(Ada-quinoline-2-amide)Cl]Ir-3。参考图2，所采用酶标板作为癌胚抗原、抗体载体，所用包被抗体2为单克隆CEA抗体，所使用的荧光探针为Probe-6（加氢还原后，探针激发波长为470nm，发射波长为530 nm）。抗原3采用CEA抗原，所述检测液为含有加氢调控荧光探针Probe-6的检测液。
以下结合附图3对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备流程参照图1进行，（以氨基化二氧化硅微球为例进行说明）
①取2.0 mL氨基化二氧化硅纳米颗粒1转移到5 mL离心管中，离心分离除去上清液，加入3mL 10%-20%戊二醛水溶液，25℃孵化2至10小时后，离心除去过量的戊二醛，并用水清洗3次以上；
②向①所的到的装有二氧化硅微球1的离心管中加入50-200μgCEA标记抗体2，25℃继续孵化2至10小时；
③向②所得到的装有二氧化硅微球1的离心管中加入2.0 mL 浓度为0.5 mM的6-单胺基-β-环糊精水溶液，继续25℃孵化2-10小时;
④离心除去过量的环糊精和标记抗体后，向溶液③中加入2.0 mL质量浓度为2%的封闭剂胎牛血清蛋白BSA，继续25℃孵化2小时，后转移至4℃冰箱，保存过夜；
⑤上述封闭过的二氧化硅纳米颗粒，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-3溶液（含10 %-90 % 有机溶剂DMF），继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
采用其他金刚烷化铱络合物Ir-1、Ir-2、Ir-4、Ir-5、Ir-6、Ir-7、Ir-8、Ir-9、Ir-10、Ir-11、Ir-12、Ir-13、Ir-14、Ir-15、Ir-16制备有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备流程与上述步骤相同，所不同之处如下：
④上述封闭过的金纳米颗粒，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-1或Ir-2或Ir-4或Ir-5或Ir-6或Ir-7或Ir-8或Ir-9或Ir-10或Ir-11或Ir-12或Ir-13或Ir-14或Ir-15或Ir-16溶液（含10-20 v/v% 二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF的水溶液），继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
（2）采用酶标板1作为癌胚抗原CEA抗原、抗体的载体。所述酶标板1可采用96孔酶标板、48孔酶标板、384孔酶标板等不同孔数的酶标板，酶标板均包含可拆与不可拆两种型号，酶标板的颜色包含黑色、白色以及无色透明色。
（3）制备检测液。
①以探针Probe-6作为加氢调控荧光探针，探针分子Probe-6的荧光调控机理如下：
Figure SMS_5
，
探针Probe-6因其中结构中氧化态官能团醛基的分子内电子共振效应，导致其荧光团荧光较强；然而，当其分子结构中的醛基被还原为甲羟基后，探针荧光底物分子内电子共振效应减弱，分子荧光信号减弱。
②检测液的配置。
将探针分子Probe-6溶于（含1.0 %-20 % 有机溶剂DMF）水溶液中，使探针分子Probe-6的最终浓度保持在 1-1000 μM，接着向混合溶剂中分别加入甲酸或甲酸钠或甲酸铵，保持溶液中甲酸根离子的最终浓度为10-1000 mM之间，调节混合液pH = 6-10，探针液置于4 ℃条件下保存备用。
（4）以癌胚抗原(CEA)为例进行免疫检测
①将单克隆抗体2 CEA（1.0-4.0 μg·mL-1）溶于pH = 9.6的碳酸盐缓冲液中，在酶标板1的每个孔中加入50-150μL的上述溶液，4 ℃条件下过夜；
②用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤①的酶标板3-5次，接着，加入100-400 μL1 %的牛血清白蛋白（BSA）封闭；
③用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤②的酶标板3-5次，加入不同浓度的癌胚抗原（AFP），在37 ℃条件下孵育1-3 小时。
④用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤③的酶标板3-5次，加入100-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，在37 ℃条件下孵育1-3 小时；
⑤用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤④的酶标板3-5次，加入100 μL步骤（2）制备的检测液，20-100℃反应10-100 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行定量检测。
检测实施例3中荧光强度的表征意义（检测原理）
（1）癌胚抗原CEA浓度较高时，意味着载体磁珠能够结合更过的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，加入检测液后，在相同条件下，可催化更多的探针分子Probe-6发生加氢还原，荧光打开，产生更强的荧光强度。
（2）当癌胚抗原CEA浓度较低或者浓度为0时，载体磁珠所结合的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料浓度也会相对较低或者为0，从而只有较少量的探针分子Probe-6能够发生加氢还原或者没有探针分子Probe-6发生还原，检测液产生的荧光强度也会相对较弱或者没有荧光。
（3）因此，本发明能利用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料在对广谱的癌症标记物CEA的检测中实现用荧光法检测。
实施例4
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在血清实际样本检测中的应用（流程可参考附图3），采用酶标板1为载体材料，所用包被抗体2为单克隆CEA包被抗体，所用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料中标记抗体为多克隆CEA标记抗体，有机铱络合物为Ir-3，所使用探针为Probe-6，抗原3采用人血清样本，所述检测液为含有Probe-6的荧光检测液。以下结合附图2对具体步骤进行说明：
其步骤基本同实施例3。
以下结合附图3对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备（以氨基二氧化硅微球为载体，同实施例3）；
（2）所使用酶标板（同实施例3）
（3）制备检测液（同实施例3）。
（4）以癌胚抗原(CEA)为例进行免疫检测
①将单克隆抗体2 CEA（1.0-4.0 μg·mL-1）溶于pH = 9.6的碳酸盐缓冲液中，在酶标板1的每个孔中加入50-150μL的上述溶液，4 ℃条件下过夜；
②用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤①的酶标板3-5次，接着，加入100-400 μL1 %的牛血清白蛋白（BSA）封闭；
③用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤②的酶标板3-5次，加入不同浓度的人体血清，在37 ℃条件下孵育1-3 小时。
④用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤③的酶标板3-5次，加入100-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
⑤用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗步骤④的酶标板3-5次，加入100 μL步骤（2）制备的检测液，20-100℃反应10-100 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行定量检测。
检测实施例2中荧光强度的表征意义
（1）阳性样本——当人体血清样本癌胚抗原(CEA)含量较高时，显示较强的荧光强度，由此可判断该血清样本可能来自癌症病人。而阴性样本——当人体血清样本癌胚抗原(CEA)含量较低时，由于癌胚抗原(CEA)含量较少，荧光强度非常弱，由此可判断该血清样本应该来自正常人。
（2）通过与癌胚抗原(CEA)的浓度标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中癌胚抗原(CEA)的含量。
（3）实施例4证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料引起的检测液荧光强度的变化，能实现实际血清样本的检测。
实施例5
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在C反应蛋白（CRP）检测中的应用（实施流程可参考图1和图2）。参考图1，纳米材料1为直径为5nm至200nm之间的氨基聚苯乙烯微球，标记抗体为多克隆CRP抗体2，所用组装环糊精4为6-氨基-β-环糊精，所用封闭剂6为胎牛血清蛋白BSA，所用金刚烷功能化金属铱络合物为[(η 5-C5Me5)Ir(Adamantan-bipyridine)Cl]Ir-4。参考图2，所采用磁珠1为50-500 nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等，所用包被抗体2为单克隆CRP抗体，所使用的荧光探针为Probe-9（加氢还原后，探针激发波长为465nm，发射波长为530nm）。抗原3采用CRP抗原，所述检测液为含有加氢调控荧光探针Probe-9的荧光检测液。
以下结合附图1对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备（以氨基聚苯乙烯微球为例进行说明）
① 取2.0 mL氨基聚苯乙烯微球1转移到5 mL离心管中，离心分离除去上清液，加入3mL 10%-20%戊二醛水溶液，25℃孵化2至10小时后，离心除去过量的戊二醛，并用水清洗3次以上；
②向①所的到的装有聚苯乙烯微球1的离心管中加入50-200μg CRP标记抗体2，25℃继续孵化2至10小时；
③向②所得到的装有聚苯乙烯微球1的离心管中加入2.0 mL 浓度为0.5 mM的6-单胺基-β-环糊精水溶液，继续25℃孵化2-10小时;
④离心除去过量的环糊精和标记抗体后，向溶液③中加入2.0 mL质量浓度为2%的封闭剂胎牛血清蛋白BSA，继续25℃孵化2小时，后转移至4℃冰箱，保存过夜；
⑤上述封闭过的聚苯乙烯微球，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-4水溶液，继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
采用其他金刚烷化铱络合物Ir-1、Ir-2、Ir-3、Ir-5、Ir-6、Ir-7、Ir-8、Ir-9、Ir-10、Ir-11、Ir-12、Ir-13、Ir-14、Ir-15、Ir-16制备有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备流程与上述步骤相同，所不同之处如下：
⑤上述封闭过的金纳米颗粒，经离心、含有吐温20的磷酸缓冲溶液PBST清洗（3-6次），接着加入2mL浓度为0.1mM的金刚烷化铱络合物Ir-1或Ir-2或Ir-3或Ir-5或Ir-6或Ir-7或Ir-8或Ir-9或Ir-10或Ir-11或Ir-12或Ir-13或Ir-14或Ir-15或Ir-16溶液（含10-20 v/v% 二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF的水溶液），继续25℃孵化24小时，离心除去过量的铱络合物，转移至4℃冰箱保存。
（2）抗体偶联磁珠的制备流程（同实施例1）
（3）制备检测液。
①以探针Probe-9作为加氢调控荧光探针，探针分子Probe-9的荧光调控机理如下：
Figure SMS_6
，
探针Probe-9因其中结构中氧化态官能团硝基的分子内电子转移效应，导致其荧光团荧光较弱；然而，当其分子结构中的硝基被还原为氨基后，探针荧光底物分子内电子转移效应减弱，分子荧光信号增强。
②检测液的配置。
将探针分子Probe-9溶于（含1.0 %-20 % 有机溶剂DMSO）水溶液中，使探针分子Probe-9的最终浓度保持在 1-1000 μM，接着向混合溶剂中分别加入甲酸或甲酸钠或甲酸铵，保持溶液中甲酸根离子的最终浓度为10-1000 mM之间，调节混合液pH = 6-10，探针液置于4 ℃条件下保存备用。
（4）以C-反应蛋白（CRP）为例进行免疫检测
①取CRP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的抗原CRP 3，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
②用PBST溶液清洗步骤①的磁珠1 2-5次，加入50-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，37 ℃条件下孵育1-3 小时。
③用PBST溶液清洗步骤②的磁珠1 2-5次，加入100 μL步骤（3）配置的检测液，30-60 ℃反应5-60 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行荧光测试。
实施例5中荧光强度的表征意义
（1）C-反应蛋白抗原（CRP）浓度越高，意味着载体磁珠能够结合更过的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，加入检测液后，在相同条件下，可催化更多的探针分子Probe-9发生加氢还原，荧光打开，产生更强的荧光强度。
（2）当C-反应蛋白抗原（CRP）浓度较低或者浓度为0时，载体磁珠所结合的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料浓度也会相对较低或者为0，从而只有较少量的探针分子Probe-9能够发生加氢还原或者没有探针分子Probe-9发生还原，检测液产生的荧光强度也会相对较弱或者没有荧光。
（3）因此，本发明能利用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料在对炎症标记物C-反应蛋白抗原（CRP）的检测中实现用荧光法检测。
实施例6
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在血清实际样本检测中的应用（流程可参考附图2），采用磁珠1为载体材料，所用包被抗体2为单克隆CRP包被抗体，所用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料中标记抗体为多克隆CRP标记抗体，有机铱络合物为Ir-4，所使用探针为Probe-9，抗原3采用人血清样本，所述检测液为含有Probe-9的荧光检测液。以下结合附图2对具体步骤进行说明：
其步骤基本同实施例5。
以下结合附图2对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备（以氨基聚苯乙烯微球为载体，同实施例5）；
（2）所使用酶标板（同实施例5）
（3）制备检测液（同实施例5）。
（4）以炎症标记物(CRP)为例进行免疫检测
①取CRP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的人体血清样品，在37 ℃条件下孵育1-3 小时；
②用PBST溶液清洗步骤①的磁珠1 2-5次，加入50-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，37 ℃条件下孵育1-3 小时。
③用PBST溶液清洗步骤②的磁珠1 2-5次，加入100 μL步骤（3）配置的检测液，30-60 ℃反应5-60 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行荧光测试。
检测实施例2中荧光强度的表征意义
（1）阳性样本——当人体血清样本C-反应蛋白抗原（CRP）含量较高时，显示较强的荧光强度，由此可判断该血清样本可能来自炎症病人。而阴性样本——当人体血清样本C-反应蛋白抗原（CRP）含量较低时，由于C-反应蛋白抗原（CRP）含量较少，荧光强度非常弱，由此可判断该血清样本应该来自正常人。
（2）通过与C-反应蛋白抗原（CRP）的浓度标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中C-反应蛋白抗原（CRP）的含量。
（3）实施例6证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料引起的检测液荧光强度的变化，能实现实际血清样本的检测。
实施例7
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在前列腺特异抗原（PSA）检测中的应用（实施流程可参考图1和图2）。参考图1，纳米材料1为直径为5nm至200 nm之间的金纳米颗粒，标记抗体为多克隆PSA抗体2，所用组装环糊精4为6-单巯基-β-环糊精，所用封闭剂6为胎牛血清蛋白BSA，所用的金刚烷功能化金属铱络合物为[(η 5-C5Me5)Ir(Adamantan-2yl-picolinamide)Cl]Ir-1。参考图2，所采用磁珠1为50-500 nm羧基磁珠、氨基磁珠、环氧基磁珠以及链霉亲和素磁珠等，所用包被抗体2为单克隆PSA抗体，所使用的荧光探针为Probe-1（加氢还原后，探针激发波长为550nm，发射波长为676nm）。抗原3采用PSA抗原，所述检测液为含有加氢调控荧光探针Probe-1的荧光检测液。
以下结合附图1对具体步骤进行说明：
（1）有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料的制备（以金纳米颗粒为标记材料，同实施例1）；
（2）包被抗体偶联磁珠的制备（以羧基磁珠为载体，同时实施例1）；
（3）制备检测液(同时实施例1）。
（4）以前列腺特异抗原（PSA）为例进行免疫检测
①取PSA的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的抗原PSA 3，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
②用PBST溶液清洗步骤①的磁珠1 2-5次，加入50-200 μL步骤（1）制备的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，37 ℃条件下孵育1-3 小时。
③用PBST溶液清洗步骤②的磁珠1 2-5次，加入100 μL步骤（3）配置的检测液，30-60 ℃反应5-60 min后，通过荧光光谱仪或荧光酶标仪进行荧光测试。
实施例7中荧光强度的表征意义
（1）前列腺特异抗原（PSA）浓度越高，意味着载体磁珠能够结合更过的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料，加入检测液后，在相同条件下，可催化更多的探针分子Probe-1发生加氢还原，荧光打开，产生更强的荧光强度。
（2）当前列腺特异抗原（PSA）浓度较低或者浓度为0时，载体磁珠所结合的有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料浓度也会相对较低或者为0，从而只有较少量的探针分子Probe-1能够发生加氢还原或者没有探针分子Probe-1发生还原，检测液产生的荧光强度也会相对较弱或者没有荧光。
（3）因此，本发明能利用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料在对前列腺癌标记物前列腺特异抗原（PSA）的检测中实现用荧光法检测。
实施例8
一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法在血清实际样本检测中的应用（流程可参考附图2），采用氨基磁珠1为载体材料，所用包被抗体2为单克隆PSA包被抗体，所用有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料中标记抗体为多克隆AFP标记抗体，有机铱络合物为Ir-1，所使用探针为Probe-1，抗原3采用人血清样本，所述检测液为含有Probe-1的荧光检测液。以下结合附图2对具体步骤进行说明：
其步骤基本同实施例7。
实施例8与实施例7所不同的是：实施例7步骤（3）、（4）的基本内容为：
（3）制备检测液（同实施例7）；
（4）以人体血清样本为例进行免疫检测
①取PSA的单克隆包被抗体2修饰的磁珠1 10 µL（10 mg / mL）转移至100 μL离心管中，用PBST溶液洗涤1-2次后，加入100 µL不同浓度的人体血清，在37 ℃条件下孵育1-3小时；
步骤（4）②、③的内容同实施例7。
检测实施例8中荧光强度的表征意义
（1）阳性样本——当人体血清样本前列腺特异抗原（PSA）较高时，显示较强的荧光强度，由此可判断该血清样本可能来自前列腺癌病人。而阴性样本——当人体血清样本前列腺特异抗原（PSA）含量较低时，由于铱络合物的含量较少，荧光强度非常弱，由此可判断该血清样本应该来自正常人。
（2）通过与前列腺特异抗原（PSA）的浓度标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测到每一例待测血清样本中前列腺特异抗原（PSA）的含量。
（3）实施例8证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度有机铱络合物、标记抗体共标记的纳米材料引起的检测液荧光强度的变化，能实现实际血清样本的检测。

Claims (6)

1.一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法，其特征在于, 环糊精-金刚烷化铱络合物标记材料的制备步骤如下：
1)以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）为载体，首先与标记抗体Ab1以一定比例直接混合修饰或采用缩合剂(1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDCI、N-羟基琥珀酰亚胺NHS)活化后偶联，得到Ab1标记的纳米材料AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1；
2)将AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1进一步与巯基或双硫键或氨基功能化β-环糊精混合振荡2到24小时，接着采用封闭剂胎牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温进行孵化封闭后得到环糊精功能化的Ab1标记的金纳米颗粒 AuNPs-Ab1@CD或AgNPs-Ab1@CD或PS-Ab1@CD或SiO2-Ab1@CD；
3)将AuNPs-Ab1@CD或AgNPs-Ab1@CD 或PS-Ab1@CD或SiO2-Ab1@CD在金刚烷化铱络合物溶液中孵化1-24小时，得到环糊精-金刚烷主客体修饰的铱络合物标记纳米材料AuNPs-Ab1@CD@Ir或AgNPs-Ab1@CD@Ir或PS-Ab1@CD@Ir或SiO2-Ab1@CD@Ir;
相应的蛋白标记物的分析包括如下步骤：
4)在载体酶标板或磁性纳米颗粒上负载包被抗体Ab2，并用封闭蛋白BSA进行孵化封闭，得到Ab2负载的载体材料S@Ab2；
5)在一定浓度的S@Ab2缓冲溶液中，加入待测蛋白AG，使待测蛋白AG与载体上的包被抗体Ab2特异性结合得到S-Ab2@AG；
6)在S-Ab2@AG中加入步骤3）得到的铱络合物标记纳米颗粒AuNPs-Ab1@CD@Ir或AgNPs-Ab1@CD@Ir或PS-Ab1@CD@Ir或SiO2-Ab1@CD@Ir，实现铱络合物对待测蛋白AG的标记；
7)向步骤6得到的标记材料中，加入含有氧化还原荧光探针和氢源（甲酸或甲酸钠或甲酸钾或甲酸铵或甲酸三乙胺或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（还原型）NADH）的荧光检测液，在0-100摄氏度温度，孵化反应0-120分钟后，测试溶液的荧光强度变化，从而实现对待测蛋白AG的定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法中，其步骤1) 所述纳米颗粒均为单分散型纳米颗粒，直径为1 nm-5000 nm，形貌包括球形或棒状或菱形。
3.根据权利要求1所述的一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法中，其特征在于：步骤3）所述的金刚烷功能化铱络合物，其结构中均包含有金刚烷官能团，能够与β-环糊精形成牢固的主客体结合体。所述金属催化剂的阴离子形式为氟硼酸根离子（BF4-）或六氟磷酸根离子（PF6-）或硫酸根离子（SO4 2-）或硝酸根离子（NO3-）、氟离子（F-）或氯离子（Cl-）或溴离子（Br-）或碘离子（I-），所述金属催化剂配体包括但不限于氮氮类配体（1, 10-菲啰啉或2, 2’-二联吡啶或2, 2’-二联嘧啶或2-吡啶苯酰胺或2-吡啶苯磺酰胺或2-喹啉苯酰胺或2-喹啉苯磺酰胺）和碳氮类配体（1-苯基吡唑或苯基亚胺或苯基吡啶或苯基咪唑或苯并喹啉）。
4.根据权利要求1所述的一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法中，其特征在于，所述荧光信号的产生放大为，铱络合物催化氧化还原型荧光探针发生加氢还原反应产生，所述荧光探针分子中均含有氧化官能团（苯醌或萘醌或蒽醌或硝基或羰基或烟酰胺盐或醛基或吡啶盐），并且当荧光探针分子中的氧化官能团被加氢还原为相应的还原态（苯二酚或萘二酚或蒽二酚或氨基或羟基或烟酰胺盐或甲羟基或二氢吡啶）后，探针会产生明显的荧光增强或减弱。荧光发色团主要包括：香豆素类、罗丹明、氧杂蒽类、萘二甲酰亚胺类、苯并恶唑类、二苯乙烯类、噻吩二羧酸酰胺类、稠环芳烃类、苝四甲酰亚胺类。
5.根据权利要求1所述的一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法中，其特征在于，金属铱络合物的结构中均包含金刚烷官能团。
6.根据权利要求1所述的一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法中，其特征在于，步骤3与步骤4的顺序不能颠倒，必须保证采用胎牛血清蛋白（BSA）或或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温封闭完成后，方可引入金刚烷功能化金属铱络合物。
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CN117050119A (zh) * 2023-10-11 2023-11-14 烟台大学 一种高加氢活性芘功能化酰胺型铱络合物及其制备方法
CN117070506A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 烟台大学 固载铱络合物和酶的碳管纳米催化剂、其制备方法及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117050119A (zh) * 2023-10-11 2023-11-14 烟台大学 一种高加氢活性芘功能化酰胺型铱络合物及其制备方法
CN117070506A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 烟台大学 固载铱络合物和酶的碳管纳米催化剂、其制备方法及应用
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