JPH0145026B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、液体中のハプテン、抗原、抗体、ビ
オチン又はアビジン（対象物質）の存在を、特異
的結合（特定結合）の相手物質に対する該対象物
質の親和性に基づいて測定するための方法及び試
薬に関するものである。更に詳しくは、本発明
は、標識物質として酵素により開裂する螢光物
質、PH指示薬又は分光光度測定用の指示色素を用
いる分析方法及び試薬に関するものである。な
お、本明細書中では「特異的」と「特定」とを同
義に用いている。 液体中の低濃度の物質の存在を検出するための
便利かつ信頼性が高く、更に危険性のない方法へ
の要望があることは明白である。このことは、
10^-11モル濃度程度の低濃度で体液中に存在する
成分が病理学上重大である臨床化学の分野に於い
ては、特に該当する。そのような低濃度の物質を
検出することの困難さは、通常は試料の量が非常
に制限される臨床化学の分野に於いて増加する。 以前に於いては、物質は、その検出される物質
が必ず反応体であるような反応系に基づいて、液
体中で検出されていた。未知物質の存在は、反応
生成物の出現もしくは既知反応体の消失によつて
検出されている。ある場合に於いては、そのよう
な分析方法は、生成物の出現もしくは反応体の消
失の速度あるいは生成した生成物もしくは平衡に
達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの
分析の反応系は必然的に小さなグループの物質の
検出のみに限定されるか、あるいは特異性のない
もののいずれかである。 特異性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用
できる分析系の研究により、放射性免疫分析法が
生み出された。この方法によると、検出対象の物
質の放射性標識を付されたものの量は、未知のも
のに特異性を有する限られた量の抗体について、
未知のものと競い合わされるようにされる。そし
て、抗体に結合されるようになる標識を付された
ものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本
来、抗体に結合されるようになる標識を付された
形の検出対象物質（束縛相）を、そのような結合
を起さない物質（遊離相）と分離することが必要
となる。この必要とされる分離を遂行するための
種々の手段が、例えば米国特許第3505019号、
3555143号、3646346号、3720760号、及び3793445
号に示されるように開発されてきた。しかし、そ
れらの手段は全て、束縛相と遊離相の効率的な分
離を確実にするためにロ過、遠心分離、洗浄もし
くはカラムの溶出などの少なくとも一つの人手に
よる操作工程を必要としている。そのような分離
は応々にして、束縛相を含む不溶性部分と遊離相
を含む液体部分から成り、各部分中の放射性活性
標識の量が標識化物質の結合の大きさの関数、従
つて検査された試料中の対象物質の量の関数とな
るようにされている系を形成させることにより行
なわれている。科学の本分野に於いて一般に用い
られ、かつ本明細書に於いて用いられる「不均一
系」とは、束縛相と遊離相の分離が行なわれるこ
とが含まれる特異的結合分析を意味している。こ
のような分離は、束縛相中の標識化物質が遊離相
中の標識化物質と区別がつきにくい系の特異的結
合分析を行なうときに必要である。 放射性物質を扱うための危険性及び困難さのた
めに、放射性免疫分析法と同程度に感度良く迅速
で、しかし結合反応を監視検出するための手段と
して放射性以外の性質を利用する使いやすい特異
的結合分析系を案出する多くの試みがなされてき
た。本明細書中に以下更に充分に記述されるよう
に、放射性原子もしくは分子の代りに標識物質と
して利用されてきたものとしては、酵素、螢光物
質及びバクテリオフアージのような種々のものが
含まれる。 標識物質として用いられる酵素を用いて開発さ
れた方法の例としては、米国特許第3654090号、
第3791932号、第3839153号、及び第3850752号、
そしてジヤーナル・オブ・イミユノロジカル・メ
ソツズ、１：247（1972）及びジヤーナル・オブ・
イミユノロジー、109：129（1972）に記載された
方法が挙げられる。記載された各々の方法に於い
ては、酵素は検出対象の物質（リガンド）もしく
はその結合の相手物質のいずれかに化学的に結合
されており、試料と共に置いた後に、不溶部分も
しくはリガンド部分のいずれかに含まれる酵素活
性の量が試料中のリガンド（対象物質）の量の関
数となるように適当な不均一系特異的結合反応の
図式が組み立てられる。従つて、酵素結合体の合
成及び特性付けに関連する問題が、この解決方向
の重大な隘路となる。 酵素付加免疫分析として興味あるものが米国特
許第3817837号に記載されている。この方法は分
離（即ち不溶性部分と液体部分）特異的結合反応
系を用いる必要がなく、従つてそれのための分離
操作を必要としない。これは、酵素付加された対
象物質が、対象物質の該結合の相手物質との反応
により酵素活性が阻害されるように作られている
からである。こうして、酵素付加されれた物質の
束縛（結合）状態にあるものと、遊離（自由）状
態にあるものとの比を、酵素活性の変化を測定す
ることにより決定する。しかしながらこの方法に
は、特性の優れた酵素付加結合体の調製及びこの
系の基本方式に適合する酵素を見いだすことの困
難さがある。 英国特許第1392403号及びフランス国特許第
2201299号には、標識物質として分光々度測定に
於いて活性な物質の不活性な前駆体を用いる特異
的結合分析が記されている。特異的結合反応系と
共に試料を保持した後、不溶性部分と液体部分を
分離し、試料中で検出されるべき対象物質の量の
関数であるところの液体部分に存在する標識物質
の量は、不活性な標識物質を色変化もしくは螢光
活性物質に変え、次いでこれを通常の手段で計測
することから成る反応工程により測定される。 異なつたタイプの標識物質を用いる他の特異的
結合分析方法は以下のように開示されている。即
ち、米国特許第3850578号には標識手段として電
子スピン共嗚を用いることが開示されており；米
国特許第3901654号には標識手段として螢光発光
の停止及び増大を用いることが開示されている。
米国商務省の国家技術情報サービス（NTIS）の
報告No.PB−224875（1973）には、化学発光反応に
より監視検出する不均一系分析系で標識物質とし
てヘミン・クロリドを用いた試み（成功していな
い）が記されている。ネイチヤー、219：186
（1968）には、ある種の放射性免疫分析操作につ
いて非常に詳しく記載されており、更に標識物質
として放射性同位元素の代わりに補酵素及びビー
ルスを用いることの可能性について、非常に概括
性な性質として付随的に言及している。しかし著
者は、そのような代りの標識物質を用いて如何に
分析を行なうかについて、あるいは実際問題とし
て、そのような分析法が実施可能であるかどうか
の点については教示していない。更に背景を記せ
ば、「競合蛋白−結合分析法の原理」（Principles
of Competitive Protein−Binding Assays）オ
デル及びドウデイ編（ジエー・ビー・リツペンコ
ツト・カンパニー、フイラデイルフイア、1972）
には、種々の既知の分析方法及び特異的結合分析
用の標識として用いられてきた様々な物質や特性
などが広範囲に議論されている。 これまでに多くの新しいタイプの特異的結合分
析方法が示唆され研究されてきたが、放射性免疫
分析法と種々の酵素付加免疫分析法が最も広く用
いられ改良されるものとして残つてきた。しか
し、両方のタイプのシステムは明白な欠点を有し
ている。即ち、放射性免疫分析に於いては、放射
性物質の取扱いが危険で、注意を必要とし、酵素
付加免疫分析に於いては、有用な酵素付加結合体
を調製するのが難しい。 従つて本発明の目的は、不便な放射性物質もし
くは部分変形酵素を標識物質として使用しない、
液体中の対象物質（リガンド）を検出するための
新規な方法及び試薬を提供することである。 更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広
く便利な不均一系特異的結合（特定結合）分析方
法及び試薬を提供することも目的の一つである。 対象物質もしくはその特異的結合の相手物質に
先行技術方法の酵素よりも更に都合よく組み合わ
せ結合することのできる標識物質を用いる不均一
系特異的結合分析方法及び試薬を提供することも
本発明の目的の一つである。 種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることによ
り、先行技術方法に於ける酵素の活性のいかなる
変化よりも更に都合良くいかなる活性の変化につ
いても検出できる標識物質を含む結合体を用いた
不均一系特異的結合分析方法及び試薬を提供する
こともまた本発明の目的の一つである。 本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ
鋭敏な不均一系特異的結合分析方法及び試薬を、
前以つて決められた反応の成分として賦与された
反応活性を示す物質を標識物質として使用するこ
とに基礎を置いて提供するものである。そのよう
な物質はここに於いて「反応体」として示され
る。 本発明の標識物質は、従来のいかなる不均一系
特異的結合分析方法に於いても使用することがで
きる。束縛相及び遊離相の各々に存在する反応体
についての量は、特異的結合反応を監視検出する
ための手段として働く前以つて決められた反応系
を反応体と共に形成する少なくとも一種の試薬と
各相を接触させることにより測定される。定量的
な測定は、既知量の測定対象の対象物質（リガン
ド）を含有する液体で同じ方法により得られた値
と一つの相で測定された反応体の活性とを比較す
ることにより行なわれる。 改良された液体中のハプテン、抗原、抗体、ビ
オチン又はアビジンを分析するための方法は、一
般には、次の(a)、(b)及び(c)工程を含んでいる。即
ち、 (a) 試験液体を、予め定められた特性を有する標
識物質と、ハプテン、抗原、抗体、ビオチン若
しくはアビジン又はそれに対する特異的結合の
相手物質との結合体からなる試薬と接触させる
工程、 ここで、該試薬と結合反応系を生成する対象
物質（リガンド）が標識化された結合体の束縛
相又は遊離相を生ずる； (b) 該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び (C) 分離された層の一における、該液体中のハプ
テン又は抗原の指標としての特性を測定する工
程 からなる不均一系免疫分析方法であつて、結合体
中の標識物質が、酵素により開裂する螢光物質、
PH指示薬又は分光光度測定用の指示薬であること
を特徴とするものである。 この後に更に詳しく述べるように、本結合反応
系は、放射性免疫分析系や不均一系酵素−免疫分
析系に於いて用いられるような既知の通常の技術
のいかなる形をとることもできるであろう。 監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好
ましい。通常は、監視検出反応は、結合体中の反
応体に対して高度に鋭敏なものから選ばれる。こ
の点に於いて、発光もしくは螢光発光反応系は非
常に有用である。特に好ましいのは循環反応系
で、反応体が循環する物質である反応系が特別に
好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵素を
触媒として利用する系が特に有利である。本発明
における結合体中の反応体は酵素系の反応体、即
ち、酵素触媒反応における酵素基質である。 本明細書に於いて用いられる用語は以下のよう
に定義される。「リガンド」、「対象物質」もしく
は「対象物質（リガンド）」は、物質もしくは一
群の物質で、その液体中の存在もしくは量が測定
されるものである。「対象物質（リガンド）の特
異的結合の相手物質」とは、物質もしくは一群の
物質で、他の物質を排除して対象物質に対して特
定の結合の親和性を示すものである。「対象物質
の特異的結合に関する類似物質」とは、物質もし
くは一群の物質で、対象物質への特異的結合の相
手物質の結合親和性に関して対象物質と本質的に
同じ挙動をとるものである。 本発明の不均一系免疫分析試薬は、液体中のハ
プテン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジンを分
析するための： 予め定められた特性を有する標識物質と、ハプ
テン、抗原、抗体、ビオチン若しくはアビジン又
はそれに対する特異的結合の相手物質との結合体
からなり、かつ、試薬とハプテン、抗原、抗体、
ビオチン又はアビジンが結合反応系を形成して標
識化された結合体の束縛相又は遊離相を生成し、
該束縛相若しくは該遊離相のいずれかの特性が、
該液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチン又は
アビジンの量の関数である不均一系免疫分析用の
試薬であつて、 結合体中の標識物質が酵素により開裂する螢光
物質、PH指示薬又は分光光度測定用の指示薬であ
ることを特徴とするものである。 特異的結合試薬は種々の形をとり得る。一般
に、そのような試薬は三種の基本成分を含有して
いる。即ち(1)検出対象物質（リガンド）、(2)リガ
ンドの特異的結合の相手物質、及び(3)、普通は標
識化された形の(a)リガンド、(b)リガンドの特異的
結合に関する類似物質もしくは(c)特異的結合の相
手物質である標識化成分、である。この結合反応
の成分は同時に一緒にされるか、あるいは順次添
加される。そして適当な保持（保存）期間の間
に、標識化成分は、例えば結合の相手物質に束縛
（結合）された標識化成分の量と不束縛（不結合）
の標識化成分の量との比率のような結合の量、大
きさ等が、存在する対象物質の量の関数となるよ
うに、対応する競合結合の相手物質に束縛（結
合）される。 以下に本発明の方法を実施する場合に用いられ
る種々の結合反応の概要のいくつかについて簡単
に記述する。 放射性免疫分析法や不均一系酵素免疫分析法の
ような通常の不均一系特異的結合分析法に於いて
は、放射活性や酵素活性のような標識化結合体に
於ける標識特性は、束縛（結合）状態及び遊離
（自由）状態の結合体にとつて本質的には同じで
ある。一方、本発明方法によれば、標識物質とし
ての反応体の活性は、場合によつては、標識化結
合体の結合に影響を受ける。そのような状況に於
いては、監視検出反応は、対象物質が液体中に存
在しない場合、或は有意でない程度に少ない量で
存在する場合、比較的に一定の性質を示す。液体
中に対象物質が存在する時は、監視検出反応の特
性もしくは性質が変化する。一般には、結合体中
の反応体の活性は、反応体が監視検出反応に関与
することができる量もしくは速度となるであろ
う。このようにして、監視検出反応の性質は液体
中の対象物質の存在により、通常はその全反応速
度、もしくは一種もしくは数種の生成する反応生
成物の平衡量について変化する。この場合に於い
て一般には、監視検出反応に関与する結合体の反
応体の活性能力は、それが結合する特異的結合物
質と該特異的結合物質の特異的結合の対応物質と
の間の反応により低下する。即ち、遊離（自由）
状態の結合体は監視検出反応に於いて、束縛（結
合）状態にある場合よりも活性が大きい。 次に示す概略式には、以下の記号が用いられ
る。記号 定 義 Ｌ 検出対象物質 対象物質もしくはその特異的結合
に関する類似物質 Ｂ 対象物質の結合の相手物質 ＊ 標識物質、例、反応体 〓 不溶性の相 → 適当な分離に続く保持期間 (lim) 限定量；選択された保持期間中に
選択された反応条件下で、結合可能箇
所の全てに結合することのできる量よ
りも少なく存在すること；例、他の成
分と結合を競い合う成分 (exc) 過剰量；選択された保持期間中に
選択された反応条件下で、結合可能箇
所の全てに結合することのできる量よ
りも多く存在すること 不均一系分析の概略式 １ 結合分析法 (a) Ｌ＋^*＋Ｂ（lim） →＋Ｂもしくは^*の不溶化剤 これは従来からの競合結合方法によるもの
である。この不溶化剤の例としては、特異的
沈降抗体、特異的不溶化抗体、Ｂもしくは
^＊が蛋白性物質である場合には硫酸アンモニ
ウムのような蛋白質沈殿剤、Ｂもしくは^*
が小さな吸収され得る分子である場合には、
デキストリンで被覆したチヤコール（木炭）
が挙げられる。同様な系についての記述はバ
イオケミカル・ジヤーナル、88：137（1963）
及び米国特許第3839153号に見られる。 (b) Ｌ＋^*＋〓Ｂ（lim）→ この方法は通常固相（ソリツド・フエー
ズ）技術と呼ばれる。同様な放射性免疫分析
法及び酵素免疫分析法の技術についての記述
は米国特許第3505019号、第3555143号、第
3646346号、及び第3654090号に見られれる。 (c) Ｌ＋B^*＋〓（lim）→ 参考文献：米国特許第3654090号 (d) Ｌ＋〓＋B^*（lim）→ 参考文献：米国特許第3850752号 ２ 順次飽和分析法 (a) Ｌ＋Ｂ（exc）→＋^*（exc） →＋Ｂもしくは^*の不溶化剤 順次飽和技術に於いては、最初の保持期間
後に残存するＢの結合箇所の一部もしくは全
部が標識化成分に結合されている。 (b) Ｌ＋〓Ｂ（exc）→＋^*（exc）→ 同様な放射性免疫分析法及び酵素免疫分析
法の技術についての記載は、米国特許第
3720760号及びジヤーナル・オブ・イミユノ
ロジー、209：129（1972）に見られる。 (c) Ｌ＋B^*（exc）→＋〓（exc）→ ３ サンドイツチ分析法 Ｌ＋〓Ｂ（exc）→B^*（exc）→ サンドイツチ分析法では、不活性化された結
合の相手物質に結合したリガンド（対象物質）
分子の一部もしくは全部が標識化成分に結合さ
れている。 参考文献：米国特許第3720760号 ４ 固相希薄化分析法 Ｌ＋^*＋〓（非特異的）→＋Ｂ（lim）→ この技術に於いて、リガンドと標識化成分は
非特異的結合剤に結合され、その比例する量は
その後リガンド及び標識化成分に更に大きな親
和性を示す結合の相手物質との結合により解離
する。この技術の最も有用な形としては、米国
特許第3659104号に記載された非特異的結合剤
のカラムを用いる方法がある。そのような技術
は、除去されない限り競合結合反応を妨害する
試料中の内因性結合物質にリガンドが結合して
いる場合に有用である。非特異性結合剤に結合
された後、内因性結合物質は適当な洗浄により
除去される。 通常の不均一系分析系に含まれる変数に関する
記載、例えば分析方法及び代替できる分離技術の
更に詳しい記述等については、「競合蛋白−結合
分析法の原理」（前出）を参考文献として挙げる
ことができる。 他の添加順序及び他の結合反応の構成もまた、
ここに述べた発明概念から逸脱せずに不均一系特
定結合分析を行なうために考案されるであろうこ
とは予測されることである。 前以つて決められた監視検出反応の成分の結合
体の反応体の活性を束縛相もしくは遊離相内で評
価する工程は、監視検出反応を結合体の反応体と
共にその相を形成する少なくとも一種の物質と接
触させ、次いでその反応の特性を測定することに
より、都合良く達成される。監視検出反応は一つ
のあるいは一連の複数の化学的に変形もしくは転
換する反応から成る。 酵素触媒の反応系が利用される場合、その系は
結合体の反応体と更に少なくとも一種の酵素を含
むものであり、また基質や補酵素の如き酵素反応
体の一種もしくは数種を含んでも良い。そのよう
な酵素触媒反応系は、単一の簡単な酵素反応を含
むか、又は複雑な一連の酵素反応及び非酵素反応
を含むであろう。例えば、酵素反応系は単一の酵
素触媒による劣化もしくは解離反応から成るかも
しれない。そのような系に於いて結合体の反応体
は、劣化もしくは解離を起こす酵素基質であり、
選ばれた束縛相もしくは遊離相と接触するために
必要な反応系の唯一の成分は、劣化もしくは解離
反応に触媒作用を及ぼす酵素である。更に複雑な
酵素触媒の反応系は二種もしくはそれ以上の反応
体が関与する単一の酵素反応でも良く、あるいは
数種の反応体が関与していても良い（但し、この
反応の内の一つは酵素触媒によるものである）。
そのような系に於いて、結合体の反応体は酵素触
媒による反応の酵素反応体の一つであり、選ばれ
た束縛相もしくは遊離相は、結合体中のものとは
別で選ばれた酵素触媒反応系を形成するのに必要
な適当な酵素及び反応成分と接触せしめられる。 この酵素触媒反応系は、微生物の如き生物体の
細胞の生態系のように複雑な生化学系を含むこと
もまた意図されている。例えば、特定な微生物の
成長に必須な栄養物質が結合体中の反応体として
選ばれても良い。反応体の唯一の栄養物質源が結
合体である環境内にそのような微生物が置かれた
場合、反応体の活性は微生物の特性、例えば微生
物の生長速度、を監視検出することにより測定で
きる。 結合体中の反応体と共に監視検出反応系を形成
する適当な反応成分は、特定結合反応の開始の
前、又はそれと同時に、あるいはそれに引き続
き、単独で或は結合した形で選ばれた分離された
相（分離相）に接触せしめられる。特定結合反応
の開始後、監視検出反応の必須成分の一部もしく
は全てを含む反応混合物は通常、得られた束縛相
及び遊離相の分離の前の前以つて決められた時間
培養される。分離の後、監視検出反応に必要で、
未だ選ばれた分離相中に充分な量存在していない
成分をこれに加える。そしてその中の反応体の活
性を評価測定して、液体中の対象物質の存在もし
くは量の指標とする。 監視検出反応の反応速度が、選ばれた束縛相も
しくは遊離相中の反応体の活性を評価測定するの
に用いられる特性である時（これが好ましい）に
は、その速度は通常、反応体の消失速度もしくは
反応生成物の出現速度を測定することにより決め
られる。そのような測定は、通常のクロマトグラ
フ、重量分析、電位差滴定、分光光度測定、螢光
測定、濁度測定、容量測定等の分析技術を含む広
範囲の種々の方法により行なわれる。本方法は第
一として低濃度の対象物質の検出を目的として考
えられているので、非常に感度の良い反応系が本
発明の新規な特定結合反応系と組合わせて用いる
ように開発された。 好ましい鋭敏な監視検出反応の他の型として
は、螢光発光を含み、かつ酵素触媒により得られ
る現象を含むものがある。そのような反応系に於
いては、結合体中の反応体は酵素反応に於ける基
質であり、その酵素反応が、結合体中の基質と区
別される螢光発光性を有する生成物を生成するも
のである。そのような酵素触媒による反応系のた
めの一般的な反応式は以下の通りである。 酵素反応の反応体 （基質）−Ｘ−Ｚ（酸素） ―――――→ 生成物 上式に於いてＸは酵素により開裂する結合もし
くは連結（橋かけ）基、例えばエステル基もしく
はアミド基、を表わし、Ｚは利用される特定結合
反応技術により対象物質（リガンド）、対象物質
の特定の結合に関する類似物質もしくは対象物質
の特定結合の相手物質のいずれかとなる特定結合
物質である。この型の反応系で用いるとこのでき
る特定の結合体は、フルオレセイン、ウンベリフ
エロン、３−インドール、β−ナフトール、３−
ピリドール、レゾルフイン、ローダミンＢ、その
他の酵素により開裂可能な種々の誘導体である。
そのような誘導体の可能な構造式の例は以下の通
りである。 上式に於いて、R¹は−OH又は−Ｘ−Ｚ（Ｘ及
びＺは前述と同じ）であり、R²は−Ｘ−Ｚ、そ
してR³は−Ｈ又は−CH₃である。 本発明は、特定結合の相手物質が存在するいか
なるハプテン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジ
ン（対象物質）の検出にも適用することができ
る。対象物質は通常、ペプチド、蛋白質、炭水化
物、糖蛋白質、ステロイド、又は生物系内に特定
結合の相手物質が存在するか或は相手物質を合成
することができる他の有機分子である。この対象
物質は、機能面の用語で言えば、抗原、その抗
体、ハプテン（付着体）、その抗体から成る群よ
り選ばれる。本発明を用いて検出することのでき
る対象物質を特に例示すれば、フエリチン、ブラ
デキニン、プロスタグランデイン及び腫瘍特異性
抗原のような抗原及びハプテン：ビオチン、；ミ
クロソーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のよ
うな抗体；そしてチロキシン結合グロブリン、ア
ビジン、内因子及びトランスコバラミンのような
特定結合受容体等が挙げられる。 本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応
体の測定可能な量の活性が維持されるような形
で、特定結合物質（選ばれた分析方法に依り、対
象物質、対象物質の特定の結合に関する類似物質
もしくは対象物質の特定結合の相手物質のいずれ
かである）に結合もしくは組合わされる。反応体
と特定結合物質との結合は、活性を有する反応体
を用いる前以つて決められた監視検出反応が、上
述の発光反応系及び循環反応系に於けるような結
合を化学的に壊すように設計されていない分析の
条件下では、通常実質的に変更できない。しか
し、ある場合には、そのような結合は、壊される
ように設計されるか、あるいは反応活性の変化を
評価するための手段としての選ばれた監視検出反
応により影響を与えられる。そのような場合とし
て、本発明の酵素による螢光発生基質の反応系が
ある。 反応体は特定結合物質に直接に組み合わされ結
合しても良く、その結果結合体の分子量は反応体
と特定結合物質の全分子量に等しいか、又は小さ
くなるようになる。しかし、通常は、反応体と特
定結合物質は、１から50個、好ましくは１から10
個の炭素原子もしくは窒素、酸素、硫黄、燐その
他のような複素原子を含む橋かけ基により連絡さ
れている。１個の原子を含む橋かけ基の例として
は、メチレン基（炭素原子１個）及びアミノ基
（複素原子１個）がある。橋かけ基は通常1000を
越えない分子量を持つており、好ましくは200よ
り小さいものである。橋かけ基は炭素原子もしく
は複素原子の鎖、もしくはそれらを組合わせたも
のを含んでおり、通常はエステル、アミド、エー
テル、チオエステル、チオエーテル、アセター
ル、メチレンもしくはアミノの如き基の形をした
連結基により、反応体と特定結合物質もしくはそ
の活性誘導体とに結合されている。 本発明の結合体中の反応体は、前以つて決めら
れた監視検出反応の成分として、賦与された（例
えば、一定の又は既知の）反応活性を有する物質
である。更に詳しく言えば、本明細書による開示
に於ては、「反応体」及び「反応活性を有する物
質」とは、自身とは異なる一もしくは数個の生成
物をもたらす、限定され、かつ測定司能な化学的
な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのよう
な化学的な変形もしくは変質に関与するような他
の型の物質）の如き反応開始手段との相互作用に
より、電極的放射、熱エネルギー、もしくは音波
エネルギーをもたらす物質を意味する。従つて本
明細書に於いて「反応体」と定義した物質群の内
には通常の無機及び有機試薬及び生化学的物質が
含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射性
アイソトープのように監視検出反応に於ける反応
体でないものは除外される。特定の化学物質は化
学的環境に従つて種々の形で機能することができ
るため、一つの化学物質が種々の異なつた分類に
分類されることがあるが、そのような物質が本明
細書の開示に於いていかなる機能を有するかが決
定されるのは、本明細書に記された選ばれた監視
検出反応に関するその物質の反応性によるもので
あるということが認識されるであろう。 本発明の反応体は、酵素基質もしくはその活性
を有する部分変形物質もしくは誘導体のような酵
素反応の反応体である。酵素基質とは、酵素を触
媒として化学的変形（変質）をすることのできる
化合物もしくは部分である。基質が結合体の反応
体として用いられる場合、その好ましい分子量は
9000より小さく、更に好ましくは5000より小さい
ものとなる。その程度の大きさの基質は、分子と
しての複雑さが少ないため、結合体を作るために
用いるのに特に都合が良い。更に、特定結合物質
に結合された時に、その程度の基質の活性は結合
体とその特定結合物質の特定結合の対応物質との
反応により容易に影響を受ける。本発明に於いて
用いることを意図している酵素基質の例として
は、フルオレセインやウンベリフエロンの誘導体
のような前述した酵素により開裂する螢光物質；
PH指示薬；及び分光光度測定用の指示色素（特に
発色型）が含まれる。 本発明の一形態として、対象物質が含有されて
いると考えられる液体と組合わされる特定結合反
応の成分は液体もしくは固体の形である。本分析
方法は、試験管のような標準の実験室用の容器中
で、固体もしくは液体の特定結合反応の成分及び
それに加えられる反応系の成分により実施され
る。 一もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又
は一もしくは数種の監視検出反応の成分は、担体
に包含されていても良い。一つの考え方として担
体は、それらの成分の一種もしくは数種をその内
側部分に例えば液体もしくはゆるい固体の形で、
あるいはその内部表面の被膜の中に、含有する試
験管又はカプセルのような液体保持用容器でもよ
い。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性で
あるマトリツクスの形態であつてもよい。そのよ
うなマトリツクスは例えば吸収性紙；重合体のフ
イルム、膜、けばもしくは塊状物；ゲル及びその
他の形である。そのような形の場合該装置は、試
験対象液体を接触させ、特定結合反応及び／又は
監視検出反応を行ない、かつ必要な分離を行なわ
しめ、そして得られる反答を観察するために都合
のよい手段を提供する。 試験対象となる液体は天然に存在するか或は人
工的に作られたものであつて、ハプテン、抗原、
抗体、ビオチン又はアビジン（対象物質）を含む
ことが知られているか或は推定されるものであ
る。通常は生物体の液状物又は、それを希釈もし
くは他の処理を施して得られた液体である。本発
明方法により分析することのできる生物体の液状
物には、血清、プラズマ、尿、羊水、脳液、せき
ずい液等が含まれる。細胞等の固体材料もしくは
気体状のもの等の他の材料も、固体もしくは気体
を溶解させるか又は固体を抽出する等の方法によ
り液体の形にして分析することができる。 先行技術の分析系とは対照的に、結合体中の標
識付与物質の反応活性と同じか又は類似した反応
活性を有する物質を含有する生物体の液体に於け
る対象物質を、バツクグラウンドに邪魔されるこ
となく分析することができる。内因性バツクグラ
ウンド反応体活性は種々の方法で容易に除くこと
ができる。生物体の液体は、内因性反応体活性を
選択的に破壊するように処理することができる。
そのような処理としては例えば、内因性活性を化
学的に破壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄
剤の破壊作用を不活性にする処理を行なう処理が
挙げられる。 本発明を以下において実施例により説明する
が、これらは本発明を制限するものではない。 実施例 １ ビオチン−ウンベリフエロン結合体の製造 （２−オキソ−２−Ｈ−１−ベンゾピラン−７
−イル）−５−〔シス−ヘキサヒドロ−２−オキソ
−1H−チエノ−（３，４−ｄ）−イミダゾール〕
酪酸エステル 300mg（1.2ミリモル）の無水ビオチンを20mlの
乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を−10
℃で乾燥窒素下で撹拌し、次いで0.17ml（1.2ミ
リモル）の乾燥トリエチルアミンを加える。新た
に蒸留したクロルギ酸エチル（３mlの乾燥エーテ
ル中0.141ml）を滴下する。30分間撹拌しながら
保持した後、得られた沈殿を乾燥窒素下で別
し、直ちに−10℃に冷却する。別された残査
に、197mg（1.2ミリモル）の無水７−ヒドロキシ
クマリンを３mlの乾燥ピリジンに溶かした溶液を
加えた後、−10℃で１時間撹拌し、次いで25℃で
20時間撹拌する。溶媒を高真空中40℃で蒸発させ
る。冷却後、得られた固体を別し、メタノール
により再結晶すると目的生成物が得られる。融点
216−218℃ 計算値（C₁₉H₂₀N₂P₅Sとして）：Ｃ、48.75；
Ｈ、4.19；Ｎ、7.21。分析値：Ｃ、58.4；Ｈ、
5.12；Ｎ、6.86。 実施例 ２ 標識物質として酵素基質を用いてのビオチンと
アビジンの特定（特異的）結合分析 本例に於いて用いられた特定結合分析系は次の
反応に基づいている。 Ａ 不溶化結合相手物質の製造 ビオチンに結合親和性を有するアビジンは、
次のように水不溶性高分子化合物ビーズに共有
結合させることにより不溶化される。 適当量のセフアローゼ（sepharose）4B（ス
エーデン、ウプサラのフアーマシア・エー・ビ
ーより入手）を、マーチ他の方法（アナリテイ
カル・バイオケミストリー、60：149（1974））
を用いてアビジンへの結合に関して活性化す
る。約４mlの活性化されたセフアローゼ4Bを
８mlの0.1M酒石酸緩衝液（PH7.0）に懸濁させ
る。この懸濁液に、9.9単位／mgの活性を有す
るアビジン６mgを含有する３mlの水を加える。
アビジン活性の１単位とは、1μｇのビオチン
と結合することのできるアビジンの量である。
得られた反応混合物を７℃で６時間撹拌する。
次いでアビジン−結合−セフアローゼ4Bを
別し、100mlの0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液
（PH9.0）で洗浄した後、アビジン−結合−セフ
アローゼ4Bを12mlの0.1Mトリス−（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液（PH
8.0）中に懸濁させ、そして0.1Mのビスーヒド
ロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（PH7.0）
により１：１に希釈する。 Ｂ ビオチンの競合結合分析：離脱するウンベリ
フエロンの量に対するビオチンの量の変動の影
響 各々全量が0.2mlで、各々0.1Mのビスーヒド
ロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（PH7.0）、
0.3μMのビオチン−ウンベリフエロン結合体
（実施例１で得たもの）、15μのアビジン−結
合−セフアローゼ4B懸濁液（本例のＡで得た
もの）、及び第１表に示した濃度のビオチンを
含有する８種類の特定結合反応混合物を調製す
る。 反応混合物を穏やかに振とうしながら室温で
20分間保持する。各反応混合物を遠心分離し、
その上澄み100μ容量を、1.08単位の豚のエス
テラーゼを含有する２mlの0.1Mビス−ヒドロ
キシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（PH8.2）と
一緒にする。室温で５分間保持した後、364n
ｍに励起を伴う448nｍで各反応混合物中に発
生する螢光強度を、アミコ・ボウマン
（Amico−Bowman）螢光分光分析計を用いて
測定する。結果を第１表に示す。

【表】 以上により本例に於いては、液相中のNAD−
ビオチンの量は、存在する遊離ビオチンの量に直
接比例することが示されている。従つて、本発明
の分析方法及び試薬は未知の液体試料中の対象物
質（リガンド）の測定のために有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチ
   ン又はアビジンを分析するための： (a) 試験液体を、予め定められた特性を有する標
   識物質とハプテン、抗原、抗体、ビオチン若し
   くはアビジン又はそれに対する特異的結合の相
   手物質との結合体からなる試薬と接触させる工
   程、 ここで、該試薬と結合反応系を生成する対象
   物質が、標識化された結合体の束縛相又は遊離
   相を生ずる： (b) 該束縛相と該遊離相とを分離する工程：及び (c) 分離された相の一における、該液体中のハプ
   テン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジンの指
   標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であつて、結合体
   中の標識物質が、酵素により開裂する螢光物質、
   PH指示薬又は分光光度測定用の指示色素であるこ
   とを特徴とする分析方法。 ２ 試験液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチ
   ン又はアビジンを分析するための： 予め定められた特性を有する標識物質とハプテ
   ン、抗原、抗体、ビオチン若しくはアビジン又は
   それに対する特異的結合の相手物質との結合体か
   らなり、かつ、試薬とハプテン、抗原、抗体、ビ
   オチン又はアビジンが、結合反応系を形成して標
   識化された結合体の束縛相又は遊離相を生成し、
   該束縛相若しくは該遊離相のいずれかの特性が、
   該液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチン又は
   アビジンの量の関数である不均一系免疫分析用の
   試薬であつて、 結合体中の標識物質が、酵素により開裂する螢
   光物質、PH指示薬又は分光光度測定用の指示色素
   であることを特徴とする試薬。 ３ (1)標識物質がハプテン又は抗原と結合してい
   る該結合体及び(2)ハプテン又は抗原に対する抗体
   からなる特許請求の範囲第２項記載の試薬。 ４ 担体マトリツクス中に包含されてなる特許請
   求の範囲第２項記載の試薬。