JPS61107158A - 検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には試料中のアナライトの測定を可能に
る、結合検定法に関る、ものである。

生物学的液体および組織の中の生理学的重要物質の検出
および定量に向けられた測定法は科学的研究および健康
管理分野において重要な道具である。い（つかの異なる
タイプの検定法が開発されておシ、それらは人間の血清
のような普通の生物学的試料の比較的高濃度の成分を検
出る、ことができるものである。このような検定法は高
分解能アガロースゲル電気泳動、および内生酵素の触媒
活性に基づく試験方法を含む。これらの方法は一般的に
は極めて低い濃度で存在る、かも知れない多数の他の生
理学的重要試料成分〔例えば、細胞調節において均密に
かかわシのめる内生分子（ホルモン、ステロイド、生化
学的メツセンシャー）；生体の基本的構造成分（アミノ
酸、プロティン、ポリサッカライド）；遺伝物質（ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ）；ビタミン、医薬および医薬中間代謝物；
毒素、病原体および免疫系によって発生る、物質〕を検
出および定量化る、のに必要とされる感度をもっていな
い。

臨床的に重要な血清成分についての初期の生物学的検定
技法、例えば１９４０年代において開発された免疫沈澱
法および免疫拡散法、もまた医学的関心のある大部分の
血清成分の検出および定量に必要な感度に欠けている。

１９５６年に、バーンンおよびイエイロウは血清ホルモ
ンの放射標識製剤を注射したインシュリン治療糖尿病患
者の血清の中の可溶性のインシュリン抗体複合体の検出
を報告している。バーンンらのＪ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎ
ｖｅｓｔ、　３５：　１７０　（１９５６）を見よ。こ
の検定法の原理は、普通は放射線免疫検定（Ｒ工、Ａ）
と呼ばれるが、その後確立され、１９６０年代後期まで
に、このＲＩＡは内分泌研究所における主要な道具であ
った。例えば、ｋプチドホルモン生理学について現在知
られている事実上すべての情報はＲＩＡの導入と１０−
１０から１０　　モル濃度のホルモンを検出し得るその
能力とから生じたものである。

このＲＩＡ検定技法はその後、特定的抗体をつ（ること
かできる物質のどれにでも定量的検出に応用できること
が示され、医薬のような化学的化合物についての多数の
ＲＩＡ法を発展させた。よシ広い意味においては、ＲＩ
Ａ原理はまた他の結合用物質が例えば受容体検定におい
て抗体を置換える系へ拡張された。１９８０年に、免疫
診断試薬単独の売上げで２億２千９百万ドルであると推
定された。

所望の感度を示すけれども、ＲＩＡは必要とる、試薬に
固有のい（つかの欠点を示す。放射性アイソトープの使
用は特定の認可と特定の実験室を必要とる、。この理由
から、ＲＩＡは日常の臨床的化学実験室にいる人々と別
れた人によって実施される。放射線は普通に使用る、天
変放射性同位元素で以て作業をる、人々に特に健康上の
災害を引起し得る。その上、用いられる放射線標識試薬
の有用寿命はアイソトープの半減期と崩壊中におこる破
壊過程によって制限される。試料中の放射能の量を測定
る、のに用いる設備は高価でｌ）、一連の試料の計数は
比較的時間のかかることである。

（スミスらのＡｍｅｒ、　Ｃｈｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　１８　：　２５３−７４　（１９８１）を見よ）総
体的にいうと、免疫診断領域におけるオートメーション
の量は日常の臨床的実験室において見られるよりもはる
かに少ない。

結合抗原から分離る、ための８時間４ｖエチレングリコ
ール促進第二抗体ＲＩＡを使用る、と、−人の技工によ
シ手動ピペットとシングルチャネル・ガンマ−カウンタ
ーを使って１日に約７５−９０検定しか実施できない。

ＲＩＡに関連る、問題を克服る、ためＫ、非アイソトー
プ的標識を用いて免疫検定技法が開発された。これらの
非アイソトープ的検定は、酵素連結免疫吸着剤検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）、螢光免疫検定（ＦＩＡ）、および発光免疫
検定（ＬＩＡ）、と呼ばれるが、用いる標識に従って、
ＲＩＡと関連る、問題の多くを回避し、かつＲＩＡに近
い感度を保有している。

更に最近では、酵素連結検定はますます一般的となり、
ＲＩＡと比べ記鎌がよシ単純であるために、多くの場合
においてＲＩＡを置換えつつある。１日当、！１１２０
００個もの多くの検定を１人の技工により、手動ピペッ
トによるミクロタイター・プレートにおいて固相ＥＬ工
ＳＡを使って実施る、ことができる。これらのタイプの
検定はまた「均質系」免疫検定を開発させ、その検定に
おいては結合および遊離の標識化物質は検出および測定
の工程に先立って分離される必要がない。ＲＩＡ法はア
ナライト濃度評価のために結合標準物質の分離を必要と
し、「不均質系」系である。抗原−抗体反応を複合化抗
原の分離を行うことなしに検出できる感度のよい検定は
また自動化る、のによシ簡単である。

いくつかの点においてＲＩＡよシ優れているけれども、
上述の非アイソトープ検定はまた反応混合物中に存在る
、内生的妨害要因によって引起される問題を示す。血清
試料中に普通に見出されるプロティンおよびその他の成
分は用いられる標識のそれと似た螢光的、化学的および
酵素的活性を示すかも知れない。その上、これらの標識
の活性は、発色団標識関連の色比合物と同じ（発光胞標
識の発光を吸収または散乱させる内在的化合物、および
酵素標識を劣化させる触媒的酵素の存在によって阻害さ
れる。採用標識の活性の測定はまた全血試料の場合のよ
うに試料の濁度によってそこなわれるかも知れない。あ
る程度までは、これらの問題は、結合標識化物償金試料
から分離し緩衝液で以て洗滌しその後に標識活性を測定
る、分離工程、あるいは結合および非結合の標識化物質
め分離がそれらを非混和性水性相の間に分配させること
によって達成される分離工程、を用いる検定技法によっ
て最小化る、ことができる。マチアツンンらの、Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｘｏｇｙ２８　：　１１７−４７　（１９８１年）、米
国特許屋４，３１２，９４４を見よ。しかし、血清妨害
化合物が存在し得る可能性はそれでもまだある。この測
定段階は光検出器と臨床実験室においてのみ一般的に利
用できる他の複雑な計装の使用をしばしば必要とる、。

それ故、検定の検出および測定段階に固有の妨害問題を
より厳しく回避し、かつ複雑化された計測の必要性を避
け、一方では医院あるいはその他の臨床実験室の外の場
所での使用に利用できる方法による高感度検出を提供る
、、アナライト存在測定用の非アイソトープ的結合検定
法を求める要望は画業において存在し続けている。

要約 本発明は試料中に存在る、アナライトを測定る、改良方
法を提供る、もので６Ｄ、その場合、アナライトの存在
は、アナライトを添加る、標識物質と会合させる方法に
よるか、あるいはアナライトおよび標識物質のための添
加結合剤についてのアナライトと添加標識物質との競合
によって測定される。その改良は一般的には標識物質の
部分として、第一相中で提供されるか或いは第一相から
成る基質からの検出可能物質の形成を触媒る、標識部を
用いることを含み；そのようにして形成される検出可能
物質は第二の別の相の中に存在る、か或いはその相から
成る。あるいはまた、標識部は基質として役立つことが
でき、それは水性の第一相中での酵素的処理の際に、標
識物質から解離して検出可能物質を形成し；そのように
して形成される検出可能物質は第二の別の相の中に存在
る、かその相から成）立つことができる。第二相への物
質の移行あるいは第二相の形成が測定され、試料中のア
ナライトの存在を測定る、のに用いられる。アナライト
と標識物質との会合、或いは、アナライトおよび標識物
質と添加結合剤との会合は、共有結合または非共有結合
の適当な形態のいかなるものも含むことができ、例えば
抗原／抗体結合あるいは核酸ハイブリッド化である。

本発明の現時点の一つの好ましい具体化においては、ヒ
トの免疫グロブリンＩｇＧについての免疫検定はアルカ
リ性ホスファターゼ標識部をもつヒ）　ＩｇＧ標識物質
を用い、この標識部は水性第一相中の親水性ｐ−フェニ
ルアゾフェニルホスフェート基質を疎水性のｐ−フェニ
ルアゾフェノール検出可能物質へ酵素的に変換る、。こ
の具体化は標識物質とヒ）　ＩｇＧ抗体とを試料へ添加
し、この反応混合物を保温し、抗体と会合した標識物質
を非会合標識物質から分離る、ことを含む。この水性試
料相中の非会合の分離された標識物質あるいは水性相中
に置かれた分離した会合標識物質は、ｐ−フェニルアゾ
フェニルホスフェート基質ト、ｐ−フェニルアゾフェノ
ール検出可能物質の形成を許す条件の下で接触させられ
る。この水性筒一相は非水性液状第二相（有機溶剤）と
接触させられ、ｐ−フェニルアゾフェノールのこの有機
液相への移行が肉眼的あるいは比色的手段によって測定
される。別の具体化はツク−オキシダーゼ標識物質のよ
うな他の標識物質の使用を含み、この物質は水性相中で
かつ空気存在下においてメチルオキソブタナール基質の
ズタンジオ／検出可能物質への転化を触媒し、この物質
は比較的高い蒸気圧をもち且つ水性相上を蔽う気相中に
おいて臭覚、燐光あるいは他の化合物との第二次反応に
よって検出できる。その他の具体化はコラ−ゲナーゼ標
識物質を用い、この物質は、水性相中に置いた固体コラ
ーゲン／青色デキストラン・ビード基質から、第二の別
の水相中に存在る、ことができる可溶性検出可能物質の
形成を触媒る、。

本発明による改良結合検出法は、第一相と非混和性の液
であるか或いは第一相と別の固体状、液体状または気体
状の相であるかの何れかである第二の相の中に存在る、
か、または第二の相として存在る、、検出可能物質の測
定を容易にる、。本発明によって包括されるものは第一
相中で提供される基質を別の第二相中に存在る、物質へ
転化させることを触媒る、酵素を標識部の部分として付
着させた標識物質を利用る、方法である。また、標識部
が第一相として存在る、基質から、別の第二相中に存在
し得る検出可能物質を酵素的に形成または放出る、方法
が包含されている。このような標識物質の例は、親水性
物質から疎水性物質の形成あるいはその逆、固体または
液状の基質からの固体状、液状またはガス状の物質の形
成、水性相中で可溶または不溶の固体基質の反対溶解特
性物質への転化、および／または固体基質からの物質の
放出、を触媒る、酵素から成る標識である。

また、採用される標識物質が、第一相中での酵素的処理
の際に標識物質から解離しかつ第二の別の相の中で存在
る、か或いは第二の別の相として存在る、。検出可能物
質を形成る、標識部をもつ、方法が含まれている。形成
されることができ且つそれらの固有の性質に基づいて周
知の手段によって検出できる物質は、本発明に従って採
用る、ことができ、そして、螢光団、発色団、化学発光
群、酵素、芳香化合物、および検出を容易にる、固有性
質に基づいて選ぶことができるその他の化合物を含む。

本発明の改良検定法による別相中の検出可能物質の測定
は、家庭の健康診断テストキットを含む二進的すなわち
「イエス／ノー」型検定での使用、および微生物、ビー
ルス、ステロイド、農薬および抗体の存在について現場
テストの工業的用途、に適している。

上記の通シ、本発明の方法は、別の相へ移され或いは別
の相として存在る、酵素的に発生る、物質を通して分析
的検定法を提供る、ものであり、マチアツソンらによっ
て開示されている方法とは区別されるものであり、彼ら
の方法においては、結合した標識物質「複合体」および
非結合状の標識物質「反応物」が非混和性液相中に非対
称的に分配され、標識活性はその中で測定される。マチ
アツンンらのＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８　：１１７−４７（１
９８２）　；米国特許４４，３１２，９４４を見よ。

本発明のその他の側面および利点は以下の詳細記述を考
察る、ことによって明らかになるが、第１図から第６図
は、本発明の現在好ましい具体化に従って、別相中に存
在る、酵素的に発生した検出可能物質の存在を測定る、
ことを通じて試料中のアナライトの存在を分析的に測定
る、、改良結合測定法をグラフ的に描いているものであ
る。

詳細説明 、以下の実施例はいくつかの好ましい手順に従う本発明
の実際を例証る、ものである。さらに特定的にいえば、
代表的標識物質すなわちヒト免疫グロブリンＩｇＧのア
ルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、およびコ
ラ−ゲナーゼ複合体の調製；水性血清試料中のヒト免疫
グロブリンＩｇＧの存在を測定る、ためのアルカリ性ホ
スファターゼ標識物質の使用；および、分析的検定手順
におけるパーオキシダーゼ標識物質およびコラ−ゲナー
ゼ標識物質の案出された使用；を取扱っている。

実施例　１ １、物質　ヒトＩｇＧ　（ロット１９２８６）、アフイ
ニテイ精製（ヤギ）抗−ウサギ、ＩｇＧ　＜ロット１５
１３７）、および（ヤギ）抗−ヒト　ＩｇＧ１Ｆａｂ’
断片スペシフインク（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）　（ｏット１
７０２６）をカッベル研究所（マルベルン、ペンシルバ
ニア州）から購入した。スクシンイミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）およびＮ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（ＳＤＤＰ）をピ
アス・ケミカル・カンパニー（ロックフォード、イリノ
イス州）から得た。シアノーゲンプロマイド活性化セフ
ァロース４Ｂおよびゲルノミ−ミエーション媒体、セフ
ァデックスＧ−２５とセファクリルＳ　−２００および
Ｓ　−３００をファーマシア・ファイン・ケミカルズ（
ビス力タウエー、ニュージャージ州）から得た。

アルカリ性ホスファターゼ・タイプ■−Ｌ（ロッ゛ドア
２　Ｆ　−５ｔ１ｏ）、コラ−ゲナーゼ（高純度、ロッ
ト３３　Ｆ　−６８１９）、ペプシン（２Ｘ結晶化）、
パーオキシダーゼ（タイプ■）ジテオスレイトール、メ
ルカプトエチルアミン、ビス−トリス、グルタルアルデ
ヒド、ゼラチン、トリス−（ヒト９０キシメチル）アミ
ノメタン（トリス）、３−（シクロへキシルアミノ）エ
タンスルホン酸（チェス）、グリシン、２−メルカプト
エチルアミン、青色デキストラン、牛血清アルブミン（
７ラクシヨンＶ）およびゲル・ξ−ミエーションの標準
化に使用る、他のプロティン、カタラーゼ、アルドラー
ゼ、チモトリプ／ノーゲンＡ１卵アルズミン、およびチ
トクｏ−ムｃ、ハシグマ・ケミカル・カンバ＝−（セン
トルイス、ミズリー州）から得た。無機質の緩衝剤およ
びその他の塩は試薬級であり、フィッシャー・サイエン
ティフィック・カンパニー（フェアローン、ニューシャ
ーシー州）、マチェンン・コールマン・アンド・ベル（
ノルウッド、オハイオ州）、あるいはシグマ・ケミカル
・カンパニーの何れかから入手した。トルエン（分光光
度測定用等級）、ｐ−フェニルアゾフェノール、ナトリ
ウム、メントール、２−ブタノン、メチルフォーメイト
、およびヨードアセタミドはアルドラーゼ・ケミカル・
カンパニー（ミルウォーキー、ウイスコンシ□ン州）か
ら得た。スパン８５はフリュー力から入手した。その他
の有機化学品および溶剤は試薬級で６Ｄ、アルドリッヒ
・ケミカル・カンパニーあるいはフィッシャー・サイエ
ンティフィック・カンパニーから入手した。

２、　クロマトグラフィーの手順 ゲルパーミェーション・クロマトグラフィーを４℃にお
ける冷凍室内で実施した。クロマトグラフィー系は７ア
ーマシア・ファイン・ケミカルズから購入し、嬬動ポン
プ（モデルＰ−１）、一端または両端に７０−アダプタ
ーをはめたガラスカラム、試料施用器、およびＦＲＡＣ
−１００また＋！ＦＲＡＣ−３００画分捕集器を含んで
いた。カラム流出物の吸収を継続的にファーマシアＵＶ
−２固定波長吸収モニターあるいはギルノン・メディカ
ル・エレクトロニクス社のホロクロム可変波長モニター
（ミドルトン、グイスコンシン州）の何れかで以て追跡
した。代表的なりロマトグラフイ実験においては、カラ
ムを溶離に使う緩衝液のカラム容積の３倍量で以てフラ
ッシュした。シュークロースを試料へ１５チに近い最終
濃度まで添加し、試料を試料施用器へ添加した。カラム
の流れを上向き方向で開始し嬬動ポンプによって調節し
た。カラムから集めた両分中のプロティンの位置を２８
０ｎｍで行なう吸収測定によって測定し、それをファー
マシア・帯状チャート記録計を使って記録した。

３、濃縮および濾過の手順 プロティンの濃縮はアミコン・コーポレーション（レキ
シントン、マサチューセッツ州）ツタイアフロー限外濾
過膜（ＰＭＩＯあるいはＰＭ３Ｑ）およびアミコン濃縮
セルを使って実施した。試料の無菌濾過を使い捨て注射
器とゲルマン・アクロディスク使い捨てフィルター集成
部材（ア／アーバー、ミシガン州）（孔径０，２μｍ）
を使って実施しだ。

４、アルカリ性ホスファターゼ・抗原複合体の製造ヒ）
　ＩｇＧのアルカリ性ホスファターゼ−複合体を、一方
のプロティン上のマレイミド置換基と他方のプロティン
のスル７ヒト１リル置換基との間の反応によってつくっ
た。異質二官能性交差結合剤、ＳＭＣＣ１を使用る、プ
ロティンのアレイミド標識化とその後のスルフヒドリル
標識化プロティンとの反応はヨシタケらのＥｕｒ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０１　：３９５−９９　（１
９７９年）によって使用された類似の方式で行った。プ
ロティン中へのスルフヒドリル基の組入れは異質二官能
性交差結合試薬、５ＰＤＰ。

を使用して、カールソンらのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　
１７３　ニア２３−３７　（１９７８年）に記載の手順
と類似の手順で達成した。

アルカリ性ホスファターゼ・ヒトＴｇＧ（Ｆａｂ′断片
）は次の通シにつくった。２０〜のアルカリ性ホスファ
ターゼをｐＨ７，０の２ｄの０．１　Ｍ燐酸ナトリウム
に溶解し、セファデックスＧ−２５カラムを同じ緩衝液
中で通過させた。この精製アルカリ性７オスフアターゼ
を空洞容積の２．５４中に集めた。

この溶液へ３０℃において攪拌しながら、ジオキチン中
の８．９２ｍＭＳＭＣＣの１１２μぎを添加した。

この添加は各々１２．５μｌの９回の別々の添加として
５分ずつ離して行った。反応は合計で約１００分の間継
続し、次いで溶液をセファデックスＧ−２５カラムへ施
用し、Ｏ，ｌ　Ｍ燐酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、　
ｐＨ７，０中で溶離させた。マレイミド基で以て標識化
されたアルカリ性７オスフアターゼを空洞容積で単離し
た。

ヒトＩｇＧ　（１００’Ｙ）を１０　ｍｌの水に溶解し
、０．１Ｍ酢酸ナトリウム／ＨＣ１、ｐＨ＝　４．３の
ｌｌ中で一晩透析した。透析に続いて、０．３　ｍｌの
酢酸塩緩衝液中のペプシン（３，０■）をこの工ｇＧ溶
液へ添加し、溶液を無菌培養管中へ無菌濾過した。これ
を次に３７℃水浴中に一装置いた。１６時間後、溶液を
濾過し、セファクリルＳ−２００カラム（直径２．６儂
、長さ１００ｃｘ）へ施用し、ｐＨ５，０で０．１Ｍ酢
酸ナトリウム１ＨＣｅ中で溶離した。この（Ｆａｂｌ）
２両分を単離し、約１０ゴへ濃縮した。（Ｆａｂ’）２
濃度は吸収によッテ５．４７×１０″″５Ｍ（ε２８ｏ
＝１．２２×１０５Ｍ”ｃＴＬ−’　）であることが測
定された。５．７Ｘ１０−７モル（Ｆａｂ’）２を複合
体調製で使用る、ために取出し、一方、残シは後の用途
に冷凍室中に貯えた。

十分なジチオトレイトールを少量の酢酸塩緩衝液中で溶
かし、最終濃度が０．０１５　Ｍジチオトレイトールに
等しいように（Ｆａｂ’）２溶液へ添加した。この溶液
を次に約２時間３７℃において攪拌し、その後、セファ
デックスＧ−２５カラムへ施用し、０．１Ｍ燐酸ナトリ
ウム、ｌ　ｍＭ　Ｈ）ＴＡ、　ｐＨ７，０の中で溶離し
た。スルフヒドリル基を含むＦａｌ）′断片をカラム空
洞容積において回収し、直ちにさきに調製したマレイミ
ド基で以て標識したアルカリ性ホスファターゼへ添加し
た。組合せた浴液を次に約７ｒｔｔｌへ濃縮し、無菌濾
過を行ない、無菌培養管中に置き、４℃において一晩攪
拌して複合体形成を行わせた。約２０時間の反応に続い
て、２−メルカプトエチルアミンを５Ｘ１０　　Ｍの最
終濃度まで添加し、未反応マレイミド基と室温において
約３３Ａ時間反応させた。溶液を次にセファクリルＳ−
３００カラムへ施用し、ＴＢＳ中で溶離した。生成物画
分を約２ゴへ濃縮し、冷凍室中に貯えた。

非標識抗原として使用る、ためのＦａｂ′断片を上の第
４節の手順から残っている（Ｆ′１ｌＬ１）′）２溶液
からつくった。溶液をジチオトレイトールの中で０．０
１５Ｍとし、約２時間３７℃で攪拌した。溶液を次に約
２．　ｍｌへ濃縮し、スル７ヒト９リル基のアルキレー
ションを丑−ドアセタミドを０．０３６Ｍの最終濃度ま
で添加る、ことによって開始させた。これを室温で約２
時間反応させ、その後、溶液をセファクリルＳ　−３０
０カラムへ施用し、ＴＢＳ中で溶離した。アルキレーシ
ョンによって封鎖されたスルフヒドリル基をもつＦａｂ
′画分を約２−へ濃縮し、冷凍室中で貯えた。

６、　アルカリ性ホスファターゼ基質の製造検定用に選
ばれる基質はｐ−フェニルアゾフェニルホスフェートで
あった。ホスホリル基導入染料は次の手順に従ってつく
った。５０Ｗ１１のテトラヒドロ７ランおよび１ｄのピ
ルジンの中の１．９８＆のｐ−フェニルアゾフェニルの
溶液へ１−の酸塩化燐（ＰＯＣｅ３）を添加した。反応
混合物を半時間還流加熱して室温へ冷却させた。混合物
を次に注意深＜　１００ｍの２ＮＨ（Ｊ溶液の中へ注ぎ
、１０分間６０℃で完全に攪拌して酸塩化物結合を加水
分解した。この手順はまた遊離水素燐酸の水性相中への
移行を許すものである。次に１有機相を静定させ、水性
相を分離して捨てた。この赤澄色層を５０−の２ＮＨＣ
Ａ溶液で以て洗滌し、赤色沈澱が直ちに形成した。沈澱
を次に濾過し、２　Ｎ　ＨＣｌ溶液で以て洗滌した。こ
の赤色沈澱を５０％ＮａＯＨ溶液中で溶かし、２ＮＨＣ
ｄ溶液の添加によってｐＨ１０，３へ調節した。この塩
基性水溶液をクロロホルムで以て抽出して、クロロホル
ム抽出物が無色となるまでクロロホルムで以て抽出して
未反応出発物質を除いた。所望の遊離燐酸を水溶液から
ｐＨを１，０へ調節る、ことによって沈降させた。生成
物を次に吸引濾過によって集めた。収量は１．１２．Ｆ
（４０％）であった。０．！ｌのｐ−フェニルアゾフェ
ニル・燐酸を１ｄの濃水酸アンモニウム中で室温におい
て溶かした。１時間後、溶剤を蒸発させ、相当る、アン
モニウム塩を定量的に得た。

ｐＨ７，０においてはｐ−フェニルアゾフェノールは主
として中性の形に６Ｄ、３４７％ｍにおいて吸収最大を
示し、吸光係数は２．ＯＸ１０Ｍ″″儂　に等しい。こ
れらの吸光係数は１００％の純度と無水の物質を仮定し
ている。ｐ−フェニルアゾフェニルホスフェートの分析
は１．５個の水分子が存在していることを示している。

ｐＨ１０，０においてはフェノレートアニオンが優勢で
４０３およ′び４３０％ｍに吸収最大をもち、各々、吸
光係数は１．９ｘｌＯＭｃｍ　　である。ｐ−フェニル
アゾフェニルホスフェートはｐＨで以て変らない吸収ス
ペクトルをもつことが発見された。吸収最大は３４０％
ｍにアシ、吸光係数は２．８ｘｌＯＭ−の　に等しい。

ｐ−フェニルアゾフェノールの吸収スペクトルはまたｐ
Ｈ８，５において記録された。このｐＨにおいて、中性
およびアニオン性の７エノールは両者とも、吸収スペク
トルの各々への寄与によって証明される通シ存在る、。

各化学種の濃度はｐＨ７，０とｐＨ１０，０において測
定した吸光係数から計算した。これらの濃度からｐ−フ
ェニルアゾフェノールの酸解離恒数は２．７ｘｌＯＭ　
　（ｐＫａ　＝ｇ、６）に等しいと決定された。

７、　不動化抗体の調製 （ヤギ）抗−ヒトエｇＧ、Ｆａｂ′断片スベ／フィック
抗体をシアノーゲンプロマイド活性化セファロースへ、
ファーマシア・ファインケミカルズが推漿る、手順に従
ってその７フイニテイクロマトグラフイ手法で不動化し
た。２１！の活性セファロースを１５分間２０ｄの１ｍ
Ｍ　ＨＣｌ中で膨潤させ、次いで４００−のＨＣｌ溶液
で以て洗滌した。３５■の抗体を２．５　ａｇの０．１
Ｍ重炭酸ナトリウム中でｐＨ８，３において溶かし、セ
ファデックスＧ−２５カラムへ施用し、同じ緩衝液で溶
離した。この活性化ゲルを１０ｍ／の重炭酸塩緩衝液で
洗滌し、カラムの空洞容積において集めた精製抗体と直
ちに混合した。ゲル／抗体混合物を次にゆつ（シと２時
間室温でゆり動かし、その後、上澄液を取り出し、ゲル
を大量の重炭酸塩緩衝液と０６１Ｍ酢酸塩／ＨＣ，ｌ。

０．５　Ｍ　ＮａＣＪ、　ｐＨ４，３の緩衝液で以て交
互に洗滌した。ゲルを最後にＴＢＳで洗滌し、ゲルを静
定させ、ＴＢＳを添加して緩衝液／ゲルの比を１に等し
くさせた。この１：１のゲル：緩衝液を次に冷凍室に貯
えた。

実施例　２゜ 緩衝液中に溶かしたヒトエｇＧＦａｂ′断片の各種濃度
の検定を次の手順に従って行なった。アルカリ性ホスフ
ァターゼ標識抗原と被検試料を１．５　ｒｔｔｌの容量
の円錐形プラスチック管へ添加し、続いて不動化抗体を
含むゲルを添加した。ゲルは磁気撹拌棒による迅速攪拌
によってスラリーとされた１：１ゲル：緩衝液から容量
的に測定された。少量のゲルについては、この１：１ス
ラリーをまず稀釈した。溶液の合計容積を次に１　％　
ＢＳＡ、　１　ｍＡＭｇＣ１２およびｌ　ｍＭ　ＺｎＣ
ｌ２を含む’ＴＢＳ溶液で以て０．６ｄとした。組合せ
た試料と試薬はアメス（エルクハルト、インディアナ州
）アリコート・ミキサーで以である時間の間室温で、通
常は一晩よく平衡させるようゆり動かした。上澄液とゲ
ルはエツベンドルフ（プリンクマン・インスンルメンツ
、ウェストヘリ−、ニューヨーク州）モデル５４１４遠
心分離機の中で円錐管の遠心作用によって分ｉし、続い
てパスツール・ピにットで以て上澄液を除いた。ゲルを
次に、ＴＢＳの添加とそれに続く混合、遠心分離および
緩衝液の除去によって数回洗滌した。上澄液とゲル画分
をスクリューキャップをもつ別々の使い捨ての１３ｒＩ
ａｎＸ　１００＋＋ｃｍのガラス培養管の中においた。

３個の対照標準を各々の免疫検定系列で以て実施した。

対照標準１　（ａｔ）においては、検定管は系列中の他
の検定管と同量のゲルと複合体を含んでいた。更に、大
過剰の抗原、１０　　モル、を添加した。試薬が適切に
反応しつつある場合には、複合体はすべて試料の上澄液
の中に見出されるはずである。対照標準■（ｃ２）にお
いては、検定管はゲルだけを含み、従って酵素活性は上
澄液またはゲル相中で見出されるべきでない。対照標準
■（ｃ３）においては、複合体だけが添加され、従って
最大の酵素活性を測定る、ことができる。これらの１対
照標準は平衡化し、相分離させ、系列中の他の検定管に
ついて使用る、同じ方式で各相について指示反応を実施
した。

指示反応は上澄あるいはゲルを含む各々の培養管へＴＢ
Ｓ−ＢＳＡ−金属（１％　ＢＳＡ、　１　ｍＭ　”９−
　Ｃ１２１ｍＭ　ＺｎＣｌ２　）緩衝液を１．２−の最
終容積まで添加る、ことＫよって実施した。１，５−の
トルエンを各管へ添加し１反応はＴＢＳ中の５Ｘ１０　
　Ｍ　ｐ−フェニルアゾフェニルホス７エートノ２００
μｌの添加で以て開始させた。管を次にゆるやかに室温
においてゆシ動かし、トルエン相の肉眼的検査と吸収測
定のために周期的に取シ出した。吸収測定には、管をメ
イクトロニック２１吸収ス−＜クト０メーター（バラシ
ュ・アンド・ロム、ロチニスター、ニューヨーク州）の
中においた。培養管中の水性相（１，４ゴ）とトルエン
相（１，５ｍＡ’）の容積はスペクトロメーター中の光
線をトルエン相のみを通過させ、従ってトルエン相中へ
分配された染料のみ測定される。

２、　　別相中のｐ−フェニルアゾフェノールの検出こ
の検定を実施る、出発点として、セファロースゲルへ不
動化された抗体はアルカリ性ホスファターゼ−抗原複合
体の中へ滴定されて複合体全部を結合る、のに必要とさ
れるゲルの最少量を決定る、。ゲルへ不動化された抗体
は（ヤギ）抗−ヒトＩｇＧ、　Ｆａｂ’断片スペシフィ
ックであった。上澄液とゲルの両者を、１０−１１モル
の複合体と各種の量のゲルとの平衡化に続いて染料分配
指示反応で以て分析した。上澄液のトルエン層中の染料
吸収はゲルを多く使用る、ほど減少し、一方、ゲル試料
のトルエン層の吸収は増加した。これはゲル上で不動化
された抗体への複合体の結合を示す。この分析からのデ
ーターはグラフで第１図に示す。

第１図から、１２μｌのゲルが上澄液からアルカリ性ホ
スファターゼ活性のすべてを除くのに十分で　　　・る
ることが明らかである。ゲルはゲルのゴあたシ多くて３
．３　Ｘ　１０−８モルの抗体を含む。５■の抗体が免
疫化過程中で１ゴのゲルについて反応したからである。

１２μｌのゲルはそれ故、４×１０　モルの抗体を含み
、これは各試料中に存在る、標識抗原よシ多くて４０倍
過剰である。複合体濃度は複合体（画分■）中のアルカ
リ性ホスファターゼ対Ｆａｂ′の仮定された２：１の比
と２８０ｎｍにおける吸収の吸光係数の相当る、和に基
づいている（ε２８０ｎｍ、アルカリ性ホスファターゼ
＝　７．４　Ｘ１０　Ｍ″″儂　、ε２８０ｎｍ、　Ｆ
ａｂｔ　＝　６−　Ｉ　Ｘ　１０　Ｍ−儂。

従９てε２８０　ｎｍ、アルカリ性ホス７アターゼーＦ
ａｂ７＝２．ｌＸ１０Ｍ″″α　）。複合体組成はセフ
ァクリル・クロマトグラフィー精製過程の間に回収され
る両分の溶離容積から推論された。検定は、１０−１１
モルのアルカリ性ホスファターゼ−Ｆａｂ’複合体と１
２μノのゲルを試料ごとに使ってテストとした。

ＴＢＳ緩衝液中のヒト脆ＧＦａｂｌ断片の各種溶液を上
述の手順に従って検定し、結果の代表的系列を、指示反
応を２時間行わせた後に、第２図に示す。試料からの上
澄画分は一般的には、Ｆａｂｌ濃度に対して、トルエン
相へ移行る、染料の量におけるかなり鋭い移り変）を示
した。ゲル画分は一般的には一層ゆるやかな移り変シを
示す。上澄液データーは従って「イエス／ノー」型の検
定によりよく用いられ、それらは肉眼的分析によく適し
、−４、ゲルデーターは、吸収測定を使って、１０倍か
ら１００倍の濃度範囲にわたって、抗原濃度を測定る、
のによりよ（適している。第２図に示す検定において、
正指示反応から負指示反応への移シ変シは上澄画分につ
いて１×１０　　モルと２ＸｌＯ−１０モルの間のＦａ
ｂｌ（ｚ１×１０ＭＦａｂ／および１．４×１０−７Ｍ
Ｆａｂｌ）でおこる。吸収はゲル画分について約１０　
　　モルのＦａｂｌと５×１０　　モルＦａｂ／の間（
７，１Ｘ１０　　および３−６　Ｘ　１０　　Ｍ　Ｆａ
ｂｔ　）で次第に変化る、。

実施例　３゜ 実施例１および２のヒトＩ　ｇ　Ｇ　Ｆａｂｔ断片・ア
ルカリ性ホスファターゼ標識物質および抗−Ｆａｂ’不
動化抗体を使って実施例２の検定手順に従ってヒト全血
中の工ｇＧについて分析した。免疫検定を実施る、前に
、血液はまず二つの可能性のある妨害源について検査し
た。第一のタイプの妨害は血液中のすべての着色物質か
らであり、それらはトルエンの中へ分配る、ことができ
る。これについてテストる、には、ＴＢＳ中の全血の２
元稀、択物を、非稀釈血液から１部を２５６に稀めた血
液にわたってつくシ、検定実施のときにトルエンと混合
した。２時間混合後、トルエン相中において色は見出さ
れなかった。第二のタイプの妨害は血ｌ夜中で存在る、
ことが知られているアルカリ性７オスフアターゼからで
るる。血液稀釈物を再びつ（す、ｐ−フェニルアゾフェ
ニルホスフエートヲ添加しかつこれをトルエンへ向けて
分配させることによって染料分配指示反応を使って分析
した。トルエン相の吸収を２時間後に検査し、各稀釈物
に対してプロットしたそれらの値を第３図に示す。１０
の単位で１以下の稀釈において見られる吸収値は、培養
管壁へ付着る、血液成分および光散乱に基づ（よシ高い
吸収値をもたらすエマルジョン形成のために、染料吸収
よシも大きい。８個の最も濃厚な血液試料を含む検定管
を２時間後に検査した。

３個の最も濃い液の中でやや黄色が見られた。それらの
結果は、１０の単位で１よシ大きい血液稀釈液について
実施した検定は生のアルカリ性ホスファターゼ活性から
の妨害から解放されるはずであることを示している。

検量曲線をＴＢＳ中のヒトＩｇＧの二元稀釈を用いてつ
（つた。実施例２０手順に従う検定を抗原の各稀釈物に
ついて実施し、結果を２時間の展開時間について第４図
にプロットした。トルエン吸収の移ｂｖｂは上澄画分中
で１×１０　　および２×１０　　モルの間のヒトＩｇ
Ｇ（７，ｌＸｌ０　　Ｍと１．４ＸＩＱ　　Ｍの工ｇＧ
　）において明らかに見られる。

血液稀釈物の免疫検定を次に実施した。結果を第５図に
おいて、上澄液変色が明らかに眼に見える２時間の展開
時間について示した。また第６図においては、１時間と
４時間の展開時間における全血の免疫検定データーが示
されている。移り変りは１時間において明らかに現われ
、展開時間が４時間へ増すにつれて違いが現われ続ける
。、１″？ジテイズ上澄画分中のトルエン層の強い黄色
化が現われ、水性相は白色沈澱物の形成で以て無色にな
る。

白色沈澱物は染料の加水分解から形成される無機燐酸塩
から生ずる。燐酸塩は緩衝液中に存在る、２価金属で以
て沈澱る、。ゲル画分は抗原濃度範囲にわたってトルエ
ン吸収において一層ゆるやかな変化を示すので、上澄液
画分中の移り変シは目で見ることができない。

血液稀釈物の上澄画分中、およびＩｇＧ検量曲線におけ
る移り変シ点から、もとの血液試料中の馳Ｇ濃度が計算
できる。正常の大人の工ｇＧ／ＩＩｋ度は８と１５　ｑ
　ＩｇＧ／ｍ／・血液の間にあることが報告されてンズ
、　１９７８年）ｐ、１８９゜我々がテストした血液試
料中のＩｇＧ濃度は１０と１４＋ηＩｇＧ／ｍＪ・血液
の間にあることが測定された。この値は予期通り、正常
のＩｇＧ濃度範囲と重なっている。この検定結果の不確
実さの水準は検定される標準と試料の濃度の間のへだた
シの関数である。濃度における不確実さは血液試料のよ
シ多くの稀釈液をテストしかつ検量系列中のＩｇＧのよ
り多くの濃度をテストる、ことによって減らすことがで
きる。

実施例　４゜ 別の蒸気相中の検出可能物質の検出に基づ（免疫検定 以下の手順が本発明の実際において有用で心ることが期
待される。

バーオー＋シダーゼ・抗体複合体を二つの手順の何れか
によってつくった。第一の手順においては、パーオキシ
ダーゼをＳＭＣＣと反応させ、次に抗体のＦａｂ／粒子
と、実施例１においてアルカリ性ホスファターゼ標識ヒ
トエｇＧＦａｂ１粒子の調製において述べた通シに反応
させた。第１表は三つの複合体の各々において使用した
試薬の相対的量および得られる複合体の組成を示してい
る。複合体組成はε２８０ｎｍ、　Ｆａｂ’粒子−＝６
．ｌＸ１０　　Ｍ　　およびε４３０ｎｍ、パーオキシ
ダーゼ＝１ｘｌＯＭ−を仮定る、吸収スペクトルによっ
て決定した。補正は２８０ｎｍにおけるパーオキシダー
ゼの吸収について行った。

第１表 パーオキシダーゼ　　Ｆ　　ｚ１モル当シＦａｂ１１モ
ル当シ１舌ル当シに添加　　に添加したパー　　に複合
したパーしかＳＭＣＣモル数　　オキシダーゼ・　　　
オキシダーゼの５０　　　　　　　　５、４　　　　　
　　　２．０４９　　　　　　　　　５、１　　　　　
　　　１．７５０　　　　　　　　５、０　　　　　　
　　０．８２パ一オキシダーゼ標識抗体をつ（る第二の
手順に２いては、パーオキシダーゼおよび全ＩｇＣ抗体
を各々別々に５ＰＤＰと反応させた。５ＰＤＰ標識パー
オキシダーゼあるいは抗体を次にジチオトレイトールと
反応させてチオール標識パーオキシダーゼあるいは抗体
を生成させ、これを次に５ＰＤＰ標識抗体または、４−
オキ７ダーゼと結合させた。

この手順はＪ、カールソン、Ｈ，ドレビン、およびに記
載されるものと類似である。以下の詳細記述が代表的で
ある。２！ＩＬｌのＰＢＳ中のＬ２．６ｍＷの（ヤギ）
抗−ウサギＩｇＧをエタノール中の２０ｍＭ５ＰＤＰの
２３．５μｌと組合わせた。この溶液をゆるやかに室温
で１時間攪拌し、次いでセファデックスＧ−２５カラム
上で精製し、０、Ｉ　Ｎ　ＮａＣ１を含む０，１Ｍの酢
酸ナトリウムで以てｐＨ４，５において溶離した。ジチ
オトレイトールをこの溶液へ２５ｍＭ溶液を生成させる
のに十分な量で添加した。この混合物を約１５分間室温
で攪拌し、その後、ｐＨ７，５で０．　Ｉ　Ｎ燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスＧ−２５カラム上
で濃縮および精製した。

パーオキシダーゼ（４３Ｗ）を０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＣ１
を含むｐＨ７，５のＯ，’Ｉ　Ｎ燐酸ナトリウムの４１
ｒＬｌの中に溶かした。これへ６７５μｌの２０ｍＭ５
ＰＤＰを添加し、得られる溶液を１時間攪拌し、その時
点で溶液をセファデックスＧ−２５カラムへ施用し、ｐ
Ｈ７，５の０．ＩＮ燐酸ナトリウムで以て溶離した。誘
導体化すれた・ξ−オキシダーゼがカラム空洞容積中に
得られ、２０ｍ１へ濃縮された。パーオキシダーゼ・５
ＰＤＰを次に誘導体化された抗体と組合わせた。

この溶液を、８ａＥ／の合計容積まで濃縮し、室温にお
いて攪拌しながら約２０時間反応させた。この複合体を
ＰＢＳで以て溶離る、セファデックスＧ−１００カラム
上で単離した。

上記手順によってつくったパーオキシダーゼ・抗体複合
体の組成を第■表の第一欄に列記る、。

類似手順によってつくった他の複合体も列記した。

全抗体濃度はε２８０　ｎｍ、　ＩｇＧ　＝　２　Ｘ　
１０　Ｍ　　に基づいている。

第■表 バーオキシダ　　抗体１モル　　抗体１モル　　抗体１
モル当１５　　　　　５．２　　　　　１０　　　　　
　０．７８２０　　　　　２、５　　　　　　２．１　
　　　　１．９１５　　　　　５、２　　　　　１０　
　　　　　０．８５２、パーオキシダーゼ基質の合成 選んだパーオキシダーゼ基質、２−メチル−３−オキソ
ブタナール（ＭＯＢ）をディールスらの卜４９巻、　１
５８　（１９１６年）の一般的手順に従ってつくった。

１１．５　ｇのナトリウム金属を５００ｒＩＬｌの無水
エーテル中の２５ｍＡ’のメタノールと組合わせ、窒素
下で一晩攪拌させた。このエーテル溶液を次に氷の中で
冷却し１．３０．８ｍｌの蟻酸メチルを添加し、次いで
４４．８１！Ｌｌの２−ブタノンをゆつ（シと添加した
（３０分から１時間）。これを−晩室温において攪拌し
、黄色溶液中の白色固体スラリーの生成をもたらした。

固体を濾過によって単離し５００−の氷水に溶かした。

これにゆつくシと３００　ａｔの水の中の３０ｍＪの硫
酸の冷凍溶液の１５０ｄを添加した。

この酸性化溶液を次に、各部当１ｏｏｏｙの４部のエー
テルで以て抽出した。組合わせたエーテル画分を次に５
０−の水で以て洗滌し、続いて飽和塩化ナトリウムを含
む水の２Ｘ５０ｍＪ部分で以て洗滌した。エーテル溶液
を硫酸マグネシウムで以て乾燥し、濾過し、エーテルを
蒸溜によって除去した。固体生成物を昇華によって精製
し、−８０℃で貯えた。このＭＯＢを使用前に第二の昇
華によって精製した。

２−メチル−３−オキソブタナール（ＭＯＢ）は緩衝液
中で溶解酸素と反応して２．３−ブタンジオン（ビアセ
チル）を生成した。この反応は酵素パーオキシダーゼに
よって触媒される。この反応過程はビアセチルの生成に
伴なう化学発光により或いは酸素消費量によって追跡る
、ことができる。反応速度に関係る、いくつかのデータ
ーを第■表に示す。酸素消費量はクラーク電極と酸素モ
ニター（イエロー・スプリング・インスッルメントＧｏ
、’イエロースプリング、オハイオ州）で以て測定した
。ビアセチルの１モルは消費酸素１モルについて生成さ
れるはずであるので、５０チの酸素消費は空気飽和溶液
中で約１．２Ｘ１０−’Ｍのビアセチルの生成ニ相尚る
、。この反応混合物へのアセチルアセトンの添加が酸素
吸収を助けることに注目すべきである。試験した溶液は
はじめは空気飽和であった。

抗−ヤギＩｇＧを含む検定管へ添加る、。この混合物へ
またパーオキシダーゼ標識ヤギＩｇＧを試料抗原の存在
なしで不動化抗体によって完全に結合されるのに十分な
少量で添加る、。これを平衡化して試料抗原とパーオキ
シダーゼ標識抗原との不動化抗体への競合的結合を行わ
せる。固体担体と上澄液を次にｒ過または遠心分離によ
って分離し、両画分を十分なＭＯＢをｐＨ６，５の０．
０１　Ｍビス−トリス中で添加して１０　　Ｍの最終Ｍ
ＯＢ濃度を達成させる。反応は栓付きの管の中で数分ま
たはそれより長く進行させる。試料中の抗原の存在は上
澄画分を分析る、とき溶液上方の蒸気相中のビアセチル
の存在によって示される。ゲル画分を分析る、とき、そ
の逆も真である。ビアセチルはその蒸気相燐先によって
測定できる燐光性化合物である。

しかし、はるかに簡単には、ビアセチルの存在はその芳
香によって決定できる。〔ビアセチルはバターの主要な
芳香性成分であり、水溶液中でその芳香によって２．３
　ｐｐｍ　（２，７Ｘ　１０　　Ｍ）において検出でき
る。（Ｗ、　Ｈ，ンユタール（編）、Ｃｏｍｐｉｌａｔ
ｉｏｎｏｆ　０ａｏｒ　ａｎｄ　Ｔａ５ｔｅ　Ｔｈｒｅ
ｓｈｏｌｄ　Ｖａｌｕｅｓ　Ｄａｔａ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｔｅｓｔ
ｉｎｇａｎａ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ。

ＡＳＴＭデーターシリーズＤＳ４８．フイラデルフイア
、パサデイナ州）〕。第■表のデーターはビアセチルが
、１０　Ｍのパーオキシダーゼが１０　　ＭのＭＯＢを
含む溶液中に存在る、ときに、数分以内でその芳香によ
って検出が容易にできる量で生成されることを示してい
る。アセチルアセトンを反応を容易にる、ために添加し
てよい。

実施例　５゜ 可溶化検出可能物質の検出に基づく免疫検定以下の手順
は本発明の実際において有用でるることが期待される。

１、　コラ−ゲナーゼ標識物質の調製 コラ−ゲナーゼ・ヒトＦａｂ／複合体をアルカリ性ホス
ファターゼ・ヒトＦａｂ　を複合体をつくる実施例１に
記載の同じ手順によってつ（つた。２．５　ｒｔｔｌの
ｐＨ７，０の０．１１’Ｔ燐酸ナトリウム緩衝液中の２
４■の高純度コラ−ゲナーゼ（１６００単位／Ｗ９・プ
ロティン）ジオキサン中の８．９　ｍＭ　ＳＭＣＣ溶液
の１７１μｌと反応させた。これは各々１９μｌで９回
にわけて、各回５分ずつ時間をあけて添加され、その間
プロティン溶液は３０℃の水浴中で攪拌した。反応はす
べての添加を行ったのちに約１時間継続１次いで誘導体
化コラ−ゲナーゼを１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，
０の０．ＩＮ燐酸ナトリウムで以て溶離る、セファデッ
クスＧ−２５カラム中で単離した。ヒトＩｇＧの（Ｆａ
ｂ’）２調製剤は実施例１に記載の通りにつくシ、２．
２Ｘ１０″′７モル（２２＋＋ｖ）をｐＨ５，０の０．
０１５Ｍジチオトレイトールおよび０．ＩＮ酢酸ナトリ
ウムの中で分割してＦａｂ’断片を形成させ、これをｌ
　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，０の０．ＩＮ燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスＧ−２５カラムの
上で単離した。このＦａｂ／断片を次に誘導体化コラ−
ゲナーゼと混合し、約４ｍｌへ濃縮し、攪拌しながら４
℃で２４時間反応させた。溶液を次に１１のＴＢＳの中
で一晩透析し、その後、Ｃａ　０１３２ｋＯ，ｏＩＮの
最終濃度まで添加し、続いてβ−メル、カプトエチルア
ミンを５Ｘ１０　　Ｍの最終濃度まで添加した（未反応
マレイミド機能の封鎖）。この反応は室温において２時
間進行し、その時点において溶液をセファクリルＳ　−
２００カラムへ施用し、１　ｍＮ　Ｃａ（Ｊ　　てｌ　
ｍＮ　ＺｎＣＡ！２を含むＴＢＳで以て啓離した。複合
体含有画分を集め、２．４　ｒｄへ濃縮し、４℃で貯蔵
した。セファクリルＳ　−２００カラムの２８０ｎｍに
おける吸収像から、この複合体は約１．５Ｆａｂｔ／コ
ラ−ゲナーゼを含むことが推定された。

着色剤用青色デキストランを含むコラーゲンビードをア
ルブミンビード調製において使用した類似の手順によっ
てつ（つた（Ｔ、に、！Ｊ−１Ｔ、Ｄ。

ノコロスキーおよびＧ、　ｐ、　ｏイヤー、５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　２１３２３３−２３５　（１９８１）　）。高
分子量青色デキストランがコラーゲンと青色デキストラ
ンとの合計重量の５チ、１０％、１５％、２０チ、２５
％および５０チを構成る、ビードをつくった。すべての
調製において、この両４リマーの合計重量は３．７５１
１であった。これを２１．２５ｇの水へ添加し、はじめ
は７０℃へ、そして次に９０℃へ加熱して溶液を明澄化
させた。

５００　ｖｔｌフラスコ中のコーン油２５０フを水浴中
で４５℃へ加熱し、オーバーヘッド機械攪拌器で以て迅
速に攪拌した。この攪拌油へ７．５ｍＪのス／ξ／８５
を添加し、続いてコラーゲン溶液をゆつくシと添加した
。ビード形成が直ちにおこった。２５チグルタルアルデ
ヒドの６００μｌを次に添加し、攪拌を２０分間継続し
た。油を次に傾瀉し、ビードをヘキサンで以て４回洗滌
し、紙タオル片の間で吸取シ乾燥を行った。乾燥後、ビ
ート９を水で３回洗滌し、水の中で４℃において貯えた
。

ナーゼ転化 青色デキストラン／コラーゲン・ビードのコシ−ゲナー
ゼ酵素的消化を、各種の量のコラ−ゲナーゼを０．１８
１１’のビードへ添加し混合物合計容積をＴＢｓと３０
μｌの０．１　Ｎ　０ａＣＡ！　２との添加によって３
　ｔｔｔｌとる、ことによって検査した。各種の反応混
合物を１．２．３．４および１９時間の反応ののちに肉
眼で検査した。また、１９時間において、溶液の吸収値
を６１５０ｍにおいて記録してコラーゲンマトリックス
から青色デキストラン放出による最大の溶液着色を測定
した。この検討の結果を２５チ青色デキストラン／コラ
ーゲン・ビードについて第■表にまとめた。その他のビ
ード組成物は類似の結果を与えたが、ビード組成中の青
色デキストランの量に応じて６１５ｎｍ吸収がよシ大き
く或いはより小さい。

第■表 ０　　　　　　　熱溶ｉ％　　　　　０．１６７４０キ
ロ単位　　　　　２　　　　　　　０．８０８８キロ単
位　　　　　３　　　　　　　　０．７９１１６キロ単
位　　　　１９　　　　　　　　０．７８９３２０　　
単位　　　　１９　　　　　　　０．７８９米　１単位
は、カルシウムイオン存在下のｐＨ７，４および３７℃
において５時間で、ニンヒドリン色でＬ−ロイシンの１
．０マイクロモルに等しいコラーゲンからのペプチドを
遊離させるものでるる（シグマ・ケミカル・Ｃｏ、の規
格）。

４、基質のコラ−ゲナーゼ複合体消化 ヒート消化実験をコラ−ゲナーゼ・ヒトＦａｂ／複合体
を使って次に繰返した。結果を第ｖ表に表示る、。６管
へ添加る、コラ−ゲナーゼ活性の量はシグマ・ケミカル
・ＣＯから入手のままのコラ−ゲナーゼの活性（１６０
０単位／ｌ１９プロティン）に基づいて、複合化過程の
影響を反映させていない。コラ−ゲナーゼ濃度は複合体
中の１．５：１のＦａｂ／：コラ−ゲナーゼ比と、Ｌ　
５　Ｆａｂ’および１コラ−ゲナーゼの２９Ｑｎｍにお
ける吸光係数の和である５２８０ｎｍ。

複合体〜２．４Ｘ１０Ｍ　　と、を仮定して測定した。

反応の進行は上置液の６１５ｎｍの吸収（Ａ６□５）に
よって追跡る、。２５％の青色デキストランを含むビー
ドと０．１８１１のビードをここでも試料として使った
。

つかの形式の何れかに従って実施できる。ヒトＩｇＧに
ついての競合的不均質系検定法を次に説明る、。未知量
の抗原を含む試料をコラ−ゲナーゼ・ヒ）　Ｆａｂｔお
よび十分なセファロース不動化抗−ヒトＦａｂｔと組合
わせて抗原不在下ですべてのコラ−ゲナーゼ活性を結合
させる。この混合物を、コラーゲン・抗原と試料抗原が
不動化抗体の限定された量へ結合る、よう競合る、ので
平衡化させる。

上澄液と固体を次にｆ過または遠心分離によって分離る
、。両両分へ青色デキストランを含むコラーゲンビード
を添加る、。ビードの量は、試料中での懸濁中、あるい
は試料が不透明であれば底へ沈降したのち、の何れかで
肉眼で識別できる程度の量であればよい。゛試料がビー
ドの存在を完全に不明瞭化る、場合には、ビードは試料
の液状部分の頌瀉またはｆ通抜に、見ることが可能であ
るようにしてよい。ビードと共に添加る、緩衝液はＣａ
Ｃ１２を１州に近い最終濃度で含む。画分中に存在る、
コラ−ゲナーゼ・ヒトＦａｂ／によるビードの消化を数
時間進行させ、その後、両分を肉眼検査してビードの溶
解がおこったかどうかを確かめる。ビードの溶解と上澄
画分中の青色デキストラン着色剤の放出はもとの試料の
中の十分大量の抗原の存在を示すものであり、一方、ビ
ード溶解とセファロースゲル画分中の着色剤放出はその
逆を示す。

実施例１の標識物質を使用る、実施例３の方法は、本発
明による試料中のアナライトの分析的測定にとって、現
在では明らかに、最も好ましくかつ完全にテストされた
具体化であるけれども、等しく有効な分析的測定は本発
明による他の改良された分析的結合検定を使用る、こと
によって達成されてよい。

上記の通シ、本発明は試料中のアナライトの分析的測定
のために１　アナライトと添加標識物質との会合反応に
よシ或いはアナライトおよび添加標識物質とアナライト
および標識物質用の添加結合剤との競合的会合反応によ
る改良された結合検定法を含むものであり、その場合、
その改良は標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質から或いは水性相と別の第一相から成る基質
からの検出可能物質の形成を触媒る、か、あるいは水性
第一相中で酵素的処理を行う際に標識物質から解離して
検出可能物質を形成る、か、の何れかである標識部を用
いることにアシ、そのようにして形成される物質は第一
相と別の第二相の中に存在る、か或いは第二相として存
在る、ことができる。会合および／または非会合の標識
物質（用いる標識部に依存る、が、それはまた分離工程
を必要とる、かどうかを決定る、）を水性相で基質また
は酵素と上記物質を形成させる条件の下で接触させる。

用いる標識部にまた応じて、物質の形成　。

は第二の別の相としてのその物質の存在を測定る、こと
によって直接的に測定され、あるいは第一相を第二の別
の相と、第一相から第二相への検出可能量の物質の移行
を許す条件の下で接触させる。

第二相中の物質の移行は次に、第ニー相中の物質の存在
を測定る、ことによって直接的に測定る、か、あるいは
、物質量の減少を比色、肉眼、あるいは嗅覚的手段を含
む周知の手段によシ或いは計器的測定によって追跡る、
ことによって間接的に測定される。希望る、場合には、
試料中に存在る、アナライトの量はまた、既知量のアナ
ライトを含む試料をつくり、各既知試料について本発明
による分析的測定を行い、そしてよく知られた方法に従
って各既知試料について結果をプロットる、ことによっ
て構成される標準曲線から外挿る、ことによって決定る
、こともできる。

実施例１．４および５の改良された結合検定法は標識物
質の調製を例証る、ものでｌ）、そして実施例２および
３は°結合検定法における標識物質の利用を例証してお
シ、それらにおいて、試料相中のアナライトの存在は別
の第二相中に存在る、物質の存在を検出る、ことによっ
て測定され、且つ、その物質は第一相中の標識物質の標
識部が関係る、酵素反応から生ずる。更に特定的にいえ
ば、実施例２および３は、試料中のアナライトの存在の
測定が添加結合剤との会合についてのアナライトと標識
物質との間の競合によって達成される検定法を例証して
おシ；会合物質と非会合物質金相互に分離し、分離した
会合標識物質を緩衝液から成るか或いは非結合標識物質
を水性第一相として含む上置液を用いる水性第一相の中
に置き、そして第一相の中で、その中の結合または非結
合標識物質によって酵素的にある物質へ転化される基質
を提供し、その物質が検出可能の量で、第一相と接触状
態とさせた第二の別の有機液相へ移行されそしてその中
で検出される。添加結合剤に対る、アナライトおよび標
識物質の競合に基づき、結合剤と会合しない標識物質の
量は試料中に存在る、アナライトの景の増加と共に増加
し、結合剤と会合る、標識物質の量は存在る、アナライ
トの量の増加と共に減少る、。利用る、標識物質は測定
されるべきアナライトのアルカリ性ホスファターゼ複合
体であったが、与えられた基質を既知物質へ触媒る、数
多くの他の酵素的標識も使用る、ことができ、例えば実
施例４および５に開示のパーオキシダーゼおよびコラ−
ゲナーゼの複合体である。

その他の形の添加結合剤も使用してよく、ビードあるい
は反応容器の壁のような他の既知担体物質へ不動化させ
た抗体も含まれる。

第二相は基質が中に提供され或いはその相として存在る
、第一相とは別であるように選ばれ、そして、物質が自
らが第二相から成る場合には、第二相へ相境界を横切っ
て検出可能物質の検出可能量が移行る、のを許すように
選ばれる。前記の各実施例においては水性試料（血清ま
たは緩衝液）を用いた。可能性のめる第二の別の相は、
この場合、相という用語はある物理系の均質で機械的に
分離可能の部分として定義される（　Ｅｎｃｙｃ１日、
　Ｂｒ１ｔ１４巻、２０４頁）が、従ってガス相、固相
、あるいは試料相と混和しない液相を含む。有機溶剤（
トルエン）の形の後者の別の相は上記概説の実施例２お
よび３に対して選ばれた。第二相はまた、°物質が溶解
性、ガス状性質あるいはその他の物理化学的性質に基づ
いてその第二相中の存在を「よシ好む」ように、物質の
性質に依存して選ばれる。

例証的実施例の有機溶剤第二相はまた、酵素的に生成さ
れる物質ｐ−フェニルアゾフェノールが疎水性であり、
液相間の境界を横切って移行し、非水性有機液相中で検
出可能量で存在る、ので選ばれた。

本発明の他の期待される具体化は、ガス状物質が液相試
料の上方のガス相中で追跡される改良検定法を含む。酵
素処理の際に第二の別のガス相の中で存在る、物質を生
成る、ことができる数多くの有力な標識が利用できる。

実施例４において示した通シ、メチルオキンブタナール
は空気存在下で酵素パーオキシダーゼによってブタンジ
オンへ転化されることが発見された。ブタンジオンはバ
ターの臭をもつ強い芳香のある物質であり、食品工業に
おいて利用されている。非ガス状第一相中のパーオキシ
ダーゼ複合化標識物質によるメチルオキンブタナールの
ブタンジオンへの酵素的転化は「嗅覚」検定法で用いる
ことができ、ブタンジオンの検出は検定管上力の空気を
採取る、ことによって実施される。文献では、液相中の
極めて小さい濃度（２，５Ｘ１０　　Ｍブタンジオン）
が上を蔽っている蒸気相中の検出可能量をもたらすこと
が示されている。このガス相中のブタンジオンの存在は
またブタンジオンの燐光により、あるいはグアニジン含
有化合物（例えばアルギニン）を含むガス相との接触で
提供される他物質とのそれの反応からの着色物質の形成
によって、検出る、こともできる。同様に、水性相中で
不溶である固体物質を水性相中で可溶である基質を用い
る酵素触媒反応から生成させ、固相中のその存在をアナ
ライト存在の指標として用いることができる。逆に、水
性相中で不溶である標識物質用固体基質をその中で可溶
性、液状またはガス状物質へ酵素的に転化させてもよ（
ａあるいはそのような物質を可溶化に際して固体基質か
ら放出させてもよい。そのような物質の形成または放出
を触媒る、標識物質の例は実施例５に示されておシ、そ
こでは、°水性相中で不溶の肉眼的識別可能の固体コラ
ーゲン／青色デキストラン・ビードがコラ−ゲナーゼに
よって水性相中へ放出される可溶性物質と青色デキスト
ランへ消化されることが示されている。第一相と別の相
の中で存在できるその他の物質の選択もまた本発明の領
域内にある。

例証用実施例は、物質の酵素的形成または放出の前に結
合標識物質の非結合標識物質からの分離を必要とる、、
改良された不均質系免疫検定法を記述しているけれども
、均質系結合検定法も本発明と矛盾なく開発る、ことが
できる。均質系検定法において用いられる標識物質は、
添加結合剤またはアナライトと会合る、ときに検出可能
物質の生成を一部または全部阻害されるが、しかし非会
合時には阻害されない標識部を含むことができる。

酵素標識物質の受容体への結合に基づく酵素活性阻害の
一般的概念は当業において知られている。

米国特許ノに４，３７６．８２５を見よ。同様に、均質
系検定法において用いられる標識物質は、酵素的に分割
可能の結合をもつ標識部を含み、その結合がその標識物
質をアナライトまたは添加結合剤へ結合る、ときに酵素
的分割が一部または完全に阻止されるものでおることが
できる。このような結合を利用る、一般的概念は当業に
おいて知られている。米国特許ノに４，３１８，９８１
を見よ。

本発明の改良を利用る、改善された非競合的会合検定技
法もまた考えられる。例えば、ＤＮＡ。

ＲＮＡおよびその他の遺伝物質についてのハイブリッド
化検定は本発明の利用によって恩恵を蒙るもので１）、
その場合には、プローブがそれらと標識部と会合させ、
その標識部が第二の別の相の中に存在る、かまたは第二
の別の相として存在る、物質を形成しあるいは酵素的処
理に際して放出る、のを触媒る、。抗体は同様に標識化
して生成物中のビールス、外因性プロティンおよび微生
物の存在を測定る、のに用いてよい。

本発明の改良された結合検定法に従って提供される別の
相の中の物質の検出は、この検定法をヒトの健康管理に
おいて用いる二進的すなわち「イエス／ノー」テストに
よく適る、ものとさせる。

本発明による物質は第二の別の相の中で存在し且つ比色
手段あるいは嗅素的手段によるような高価な設備なしで
検出できるように選ぶことができるので、医院あるいは
家庭キットにおいて妊娠テスト、尿感染テスト、糖尿テ
ストなど簡単なテストに使用できる。更に、本発明の検
定法はまた検出可能物質の吸収を測定る、計器を用いる
臨床的設備においても利用でき、その測定は試料相と別
の相の中の検出可能物質の存在によって楽になる。

前述の開示と矛盾る、ことなく、本発明の実際における
数多くの修正と変更が画業熟練者にとっておこることが
予期される。従って、特許請求の範囲に見られるような
制限のみが上述の本発明に対してなされるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図は本発明の現在好ましい具体化による
、別の相の中で存在る、酵素的に発生させた検出可能物
質の存在を測定る、ことを通して、試料中のアナライト
存在を分析的に測定る、ための改良結合検定法をグラフ
的に例証る、ものである。 （外５名） ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ Ｆａｂ”モル ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ 血液稀釈 ４３０ｎｍにさける吸収 手続補正書 １．事件の表示 昭和６０年特許願第　Ａ／ψノアよ　号２、発明の名称 謄是）ル ６、補正をる、者 事件との関係　　特許出願人　　。 住所 ２　ｉ＋　　　ア七フ゛フープし−シフ７４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加される
   標識物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライ
   トおよび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の
   添加結合剤との競合的会合反応によつて測定し、アナラ
   イトの存在を会合した標識物質を非会合標識物質から分
   離した上で測定する、試料中のアナライトの存在を分析
   的に測定する方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
   される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
   うにして形成される物質が第一相とは別の第二相中に存
   在することができる、酵素標識部を使用し； （２）分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
   、上記第一相中に、かつ上記基質と接触させて上記検出
   可能物質の形成を許す条件の下で置き； （３）上記第一相を上記物質が中に存在し得る第二の別
   の相と、上記物質の検出可能量が上記第一相から上記第
   二相へ移ることを許す条件の下で接触させ；そして、 （４）上記物質の上記第二相への移行を測定する； ことから成る方法。 ２）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識物
   質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトおよ
   び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結
   合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナ
   ライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離
   した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析的
   測定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
   される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
   うにして形成される物質が第一相と別の第二相から成る
   、酵素標識部を使用し； （２）分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
   上記第一相中でかつ上記第二相から成る上記物質の形成
   を許す条件の下で上記基質と接触させて置き；そして、 （３）上記第二相から成る上記物質の形成を測定する； ことから成る方法。 ３）アナライトの存在を、（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトお
   よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
   結合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、ア
   ナライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分
   離した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析
   的測定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、第一相から成る基質
   からの検出可能物質の形成または放出を触媒し、そのよ
   うにして形成あるいは放出される物質が第一相と異なる
   第二水性相中で存在することができる、酵素標識部を使
   用し； （２）分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
   、上記物質が存在することができる上記第二の別の相の
   中で、かつ上記物質の形成または放出並びに上記物質の
   検出可能量の上記第二相への移行を許す条件の下で、上
   記物質と接触させ；そして、 （３）上記物質の上記第二相への移行を測定する； ことから成る方法。 ４）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識物
   質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトおよ
   び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結
   合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナ
   ライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離
   した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析的
   測定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性第一相中での酵
   素処理の際に標識物質から解離しかつ検出可能物質を形
   成し、そのようにして形成される上記物質が第一相と異
   なる第二相の中で存在することができる、標識部を使用
   し； （２）分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
   上記第一相中に置き、その標識部をそれを解離させるこ
   とができる酵素と接触状態としかつ上記物質をそれの形
   成を許す条件の下で形成させることによつて、標識部を
   酵素的に処理し； （３）上記第一相を、上記物質が存在し得る第二の別の
   相と、かつ上記物質の検出可能量の上記第二相への上記
   第一相からの移行を許す条件の下で、接触させ；そして
   、 （４）上記物質の上記第二相への移行を測定する； ことから成る方法。 ５）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識物
   質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトおよ
   び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の結合剤
   との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナライ
   トの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離した
   上で検出する、試料中のアナライトの存在の分析的測定
   方法において、（１）上記標識物質の部分として、水性
   第一相中で酵素処理をする際に標識物質から解離しかつ
   検出可能物質を形成し、そのようにして形成される上記
   物質が第一相と異なる第二相から成る、標識部を使用し
   ； （２）分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
   第一相に置き、その標識部をそれを解離させることがで
   きる酵素と接触状態とさせることによつて酵素的に処理
   し、そして上記第二相から成る上記物質の形成を許す条
   件の下で上記物質を形成することにより標識部を酵素処
   理し；そして、 （３）上記第二相から成る上記物質の形成を測定する； ことから成る方法。 ６）アナライトがホルモン、医薬、医薬中間代謝物、カ
   テコールアミン、腫瘍抗原、ステロイド、生化学的メッ
   センジャー、アミノ酸、プロテイン、ポリペプチド、ビ
   タミン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、抗体、ビールス、微生
   物、あるいはモノ−、ジ−、あるいはポリサッカライド
   、である、特許請求の範囲第１、２、３、４または５項
   に記載の方法。 ７）アナライトと会合できる標識物質が上記アナライト
   について特定的または非特定的結合剤である、特許請求
   の範囲第１、２、３、４または５項に記載の方法。 ８）添加結合剤との会合にアナライトと競合する標識物
   質が上記アナライトの類似体であり、上記添加結合剤が
   上記アナライトおよび標識物質についての特定的または
   非特定的結合剤である、特許請求の範囲第１、２、３、
   ４または５項に記載の方法。 ９）上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第二
   相中の上記物質の存在を測定することによつて測定され
   る、特許請求の範囲第１、３、または４項に記載の方法
   。 １０）上記検出可能物質の形成が上記第二の別の相の存
   在を測定することによつて測定される、特許請求の範囲
   第２または第５項に記載の方法。 １１）上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
   一相から成る基質の量の減少を測定することによつて間
   接的に測定される、特許請求の範囲第３項に記載の方法
   。 １２）上記検出可能物質が螢光団、発色団、化学発光群
   、酵素および／または芳香化合物から成る群から選ばれ
   る、特許請求の範囲第１、２、３、４または５項に記載
   の方法。 １３）上記酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、上
   記基質がｐ−フェニルアゾフェニルホスフェートである
   、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １４）上記アルカリ性ホスファターゼが上記ｐ−フェニ
   ルアゾフェニルホスフェートの疎水性検出可能物質ｐ−
   フェニルアゾフェノールへの転化を触媒する、特許請求
   の範囲第１３項に記載の方法。 １５）上記第二の別の相が非水性有機液相である、特許
   請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６）上記ｐ−フェニルアゾフェノールの存在が上記有
   機液相中で比色的手段によつて検出される、特許請求の
   範囲第１５項に記載の方法。 １７）上記アナライトがヒト免疫グロブリンＩｇＧであ
   る、特許請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８）上記標識物質がアルカリ性ホスファターゼ標識ヒ
   トＩｇＧ　Ｆ＿ａ＿ｂ＿′断片である、特許請求の範囲
   第１７項に記載の方法。 １９）上記添加結合剤がヒトＩｇＧ　Ｆ＿ａ＿ｂ＿′断
   片スペシフィック（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に対する抗体で
   ある、特許請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０）水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
   質形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相中に存在す
   ることができる物質の形成を触媒し、上記第二の別相が （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、および／または （ｃ）ガス相 から成る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ２１）上記酵素標識部が、上記水性第一相中で提供され
   る親水性基質から上記第二の別の非水性液相中で存在で
   きる疎水性検出可能物質を形成するのを触媒する、特許
   請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２）上記水性第一相中で提供される親水性基質から上
   記第二の別の非水性液相中で存在し得る疎水性検出可能
   物質の酵素的形成が、親水性ｐ−フェニルアゾフェニル
   ホスフェート基質から疎水性ｐ−フェニルアゾフェノー
   ル物質のアルカリ性ホスファターゼ酵素的形成を含む、
   特許請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３）上記水性第一相中で提供される基質から上記第二
   の別の相の中で存在できる検出可能物質を形成するのを
   触媒する上記酵素標識部が、メチルオキソブタナール基
   質からのブタンジオン物質のパーオキシダーゼ酵素的形
   成を含む、特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４）上記ガス相中のブタンジオン物質の存在が嗅覚的
   手段、燐光および／または燐光、螢光、あるいは着色物
   質の形成をもたらす他の化合物との第二次反応によつて
   検出される、特許請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５）水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
   質形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相から成る物
   質の形成を触媒し、上記の第二の別の相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ２６）第一の別の相から成る基質からの検出可能物質の
   形成または放出を触媒する上記酵素標識部が、第一の別
   の相から成る基質から第二の別の水性相中で存在できる
   物質の形成または放出を触媒し、上記第一の別の相が （ａ）上記第二相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ２７）第一の別の固相から成る基質から第二の別の水性
   相中で存在できる検出可能物質を形成または放出するの
   を触媒する上記の酵素標識部が、固体コラーゲン／着色
   剤粒子からの可溶性コラーゲン物質のコラーゲナーゼ酵
   素的形成と着色剤物質の放出とを提供する、特許請求の
   範囲第２６項に記載の方法。 ２８）上記の固体コラーゲン／着色剤基質がコラーゲン
   ／青色デキストラン粒子から成る、特許請求の範囲第２
   ７項に記載の方法。 ２９）上記の第二の別の水性相中の青色デキストララン
   物質の存在が肉眼的あるいは比色的手段によつて測定さ
   れる、特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０）上記液相中の可溶性コラーゲンの存在が固体コラ
   ーゲンビードの量の減少を検出することから成る肉眼的
   または比色的手段によつて間接的に測定される、特許請
   求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１）第一水性相中の酵素的処理の際の標識部が第二の
   別の相の中で存在できる検出可能物質に解離し、上記第
   二の別の相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、および／または （ｃ）ガス相、 から成る、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ３２）第一水性相中の酵素的処理の際の標識部が第二の
   別の相から成る検出可能物質に解離し、上記第二の別の
   相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ３３）コラーゲン粒子と着色剤物質とから成る第二の別
   の相の中で検出可能量で存在できる物質へ第一相中で酵
   素的に転化し得る組成物。 ３４）上記着色物質が青色デキストランである、特許請
   求の範囲第２６項に記載の組成物。 ３５）アナライトの存在が（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトお
   よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
   結合剤との競合的会合反応によつて測定され、かつ、標
   識物質がアナライトあるいは標識物質と会合するときに
   会合しないときとは異なる程度の触媒的活性を示す酵素
   標識部から成る、試料中のアナライトの存在の分析的測
   定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
   される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
   うにして形成される物質が第一相と異なる第二相の中で
   存在することができる、酵素標識部を使用し、 （２）会合標識物質と非会合標識物質とを上記第一相中
   でかつ上記物質の形成を許す条件の下で上記基質と接触
   させて置き、 （３）上記第一相を上記物質が存在し得る第二の別相と
   、かつ、上記第一相から上記第二相へ上記物質の検出可
   能量の移行を許す条件の下で、接触させ、そして （４）上記物質の上記第二相への移行を測定する、 ことからなる方法。 ３６）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトお
   よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
   結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識
   物質がアナライトあるいは添加結合剤と会合するときに
   異なる程度の触媒活性を示す酵素標識部から成る、試料
   中のアナライトの存在の分析的測定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
   される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
   うにして形成される上記物質が第一相と異なる第二相か
   ら成る、酵素標識部を使用し、 （２）会合標識物質および非会合標識物質を上記第一相
   中にかつ上記第二相から成る上記物質の形成を許す条件
   の下で上記基質と接触させて置き、 （３）上記第二相から成る上記物質の形成を測定する、 ことから成る方法。 ３７）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトお
   よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
   結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ標識物
   質がアナライトあるいは標識物質と会合するときに非会
   合時とは異なる程度の触媒活性を示す酵素標識部から成
   る、試料中のアナライトの存在の分析的測定方法におい
   て、 （１）上記標識物質の部分として、第一相から成る基質
   からの検出可能物質の形成または放出を触媒し、そのよ
   うにして形成または放出される物質が第一相と異なる第
   二水性相の中で存在することができる、酵素標識部を使
   用し、 （２）会合標識物質と非会合標識物質とを、上記物質が
   存在することができる上記第二の別の相の中に、かつ上
   記物質の形成または放出と上記物質の検出可能量の上記
   第二相への移行を許す条件の下で、上記基質と接触状態
   に置き、そして、 （３）上記第二相への上記物質の移行を測定する、 ことから成る方法。 ３８）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により、あるいは（ｂ）アナライトお
   よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
   結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識
   物質がそれがアナライトあるいは添加結合剤と会合して
   いるときに酵素的処理の際に会合していないときと異な
   る程度の検出可能物質への解離を示す標識部分から成る
   、試料中のアナライトの存在の分析的測定方法において
   、（１）上記標識物質の部分として、水性第一相中の酵
   素的処理に際に標識物質から解離し検出可能物質を形成
   し、そのようにして形成される上記物質が第一相と異な
   る第二相中で存在できるものである、標識部を使用し、 （２）会合標識物質および非会合標識物質を上記第一相
   中に置き、その標識部を、それを解離させることができ
   る酵素とそれを接触状態としかつ上記物質の形成を許す
   条件の下で上記物質を形成させることによつて、酵素的
   に処理し、（３）上記第一相を、上記物質が存在し得る
   第二の別の相とかつ上記第一相から上記第二相への上記
   物質の検出可能量の移行を許す条件の下で接触させ、そ
   して、 （４）上記物質の上記第二相への移行を測定する、 ことから成る方法。 ３９）アナライトの存在を（ａ）アナライトと添加標識
   物質との会合反応により或いは（ｂ）アナライトおよび
   添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結合
   剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識物質
   が、それがアナライトまたはは添加結合剤と会合してい
   るときに酵素的処理に際して非会合状であるときと異な
   る程度の検出可能物質への解離を示す標識部から成る、
   試料中のアナライトの存在の分析的測定方法において、 （１）上記標識物質の部分として、水性相中の酵素処理
   に際して標識物質から解離し検出可能物質を形成し、そ
   のようにして形成される上記物質が第一相と異なる第二
   相から成る、標識部を使用し、 （２）会合標識物質および非会合標識物質を第一相中に
   置き、その標識部を、それを解離させることができる酵
   素と接触状態にしかつ上記物質を第二相から成る上記物
   質の形成を許す条件の下で形成させることによつて、酵
   素的に処理し、 （３）上記第二相から成る上記物質の形成を測定する、 ことから成る方法。 ４０）アナライトがホルモン、医薬、医薬中間代謝物、
   カテコールアミン、腫瘍抗原、ステロイド、生化学的メ
   ッセンジャー、アミノ酸、プロテイン、ポリペプチド、
   ビタミン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、抗体、ビールス、微
   生物、あるいはモノ−、ジ−、あるいはポリサッカライ
   ド、である特許請求の範囲第３５、３６、３７、３８あ
   るいは３９項に記載の方法。 ４１）アナライトと会合することができる標識物質がそ
   のアナライトについての特定的結合剤あるいは非特定的
   結合剤である、特許請求の範囲第３５、３６、３７、３
   ８あるいは３９項に記載の方法。 ４２）添加結合剤との会合についてアナライトと競合す
   る標識物質がそのアナライトの類似物質であり、上記添
   加結合剤が上記アナライトおよび標識物質についての特
   定的または非特定的結合剤である、特許請求の範囲第３
   ５、３６、３７、３８、あるいは３９項に記載の方法。 ４３）上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
   二相中の上記物質の存在を測定することによつて測定さ
   れる、特許請求の範囲第３５、３６、３７または３８項
   に記載の方法。 ４４）上記検出可能物質の形成が上記第二の別の相の存
   在を測定することによつて測定される、特許請求の範囲
   第３６項または第３９項に記載の方法。 ４５）上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
   一相から成る基質の量の減少を測定することによつて間
   接的に測定される、特許請求の範囲第３７項に記載の方
   法。 ４６）上記物質が螢光団、発色団、化学発光群、酵素、
   および／または芳香化合物から成る群から選ばれる、特
   許請求の範囲第３５、３６、３７、３８あるいは３９項
   に記載の方法。 ４７）水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
   質の形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相中に存在
   できる物質の形成を触媒し、この第二の別の相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、および／または （ｃ）ガス相、 から成る、特許請求の範囲第３５項に記載の方法。 ４８）水性第一相中で提供される基質から検出可能物質
   の形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相から成る物
   質の形成を触媒し、上記第二の別の相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第３６項に記載の方法。 ４９）第一の別の相から成る基質からの検出可能物質の
   形成または放出を触媒する上記酵素標識部が第一の別の
   相から成る基質から第二の別の水性相中で存在できる物
   質の形成または放出を触媒し、上記の第一の別の相が、 （ａ）上記第二相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第３６項に記載の方法。 ５０）標識部が第一水性相中の酵素的処理の際に第二の
   別の相中に存在できる検出可能物質に解離し、上記第二
   の別の相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、および／または （ｃ）ガス相、 から成る、特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 ５１）標識部が第一水性相中の酵素的処理の際に第二の
   別の相から成る検出可能物質へ解離し、上記第二の別の
   相が、 （ａ）上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 （ｂ）非水性液相、 （ｃ）ガス相、および／または （ｄ）固相、 から成る、特許請求の範囲第３９項に記載の方法。