JPS61107158A - 検定方法 - Google Patents
検定方法Info
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- JPS61107158A JPS61107158A JP60214372A JP21437285A JPS61107158A JP S61107158 A JPS61107158 A JP S61107158A JP 60214372 A JP60214372 A JP 60214372A JP 21437285 A JP21437285 A JP 21437285A JP S61107158 A JPS61107158 A JP S61107158A
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- Japan
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
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- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的には試料中のアナライトの測定を可能に
る、結合検定法に関る、ものである。
る、結合検定法に関る、ものである。
生物学的液体および組織の中の生理学的重要物質の検出
および定量に向けられた測定法は科学的研究および健康
管理分野において重要な道具である。い(つかの異なる
タイプの検定法が開発されておシ、それらは人間の血清
のような普通の生物学的試料の比較的高濃度の成分を検
出る、ことができるものである。このような検定法は高
分解能アガロースゲル電気泳動、および内生酵素の触媒
活性に基づく試験方法を含む。これらの方法は一般的に
は極めて低い濃度で存在る、かも知れない多数の他の生
理学的重要試料成分〔例えば、細胞調節において均密に
かかわシのめる内生分子(ホルモン、ステロイド、生化
学的メツセンシャー);生体の基本的構造成分(アミノ
酸、プロティン、ポリサッカライド);遺伝物質(DN
A、RNA);ビタミン、医薬および医薬中間代謝物;
毒素、病原体および免疫系によって発生る、物質〕を検
出および定量化る、のに必要とされる感度をもっていな
い。
および定量に向けられた測定法は科学的研究および健康
管理分野において重要な道具である。い(つかの異なる
タイプの検定法が開発されておシ、それらは人間の血清
のような普通の生物学的試料の比較的高濃度の成分を検
出る、ことができるものである。このような検定法は高
分解能アガロースゲル電気泳動、および内生酵素の触媒
活性に基づく試験方法を含む。これらの方法は一般的に
は極めて低い濃度で存在る、かも知れない多数の他の生
理学的重要試料成分〔例えば、細胞調節において均密に
かかわシのめる内生分子(ホルモン、ステロイド、生化
学的メツセンシャー);生体の基本的構造成分(アミノ
酸、プロティン、ポリサッカライド);遺伝物質(DN
A、RNA);ビタミン、医薬および医薬中間代謝物;
毒素、病原体および免疫系によって発生る、物質〕を検
出および定量化る、のに必要とされる感度をもっていな
い。
臨床的に重要な血清成分についての初期の生物学的検定
技法、例えば1940年代において開発された免疫沈澱
法および免疫拡散法、もまた医学的関心のある大部分の
血清成分の検出および定量に必要な感度に欠けている。
技法、例えば1940年代において開発された免疫沈澱
法および免疫拡散法、もまた医学的関心のある大部分の
血清成分の検出および定量に必要な感度に欠けている。
1956年に、バーンンおよびイエイロウは血清ホルモ
ンの放射標識製剤を注射したインシュリン治療糖尿病患
者の血清の中の可溶性のインシュリン抗体複合体の検出
を報告している。バーンンらのJ、 C11n、 In
vest、 35: 170 (1956)を見よ。こ
の検定法の原理は、普通は放射線免疫検定(R工、A)
と呼ばれるが、その後確立され、1960年代後期まで
に、このRIAは内分泌研究所における主要な道具であ
った。例えば、kプチドホルモン生理学について現在知
られている事実上すべての情報はRIAの導入と10−
10から10 モル濃度のホルモンを検出し得るその
能力とから生じたものである。
ンの放射標識製剤を注射したインシュリン治療糖尿病患
者の血清の中の可溶性のインシュリン抗体複合体の検出
を報告している。バーンンらのJ、 C11n、 In
vest、 35: 170 (1956)を見よ。こ
の検定法の原理は、普通は放射線免疫検定(R工、A)
と呼ばれるが、その後確立され、1960年代後期まで
に、このRIAは内分泌研究所における主要な道具であ
った。例えば、kプチドホルモン生理学について現在知
られている事実上すべての情報はRIAの導入と10−
10から10 モル濃度のホルモンを検出し得るその
能力とから生じたものである。
このRIA検定技法はその後、特定的抗体をつ(ること
かできる物質のどれにでも定量的検出に応用できること
が示され、医薬のような化学的化合物についての多数の
RIA法を発展させた。よシ広い意味においては、RI
A原理はまた他の結合用物質が例えば受容体検定におい
て抗体を置換える系へ拡張された。1980年に、免疫
診断試薬単独の売上げで2億2千9百万ドルであると推
定された。
かできる物質のどれにでも定量的検出に応用できること
が示され、医薬のような化学的化合物についての多数の
RIA法を発展させた。よシ広い意味においては、RI
A原理はまた他の結合用物質が例えば受容体検定におい
て抗体を置換える系へ拡張された。1980年に、免疫
診断試薬単独の売上げで2億2千9百万ドルであると推
定された。
所望の感度を示すけれども、RIAは必要とる、試薬に
固有のい(つかの欠点を示す。放射性アイソトープの使
用は特定の認可と特定の実験室を必要とる、。この理由
から、RIAは日常の臨床的化学実験室にいる人々と別
れた人によって実施される。放射線は普通に使用る、天
変放射性同位元素で以て作業をる、人々に特に健康上の
災害を引起し得る。その上、用いられる放射線標識試薬
の有用寿命はアイソトープの半減期と崩壊中におこる破
壊過程によって制限される。試料中の放射能の量を測定
る、のに用いる設備は高価でl)、一連の試料の計数は
比較的時間のかかることである。
固有のい(つかの欠点を示す。放射性アイソトープの使
用は特定の認可と特定の実験室を必要とる、。この理由
から、RIAは日常の臨床的化学実験室にいる人々と別
れた人によって実施される。放射線は普通に使用る、天
変放射性同位元素で以て作業をる、人々に特に健康上の
災害を引起し得る。その上、用いられる放射線標識試薬
の有用寿命はアイソトープの半減期と崩壊中におこる破
壊過程によって制限される。試料中の放射能の量を測定
る、のに用いる設備は高価でl)、一連の試料の計数は
比較的時間のかかることである。
(スミスらのAmer、 Chin、 Biochem
、 18 : 253−74 (1981)を見よ)総
体的にいうと、免疫診断領域におけるオートメーション
の量は日常の臨床的実験室において見られるよりもはる
かに少ない。
、 18 : 253−74 (1981)を見よ)総
体的にいうと、免疫診断領域におけるオートメーション
の量は日常の臨床的実験室において見られるよりもはる
かに少ない。
結合抗原から分離る、ための8時間4vエチレングリコ
ール促進第二抗体RIAを使用る、と、−人の技工によ
シ手動ピペットとシングルチャネル・ガンマ−カウンタ
ーを使って1日に約75−90検定しか実施できない。
ール促進第二抗体RIAを使用る、と、−人の技工によ
シ手動ピペットとシングルチャネル・ガンマ−カウンタ
ーを使って1日に約75−90検定しか実施できない。
RIAに関連る、問題を克服る、ためK、非アイソトー
プ的標識を用いて免疫検定技法が開発された。これらの
非アイソトープ的検定は、酵素連結免疫吸着剤検定(E
LISA)、螢光免疫検定(FIA)、および発光免疫
検定(LIA)、と呼ばれるが、用いる標識に従って、
RIAと関連る、問題の多くを回避し、かつRIAに近
い感度を保有している。
プ的標識を用いて免疫検定技法が開発された。これらの
非アイソトープ的検定は、酵素連結免疫吸着剤検定(E
LISA)、螢光免疫検定(FIA)、および発光免疫
検定(LIA)、と呼ばれるが、用いる標識に従って、
RIAと関連る、問題の多くを回避し、かつRIAに近
い感度を保有している。
更に最近では、酵素連結検定はますます一般的となり、
RIAと比べ記鎌がよシ単純であるために、多くの場合
においてRIAを置換えつつある。1日当、!1120
00個もの多くの検定を1人の技工により、手動ピペッ
トによるミクロタイター・プレートにおいて固相EL工
SAを使って実施る、ことができる。これらのタイプの
検定はまた「均質系」免疫検定を開発させ、その検定に
おいては結合および遊離の標識化物質は検出および測定
の工程に先立って分離される必要がない。RIA法はア
ナライト濃度評価のために結合標準物質の分離を必要と
し、「不均質系」系である。抗原−抗体反応を複合化抗
原の分離を行うことなしに検出できる感度のよい検定は
また自動化る、のによシ簡単である。
RIAと比べ記鎌がよシ単純であるために、多くの場合
においてRIAを置換えつつある。1日当、!1120
00個もの多くの検定を1人の技工により、手動ピペッ
トによるミクロタイター・プレートにおいて固相EL工
SAを使って実施る、ことができる。これらのタイプの
検定はまた「均質系」免疫検定を開発させ、その検定に
おいては結合および遊離の標識化物質は検出および測定
の工程に先立って分離される必要がない。RIA法はア
ナライト濃度評価のために結合標準物質の分離を必要と
し、「不均質系」系である。抗原−抗体反応を複合化抗
原の分離を行うことなしに検出できる感度のよい検定は
また自動化る、のによシ簡単である。
いくつかの点においてRIAよシ優れているけれども、
上述の非アイソトープ検定はまた反応混合物中に存在る
、内生的妨害要因によって引起される問題を示す。血清
試料中に普通に見出されるプロティンおよびその他の成
分は用いられる標識のそれと似た螢光的、化学的および
酵素的活性を示すかも知れない。その上、これらの標識
の活性は、発色団標識関連の色比合物と同じ(発光胞標
識の発光を吸収または散乱させる内在的化合物、および
酵素標識を劣化させる触媒的酵素の存在によって阻害さ
れる。採用標識の活性の測定はまた全血試料の場合のよ
うに試料の濁度によってそこなわれるかも知れない。あ
る程度までは、これらの問題は、結合標識化物償金試料
から分離し緩衝液で以て洗滌しその後に標識活性を測定
る、分離工程、あるいは結合および非結合の標識化物質
め分離がそれらを非混和性水性相の間に分配させること
によって達成される分離工程、を用いる検定技法によっ
て最小化る、ことができる。マチアツンンらの、Adv
ances in Applied Microbio
xogy28 : 117−47 (1981年)、米
国特許屋4,312,944を見よ。しかし、血清妨害
化合物が存在し得る可能性はそれでもまだある。この測
定段階は光検出器と臨床実験室においてのみ一般的に利
用できる他の複雑な計装の使用をしばしば必要とる、。
上述の非アイソトープ検定はまた反応混合物中に存在る
、内生的妨害要因によって引起される問題を示す。血清
試料中に普通に見出されるプロティンおよびその他の成
分は用いられる標識のそれと似た螢光的、化学的および
酵素的活性を示すかも知れない。その上、これらの標識
の活性は、発色団標識関連の色比合物と同じ(発光胞標
識の発光を吸収または散乱させる内在的化合物、および
酵素標識を劣化させる触媒的酵素の存在によって阻害さ
れる。採用標識の活性の測定はまた全血試料の場合のよ
うに試料の濁度によってそこなわれるかも知れない。あ
る程度までは、これらの問題は、結合標識化物償金試料
から分離し緩衝液で以て洗滌しその後に標識活性を測定
る、分離工程、あるいは結合および非結合の標識化物質
め分離がそれらを非混和性水性相の間に分配させること
によって達成される分離工程、を用いる検定技法によっ
て最小化る、ことができる。マチアツンンらの、Adv
ances in Applied Microbio
xogy28 : 117−47 (1981年)、米
国特許屋4,312,944を見よ。しかし、血清妨害
化合物が存在し得る可能性はそれでもまだある。この測
定段階は光検出器と臨床実験室においてのみ一般的に利
用できる他の複雑な計装の使用をしばしば必要とる、。
それ故、検定の検出および測定段階に固有の妨害問題を
より厳しく回避し、かつ複雑化された計測の必要性を避
け、一方では医院あるいはその他の臨床実験室の外の場
所での使用に利用できる方法による高感度検出を提供る
、、アナライト存在測定用の非アイソトープ的結合検定
法を求める要望は画業において存在し続けている。
より厳しく回避し、かつ複雑化された計測の必要性を避
け、一方では医院あるいはその他の臨床実験室の外の場
所での使用に利用できる方法による高感度検出を提供る
、、アナライト存在測定用の非アイソトープ的結合検定
法を求める要望は画業において存在し続けている。
要約
本発明は試料中に存在る、アナライトを測定る、改良方
法を提供る、もので6D、その場合、アナライトの存在
は、アナライトを添加る、標識物質と会合させる方法に
よるか、あるいはアナライトおよび標識物質のための添
加結合剤についてのアナライトと添加標識物質との競合
によって測定される。その改良は一般的には標識物質の
部分として、第一相中で提供されるか或いは第一相から
成る基質からの検出可能物質の形成を触媒る、標識部を
用いることを含み;そのようにして形成される検出可能
物質は第二の別の相の中に存在る、か或いはその相から
成る。あるいはまた、標識部は基質として役立つことが
でき、それは水性の第一相中での酵素的処理の際に、標
識物質から解離して検出可能物質を形成し;そのように
して形成される検出可能物質は第二の別の相の中に存在
る、かその相から成)立つことができる。第二相への物
質の移行あるいは第二相の形成が測定され、試料中のア
ナライトの存在を測定る、のに用いられる。アナライト
と標識物質との会合、或いは、アナライトおよび標識物
質と添加結合剤との会合は、共有結合または非共有結合
の適当な形態のいかなるものも含むことができ、例えば
抗原/抗体結合あるいは核酸ハイブリッド化である。
法を提供る、もので6D、その場合、アナライトの存在
は、アナライトを添加る、標識物質と会合させる方法に
よるか、あるいはアナライトおよび標識物質のための添
加結合剤についてのアナライトと添加標識物質との競合
によって測定される。その改良は一般的には標識物質の
部分として、第一相中で提供されるか或いは第一相から
成る基質からの検出可能物質の形成を触媒る、標識部を
用いることを含み;そのようにして形成される検出可能
物質は第二の別の相の中に存在る、か或いはその相から
成る。あるいはまた、標識部は基質として役立つことが
でき、それは水性の第一相中での酵素的処理の際に、標
識物質から解離して検出可能物質を形成し;そのように
して形成される検出可能物質は第二の別の相の中に存在
る、かその相から成)立つことができる。第二相への物
質の移行あるいは第二相の形成が測定され、試料中のア
ナライトの存在を測定る、のに用いられる。アナライト
と標識物質との会合、或いは、アナライトおよび標識物
質と添加結合剤との会合は、共有結合または非共有結合
の適当な形態のいかなるものも含むことができ、例えば
抗原/抗体結合あるいは核酸ハイブリッド化である。
本発明の現時点の一つの好ましい具体化においては、ヒ
トの免疫グロブリンIgGについての免疫検定はアルカ
リ性ホスファターゼ標識部をもつヒ) IgG標識物質
を用い、この標識部は水性第一相中の親水性p−フェニ
ルアゾフェニルホスフェート基質を疎水性のp−フェニ
ルアゾフェノール検出可能物質へ酵素的に変換る、。こ
の具体化は標識物質とヒ) IgG抗体とを試料へ添加
し、この反応混合物を保温し、抗体と会合した標識物質
を非会合標識物質から分離る、ことを含む。この水性試
料相中の非会合の分離された標識物質あるいは水性相中
に置かれた分離した会合標識物質は、p−フェニルアゾ
フェニルホスフェート基質ト、p−フェニルアゾフェノ
ール検出可能物質の形成を許す条件の下で接触させられ
る。この水性筒一相は非水性液状第二相(有機溶剤)と
接触させられ、p−フェニルアゾフェノールのこの有機
液相への移行が肉眼的あるいは比色的手段によって測定
される。別の具体化はツク−オキシダーゼ標識物質のよ
うな他の標識物質の使用を含み、この物質は水性相中で
かつ空気存在下においてメチルオキソブタナール基質の
ズタンジオ/検出可能物質への転化を触媒し、この物質
は比較的高い蒸気圧をもち且つ水性相上を蔽う気相中に
おいて臭覚、燐光あるいは他の化合物との第二次反応に
よって検出できる。その他の具体化はコラ−ゲナーゼ標
識物質を用い、この物質は、水性相中に置いた固体コラ
ーゲン/青色デキストラン・ビード基質から、第二の別
の水相中に存在る、ことができる可溶性検出可能物質の
形成を触媒る、。
トの免疫グロブリンIgGについての免疫検定はアルカ
リ性ホスファターゼ標識部をもつヒ) IgG標識物質
を用い、この標識部は水性第一相中の親水性p−フェニ
ルアゾフェニルホスフェート基質を疎水性のp−フェニ
ルアゾフェノール検出可能物質へ酵素的に変換る、。こ
の具体化は標識物質とヒ) IgG抗体とを試料へ添加
し、この反応混合物を保温し、抗体と会合した標識物質
を非会合標識物質から分離る、ことを含む。この水性試
料相中の非会合の分離された標識物質あるいは水性相中
に置かれた分離した会合標識物質は、p−フェニルアゾ
フェニルホスフェート基質ト、p−フェニルアゾフェノ
ール検出可能物質の形成を許す条件の下で接触させられ
る。この水性筒一相は非水性液状第二相(有機溶剤)と
接触させられ、p−フェニルアゾフェノールのこの有機
液相への移行が肉眼的あるいは比色的手段によって測定
される。別の具体化はツク−オキシダーゼ標識物質のよ
うな他の標識物質の使用を含み、この物質は水性相中で
かつ空気存在下においてメチルオキソブタナール基質の
ズタンジオ/検出可能物質への転化を触媒し、この物質
は比較的高い蒸気圧をもち且つ水性相上を蔽う気相中に
おいて臭覚、燐光あるいは他の化合物との第二次反応に
よって検出できる。その他の具体化はコラ−ゲナーゼ標
識物質を用い、この物質は、水性相中に置いた固体コラ
ーゲン/青色デキストラン・ビード基質から、第二の別
の水相中に存在る、ことができる可溶性検出可能物質の
形成を触媒る、。
本発明による改良結合検出法は、第一相と非混和性の液
であるか或いは第一相と別の固体状、液体状または気体
状の相であるかの何れかである第二の相の中に存在る、
か、または第二の相として存在る、、検出可能物質の測
定を容易にる、。本発明によって包括されるものは第一
相中で提供される基質を別の第二相中に存在る、物質へ
転化させることを触媒る、酵素を標識部の部分として付
着させた標識物質を利用る、方法である。また、標識部
が第一相として存在る、基質から、別の第二相中に存在
し得る検出可能物質を酵素的に形成または放出る、方法
が包含されている。このような標識物質の例は、親水性
物質から疎水性物質の形成あるいはその逆、固体または
液状の基質からの固体状、液状またはガス状の物質の形
成、水性相中で可溶または不溶の固体基質の反対溶解特
性物質への転化、および/または固体基質からの物質の
放出、を触媒る、酵素から成る標識である。
であるか或いは第一相と別の固体状、液体状または気体
状の相であるかの何れかである第二の相の中に存在る、
か、または第二の相として存在る、、検出可能物質の測
定を容易にる、。本発明によって包括されるものは第一
相中で提供される基質を別の第二相中に存在る、物質へ
転化させることを触媒る、酵素を標識部の部分として付
着させた標識物質を利用る、方法である。また、標識部
が第一相として存在る、基質から、別の第二相中に存在
し得る検出可能物質を酵素的に形成または放出る、方法
が包含されている。このような標識物質の例は、親水性
物質から疎水性物質の形成あるいはその逆、固体または
液状の基質からの固体状、液状またはガス状の物質の形
成、水性相中で可溶または不溶の固体基質の反対溶解特
性物質への転化、および/または固体基質からの物質の
放出、を触媒る、酵素から成る標識である。
また、採用される標識物質が、第一相中での酵素的処理
の際に標識物質から解離しかつ第二の別の相の中で存在
る、か或いは第二の別の相として存在る、。検出可能物
質を形成る、標識部をもつ、方法が含まれている。形成
されることができ且つそれらの固有の性質に基づいて周
知の手段によって検出できる物質は、本発明に従って採
用る、ことができ、そして、螢光団、発色団、化学発光
群、酵素、芳香化合物、および検出を容易にる、固有性
質に基づいて選ぶことができるその他の化合物を含む。
の際に標識物質から解離しかつ第二の別の相の中で存在
る、か或いは第二の別の相として存在る、。検出可能物
質を形成る、標識部をもつ、方法が含まれている。形成
されることができ且つそれらの固有の性質に基づいて周
知の手段によって検出できる物質は、本発明に従って採
用る、ことができ、そして、螢光団、発色団、化学発光
群、酵素、芳香化合物、および検出を容易にる、固有性
質に基づいて選ぶことができるその他の化合物を含む。
本発明の改良検定法による別相中の検出可能物質の測定
は、家庭の健康診断テストキットを含む二進的すなわち
「イエス/ノー」型検定での使用、および微生物、ビー
ルス、ステロイド、農薬および抗体の存在について現場
テストの工業的用途、に適している。
は、家庭の健康診断テストキットを含む二進的すなわち
「イエス/ノー」型検定での使用、および微生物、ビー
ルス、ステロイド、農薬および抗体の存在について現場
テストの工業的用途、に適している。
上記の通シ、本発明の方法は、別の相へ移され或いは別
の相として存在る、酵素的に発生る、物質を通して分析
的検定法を提供る、ものであり、マチアツソンらによっ
て開示されている方法とは区別されるものであり、彼ら
の方法においては、結合した標識物質「複合体」および
非結合状の標識物質「反応物」が非混和性液相中に非対
称的に分配され、標識活性はその中で測定される。マチ
アツンンらのAdvances in Applied
Microbiology28 :117−47(1
982) ;米国特許44,312,944を見よ。
の相として存在る、酵素的に発生る、物質を通して分析
的検定法を提供る、ものであり、マチアツソンらによっ
て開示されている方法とは区別されるものであり、彼ら
の方法においては、結合した標識物質「複合体」および
非結合状の標識物質「反応物」が非混和性液相中に非対
称的に分配され、標識活性はその中で測定される。マチ
アツンンらのAdvances in Applied
Microbiology28 :117−47(1
982) ;米国特許44,312,944を見よ。
本発明のその他の側面および利点は以下の詳細記述を考
察る、ことによって明らかになるが、第1図から第6図
は、本発明の現在好ましい具体化に従って、別相中に存
在る、酵素的に発生した検出可能物質の存在を測定る、
ことを通じて試料中のアナライトの存在を分析的に測定
る、、改良結合測定法をグラフ的に描いているものであ
る。
察る、ことによって明らかになるが、第1図から第6図
は、本発明の現在好ましい具体化に従って、別相中に存
在る、酵素的に発生した検出可能物質の存在を測定る、
ことを通じて試料中のアナライトの存在を分析的に測定
る、、改良結合測定法をグラフ的に描いているものであ
る。
詳細説明
、以下の実施例はいくつかの好ましい手順に従う本発明
の実際を例証る、ものである。さらに特定的にいえば、
代表的標識物質すなわちヒト免疫グロブリンIgGのア
ルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、およびコ
ラ−ゲナーゼ複合体の調製;水性血清試料中のヒト免疫
グロブリンIgGの存在を測定る、ためのアルカリ性ホ
スファターゼ標識物質の使用;および、分析的検定手順
におけるパーオキシダーゼ標識物質およびコラ−ゲナー
ゼ標識物質の案出された使用;を取扱っている。
の実際を例証る、ものである。さらに特定的にいえば、
代表的標識物質すなわちヒト免疫グロブリンIgGのア
ルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、およびコ
ラ−ゲナーゼ複合体の調製;水性血清試料中のヒト免疫
グロブリンIgGの存在を測定る、ためのアルカリ性ホ
スファターゼ標識物質の使用;および、分析的検定手順
におけるパーオキシダーゼ標識物質およびコラ−ゲナー
ゼ標識物質の案出された使用;を取扱っている。
実施例 1
1、物質 ヒトIgG (ロット19286)、アフイ
ニテイ精製(ヤギ)抗−ウサギ、IgG <ロット15
137)、および(ヤギ)抗−ヒト IgG1Fab’
断片スペシフインク(specific) (oット1
7026)をカッベル研究所(マルベルン、ペンシルバ
ニア州)から購入した。スクシンイミジル4−(N−マ
レイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート(SMCC)およびN−スクシンイミジル3−(2
−ピリジルジチオ)プロピオネ−) (SDDP)をピ
アス・ケミカル・カンパニー(ロックフォード、イリノ
イス州)から得た。シアノーゲンプロマイド活性化セフ
ァロース4Bおよびゲルノミ−ミエーション媒体、セフ
ァデックスG−25とセファクリルS −200および
S −300をファーマシア・ファイン・ケミカルズ(
ビス力タウエー、ニュージャージ州)から得た。
ニテイ精製(ヤギ)抗−ウサギ、IgG <ロット15
137)、および(ヤギ)抗−ヒト IgG1Fab’
断片スペシフインク(specific) (oット1
7026)をカッベル研究所(マルベルン、ペンシルバ
ニア州)から購入した。スクシンイミジル4−(N−マ
レイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート(SMCC)およびN−スクシンイミジル3−(2
−ピリジルジチオ)プロピオネ−) (SDDP)をピ
アス・ケミカル・カンパニー(ロックフォード、イリノ
イス州)から得た。シアノーゲンプロマイド活性化セフ
ァロース4Bおよびゲルノミ−ミエーション媒体、セフ
ァデックスG−25とセファクリルS −200および
S −300をファーマシア・ファイン・ケミカルズ(
ビス力タウエー、ニュージャージ州)から得た。
アルカリ性ホスファターゼ・タイプ■−L(ロッ゛ドア
2 F −5t1o)、コラ−ゲナーゼ(高純度、ロッ
ト33 F −6819)、ペプシン(2X結晶化)、
パーオキシダーゼ(タイプ■)ジテオスレイトール、メ
ルカプトエチルアミン、ビス−トリス、グルタルアルデ
ヒド、ゼラチン、トリス−(ヒト90キシメチル)アミ
ノメタン(トリス)、3−(シクロへキシルアミノ)エ
タンスルホン酸(チェス)、グリシン、2−メルカプト
エチルアミン、青色デキストラン、牛血清アルブミン(
7ラクシヨンV)およびゲル・ξ−ミエーションの標準
化に使用る、他のプロティン、カタラーゼ、アルドラー
ゼ、チモトリプ/ノーゲンA1卵アルズミン、およびチ
トクo−ムc、ハシグマ・ケミカル・カンバ=−(セン
トルイス、ミズリー州)から得た。無機質の緩衝剤およ
びその他の塩は試薬級であり、フィッシャー・サイエン
ティフィック・カンパニー(フェアローン、ニューシャ
ーシー州)、マチェンン・コールマン・アンド・ベル(
ノルウッド、オハイオ州)、あるいはシグマ・ケミカル
・カンパニーの何れかから入手した。トルエン(分光光
度測定用等級)、p−フェニルアゾフェノール、ナトリ
ウム、メントール、2−ブタノン、メチルフォーメイト
、およびヨードアセタミドはアルドラーゼ・ケミカル・
カンパニー(ミルウォーキー、ウイスコンシ□ン州)か
ら得た。スパン85はフリュー力から入手した。その他
の有機化学品および溶剤は試薬級で6D、アルドリッヒ
・ケミカル・カンパニーあるいはフィッシャー・サイエ
ンティフィック・カンパニーから入手した。
2 F −5t1o)、コラ−ゲナーゼ(高純度、ロッ
ト33 F −6819)、ペプシン(2X結晶化)、
パーオキシダーゼ(タイプ■)ジテオスレイトール、メ
ルカプトエチルアミン、ビス−トリス、グルタルアルデ
ヒド、ゼラチン、トリス−(ヒト90キシメチル)アミ
ノメタン(トリス)、3−(シクロへキシルアミノ)エ
タンスルホン酸(チェス)、グリシン、2−メルカプト
エチルアミン、青色デキストラン、牛血清アルブミン(
7ラクシヨンV)およびゲル・ξ−ミエーションの標準
化に使用る、他のプロティン、カタラーゼ、アルドラー
ゼ、チモトリプ/ノーゲンA1卵アルズミン、およびチ
トクo−ムc、ハシグマ・ケミカル・カンバ=−(セン
トルイス、ミズリー州)から得た。無機質の緩衝剤およ
びその他の塩は試薬級であり、フィッシャー・サイエン
ティフィック・カンパニー(フェアローン、ニューシャ
ーシー州)、マチェンン・コールマン・アンド・ベル(
ノルウッド、オハイオ州)、あるいはシグマ・ケミカル
・カンパニーの何れかから入手した。トルエン(分光光
度測定用等級)、p−フェニルアゾフェノール、ナトリ
ウム、メントール、2−ブタノン、メチルフォーメイト
、およびヨードアセタミドはアルドラーゼ・ケミカル・
カンパニー(ミルウォーキー、ウイスコンシ□ン州)か
ら得た。スパン85はフリュー力から入手した。その他
の有機化学品および溶剤は試薬級で6D、アルドリッヒ
・ケミカル・カンパニーあるいはフィッシャー・サイエ
ンティフィック・カンパニーから入手した。
2、 クロマトグラフィーの手順
ゲルパーミェーション・クロマトグラフィーを4℃にお
ける冷凍室内で実施した。クロマトグラフィー系は7ア
ーマシア・ファイン・ケミカルズから購入し、嬬動ポン
プ(モデルP−1)、一端または両端に70−アダプタ
ーをはめたガラスカラム、試料施用器、およびFRAC
−100また+!FRAC−300画分捕集器を含んで
いた。カラム流出物の吸収を継続的にファーマシアUV
−2固定波長吸収モニターあるいはギルノン・メディカ
ル・エレクトロニクス社のホロクロム可変波長モニター
(ミドルトン、グイスコンシン州)の何れかで以て追跡
した。代表的なりロマトグラフイ実験においては、カラ
ムを溶離に使う緩衝液のカラム容積の3倍量で以てフラ
ッシュした。シュークロースを試料へ15チに近い最終
濃度まで添加し、試料を試料施用器へ添加した。カラム
の流れを上向き方向で開始し嬬動ポンプによって調節し
た。カラムから集めた両分中のプロティンの位置を28
0nmで行なう吸収測定によって測定し、それをファー
マシア・帯状チャート記録計を使って記録した。
ける冷凍室内で実施した。クロマトグラフィー系は7ア
ーマシア・ファイン・ケミカルズから購入し、嬬動ポン
プ(モデルP−1)、一端または両端に70−アダプタ
ーをはめたガラスカラム、試料施用器、およびFRAC
−100また+!FRAC−300画分捕集器を含んで
いた。カラム流出物の吸収を継続的にファーマシアUV
−2固定波長吸収モニターあるいはギルノン・メディカ
ル・エレクトロニクス社のホロクロム可変波長モニター
(ミドルトン、グイスコンシン州)の何れかで以て追跡
した。代表的なりロマトグラフイ実験においては、カラ
ムを溶離に使う緩衝液のカラム容積の3倍量で以てフラ
ッシュした。シュークロースを試料へ15チに近い最終
濃度まで添加し、試料を試料施用器へ添加した。カラム
の流れを上向き方向で開始し嬬動ポンプによって調節し
た。カラムから集めた両分中のプロティンの位置を28
0nmで行なう吸収測定によって測定し、それをファー
マシア・帯状チャート記録計を使って記録した。
3、濃縮および濾過の手順
プロティンの濃縮はアミコン・コーポレーション(レキ
シントン、マサチューセッツ州)ツタイアフロー限外濾
過膜(PMIOあるいはPM3Q)およびアミコン濃縮
セルを使って実施した。試料の無菌濾過を使い捨て注射
器とゲルマン・アクロディスク使い捨てフィルター集成
部材(ア/アーバー、ミシガン州)(孔径0,2μm)
を使って実施しだ。
シントン、マサチューセッツ州)ツタイアフロー限外濾
過膜(PMIOあるいはPM3Q)およびアミコン濃縮
セルを使って実施した。試料の無菌濾過を使い捨て注射
器とゲルマン・アクロディスク使い捨てフィルター集成
部材(ア/アーバー、ミシガン州)(孔径0,2μm)
を使って実施しだ。
4、アルカリ性ホスファターゼ・抗原複合体の製造ヒ)
IgGのアルカリ性ホスファターゼ−複合体を、一方
のプロティン上のマレイミド置換基と他方のプロティン
のスル7ヒト1リル置換基との間の反応によってつくっ
た。異質二官能性交差結合剤、SMCC1を使用る、プ
ロティンのアレイミド標識化とその後のスルフヒドリル
標識化プロティンとの反応はヨシタケらのEur、 J
、 Biochem、 101 :395−99 (1
979年)によって使用された類似の方式で行った。プ
ロティン中へのスルフヒドリル基の組入れは異質二官能
性交差結合試薬、5PDP。
IgGのアルカリ性ホスファターゼ−複合体を、一方
のプロティン上のマレイミド置換基と他方のプロティン
のスル7ヒト1リル置換基との間の反応によってつくっ
た。異質二官能性交差結合剤、SMCC1を使用る、プ
ロティンのアレイミド標識化とその後のスルフヒドリル
標識化プロティンとの反応はヨシタケらのEur、 J
、 Biochem、 101 :395−99 (1
979年)によって使用された類似の方式で行った。プ
ロティン中へのスルフヒドリル基の組入れは異質二官能
性交差結合試薬、5PDP。
を使用して、カールソンらのBiochem、 J、
173 ニア23−37 (1978年)に記載の手順
と類似の手順で達成した。
173 ニア23−37 (1978年)に記載の手順
と類似の手順で達成した。
アルカリ性ホスファターゼ・ヒトTgG(Fab′断片
)は次の通シにつくった。20〜のアルカリ性ホスファ
ターゼをpH7,0の2dの0.1 M燐酸ナトリウム
に溶解し、セファデックスG−25カラムを同じ緩衝液
中で通過させた。この精製アルカリ性7オスフアターゼ
を空洞容積の2.54中に集めた。
)は次の通シにつくった。20〜のアルカリ性ホスファ
ターゼをpH7,0の2dの0.1 M燐酸ナトリウム
に溶解し、セファデックスG−25カラムを同じ緩衝液
中で通過させた。この精製アルカリ性7オスフアターゼ
を空洞容積の2.54中に集めた。
この溶液へ30℃において攪拌しながら、ジオキチン中
の8.92mMSMCCの112μぎを添加した。
の8.92mMSMCCの112μぎを添加した。
この添加は各々12.5μlの9回の別々の添加として
5分ずつ離して行った。反応は合計で約100分の間継
続し、次いで溶液をセファデックスG−25カラムへ施
用し、O,l M燐酸ナトリウム、1mMEDTA、
pH7,0中で溶離させた。マレイミド基で以て標識化
されたアルカリ性7オスフアターゼを空洞容積で単離し
た。
5分ずつ離して行った。反応は合計で約100分の間継
続し、次いで溶液をセファデックスG−25カラムへ施
用し、O,l M燐酸ナトリウム、1mMEDTA、
pH7,0中で溶離させた。マレイミド基で以て標識化
されたアルカリ性7オスフアターゼを空洞容積で単離し
た。
ヒトIgG (100’Y)を10 mlの水に溶解し
、0.1M酢酸ナトリウム/HC1、pH= 4.3の
ll中で一晩透析した。透析に続いて、0.3 mlの
酢酸塩緩衝液中のペプシン(3,0■)をこの工gG溶
液へ添加し、溶液を無菌培養管中へ無菌濾過した。これ
を次に37℃水浴中に一装置いた。16時間後、溶液を
濾過し、セファクリルS−200カラム(直径2.6儂
、長さ100cx)へ施用し、pH5,0で0.1M酢
酸ナトリウム1HCe中で溶離した。この(Fabl)
2両分を単離し、約10ゴへ濃縮した。(Fab’)2
濃度は吸収によッテ5.47×10″″5M(ε28o
=1.22×105M”cTL−’ )であることが測
定された。5.7X10−7モル(Fab’)2を複合
体調製で使用る、ために取出し、一方、残シは後の用途
に冷凍室中に貯えた。
、0.1M酢酸ナトリウム/HC1、pH= 4.3の
ll中で一晩透析した。透析に続いて、0.3 mlの
酢酸塩緩衝液中のペプシン(3,0■)をこの工gG溶
液へ添加し、溶液を無菌培養管中へ無菌濾過した。これ
を次に37℃水浴中に一装置いた。16時間後、溶液を
濾過し、セファクリルS−200カラム(直径2.6儂
、長さ100cx)へ施用し、pH5,0で0.1M酢
酸ナトリウム1HCe中で溶離した。この(Fabl)
2両分を単離し、約10ゴへ濃縮した。(Fab’)2
濃度は吸収によッテ5.47×10″″5M(ε28o
=1.22×105M”cTL−’ )であることが測
定された。5.7X10−7モル(Fab’)2を複合
体調製で使用る、ために取出し、一方、残シは後の用途
に冷凍室中に貯えた。
十分なジチオトレイトールを少量の酢酸塩緩衝液中で溶
かし、最終濃度が0.015 Mジチオトレイトールに
等しいように(Fab’)2溶液へ添加した。この溶液
を次に約2時間37℃において攪拌し、その後、セファ
デックスG−25カラムへ施用し、0.1M燐酸ナトリ
ウム、l mM H)TA、 pH7,0の中で溶離し
た。スルフヒドリル基を含むFal)′断片をカラム空
洞容積において回収し、直ちにさきに調製したマレイミ
ド基で以て標識したアルカリ性ホスファターゼへ添加し
た。組合せた浴液を次に約7rttlへ濃縮し、無菌濾
過を行ない、無菌培養管中に置き、4℃において一晩攪
拌して複合体形成を行わせた。約20時間の反応に続い
て、2−メルカプトエチルアミンを5X10 Mの最
終濃度まで添加し、未反応マレイミド基と室温において
約33A時間反応させた。溶液を次にセファクリルS−
300カラムへ施用し、TBS中で溶離した。生成物画
分を約2ゴへ濃縮し、冷凍室中に貯えた。
かし、最終濃度が0.015 Mジチオトレイトールに
等しいように(Fab’)2溶液へ添加した。この溶液
を次に約2時間37℃において攪拌し、その後、セファ
デックスG−25カラムへ施用し、0.1M燐酸ナトリ
ウム、l mM H)TA、 pH7,0の中で溶離し
た。スルフヒドリル基を含むFal)′断片をカラム空
洞容積において回収し、直ちにさきに調製したマレイミ
ド基で以て標識したアルカリ性ホスファターゼへ添加し
た。組合せた浴液を次に約7rttlへ濃縮し、無菌濾
過を行ない、無菌培養管中に置き、4℃において一晩攪
拌して複合体形成を行わせた。約20時間の反応に続い
て、2−メルカプトエチルアミンを5X10 Mの最
終濃度まで添加し、未反応マレイミド基と室温において
約33A時間反応させた。溶液を次にセファクリルS−
300カラムへ施用し、TBS中で溶離した。生成物画
分を約2ゴへ濃縮し、冷凍室中に貯えた。
非標識抗原として使用る、ためのFab′断片を上の第
4節の手順から残っている(F′1lL1)′)2溶液
からつくった。溶液をジチオトレイトールの中で0.0
15Mとし、約2時間37℃で攪拌した。溶液を次に約
2. mlへ濃縮し、スル7ヒト9リル基のアルキレー
ションを丑−ドアセタミドを0.036Mの最終濃度ま
で添加る、ことによって開始させた。これを室温で約2
時間反応させ、その後、溶液をセファクリルS −30
0カラムへ施用し、TBS中で溶離した。アルキレーシ
ョンによって封鎖されたスルフヒドリル基をもつFab
′画分を約2−へ濃縮し、冷凍室中で貯えた。
4節の手順から残っている(F′1lL1)′)2溶液
からつくった。溶液をジチオトレイトールの中で0.0
15Mとし、約2時間37℃で攪拌した。溶液を次に約
2. mlへ濃縮し、スル7ヒト9リル基のアルキレー
ションを丑−ドアセタミドを0.036Mの最終濃度ま
で添加る、ことによって開始させた。これを室温で約2
時間反応させ、その後、溶液をセファクリルS −30
0カラムへ施用し、TBS中で溶離した。アルキレーシ
ョンによって封鎖されたスルフヒドリル基をもつFab
′画分を約2−へ濃縮し、冷凍室中で貯えた。
6、 アルカリ性ホスファターゼ基質の製造検定用に選
ばれる基質はp−フェニルアゾフェニルホスフェートで
あった。ホスホリル基導入染料は次の手順に従ってつく
った。50W11のテトラヒドロ7ランおよび1dのピ
ルジンの中の1.98&のp−フェニルアゾフェニルの
溶液へ1−の酸塩化燐(POCe3)を添加した。反応
混合物を半時間還流加熱して室温へ冷却させた。混合物
を次に注意深< 100mの2NH(J溶液の中へ注ぎ
、10分間60℃で完全に攪拌して酸塩化物結合を加水
分解した。この手順はまた遊離水素燐酸の水性相中への
移行を許すものである。次に1有機相を静定させ、水性
相を分離して捨てた。この赤澄色層を50−の2NHC
A溶液で以て洗滌し、赤色沈澱が直ちに形成した。沈澱
を次に濾過し、2 N HCl溶液で以て洗滌した。こ
の赤色沈澱を50%NaOH溶液中で溶かし、2NHC
d溶液の添加によってpH10,3へ調節した。この塩
基性水溶液をクロロホルムで以て抽出して、クロロホル
ム抽出物が無色となるまでクロロホルムで以て抽出して
未反応出発物質を除いた。所望の遊離燐酸を水溶液から
pHを1,0へ調節る、ことによって沈降させた。生成
物を次に吸引濾過によって集めた。収量は1.12.F
(40%)であった。0.!lのp−フェニルアゾフェ
ニル・燐酸を1dの濃水酸アンモニウム中で室温におい
て溶かした。1時間後、溶剤を蒸発させ、相当る、アン
モニウム塩を定量的に得た。
ばれる基質はp−フェニルアゾフェニルホスフェートで
あった。ホスホリル基導入染料は次の手順に従ってつく
った。50W11のテトラヒドロ7ランおよび1dのピ
ルジンの中の1.98&のp−フェニルアゾフェニルの
溶液へ1−の酸塩化燐(POCe3)を添加した。反応
混合物を半時間還流加熱して室温へ冷却させた。混合物
を次に注意深< 100mの2NH(J溶液の中へ注ぎ
、10分間60℃で完全に攪拌して酸塩化物結合を加水
分解した。この手順はまた遊離水素燐酸の水性相中への
移行を許すものである。次に1有機相を静定させ、水性
相を分離して捨てた。この赤澄色層を50−の2NHC
A溶液で以て洗滌し、赤色沈澱が直ちに形成した。沈澱
を次に濾過し、2 N HCl溶液で以て洗滌した。こ
の赤色沈澱を50%NaOH溶液中で溶かし、2NHC
d溶液の添加によってpH10,3へ調節した。この塩
基性水溶液をクロロホルムで以て抽出して、クロロホル
ム抽出物が無色となるまでクロロホルムで以て抽出して
未反応出発物質を除いた。所望の遊離燐酸を水溶液から
pHを1,0へ調節る、ことによって沈降させた。生成
物を次に吸引濾過によって集めた。収量は1.12.F
(40%)であった。0.!lのp−フェニルアゾフェ
ニル・燐酸を1dの濃水酸アンモニウム中で室温におい
て溶かした。1時間後、溶剤を蒸発させ、相当る、アン
モニウム塩を定量的に得た。
pH7,0においてはp−フェニルアゾフェノールは主
として中性の形に6D、347%mにおいて吸収最大を
示し、吸光係数は2.OX10M″″儂 に等しい。こ
れらの吸光係数は100%の純度と無水の物質を仮定し
ている。p−フェニルアゾフェニルホスフェートの分析
は1.5個の水分子が存在していることを示している。
として中性の形に6D、347%mにおいて吸収最大を
示し、吸光係数は2.OX10M″″儂 に等しい。こ
れらの吸光係数は100%の純度と無水の物質を仮定し
ている。p−フェニルアゾフェニルホスフェートの分析
は1.5個の水分子が存在していることを示している。
pH10,0においてはフェノレートアニオンが優勢で
403およ′び430%mに吸収最大をもち、各々、吸
光係数は1.9xlOMcm である。p−フェニル
アゾフェニルホスフェートはpHで以て変らない吸収ス
ペクトルをもつことが発見された。吸収最大は340%
mにアシ、吸光係数は2.8xlOM−の に等しい。
403およ′び430%mに吸収最大をもち、各々、吸
光係数は1.9xlOMcm である。p−フェニル
アゾフェニルホスフェートはpHで以て変らない吸収ス
ペクトルをもつことが発見された。吸収最大は340%
mにアシ、吸光係数は2.8xlOM−の に等しい。
p−フェニルアゾフェノールの吸収スペクトルはまたp
H8,5において記録された。このpHにおいて、中性
およびアニオン性の7エノールは両者とも、吸収スペク
トルの各々への寄与によって証明される通シ存在る、。
H8,5において記録された。このpHにおいて、中性
およびアニオン性の7エノールは両者とも、吸収スペク
トルの各々への寄与によって証明される通シ存在る、。
各化学種の濃度はpH7,0とpH10,0において測
定した吸光係数から計算した。これらの濃度からp−フ
ェニルアゾフェノールの酸解離恒数は2.7xlOM
(pKa =g、6)に等しいと決定された。
定した吸光係数から計算した。これらの濃度からp−フ
ェニルアゾフェノールの酸解離恒数は2.7xlOM
(pKa =g、6)に等しいと決定された。
7、 不動化抗体の調製
(ヤギ)抗−ヒトエgG、Fab′断片スベ/フィック
抗体をシアノーゲンプロマイド活性化セファロースへ、
ファーマシア・ファインケミカルズが推漿る、手順に従
ってその7フイニテイクロマトグラフイ手法で不動化し
た。21!の活性セファロースを15分間20dの1m
M HCl中で膨潤させ、次いで400−のHCl溶液
で以て洗滌した。35■の抗体を2.5 agの0.1
M重炭酸ナトリウム中でpH8,3において溶かし、セ
ファデックスG−25カラムへ施用し、同じ緩衝液で溶
離した。この活性化ゲルを10m/の重炭酸塩緩衝液で
洗滌し、カラムの空洞容積において集めた精製抗体と直
ちに混合した。ゲル/抗体混合物を次にゆつ(シと2時
間室温でゆり動かし、その後、上澄液を取り出し、ゲル
を大量の重炭酸塩緩衝液と061M酢酸塩/HC,l。
抗体をシアノーゲンプロマイド活性化セファロースへ、
ファーマシア・ファインケミカルズが推漿る、手順に従
ってその7フイニテイクロマトグラフイ手法で不動化し
た。21!の活性セファロースを15分間20dの1m
M HCl中で膨潤させ、次いで400−のHCl溶液
で以て洗滌した。35■の抗体を2.5 agの0.1
M重炭酸ナトリウム中でpH8,3において溶かし、セ
ファデックスG−25カラムへ施用し、同じ緩衝液で溶
離した。この活性化ゲルを10m/の重炭酸塩緩衝液で
洗滌し、カラムの空洞容積において集めた精製抗体と直
ちに混合した。ゲル/抗体混合物を次にゆつ(シと2時
間室温でゆり動かし、その後、上澄液を取り出し、ゲル
を大量の重炭酸塩緩衝液と061M酢酸塩/HC,l。
0.5 M NaCJ、 pH4,3の緩衝液で以て交
互に洗滌した。ゲルを最後にTBSで洗滌し、ゲルを静
定させ、TBSを添加して緩衝液/ゲルの比を1に等し
くさせた。この1:1のゲル:緩衝液を次に冷凍室に貯
えた。
互に洗滌した。ゲルを最後にTBSで洗滌し、ゲルを静
定させ、TBSを添加して緩衝液/ゲルの比を1に等し
くさせた。この1:1のゲル:緩衝液を次に冷凍室に貯
えた。
実施例 2゜
緩衝液中に溶かしたヒトエgGFab′断片の各種濃度
の検定を次の手順に従って行なった。アルカリ性ホスフ
ァターゼ標識抗原と被検試料を1.5 rttlの容量
の円錐形プラスチック管へ添加し、続いて不動化抗体を
含むゲルを添加した。ゲルは磁気撹拌棒による迅速攪拌
によってスラリーとされた1:1ゲル:緩衝液から容量
的に測定された。少量のゲルについては、この1:1ス
ラリーをまず稀釈した。溶液の合計容積を次に1 %
BSA、 1 mAMgC12およびl mM ZnC
l2を含む’TBS溶液で以て0.6dとした。組合せ
た試料と試薬はアメス(エルクハルト、インディアナ州
)アリコート・ミキサーで以である時間の間室温で、通
常は一晩よく平衡させるようゆり動かした。上澄液とゲ
ルはエツベンドルフ(プリンクマン・インスンルメンツ
、ウェストヘリ−、ニューヨーク州)モデル5414遠
心分離機の中で円錐管の遠心作用によって分iし、続い
てパスツール・ピにットで以て上澄液を除いた。ゲルを
次に、TBSの添加とそれに続く混合、遠心分離および
緩衝液の除去によって数回洗滌した。上澄液とゲル画分
をスクリューキャップをもつ別々の使い捨ての13rI
anX 100++cmのガラス培養管の中においた。
の検定を次の手順に従って行なった。アルカリ性ホスフ
ァターゼ標識抗原と被検試料を1.5 rttlの容量
の円錐形プラスチック管へ添加し、続いて不動化抗体を
含むゲルを添加した。ゲルは磁気撹拌棒による迅速攪拌
によってスラリーとされた1:1ゲル:緩衝液から容量
的に測定された。少量のゲルについては、この1:1ス
ラリーをまず稀釈した。溶液の合計容積を次に1 %
BSA、 1 mAMgC12およびl mM ZnC
l2を含む’TBS溶液で以て0.6dとした。組合せ
た試料と試薬はアメス(エルクハルト、インディアナ州
)アリコート・ミキサーで以である時間の間室温で、通
常は一晩よく平衡させるようゆり動かした。上澄液とゲ
ルはエツベンドルフ(プリンクマン・インスンルメンツ
、ウェストヘリ−、ニューヨーク州)モデル5414遠
心分離機の中で円錐管の遠心作用によって分iし、続い
てパスツール・ピにットで以て上澄液を除いた。ゲルを
次に、TBSの添加とそれに続く混合、遠心分離および
緩衝液の除去によって数回洗滌した。上澄液とゲル画分
をスクリューキャップをもつ別々の使い捨ての13rI
anX 100++cmのガラス培養管の中においた。
3個の対照標準を各々の免疫検定系列で以て実施した。
対照標準1 (at)においては、検定管は系列中の他
の検定管と同量のゲルと複合体を含んでいた。更に、大
過剰の抗原、10 モル、を添加した。試薬が適切に
反応しつつある場合には、複合体はすべて試料の上澄液
の中に見出されるはずである。対照標準■(c2)にお
いては、検定管はゲルだけを含み、従って酵素活性は上
澄液またはゲル相中で見出されるべきでない。対照標準
■(c3)においては、複合体だけが添加され、従って
最大の酵素活性を測定る、ことができる。これらの1対
照標準は平衡化し、相分離させ、系列中の他の検定管に
ついて使用る、同じ方式で各相について指示反応を実施
した。
の検定管と同量のゲルと複合体を含んでいた。更に、大
過剰の抗原、10 モル、を添加した。試薬が適切に
反応しつつある場合には、複合体はすべて試料の上澄液
の中に見出されるはずである。対照標準■(c2)にお
いては、検定管はゲルだけを含み、従って酵素活性は上
澄液またはゲル相中で見出されるべきでない。対照標準
■(c3)においては、複合体だけが添加され、従って
最大の酵素活性を測定る、ことができる。これらの1対
照標準は平衡化し、相分離させ、系列中の他の検定管に
ついて使用る、同じ方式で各相について指示反応を実施
した。
指示反応は上澄あるいはゲルを含む各々の培養管へTB
S−BSA−金属(1% BSA、 1 mM ”9−
C121mM ZnCl2 )緩衝液を1.2−の最
終容積まで添加る、ことKよって実施した。1,5−の
トルエンを各管へ添加し1反応はTBS中の5X10
M p−フェニルアゾフェニルホス7エートノ200
μlの添加で以て開始させた。管を次にゆるやかに室温
においてゆシ動かし、トルエン相の肉眼的検査と吸収測
定のために周期的に取シ出した。吸収測定には、管をメ
イクトロニック21吸収ス−<クト0メーター(バラシ
ュ・アンド・ロム、ロチニスター、ニューヨーク州)の
中においた。培養管中の水性相(1,4ゴ)とトルエン
相(1,5mA’)の容積はスペクトロメーター中の光
線をトルエン相のみを通過させ、従ってトルエン相中へ
分配された染料のみ測定される。
S−BSA−金属(1% BSA、 1 mM ”9−
C121mM ZnCl2 )緩衝液を1.2−の最
終容積まで添加る、ことKよって実施した。1,5−の
トルエンを各管へ添加し1反応はTBS中の5X10
M p−フェニルアゾフェニルホス7エートノ200
μlの添加で以て開始させた。管を次にゆるやかに室温
においてゆシ動かし、トルエン相の肉眼的検査と吸収測
定のために周期的に取シ出した。吸収測定には、管をメ
イクトロニック21吸収ス−<クト0メーター(バラシ
ュ・アンド・ロム、ロチニスター、ニューヨーク州)の
中においた。培養管中の水性相(1,4ゴ)とトルエン
相(1,5mA’)の容積はスペクトロメーター中の光
線をトルエン相のみを通過させ、従ってトルエン相中へ
分配された染料のみ測定される。
2、 別相中のp−フェニルアゾフェノールの検出こ
の検定を実施る、出発点として、セファロースゲルへ不
動化された抗体はアルカリ性ホスファターゼ−抗原複合
体の中へ滴定されて複合体全部を結合る、のに必要とさ
れるゲルの最少量を決定る、。ゲルへ不動化された抗体
は(ヤギ)抗−ヒトIgG、 Fab’断片スペシフィ
ックであった。上澄液とゲルの両者を、10−11モル
の複合体と各種の量のゲルとの平衡化に続いて染料分配
指示反応で以て分析した。上澄液のトルエン層中の染料
吸収はゲルを多く使用る、ほど減少し、一方、ゲル試料
のトルエン層の吸収は増加した。これはゲル上で不動化
された抗体への複合体の結合を示す。この分析からのデ
ーターはグラフで第1図に示す。
の検定を実施る、出発点として、セファロースゲルへ不
動化された抗体はアルカリ性ホスファターゼ−抗原複合
体の中へ滴定されて複合体全部を結合る、のに必要とさ
れるゲルの最少量を決定る、。ゲルへ不動化された抗体
は(ヤギ)抗−ヒトIgG、 Fab’断片スペシフィ
ックであった。上澄液とゲルの両者を、10−11モル
の複合体と各種の量のゲルとの平衡化に続いて染料分配
指示反応で以て分析した。上澄液のトルエン層中の染料
吸収はゲルを多く使用る、ほど減少し、一方、ゲル試料
のトルエン層の吸収は増加した。これはゲル上で不動化
された抗体への複合体の結合を示す。この分析からのデ
ーターはグラフで第1図に示す。
第1図から、12μlのゲルが上澄液からアルカリ性ホ
スファターゼ活性のすべてを除くのに十分で ・る
ることが明らかである。ゲルはゲルのゴあたシ多くて3
.3 X 10−8モルの抗体を含む。5■の抗体が免
疫化過程中で1ゴのゲルについて反応したからである。
スファターゼ活性のすべてを除くのに十分で ・る
ることが明らかである。ゲルはゲルのゴあたシ多くて3
.3 X 10−8モルの抗体を含む。5■の抗体が免
疫化過程中で1ゴのゲルについて反応したからである。
12μlのゲルはそれ故、4×10 モルの抗体を含み
、これは各試料中に存在る、標識抗原よシ多くて40倍
過剰である。複合体濃度は複合体(画分■)中のアルカ
リ性ホスファターゼ対Fab′の仮定された2:1の比
と280nmにおける吸収の吸光係数の相当る、和に基
づいている(ε280nm、アルカリ性ホスファターゼ
= 7.4 X10 M″″儂 、ε280nm、 F
abt = 6− I X 10 M−儂。
、これは各試料中に存在る、標識抗原よシ多くて40倍
過剰である。複合体濃度は複合体(画分■)中のアルカ
リ性ホスファターゼ対Fab′の仮定された2:1の比
と280nmにおける吸収の吸光係数の相当る、和に基
づいている(ε280nm、アルカリ性ホスファターゼ
= 7.4 X10 M″″儂 、ε280nm、 F
abt = 6− I X 10 M−儂。
従9てε280 nm、アルカリ性ホス7アターゼーF
ab7=2.lX10M″″α )。複合体組成はセフ
ァクリル・クロマトグラフィー精製過程の間に回収され
る両分の溶離容積から推論された。検定は、10−11
モルのアルカリ性ホスファターゼ−Fab’複合体と1
2μノのゲルを試料ごとに使ってテストとした。
ab7=2.lX10M″″α )。複合体組成はセフ
ァクリル・クロマトグラフィー精製過程の間に回収され
る両分の溶離容積から推論された。検定は、10−11
モルのアルカリ性ホスファターゼ−Fab’複合体と1
2μノのゲルを試料ごとに使ってテストとした。
TBS緩衝液中のヒト脆GFabl断片の各種溶液を上
述の手順に従って検定し、結果の代表的系列を、指示反
応を2時間行わせた後に、第2図に示す。試料からの上
澄画分は一般的には、Fabl濃度に対して、トルエン
相へ移行る、染料の量におけるかなり鋭い移り変)を示
した。ゲル画分は一般的には一層ゆるやかな移り変シを
示す。上澄液データーは従って「イエス/ノー」型の検
定によりよく用いられ、それらは肉眼的分析によく適し
、−4、ゲルデーターは、吸収測定を使って、10倍か
ら100倍の濃度範囲にわたって、抗原濃度を測定る、
のによりよ(適している。第2図に示す検定において、
正指示反応から負指示反応への移シ変シは上澄画分につ
いて1×10 モルと2XlO−10モルの間のFa
bl(z1×10MFab/および1.4×10−7M
Fabl)でおこる。吸収はゲル画分について約10
モルのFablと5×10 モルFab/の間(
7,1X10 および3−6 X 10 M Fa
bt )で次第に変化る、。
述の手順に従って検定し、結果の代表的系列を、指示反
応を2時間行わせた後に、第2図に示す。試料からの上
澄画分は一般的には、Fabl濃度に対して、トルエン
相へ移行る、染料の量におけるかなり鋭い移り変)を示
した。ゲル画分は一般的には一層ゆるやかな移り変シを
示す。上澄液データーは従って「イエス/ノー」型の検
定によりよく用いられ、それらは肉眼的分析によく適し
、−4、ゲルデーターは、吸収測定を使って、10倍か
ら100倍の濃度範囲にわたって、抗原濃度を測定る、
のによりよ(適している。第2図に示す検定において、
正指示反応から負指示反応への移シ変シは上澄画分につ
いて1×10 モルと2XlO−10モルの間のFa
bl(z1×10MFab/および1.4×10−7M
Fabl)でおこる。吸収はゲル画分について約10
モルのFablと5×10 モルFab/の間(
7,1X10 および3−6 X 10 M Fa
bt )で次第に変化る、。
実施例 3゜
実施例1および2のヒトI g G Fabt断片・ア
ルカリ性ホスファターゼ標識物質および抗−Fab’不
動化抗体を使って実施例2の検定手順に従ってヒト全血
中の工gGについて分析した。免疫検定を実施る、前に
、血液はまず二つの可能性のある妨害源について検査し
た。第一のタイプの妨害は血液中のすべての着色物質か
らであり、それらはトルエンの中へ分配る、ことができ
る。これについてテストる、には、TBS中の全血の2
元稀、択物を、非稀釈血液から1部を256に稀めた血
液にわたってつくシ、検定実施のときにトルエンと混合
した。2時間混合後、トルエン相中において色は見出さ
れなかった。第二のタイプの妨害は血l夜中で存在る、
ことが知られているアルカリ性7オスフアターゼからで
るる。血液稀釈物を再びつ(す、p−フェニルアゾフェ
ニルホスフエートヲ添加しかつこれをトルエンへ向けて
分配させることによって染料分配指示反応を使って分析
した。トルエン相の吸収を2時間後に検査し、各稀釈物
に対してプロットしたそれらの値を第3図に示す。10
の単位で1以下の稀釈において見られる吸収値は、培養
管壁へ付着る、血液成分および光散乱に基づ(よシ高い
吸収値をもたらすエマルジョン形成のために、染料吸収
よシも大きい。8個の最も濃厚な血液試料を含む検定管
を2時間後に検査した。
ルカリ性ホスファターゼ標識物質および抗−Fab’不
動化抗体を使って実施例2の検定手順に従ってヒト全血
中の工gGについて分析した。免疫検定を実施る、前に
、血液はまず二つの可能性のある妨害源について検査し
た。第一のタイプの妨害は血液中のすべての着色物質か
らであり、それらはトルエンの中へ分配る、ことができ
る。これについてテストる、には、TBS中の全血の2
元稀、択物を、非稀釈血液から1部を256に稀めた血
液にわたってつくシ、検定実施のときにトルエンと混合
した。2時間混合後、トルエン相中において色は見出さ
れなかった。第二のタイプの妨害は血l夜中で存在る、
ことが知られているアルカリ性7オスフアターゼからで
るる。血液稀釈物を再びつ(す、p−フェニルアゾフェ
ニルホスフエートヲ添加しかつこれをトルエンへ向けて
分配させることによって染料分配指示反応を使って分析
した。トルエン相の吸収を2時間後に検査し、各稀釈物
に対してプロットしたそれらの値を第3図に示す。10
の単位で1以下の稀釈において見られる吸収値は、培養
管壁へ付着る、血液成分および光散乱に基づ(よシ高い
吸収値をもたらすエマルジョン形成のために、染料吸収
よシも大きい。8個の最も濃厚な血液試料を含む検定管
を2時間後に検査した。
3個の最も濃い液の中でやや黄色が見られた。それらの
結果は、10の単位で1よシ大きい血液稀釈液について
実施した検定は生のアルカリ性ホスファターゼ活性から
の妨害から解放されるはずであることを示している。
結果は、10の単位で1よシ大きい血液稀釈液について
実施した検定は生のアルカリ性ホスファターゼ活性から
の妨害から解放されるはずであることを示している。
検量曲線をTBS中のヒトIgGの二元稀釈を用いてつ
(つた。実施例20手順に従う検定を抗原の各稀釈物に
ついて実施し、結果を2時間の展開時間について第4図
にプロットした。トルエン吸収の移bvbは上澄画分中
で1×10 および2×10 モルの間のヒトIg
G(7,lXl0 Mと1.4XIQ Mの工gG
)において明らかに見られる。
(つた。実施例20手順に従う検定を抗原の各稀釈物に
ついて実施し、結果を2時間の展開時間について第4図
にプロットした。トルエン吸収の移bvbは上澄画分中
で1×10 および2×10 モルの間のヒトIg
G(7,lXl0 Mと1.4XIQ Mの工gG
)において明らかに見られる。
血液稀釈物の免疫検定を次に実施した。結果を第5図に
おいて、上澄液変色が明らかに眼に見える2時間の展開
時間について示した。また第6図においては、1時間と
4時間の展開時間における全血の免疫検定データーが示
されている。移り変りは1時間において明らかに現われ
、展開時間が4時間へ増すにつれて違いが現われ続ける
。、1″?ジテイズ上澄画分中のトルエン層の強い黄色
化が現われ、水性相は白色沈澱物の形成で以て無色にな
る。
おいて、上澄液変色が明らかに眼に見える2時間の展開
時間について示した。また第6図においては、1時間と
4時間の展開時間における全血の免疫検定データーが示
されている。移り変りは1時間において明らかに現われ
、展開時間が4時間へ増すにつれて違いが現われ続ける
。、1″?ジテイズ上澄画分中のトルエン層の強い黄色
化が現われ、水性相は白色沈澱物の形成で以て無色にな
る。
白色沈澱物は染料の加水分解から形成される無機燐酸塩
から生ずる。燐酸塩は緩衝液中に存在る、2価金属で以
て沈澱る、。ゲル画分は抗原濃度範囲にわたってトルエ
ン吸収において一層ゆるやかな変化を示すので、上澄液
画分中の移り変シは目で見ることができない。
から生ずる。燐酸塩は緩衝液中に存在る、2価金属で以
て沈澱る、。ゲル画分は抗原濃度範囲にわたってトルエ
ン吸収において一層ゆるやかな変化を示すので、上澄液
画分中の移り変シは目で見ることができない。
血液稀釈物の上澄画分中、およびIgG検量曲線におけ
る移り変シ点から、もとの血液試料中の馳G濃度が計算
できる。正常の大人の工gG/IIk度は8と15 q
IgG/m/・血液の間にあることが報告されてンズ
、 1978年)p、189゜我々がテストした血液試
料中のIgG濃度は10と14+ηIgG/mJ・血液
の間にあることが測定された。この値は予期通り、正常
のIgG濃度範囲と重なっている。この検定結果の不確
実さの水準は検定される標準と試料の濃度の間のへだた
シの関数である。濃度における不確実さは血液試料のよ
シ多くの稀釈液をテストしかつ検量系列中のIgGのよ
り多くの濃度をテストる、ことによって減らすことがで
きる。
る移り変シ点から、もとの血液試料中の馳G濃度が計算
できる。正常の大人の工gG/IIk度は8と15 q
IgG/m/・血液の間にあることが報告されてンズ
、 1978年)p、189゜我々がテストした血液試
料中のIgG濃度は10と14+ηIgG/mJ・血液
の間にあることが測定された。この値は予期通り、正常
のIgG濃度範囲と重なっている。この検定結果の不確
実さの水準は検定される標準と試料の濃度の間のへだた
シの関数である。濃度における不確実さは血液試料のよ
シ多くの稀釈液をテストしかつ検量系列中のIgGのよ
り多くの濃度をテストる、ことによって減らすことがで
きる。
実施例 4゜
別の蒸気相中の検出可能物質の検出に基づ(免疫検定
以下の手順が本発明の実際において有用で心ることが期
待される。
待される。
バーオー+シダーゼ・抗体複合体を二つの手順の何れか
によってつくった。第一の手順においては、パーオキシ
ダーゼをSMCCと反応させ、次に抗体のFab/粒子
と、実施例1においてアルカリ性ホスファターゼ標識ヒ
トエgGFab1粒子の調製において述べた通シに反応
させた。第1表は三つの複合体の各々において使用した
試薬の相対的量および得られる複合体の組成を示してい
る。複合体組成はε280nm、 Fab’粒子−=6
.lX10 M およびε430nm、パーオキシ
ダーゼ=1xlOM−を仮定る、吸収スペクトルによっ
て決定した。補正は280nmにおけるパーオキシダー
ゼの吸収について行った。
によってつくった。第一の手順においては、パーオキシ
ダーゼをSMCCと反応させ、次に抗体のFab/粒子
と、実施例1においてアルカリ性ホスファターゼ標識ヒ
トエgGFab1粒子の調製において述べた通シに反応
させた。第1表は三つの複合体の各々において使用した
試薬の相対的量および得られる複合体の組成を示してい
る。複合体組成はε280nm、 Fab’粒子−=6
.lX10 M およびε430nm、パーオキシ
ダーゼ=1xlOM−を仮定る、吸収スペクトルによっ
て決定した。補正は280nmにおけるパーオキシダー
ゼの吸収について行った。
第1表
パーオキシダーゼ F z1モル当シFab11モ
ル当シ1舌ル当シに添加 に添加したパー に複合
したパーしかSMCCモル数 オキシダーゼ・
オキシダーゼの50 5、4
2.049 5、1
1.750 5、0
0.82パ一オキシダーゼ標識抗体をつ(る第二の
手順に2いては、パーオキシダーゼおよび全IgC抗体
を各々別々に5PDPと反応させた。5PDP標識パー
オキシダーゼあるいは抗体を次にジチオトレイトールと
反応させてチオール標識パーオキシダーゼあるいは抗体
を生成させ、これを次に5PDP標識抗体または、4−
オキ7ダーゼと結合させた。
ル当シ1舌ル当シに添加 に添加したパー に複合
したパーしかSMCCモル数 オキシダーゼ・
オキシダーゼの50 5、4
2.049 5、1
1.750 5、0
0.82パ一オキシダーゼ標識抗体をつ(る第二の
手順に2いては、パーオキシダーゼおよび全IgC抗体
を各々別々に5PDPと反応させた。5PDP標識パー
オキシダーゼあるいは抗体を次にジチオトレイトールと
反応させてチオール標識パーオキシダーゼあるいは抗体
を生成させ、これを次に5PDP標識抗体または、4−
オキ7ダーゼと結合させた。
この手順はJ、カールソン、H,ドレビン、およびに記
載されるものと類似である。以下の詳細記述が代表的で
ある。2!ILlのPBS中のL2.6mWの(ヤギ)
抗−ウサギIgGをエタノール中の20mM5PDPの
23.5μlと組合わせた。この溶液をゆるやかに室温
で1時間攪拌し、次いでセファデックスG−25カラム
上で精製し、0、I N NaC1を含む0,1Mの酢
酸ナトリウムで以てpH4,5において溶離した。ジチ
オトレイトールをこの溶液へ25mM溶液を生成させる
のに十分な量で添加した。この混合物を約15分間室温
で攪拌し、その後、pH7,5で0. I N燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスG−25カラム上
で濃縮および精製した。
載されるものと類似である。以下の詳細記述が代表的で
ある。2!ILlのPBS中のL2.6mWの(ヤギ)
抗−ウサギIgGをエタノール中の20mM5PDPの
23.5μlと組合わせた。この溶液をゆるやかに室温
で1時間攪拌し、次いでセファデックスG−25カラム
上で精製し、0、I N NaC1を含む0,1Mの酢
酸ナトリウムで以てpH4,5において溶離した。ジチ
オトレイトールをこの溶液へ25mM溶液を生成させる
のに十分な量で添加した。この混合物を約15分間室温
で攪拌し、その後、pH7,5で0. I N燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスG−25カラム上
で濃縮および精製した。
パーオキシダーゼ(43W)を0. I N NaC1
を含むpH7,5のO,’I N燐酸ナトリウムの41
rLlの中に溶かした。これへ675μlの20mM5
PDPを添加し、得られる溶液を1時間攪拌し、その時
点で溶液をセファデックスG−25カラムへ施用し、p
H7,5の0.IN燐酸ナトリウムで以て溶離した。誘
導体化すれた・ξ−オキシダーゼがカラム空洞容積中に
得られ、20m1へ濃縮された。パーオキシダーゼ・5
PDPを次に誘導体化された抗体と組合わせた。
を含むpH7,5のO,’I N燐酸ナトリウムの41
rLlの中に溶かした。これへ675μlの20mM5
PDPを添加し、得られる溶液を1時間攪拌し、その時
点で溶液をセファデックスG−25カラムへ施用し、p
H7,5の0.IN燐酸ナトリウムで以て溶離した。誘
導体化すれた・ξ−オキシダーゼがカラム空洞容積中に
得られ、20m1へ濃縮された。パーオキシダーゼ・5
PDPを次に誘導体化された抗体と組合わせた。
この溶液を、8aE/の合計容積まで濃縮し、室温にお
いて攪拌しながら約20時間反応させた。この複合体を
PBSで以て溶離る、セファデックスG−100カラム
上で単離した。
いて攪拌しながら約20時間反応させた。この複合体を
PBSで以て溶離る、セファデックスG−100カラム
上で単離した。
上記手順によってつくったパーオキシダーゼ・抗体複合
体の組成を第■表の第一欄に列記る、。
体の組成を第■表の第一欄に列記る、。
類似手順によってつくった他の複合体も列記した。
全抗体濃度はε280 nm、 IgG = 2 X
10 M に基づいている。
10 M に基づいている。
第■表
バーオキシダ 抗体1モル 抗体1モル 抗体1
モル当15 5.2 10
0.7820 2、5 2.1
1.915 5、2 10
0.852、パーオキシダーゼ基質の合成 選んだパーオキシダーゼ基質、2−メチル−3−オキソ
ブタナール(MOB)をディールスらの卜49巻、 1
58 (1916年)の一般的手順に従ってつくった。
モル当15 5.2 10
0.7820 2、5 2.1
1.915 5、2 10
0.852、パーオキシダーゼ基質の合成 選んだパーオキシダーゼ基質、2−メチル−3−オキソ
ブタナール(MOB)をディールスらの卜49巻、 1
58 (1916年)の一般的手順に従ってつくった。
11.5 gのナトリウム金属を500rILlの無水
エーテル中の25mA’のメタノールと組合わせ、窒素
下で一晩攪拌させた。このエーテル溶液を次に氷の中で
冷却し1.30.8mlの蟻酸メチルを添加し、次いで
44.81!Llの2−ブタノンをゆつ(シと添加した
(30分から1時間)。これを−晩室温において攪拌し
、黄色溶液中の白色固体スラリーの生成をもたらした。
エーテル中の25mA’のメタノールと組合わせ、窒素
下で一晩攪拌させた。このエーテル溶液を次に氷の中で
冷却し1.30.8mlの蟻酸メチルを添加し、次いで
44.81!Llの2−ブタノンをゆつ(シと添加した
(30分から1時間)。これを−晩室温において攪拌し
、黄色溶液中の白色固体スラリーの生成をもたらした。
固体を濾過によって単離し500−の氷水に溶かした。
これにゆつくシと300 atの水の中の30mJの硫
酸の冷凍溶液の150dを添加した。
酸の冷凍溶液の150dを添加した。
この酸性化溶液を次に、各部当1oooyの4部のエー
テルで以て抽出した。組合わせたエーテル画分を次に5
0−の水で以て洗滌し、続いて飽和塩化ナトリウムを含
む水の2X50mJ部分で以て洗滌した。エーテル溶液
を硫酸マグネシウムで以て乾燥し、濾過し、エーテルを
蒸溜によって除去した。固体生成物を昇華によって精製
し、−80℃で貯えた。このMOBを使用前に第二の昇
華によって精製した。
テルで以て抽出した。組合わせたエーテル画分を次に5
0−の水で以て洗滌し、続いて飽和塩化ナトリウムを含
む水の2X50mJ部分で以て洗滌した。エーテル溶液
を硫酸マグネシウムで以て乾燥し、濾過し、エーテルを
蒸溜によって除去した。固体生成物を昇華によって精製
し、−80℃で貯えた。このMOBを使用前に第二の昇
華によって精製した。
2−メチル−3−オキソブタナール(MOB)は緩衝液
中で溶解酸素と反応して2.3−ブタンジオン(ビアセ
チル)を生成した。この反応は酵素パーオキシダーゼに
よって触媒される。この反応過程はビアセチルの生成に
伴なう化学発光により或いは酸素消費量によって追跡る
、ことができる。反応速度に関係る、いくつかのデータ
ーを第■表に示す。酸素消費量はクラーク電極と酸素モ
ニター(イエロー・スプリング・インスッルメントGo
、’イエロースプリング、オハイオ州)で以て測定した
。ビアセチルの1モルは消費酸素1モルについて生成さ
れるはずであるので、50チの酸素消費は空気飽和溶液
中で約1.2X10−’Mのビアセチルの生成ニ相尚る
、。この反応混合物へのアセチルアセトンの添加が酸素
吸収を助けることに注目すべきである。試験した溶液は
はじめは空気飽和であった。
中で溶解酸素と反応して2.3−ブタンジオン(ビアセ
チル)を生成した。この反応は酵素パーオキシダーゼに
よって触媒される。この反応過程はビアセチルの生成に
伴なう化学発光により或いは酸素消費量によって追跡る
、ことができる。反応速度に関係る、いくつかのデータ
ーを第■表に示す。酸素消費量はクラーク電極と酸素モ
ニター(イエロー・スプリング・インスッルメントGo
、’イエロースプリング、オハイオ州)で以て測定した
。ビアセチルの1モルは消費酸素1モルについて生成さ
れるはずであるので、50チの酸素消費は空気飽和溶液
中で約1.2X10−’Mのビアセチルの生成ニ相尚る
、。この反応混合物へのアセチルアセトンの添加が酸素
吸収を助けることに注目すべきである。試験した溶液は
はじめは空気飽和であった。
抗−ヤギIgGを含む検定管へ添加る、。この混合物へ
またパーオキシダーゼ標識ヤギIgGを試料抗原の存在
なしで不動化抗体によって完全に結合されるのに十分な
少量で添加る、。これを平衡化して試料抗原とパーオキ
シダーゼ標識抗原との不動化抗体への競合的結合を行わ
せる。固体担体と上澄液を次にr過または遠心分離によ
って分離し、両画分を十分なMOBをpH6,5の0.
01 Mビス−トリス中で添加して10 Mの最終M
OB濃度を達成させる。反応は栓付きの管の中で数分ま
たはそれより長く進行させる。試料中の抗原の存在は上
澄画分を分析る、とき溶液上方の蒸気相中のビアセチル
の存在によって示される。ゲル画分を分析る、とき、そ
の逆も真である。ビアセチルはその蒸気相燐先によって
測定できる燐光性化合物である。
またパーオキシダーゼ標識ヤギIgGを試料抗原の存在
なしで不動化抗体によって完全に結合されるのに十分な
少量で添加る、。これを平衡化して試料抗原とパーオキ
シダーゼ標識抗原との不動化抗体への競合的結合を行わ
せる。固体担体と上澄液を次にr過または遠心分離によ
って分離し、両画分を十分なMOBをpH6,5の0.
01 Mビス−トリス中で添加して10 Mの最終M
OB濃度を達成させる。反応は栓付きの管の中で数分ま
たはそれより長く進行させる。試料中の抗原の存在は上
澄画分を分析る、とき溶液上方の蒸気相中のビアセチル
の存在によって示される。ゲル画分を分析る、とき、そ
の逆も真である。ビアセチルはその蒸気相燐先によって
測定できる燐光性化合物である。
しかし、はるかに簡単には、ビアセチルの存在はその芳
香によって決定できる。〔ビアセチルはバターの主要な
芳香性成分であり、水溶液中でその芳香によって2.3
ppm (2,7X 10 M)において検出でき
る。(W、 H,ンユタール(編)、Compilat
ionof 0aor and Ta5te Thre
shold Values Data。
香によって決定できる。〔ビアセチルはバターの主要な
芳香性成分であり、水溶液中でその芳香によって2.3
ppm (2,7X 10 M)において検出でき
る。(W、 H,ンユタール(編)、Compilat
ionof 0aor and Ta5te Thre
shold Values Data。
American 5ociety for Test
ingana Materials。
ingana Materials。
ASTMデーターシリーズDS48.フイラデルフイア
、パサデイナ州)〕。第■表のデーターはビアセチルが
、10 Mのパーオキシダーゼが10 MのMOBを
含む溶液中に存在る、ときに、数分以内でその芳香によ
って検出が容易にできる量で生成されることを示してい
る。アセチルアセトンを反応を容易にる、ために添加し
てよい。
、パサデイナ州)〕。第■表のデーターはビアセチルが
、10 Mのパーオキシダーゼが10 MのMOBを
含む溶液中に存在る、ときに、数分以内でその芳香によ
って検出が容易にできる量で生成されることを示してい
る。アセチルアセトンを反応を容易にる、ために添加し
てよい。
実施例 5゜
可溶化検出可能物質の検出に基づく免疫検定以下の手順
は本発明の実際において有用でるることが期待される。
は本発明の実際において有用でるることが期待される。
1、 コラ−ゲナーゼ標識物質の調製
コラ−ゲナーゼ・ヒトFab/複合体をアルカリ性ホス
ファターゼ・ヒトFab を複合体をつくる実施例1に
記載の同じ手順によってつ(つた。2.5 rttlの
pH7,0の0.11’T燐酸ナトリウム緩衝液中の2
4■の高純度コラ−ゲナーゼ(1600単位/W9・プ
ロティン)ジオキサン中の8.9 mM SMCC溶液
の171μlと反応させた。これは各々19μlで9回
にわけて、各回5分ずつ時間をあけて添加され、その間
プロティン溶液は30℃の水浴中で攪拌した。反応はす
べての添加を行ったのちに約1時間継続1次いで誘導体
化コラ−ゲナーゼを1 mM EDTAを含むpH7,
0の0.IN燐酸ナトリウムで以て溶離る、セファデッ
クスG−25カラム中で単離した。ヒトIgGの(Fa
b’)2調製剤は実施例1に記載の通りにつくシ、2.
2X10″′7モル(22++v)をpH5,0の0.
015Mジチオトレイトールおよび0.IN酢酸ナトリ
ウムの中で分割してFab’断片を形成させ、これをl
mM EDTAを含むpH7,0の0.IN燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスG−25カラムの
上で単離した。このFab/断片を次に誘導体化コラ−
ゲナーゼと混合し、約4mlへ濃縮し、攪拌しながら4
℃で24時間反応させた。溶液を次に11のTBSの中
で一晩透析し、その後、Ca 0132kO,oINの
最終濃度まで添加し、続いてβ−メル、カプトエチルア
ミンを5X10 Mの最終濃度まで添加した(未反応
マレイミド機能の封鎖)。この反応は室温において2時
間進行し、その時点において溶液をセファクリルS −
200カラムへ施用し、1 mN Ca(J てl
mN ZnCA!2を含むTBSで以て啓離した。複合
体含有画分を集め、2.4 rdへ濃縮し、4℃で貯蔵
した。セファクリルS −200カラムの280nmに
おける吸収像から、この複合体は約1.5Fabt/コ
ラ−ゲナーゼを含むことが推定された。
ファターゼ・ヒトFab を複合体をつくる実施例1に
記載の同じ手順によってつ(つた。2.5 rttlの
pH7,0の0.11’T燐酸ナトリウム緩衝液中の2
4■の高純度コラ−ゲナーゼ(1600単位/W9・プ
ロティン)ジオキサン中の8.9 mM SMCC溶液
の171μlと反応させた。これは各々19μlで9回
にわけて、各回5分ずつ時間をあけて添加され、その間
プロティン溶液は30℃の水浴中で攪拌した。反応はす
べての添加を行ったのちに約1時間継続1次いで誘導体
化コラ−ゲナーゼを1 mM EDTAを含むpH7,
0の0.IN燐酸ナトリウムで以て溶離る、セファデッ
クスG−25カラム中で単離した。ヒトIgGの(Fa
b’)2調製剤は実施例1に記載の通りにつくシ、2.
2X10″′7モル(22++v)をpH5,0の0.
015Mジチオトレイトールおよび0.IN酢酸ナトリ
ウムの中で分割してFab’断片を形成させ、これをl
mM EDTAを含むpH7,0の0.IN燐酸ナト
リウムで以て溶離る、セファデックスG−25カラムの
上で単離した。このFab/断片を次に誘導体化コラ−
ゲナーゼと混合し、約4mlへ濃縮し、攪拌しながら4
℃で24時間反応させた。溶液を次に11のTBSの中
で一晩透析し、その後、Ca 0132kO,oINの
最終濃度まで添加し、続いてβ−メル、カプトエチルア
ミンを5X10 Mの最終濃度まで添加した(未反応
マレイミド機能の封鎖)。この反応は室温において2時
間進行し、その時点において溶液をセファクリルS −
200カラムへ施用し、1 mN Ca(J てl
mN ZnCA!2を含むTBSで以て啓離した。複合
体含有画分を集め、2.4 rdへ濃縮し、4℃で貯蔵
した。セファクリルS −200カラムの280nmに
おける吸収像から、この複合体は約1.5Fabt/コ
ラ−ゲナーゼを含むことが推定された。
着色剤用青色デキストランを含むコラーゲンビードをア
ルブミンビード調製において使用した類似の手順によっ
てつ(つた(T、に、!J−1T、D。
ルブミンビード調製において使用した類似の手順によっ
てつ(つた(T、に、!J−1T、D。
ノコロスキーおよびG、 p、 oイヤー、5cien
ce、 213233−235 (1981) )。高
分子量青色デキストランがコラーゲンと青色デキストラ
ンとの合計重量の5チ、10%、15%、20チ、25
%および50チを構成る、ビードをつくった。すべての
調製において、この両4リマーの合計重量は3.751
1であった。これを21.25gの水へ添加し、はじめ
は70℃へ、そして次に90℃へ加熱して溶液を明澄化
させた。
ce、 213233−235 (1981) )。高
分子量青色デキストランがコラーゲンと青色デキストラ
ンとの合計重量の5チ、10%、15%、20チ、25
%および50チを構成る、ビードをつくった。すべての
調製において、この両4リマーの合計重量は3.751
1であった。これを21.25gの水へ添加し、はじめ
は70℃へ、そして次に90℃へ加熱して溶液を明澄化
させた。
500 vtlフラスコ中のコーン油250フを水浴中
で45℃へ加熱し、オーバーヘッド機械攪拌器で以て迅
速に攪拌した。この攪拌油へ7.5mJのス/ξ/85
を添加し、続いてコラーゲン溶液をゆつくシと添加した
。ビード形成が直ちにおこった。25チグルタルアルデ
ヒドの600μlを次に添加し、攪拌を20分間継続し
た。油を次に傾瀉し、ビードをヘキサンで以て4回洗滌
し、紙タオル片の間で吸取シ乾燥を行った。乾燥後、ビ
ート9を水で3回洗滌し、水の中で4℃において貯えた
。
で45℃へ加熱し、オーバーヘッド機械攪拌器で以て迅
速に攪拌した。この攪拌油へ7.5mJのス/ξ/85
を添加し、続いてコラーゲン溶液をゆつくシと添加した
。ビード形成が直ちにおこった。25チグルタルアルデ
ヒドの600μlを次に添加し、攪拌を20分間継続し
た。油を次に傾瀉し、ビードをヘキサンで以て4回洗滌
し、紙タオル片の間で吸取シ乾燥を行った。乾燥後、ビ
ート9を水で3回洗滌し、水の中で4℃において貯えた
。
ナーゼ転化
青色デキストラン/コラーゲン・ビードのコシ−ゲナー
ゼ酵素的消化を、各種の量のコラ−ゲナーゼを0.18
11’のビードへ添加し混合物合計容積をTBsと30
μlの0.1 N 0aCA! 2との添加によって3
tttlとる、ことによって検査した。各種の反応混
合物を1.2.3.4および19時間の反応ののちに肉
眼で検査した。また、19時間において、溶液の吸収値
を6150mにおいて記録してコラーゲンマトリックス
から青色デキストラン放出による最大の溶液着色を測定
した。この検討の結果を25チ青色デキストラン/コラ
ーゲン・ビードについて第■表にまとめた。その他のビ
ード組成物は類似の結果を与えたが、ビード組成中の青
色デキストランの量に応じて615nm吸収がよシ大き
く或いはより小さい。
ゼ酵素的消化を、各種の量のコラ−ゲナーゼを0.18
11’のビードへ添加し混合物合計容積をTBsと30
μlの0.1 N 0aCA! 2との添加によって3
tttlとる、ことによって検査した。各種の反応混
合物を1.2.3.4および19時間の反応ののちに肉
眼で検査した。また、19時間において、溶液の吸収値
を6150mにおいて記録してコラーゲンマトリックス
から青色デキストラン放出による最大の溶液着色を測定
した。この検討の結果を25チ青色デキストラン/コラ
ーゲン・ビードについて第■表にまとめた。その他のビ
ード組成物は類似の結果を与えたが、ビード組成中の青
色デキストランの量に応じて615nm吸収がよシ大き
く或いはより小さい。
第■表
0 熱溶i% 0.16740キ
ロ単位 2 0.8088キロ単
位 3 0.79116キロ単
位 19 0.789320
単位 19 0.789米 1単位
は、カルシウムイオン存在下のpH7,4および37℃
において5時間で、ニンヒドリン色でL−ロイシンの1
.0マイクロモルに等しいコラーゲンからのペプチドを
遊離させるものでるる(シグマ・ケミカル・Co、の規
格)。
ロ単位 2 0.8088キロ単
位 3 0.79116キロ単
位 19 0.789320
単位 19 0.789米 1単位
は、カルシウムイオン存在下のpH7,4および37℃
において5時間で、ニンヒドリン色でL−ロイシンの1
.0マイクロモルに等しいコラーゲンからのペプチドを
遊離させるものでるる(シグマ・ケミカル・Co、の規
格)。
4、基質のコラ−ゲナーゼ複合体消化
ヒート消化実験をコラ−ゲナーゼ・ヒトFab/複合体
を使って次に繰返した。結果を第v表に表示る、。6管
へ添加る、コラ−ゲナーゼ活性の量はシグマ・ケミカル
・COから入手のままのコラ−ゲナーゼの活性(160
0単位/l19プロティン)に基づいて、複合化過程の
影響を反映させていない。コラ−ゲナーゼ濃度は複合体
中の1.5:1のFab/:コラ−ゲナーゼ比と、L
5 Fab’および1コラ−ゲナーゼの29Qnmにお
ける吸光係数の和である5280nm。
を使って次に繰返した。結果を第v表に表示る、。6管
へ添加る、コラ−ゲナーゼ活性の量はシグマ・ケミカル
・COから入手のままのコラ−ゲナーゼの活性(160
0単位/l19プロティン)に基づいて、複合化過程の
影響を反映させていない。コラ−ゲナーゼ濃度は複合体
中の1.5:1のFab/:コラ−ゲナーゼ比と、L
5 Fab’および1コラ−ゲナーゼの29Qnmにお
ける吸光係数の和である5280nm。
複合体〜2.4X10M と、を仮定して測定した。
反応の進行は上置液の615nmの吸収(A6□5)に
よって追跡る、。25%の青色デキストランを含むビー
ドと0.1811のビードをここでも試料として使った
。
よって追跡る、。25%の青色デキストランを含むビー
ドと0.1811のビードをここでも試料として使った
。
つかの形式の何れかに従って実施できる。ヒトIgGに
ついての競合的不均質系検定法を次に説明る、。未知量
の抗原を含む試料をコラ−ゲナーゼ・ヒ) Fabtお
よび十分なセファロース不動化抗−ヒトFabtと組合
わせて抗原不在下ですべてのコラ−ゲナーゼ活性を結合
させる。この混合物を、コラーゲン・抗原と試料抗原が
不動化抗体の限定された量へ結合る、よう競合る、ので
平衡化させる。
ついての競合的不均質系検定法を次に説明る、。未知量
の抗原を含む試料をコラ−ゲナーゼ・ヒ) Fabtお
よび十分なセファロース不動化抗−ヒトFabtと組合
わせて抗原不在下ですべてのコラ−ゲナーゼ活性を結合
させる。この混合物を、コラーゲン・抗原と試料抗原が
不動化抗体の限定された量へ結合る、よう競合る、ので
平衡化させる。
上澄液と固体を次にf過または遠心分離によって分離る
、。両両分へ青色デキストランを含むコラーゲンビード
を添加る、。ビードの量は、試料中での懸濁中、あるい
は試料が不透明であれば底へ沈降したのち、の何れかで
肉眼で識別できる程度の量であればよい。゛試料がビー
ドの存在を完全に不明瞭化る、場合には、ビードは試料
の液状部分の頌瀉またはf通抜に、見ることが可能であ
るようにしてよい。ビードと共に添加る、緩衝液はCa
C12を1州に近い最終濃度で含む。画分中に存在る、
コラ−ゲナーゼ・ヒトFab/によるビードの消化を数
時間進行させ、その後、両分を肉眼検査してビードの溶
解がおこったかどうかを確かめる。ビードの溶解と上澄
画分中の青色デキストラン着色剤の放出はもとの試料の
中の十分大量の抗原の存在を示すものであり、一方、ビ
ード溶解とセファロースゲル画分中の着色剤放出はその
逆を示す。
、。両両分へ青色デキストランを含むコラーゲンビード
を添加る、。ビードの量は、試料中での懸濁中、あるい
は試料が不透明であれば底へ沈降したのち、の何れかで
肉眼で識別できる程度の量であればよい。゛試料がビー
ドの存在を完全に不明瞭化る、場合には、ビードは試料
の液状部分の頌瀉またはf通抜に、見ることが可能であ
るようにしてよい。ビードと共に添加る、緩衝液はCa
C12を1州に近い最終濃度で含む。画分中に存在る、
コラ−ゲナーゼ・ヒトFab/によるビードの消化を数
時間進行させ、その後、両分を肉眼検査してビードの溶
解がおこったかどうかを確かめる。ビードの溶解と上澄
画分中の青色デキストラン着色剤の放出はもとの試料の
中の十分大量の抗原の存在を示すものであり、一方、ビ
ード溶解とセファロースゲル画分中の着色剤放出はその
逆を示す。
実施例1の標識物質を使用る、実施例3の方法は、本発
明による試料中のアナライトの分析的測定にとって、現
在では明らかに、最も好ましくかつ完全にテストされた
具体化であるけれども、等しく有効な分析的測定は本発
明による他の改良された分析的結合検定を使用る、こと
によって達成されてよい。
明による試料中のアナライトの分析的測定にとって、現
在では明らかに、最も好ましくかつ完全にテストされた
具体化であるけれども、等しく有効な分析的測定は本発
明による他の改良された分析的結合検定を使用る、こと
によって達成されてよい。
上記の通シ、本発明は試料中のアナライトの分析的測定
のために1 アナライトと添加標識物質との会合反応に
よシ或いはアナライトおよび添加標識物質とアナライト
および標識物質用の添加結合剤との競合的会合反応によ
る改良された結合検定法を含むものであり、その場合、
その改良は標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質から或いは水性相と別の第一相から成る基質
からの検出可能物質の形成を触媒る、か、あるいは水性
第一相中で酵素的処理を行う際に標識物質から解離して
検出可能物質を形成る、か、の何れかである標識部を用
いることにアシ、そのようにして形成される物質は第一
相と別の第二相の中に存在る、か或いは第二相として存
在る、ことができる。会合および/または非会合の標識
物質(用いる標識部に依存る、が、それはまた分離工程
を必要とる、かどうかを決定る、)を水性相で基質また
は酵素と上記物質を形成させる条件の下で接触させる。
のために1 アナライトと添加標識物質との会合反応に
よシ或いはアナライトおよび添加標識物質とアナライト
および標識物質用の添加結合剤との競合的会合反応によ
る改良された結合検定法を含むものであり、その場合、
その改良は標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質から或いは水性相と別の第一相から成る基質
からの検出可能物質の形成を触媒る、か、あるいは水性
第一相中で酵素的処理を行う際に標識物質から解離して
検出可能物質を形成る、か、の何れかである標識部を用
いることにアシ、そのようにして形成される物質は第一
相と別の第二相の中に存在る、か或いは第二相として存
在る、ことができる。会合および/または非会合の標識
物質(用いる標識部に依存る、が、それはまた分離工程
を必要とる、かどうかを決定る、)を水性相で基質また
は酵素と上記物質を形成させる条件の下で接触させる。
用いる標識部にまた応じて、物質の形成 。
は第二の別の相としてのその物質の存在を測定る、こと
によって直接的に測定され、あるいは第一相を第二の別
の相と、第一相から第二相への検出可能量の物質の移行
を許す条件の下で接触させる。
によって直接的に測定され、あるいは第一相を第二の別
の相と、第一相から第二相への検出可能量の物質の移行
を許す条件の下で接触させる。
第二相中の物質の移行は次に、第ニー相中の物質の存在
を測定る、ことによって直接的に測定る、か、あるいは
、物質量の減少を比色、肉眼、あるいは嗅覚的手段を含
む周知の手段によシ或いは計器的測定によって追跡る、
ことによって間接的に測定される。希望る、場合には、
試料中に存在る、アナライトの量はまた、既知量のアナ
ライトを含む試料をつくり、各既知試料について本発明
による分析的測定を行い、そしてよく知られた方法に従
って各既知試料について結果をプロットる、ことによっ
て構成される標準曲線から外挿る、ことによって決定る
、こともできる。
を測定る、ことによって直接的に測定る、か、あるいは
、物質量の減少を比色、肉眼、あるいは嗅覚的手段を含
む周知の手段によシ或いは計器的測定によって追跡る、
ことによって間接的に測定される。希望る、場合には、
試料中に存在る、アナライトの量はまた、既知量のアナ
ライトを含む試料をつくり、各既知試料について本発明
による分析的測定を行い、そしてよく知られた方法に従
って各既知試料について結果をプロットる、ことによっ
て構成される標準曲線から外挿る、ことによって決定る
、こともできる。
実施例1.4および5の改良された結合検定法は標識物
質の調製を例証る、ものでl)、そして実施例2および
3は°結合検定法における標識物質の利用を例証してお
シ、それらにおいて、試料相中のアナライトの存在は別
の第二相中に存在る、物質の存在を検出る、ことによっ
て測定され、且つ、その物質は第一相中の標識物質の標
識部が関係る、酵素反応から生ずる。更に特定的にいえ
ば、実施例2および3は、試料中のアナライトの存在の
測定が添加結合剤との会合についてのアナライトと標識
物質との間の競合によって達成される検定法を例証して
おシ;会合物質と非会合物質金相互に分離し、分離した
会合標識物質を緩衝液から成るか或いは非結合標識物質
を水性第一相として含む上置液を用いる水性第一相の中
に置き、そして第一相の中で、その中の結合または非結
合標識物質によって酵素的にある物質へ転化される基質
を提供し、その物質が検出可能の量で、第一相と接触状
態とさせた第二の別の有機液相へ移行されそしてその中
で検出される。添加結合剤に対る、アナライトおよび標
識物質の競合に基づき、結合剤と会合しない標識物質の
量は試料中に存在る、アナライトの景の増加と共に増加
し、結合剤と会合る、標識物質の量は存在る、アナライ
トの量の増加と共に減少る、。利用る、標識物質は測定
されるべきアナライトのアルカリ性ホスファターゼ複合
体であったが、与えられた基質を既知物質へ触媒る、数
多くの他の酵素的標識も使用る、ことができ、例えば実
施例4および5に開示のパーオキシダーゼおよびコラ−
ゲナーゼの複合体である。
質の調製を例証る、ものでl)、そして実施例2および
3は°結合検定法における標識物質の利用を例証してお
シ、それらにおいて、試料相中のアナライトの存在は別
の第二相中に存在る、物質の存在を検出る、ことによっ
て測定され、且つ、その物質は第一相中の標識物質の標
識部が関係る、酵素反応から生ずる。更に特定的にいえ
ば、実施例2および3は、試料中のアナライトの存在の
測定が添加結合剤との会合についてのアナライトと標識
物質との間の競合によって達成される検定法を例証して
おシ;会合物質と非会合物質金相互に分離し、分離した
会合標識物質を緩衝液から成るか或いは非結合標識物質
を水性第一相として含む上置液を用いる水性第一相の中
に置き、そして第一相の中で、その中の結合または非結
合標識物質によって酵素的にある物質へ転化される基質
を提供し、その物質が検出可能の量で、第一相と接触状
態とさせた第二の別の有機液相へ移行されそしてその中
で検出される。添加結合剤に対る、アナライトおよび標
識物質の競合に基づき、結合剤と会合しない標識物質の
量は試料中に存在る、アナライトの景の増加と共に増加
し、結合剤と会合る、標識物質の量は存在る、アナライ
トの量の増加と共に減少る、。利用る、標識物質は測定
されるべきアナライトのアルカリ性ホスファターゼ複合
体であったが、与えられた基質を既知物質へ触媒る、数
多くの他の酵素的標識も使用る、ことができ、例えば実
施例4および5に開示のパーオキシダーゼおよびコラ−
ゲナーゼの複合体である。
その他の形の添加結合剤も使用してよく、ビードあるい
は反応容器の壁のような他の既知担体物質へ不動化させ
た抗体も含まれる。
は反応容器の壁のような他の既知担体物質へ不動化させ
た抗体も含まれる。
第二相は基質が中に提供され或いはその相として存在る
、第一相とは別であるように選ばれ、そして、物質が自
らが第二相から成る場合には、第二相へ相境界を横切っ
て検出可能物質の検出可能量が移行る、のを許すように
選ばれる。前記の各実施例においては水性試料(血清ま
たは緩衝液)を用いた。可能性のめる第二の別の相は、
この場合、相という用語はある物理系の均質で機械的に
分離可能の部分として定義される( Encyc1日、
Br1t14巻、204頁)が、従ってガス相、固相
、あるいは試料相と混和しない液相を含む。有機溶剤(
トルエン)の形の後者の別の相は上記概説の実施例2お
よび3に対して選ばれた。第二相はまた、°物質が溶解
性、ガス状性質あるいはその他の物理化学的性質に基づ
いてその第二相中の存在を「よシ好む」ように、物質の
性質に依存して選ばれる。
、第一相とは別であるように選ばれ、そして、物質が自
らが第二相から成る場合には、第二相へ相境界を横切っ
て検出可能物質の検出可能量が移行る、のを許すように
選ばれる。前記の各実施例においては水性試料(血清ま
たは緩衝液)を用いた。可能性のめる第二の別の相は、
この場合、相という用語はある物理系の均質で機械的に
分離可能の部分として定義される( Encyc1日、
Br1t14巻、204頁)が、従ってガス相、固相
、あるいは試料相と混和しない液相を含む。有機溶剤(
トルエン)の形の後者の別の相は上記概説の実施例2お
よび3に対して選ばれた。第二相はまた、°物質が溶解
性、ガス状性質あるいはその他の物理化学的性質に基づ
いてその第二相中の存在を「よシ好む」ように、物質の
性質に依存して選ばれる。
例証的実施例の有機溶剤第二相はまた、酵素的に生成さ
れる物質p−フェニルアゾフェノールが疎水性であり、
液相間の境界を横切って移行し、非水性有機液相中で検
出可能量で存在る、ので選ばれた。
れる物質p−フェニルアゾフェノールが疎水性であり、
液相間の境界を横切って移行し、非水性有機液相中で検
出可能量で存在る、ので選ばれた。
本発明の他の期待される具体化は、ガス状物質が液相試
料の上方のガス相中で追跡される改良検定法を含む。酵
素処理の際に第二の別のガス相の中で存在る、物質を生
成る、ことができる数多くの有力な標識が利用できる。
料の上方のガス相中で追跡される改良検定法を含む。酵
素処理の際に第二の別のガス相の中で存在る、物質を生
成る、ことができる数多くの有力な標識が利用できる。
実施例4において示した通シ、メチルオキンブタナール
は空気存在下で酵素パーオキシダーゼによってブタンジ
オンへ転化されることが発見された。ブタンジオンはバ
ターの臭をもつ強い芳香のある物質であり、食品工業に
おいて利用されている。非ガス状第一相中のパーオキシ
ダーゼ複合化標識物質によるメチルオキンブタナールの
ブタンジオンへの酵素的転化は「嗅覚」検定法で用いる
ことができ、ブタンジオンの検出は検定管上力の空気を
採取る、ことによって実施される。文献では、液相中の
極めて小さい濃度(2,5X10 Mブタンジオン)
が上を蔽っている蒸気相中の検出可能量をもたらすこと
が示されている。このガス相中のブタンジオンの存在は
またブタンジオンの燐光により、あるいはグアニジン含
有化合物(例えばアルギニン)を含むガス相との接触で
提供される他物質とのそれの反応からの着色物質の形成
によって、検出る、こともできる。同様に、水性相中で
不溶である固体物質を水性相中で可溶である基質を用い
る酵素触媒反応から生成させ、固相中のその存在をアナ
ライト存在の指標として用いることができる。逆に、水
性相中で不溶である標識物質用固体基質をその中で可溶
性、液状またはガス状物質へ酵素的に転化させてもよ(
aあるいはそのような物質を可溶化に際して固体基質か
ら放出させてもよい。そのような物質の形成または放出
を触媒る、標識物質の例は実施例5に示されておシ、そ
こでは、°水性相中で不溶の肉眼的識別可能の固体コラ
ーゲン/青色デキストラン・ビードがコラ−ゲナーゼに
よって水性相中へ放出される可溶性物質と青色デキスト
ランへ消化されることが示されている。第一相と別の相
の中で存在できるその他の物質の選択もまた本発明の領
域内にある。
は空気存在下で酵素パーオキシダーゼによってブタンジ
オンへ転化されることが発見された。ブタンジオンはバ
ターの臭をもつ強い芳香のある物質であり、食品工業に
おいて利用されている。非ガス状第一相中のパーオキシ
ダーゼ複合化標識物質によるメチルオキンブタナールの
ブタンジオンへの酵素的転化は「嗅覚」検定法で用いる
ことができ、ブタンジオンの検出は検定管上力の空気を
採取る、ことによって実施される。文献では、液相中の
極めて小さい濃度(2,5X10 Mブタンジオン)
が上を蔽っている蒸気相中の検出可能量をもたらすこと
が示されている。このガス相中のブタンジオンの存在は
またブタンジオンの燐光により、あるいはグアニジン含
有化合物(例えばアルギニン)を含むガス相との接触で
提供される他物質とのそれの反応からの着色物質の形成
によって、検出る、こともできる。同様に、水性相中で
不溶である固体物質を水性相中で可溶である基質を用い
る酵素触媒反応から生成させ、固相中のその存在をアナ
ライト存在の指標として用いることができる。逆に、水
性相中で不溶である標識物質用固体基質をその中で可溶
性、液状またはガス状物質へ酵素的に転化させてもよ(
aあるいはそのような物質を可溶化に際して固体基質か
ら放出させてもよい。そのような物質の形成または放出
を触媒る、標識物質の例は実施例5に示されておシ、そ
こでは、°水性相中で不溶の肉眼的識別可能の固体コラ
ーゲン/青色デキストラン・ビードがコラ−ゲナーゼに
よって水性相中へ放出される可溶性物質と青色デキスト
ランへ消化されることが示されている。第一相と別の相
の中で存在できるその他の物質の選択もまた本発明の領
域内にある。
例証用実施例は、物質の酵素的形成または放出の前に結
合標識物質の非結合標識物質からの分離を必要とる、、
改良された不均質系免疫検定法を記述しているけれども
、均質系結合検定法も本発明と矛盾なく開発る、ことが
できる。均質系検定法において用いられる標識物質は、
添加結合剤またはアナライトと会合る、ときに検出可能
物質の生成を一部または全部阻害されるが、しかし非会
合時には阻害されない標識部を含むことができる。
合標識物質の非結合標識物質からの分離を必要とる、、
改良された不均質系免疫検定法を記述しているけれども
、均質系結合検定法も本発明と矛盾なく開発る、ことが
できる。均質系検定法において用いられる標識物質は、
添加結合剤またはアナライトと会合る、ときに検出可能
物質の生成を一部または全部阻害されるが、しかし非会
合時には阻害されない標識部を含むことができる。
酵素標識物質の受容体への結合に基づく酵素活性阻害の
一般的概念は当業において知られている。
一般的概念は当業において知られている。
米国特許ノに4,376.825を見よ。同様に、均質
系検定法において用いられる標識物質は、酵素的に分割
可能の結合をもつ標識部を含み、その結合がその標識物
質をアナライトまたは添加結合剤へ結合る、ときに酵素
的分割が一部または完全に阻止されるものでおることが
できる。このような結合を利用る、一般的概念は当業に
おいて知られている。米国特許ノに4,318,981
を見よ。
系検定法において用いられる標識物質は、酵素的に分割
可能の結合をもつ標識部を含み、その結合がその標識物
質をアナライトまたは添加結合剤へ結合る、ときに酵素
的分割が一部または完全に阻止されるものでおることが
できる。このような結合を利用る、一般的概念は当業に
おいて知られている。米国特許ノに4,318,981
を見よ。
本発明の改良を利用る、改善された非競合的会合検定技
法もまた考えられる。例えば、DNA。
法もまた考えられる。例えば、DNA。
RNAおよびその他の遺伝物質についてのハイブリッド
化検定は本発明の利用によって恩恵を蒙るもので1)、
その場合には、プローブがそれらと標識部と会合させ、
その標識部が第二の別の相の中に存在る、かまたは第二
の別の相として存在る、物質を形成しあるいは酵素的処
理に際して放出る、のを触媒る、。抗体は同様に標識化
して生成物中のビールス、外因性プロティンおよび微生
物の存在を測定る、のに用いてよい。
化検定は本発明の利用によって恩恵を蒙るもので1)、
その場合には、プローブがそれらと標識部と会合させ、
その標識部が第二の別の相の中に存在る、かまたは第二
の別の相として存在る、物質を形成しあるいは酵素的処
理に際して放出る、のを触媒る、。抗体は同様に標識化
して生成物中のビールス、外因性プロティンおよび微生
物の存在を測定る、のに用いてよい。
本発明の改良された結合検定法に従って提供される別の
相の中の物質の検出は、この検定法をヒトの健康管理に
おいて用いる二進的すなわち「イエス/ノー」テストに
よく適る、ものとさせる。
相の中の物質の検出は、この検定法をヒトの健康管理に
おいて用いる二進的すなわち「イエス/ノー」テストに
よく適る、ものとさせる。
本発明による物質は第二の別の相の中で存在し且つ比色
手段あるいは嗅素的手段によるような高価な設備なしで
検出できるように選ぶことができるので、医院あるいは
家庭キットにおいて妊娠テスト、尿感染テスト、糖尿テ
ストなど簡単なテストに使用できる。更に、本発明の検
定法はまた検出可能物質の吸収を測定る、計器を用いる
臨床的設備においても利用でき、その測定は試料相と別
の相の中の検出可能物質の存在によって楽になる。
手段あるいは嗅素的手段によるような高価な設備なしで
検出できるように選ぶことができるので、医院あるいは
家庭キットにおいて妊娠テスト、尿感染テスト、糖尿テ
ストなど簡単なテストに使用できる。更に、本発明の検
定法はまた検出可能物質の吸収を測定る、計器を用いる
臨床的設備においても利用でき、その測定は試料相と別
の相の中の検出可能物質の存在によって楽になる。
前述の開示と矛盾る、ことなく、本発明の実際における
数多くの修正と変更が画業熟練者にとっておこることが
予期される。従って、特許請求の範囲に見られるような
制限のみが上述の本発明に対してなされるべきである。
数多くの修正と変更が画業熟練者にとっておこることが
予期される。従って、特許請求の範囲に見られるような
制限のみが上述の本発明に対してなされるべきである。
第1図から第6図は本発明の現在好ましい具体化による
、別の相の中で存在る、酵素的に発生させた検出可能物
質の存在を測定る、ことを通して、試料中のアナライト
存在を分析的に測定る、ための改良結合検定法をグラフ
的に例証る、ものである。 (外5名) FIG、 I FIG、 2 Fab”モル FIG、 4 FIG、 5 血液稀釈 430nmにさける吸収 手続補正書 1.事件の表示 昭和60年特許願第 A/ψノアよ 号2、発明の名称 謄是)ル 6、補正をる、者 事件との関係 特許出願人 。 住所 2 i+ ア七フ゛フープし−シフ74、代理人
、別の相の中で存在る、酵素的に発生させた検出可能物
質の存在を測定る、ことを通して、試料中のアナライト
存在を分析的に測定る、ための改良結合検定法をグラフ
的に例証る、ものである。 (外5名) FIG、 I FIG、 2 Fab”モル FIG、 4 FIG、 5 血液稀釈 430nmにさける吸収 手続補正書 1.事件の表示 昭和60年特許願第 A/ψノアよ 号2、発明の名称 謄是)ル 6、補正をる、者 事件との関係 特許出願人 。 住所 2 i+ ア七フ゛フープし−シフ74、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)アナライトの存在を(a)アナライトと添加される
標識物質との会合反応により、あるいは(b)アナライ
トおよび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の
添加結合剤との競合的会合反応によつて測定し、アナラ
イトの存在を会合した標識物質を非会合標識物質から分
離した上で測定する、試料中のアナライトの存在を分析
的に測定する方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
うにして形成される物質が第一相とは別の第二相中に存
在することができる、酵素標識部を使用し; (2)分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
、上記第一相中に、かつ上記基質と接触させて上記検出
可能物質の形成を許す条件の下で置き; (3)上記第一相を上記物質が中に存在し得る第二の別
の相と、上記物質の検出可能量が上記第一相から上記第
二相へ移ることを許す条件の下で接触させ;そして、 (4)上記物質の上記第二相への移行を測定する; ことから成る方法。 2)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識物
質との会合反応により、あるいは(b)アナライトおよ
び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結
合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナ
ライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離
した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析的
測定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
うにして形成される物質が第一相と別の第二相から成る
、酵素標識部を使用し; (2)分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
上記第一相中でかつ上記第二相から成る上記物質の形成
を許す条件の下で上記基質と接触させて置き;そして、 (3)上記第二相から成る上記物質の形成を測定する; ことから成る方法。 3)アナライトの存在を、(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により、あるいは(b)アナライトお
よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
結合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、ア
ナライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分
離した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析
的測定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、第一相から成る基質
からの検出可能物質の形成または放出を触媒し、そのよ
うにして形成あるいは放出される物質が第一相と異なる
第二水性相中で存在することができる、酵素標識部を使
用し; (2)分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
、上記物質が存在することができる上記第二の別の相の
中で、かつ上記物質の形成または放出並びに上記物質の
検出可能量の上記第二相への移行を許す条件の下で、上
記物質と接触させ;そして、 (3)上記物質の上記第二相への移行を測定する; ことから成る方法。 4)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識物
質との会合反応により、あるいは(b)アナライトおよ
び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結
合剤との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナ
ライトの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離
した上で測定する、試料中のアナライトの存在の分析的
測定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性第一相中での酵
素処理の際に標識物質から解離しかつ検出可能物質を形
成し、そのようにして形成される上記物質が第一相と異
なる第二相の中で存在することができる、標識部を使用
し; (2)分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
上記第一相中に置き、その標識部をそれを解離させるこ
とができる酵素と接触状態としかつ上記物質をそれの形
成を許す条件の下で形成させることによつて、標識部を
酵素的に処理し; (3)上記第一相を、上記物質が存在し得る第二の別の
相と、かつ上記物質の検出可能量の上記第二相への上記
第一相からの移行を許す条件の下で、接触させ;そして
、 (4)上記物質の上記第二相への移行を測定する; ことから成る方法。 5)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識物
質との会合反応により、あるいは(b)アナライトおよ
び添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の結合剤
との競合的会合反応によつて測定し、そして、アナライ
トの存在を会合標識物質を非会合標識物質から分離した
上で検出する、試料中のアナライトの存在の分析的測定
方法において、(1)上記標識物質の部分として、水性
第一相中で酵素処理をする際に標識物質から解離しかつ
検出可能物質を形成し、そのようにして形成される上記
物質が第一相と異なる第二相から成る、標識部を使用し
; (2)分離した会合標識物質あるいは非会合標識物質を
第一相に置き、その標識部をそれを解離させることがで
きる酵素と接触状態とさせることによつて酵素的に処理
し、そして上記第二相から成る上記物質の形成を許す条
件の下で上記物質を形成することにより標識部を酵素処
理し;そして、 (3)上記第二相から成る上記物質の形成を測定する; ことから成る方法。 6)アナライトがホルモン、医薬、医薬中間代謝物、カ
テコールアミン、腫瘍抗原、ステロイド、生化学的メッ
センジャー、アミノ酸、プロテイン、ポリペプチド、ビ
タミン、DNA、RNA、血球、抗体、ビールス、微生
物、あるいはモノ−、ジ−、あるいはポリサッカライド
、である、特許請求の範囲第1、2、3、4または5項
に記載の方法。 7)アナライトと会合できる標識物質が上記アナライト
について特定的または非特定的結合剤である、特許請求
の範囲第1、2、3、4または5項に記載の方法。 8)添加結合剤との会合にアナライトと競合する標識物
質が上記アナライトの類似体であり、上記添加結合剤が
上記アナライトおよび標識物質についての特定的または
非特定的結合剤である、特許請求の範囲第1、2、3、
4または5項に記載の方法。 9)上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第二
相中の上記物質の存在を測定することによつて測定され
る、特許請求の範囲第1、3、または4項に記載の方法
。 10)上記検出可能物質の形成が上記第二の別の相の存
在を測定することによつて測定される、特許請求の範囲
第2または第5項に記載の方法。 11)上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
一相から成る基質の量の減少を測定することによつて間
接的に測定される、特許請求の範囲第3項に記載の方法
。 12)上記検出可能物質が螢光団、発色団、化学発光群
、酵素および/または芳香化合物から成る群から選ばれ
る、特許請求の範囲第1、2、3、4または5項に記載
の方法。 13)上記酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、上
記基質がp−フェニルアゾフェニルホスフェートである
、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 14)上記アルカリ性ホスファターゼが上記p−フェニ
ルアゾフェニルホスフェートの疎水性検出可能物質p−
フェニルアゾフェノールへの転化を触媒する、特許請求
の範囲第13項に記載の方法。 15)上記第二の別の相が非水性有機液相である、特許
請求の範囲第14項に記載の方法。 16)上記p−フェニルアゾフェノールの存在が上記有
機液相中で比色的手段によつて検出される、特許請求の
範囲第15項に記載の方法。 17)上記アナライトがヒト免疫グロブリンIgGであ
る、特許請求の範囲第16項に記載の方法。 18)上記標識物質がアルカリ性ホスファターゼ標識ヒ
トIgG F_a_b_′断片である、特許請求の範囲
第17項に記載の方法。 19)上記添加結合剤がヒトIgG F_a_b_′断
片スペシフィック(specific)に対する抗体で
ある、特許請求の範囲第18項に記載の方法。 20)水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
質形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相中に存在す
ることができる物質の形成を触媒し、上記第二の別相が (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、および/または (c)ガス相 から成る、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 21)上記酵素標識部が、上記水性第一相中で提供され
る親水性基質から上記第二の別の非水性液相中で存在で
きる疎水性検出可能物質を形成するのを触媒する、特許
請求の範囲第20項に記載の方法。 22)上記水性第一相中で提供される親水性基質から上
記第二の別の非水性液相中で存在し得る疎水性検出可能
物質の酵素的形成が、親水性p−フェニルアゾフェニル
ホスフェート基質から疎水性p−フェニルアゾフェノー
ル物質のアルカリ性ホスファターゼ酵素的形成を含む、
特許請求の範囲第21項に記載の方法。 23)上記水性第一相中で提供される基質から上記第二
の別の相の中で存在できる検出可能物質を形成するのを
触媒する上記酵素標識部が、メチルオキソブタナール基
質からのブタンジオン物質のパーオキシダーゼ酵素的形
成を含む、特許請求の範囲第20項に記載の方法。 24)上記ガス相中のブタンジオン物質の存在が嗅覚的
手段、燐光および/または燐光、螢光、あるいは着色物
質の形成をもたらす他の化合物との第二次反応によつて
検出される、特許請求の範囲第23項に記載の方法。 25)水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
質形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相から成る物
質の形成を触媒し、上記の第二の別の相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第2項に記載の方法。 26)第一の別の相から成る基質からの検出可能物質の
形成または放出を触媒する上記酵素標識部が、第一の別
の相から成る基質から第二の別の水性相中で存在できる
物質の形成または放出を触媒し、上記第一の別の相が (a)上記第二相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第3項に記載の方法。 27)第一の別の固相から成る基質から第二の別の水性
相中で存在できる検出可能物質を形成または放出するの
を触媒する上記の酵素標識部が、固体コラーゲン/着色
剤粒子からの可溶性コラーゲン物質のコラーゲナーゼ酵
素的形成と着色剤物質の放出とを提供する、特許請求の
範囲第26項に記載の方法。 28)上記の固体コラーゲン/着色剤基質がコラーゲン
/青色デキストラン粒子から成る、特許請求の範囲第2
7項に記載の方法。 29)上記の第二の別の水性相中の青色デキストララン
物質の存在が肉眼的あるいは比色的手段によつて測定さ
れる、特許請求の範囲第28項に記載の方法。 30)上記液相中の可溶性コラーゲンの存在が固体コラ
ーゲンビードの量の減少を検出することから成る肉眼的
または比色的手段によつて間接的に測定される、特許請
求の範囲第28項に記載の方法。 31)第一水性相中の酵素的処理の際の標識部が第二の
別の相の中で存在できる検出可能物質に解離し、上記第
二の別の相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、および/または (c)ガス相、 から成る、特許請求の範囲第4項に記載の方法。 32)第一水性相中の酵素的処理の際の標識部が第二の
別の相から成る検出可能物質に解離し、上記第二の別の
相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第5項に記載の方法。 33)コラーゲン粒子と着色剤物質とから成る第二の別
の相の中で検出可能量で存在できる物質へ第一相中で酵
素的に転化し得る組成物。 34)上記着色物質が青色デキストランである、特許請
求の範囲第26項に記載の組成物。 35)アナライトの存在が(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により、あるいは(b)アナライトお
よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
結合剤との競合的会合反応によつて測定され、かつ、標
識物質がアナライトあるいは標識物質と会合するときに
会合しないときとは異なる程度の触媒的活性を示す酵素
標識部から成る、試料中のアナライトの存在の分析的測
定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
うにして形成される物質が第一相と異なる第二相の中で
存在することができる、酵素標識部を使用し、 (2)会合標識物質と非会合標識物質とを上記第一相中
でかつ上記物質の形成を許す条件の下で上記基質と接触
させて置き、 (3)上記第一相を上記物質が存在し得る第二の別相と
、かつ、上記第一相から上記第二相へ上記物質の検出可
能量の移行を許す条件の下で、接触させ、そして (4)上記物質の上記第二相への移行を測定する、 ことからなる方法。 36)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により、あるいは(b)アナライトお
よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識
物質がアナライトあるいは添加結合剤と会合するときに
異なる程度の触媒活性を示す酵素標識部から成る、試料
中のアナライトの存在の分析的測定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性第一相中で提供
される基質からの検出可能物質の形成を触媒し、そのよ
うにして形成される上記物質が第一相と異なる第二相か
ら成る、酵素標識部を使用し、 (2)会合標識物質および非会合標識物質を上記第一相
中にかつ上記第二相から成る上記物質の形成を許す条件
の下で上記基質と接触させて置き、 (3)上記第二相から成る上記物質の形成を測定する、 ことから成る方法。 37)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により、あるいは(b)アナライトお
よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ標識物
質がアナライトあるいは標識物質と会合するときに非会
合時とは異なる程度の触媒活性を示す酵素標識部から成
る、試料中のアナライトの存在の分析的測定方法におい
て、 (1)上記標識物質の部分として、第一相から成る基質
からの検出可能物質の形成または放出を触媒し、そのよ
うにして形成または放出される物質が第一相と異なる第
二水性相の中で存在することができる、酵素標識部を使
用し、 (2)会合標識物質と非会合標識物質とを、上記物質が
存在することができる上記第二の別の相の中に、かつ上
記物質の形成または放出と上記物質の検出可能量の上記
第二相への移行を許す条件の下で、上記基質と接触状態
に置き、そして、 (3)上記第二相への上記物質の移行を測定する、 ことから成る方法。 38)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により、あるいは(b)アナライトお
よび添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加
結合剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識
物質がそれがアナライトあるいは添加結合剤と会合して
いるときに酵素的処理の際に会合していないときと異な
る程度の検出可能物質への解離を示す標識部分から成る
、試料中のアナライトの存在の分析的測定方法において
、(1)上記標識物質の部分として、水性第一相中の酵
素的処理に際に標識物質から解離し検出可能物質を形成
し、そのようにして形成される上記物質が第一相と異な
る第二相中で存在できるものである、標識部を使用し、 (2)会合標識物質および非会合標識物質を上記第一相
中に置き、その標識部を、それを解離させることができ
る酵素とそれを接触状態としかつ上記物質の形成を許す
条件の下で上記物質を形成させることによつて、酵素的
に処理し、(3)上記第一相を、上記物質が存在し得る
第二の別の相とかつ上記第一相から上記第二相への上記
物質の検出可能量の移行を許す条件の下で接触させ、そ
して、 (4)上記物質の上記第二相への移行を測定する、 ことから成る方法。 39)アナライトの存在を(a)アナライトと添加標識
物質との会合反応により或いは(b)アナライトおよび
添加標識物質とアナライトおよび標識物質用の添加結合
剤との競合的会合反応によつて測定し、かつ、標識物質
が、それがアナライトまたはは添加結合剤と会合してい
るときに酵素的処理に際して非会合状であるときと異な
る程度の検出可能物質への解離を示す標識部から成る、
試料中のアナライトの存在の分析的測定方法において、 (1)上記標識物質の部分として、水性相中の酵素処理
に際して標識物質から解離し検出可能物質を形成し、そ
のようにして形成される上記物質が第一相と異なる第二
相から成る、標識部を使用し、 (2)会合標識物質および非会合標識物質を第一相中に
置き、その標識部を、それを解離させることができる酵
素と接触状態にしかつ上記物質を第二相から成る上記物
質の形成を許す条件の下で形成させることによつて、酵
素的に処理し、 (3)上記第二相から成る上記物質の形成を測定する、 ことから成る方法。 40)アナライトがホルモン、医薬、医薬中間代謝物、
カテコールアミン、腫瘍抗原、ステロイド、生化学的メ
ッセンジャー、アミノ酸、プロテイン、ポリペプチド、
ビタミン、DNA、RNA、血球、抗体、ビールス、微
生物、あるいはモノ−、ジ−、あるいはポリサッカライ
ド、である特許請求の範囲第35、36、37、38あ
るいは39項に記載の方法。 41)アナライトと会合することができる標識物質がそ
のアナライトについての特定的結合剤あるいは非特定的
結合剤である、特許請求の範囲第35、36、37、3
8あるいは39項に記載の方法。 42)添加結合剤との会合についてアナライトと競合す
る標識物質がそのアナライトの類似物質であり、上記添
加結合剤が上記アナライトおよび標識物質についての特
定的または非特定的結合剤である、特許請求の範囲第3
5、36、37、38、あるいは39項に記載の方法。 43)上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
二相中の上記物質の存在を測定することによつて測定さ
れる、特許請求の範囲第35、36、37または38項
に記載の方法。 44)上記検出可能物質の形成が上記第二の別の相の存
在を測定することによつて測定される、特許請求の範囲
第36項または第39項に記載の方法。 45)上記検出可能物質の上記第二相への移行が上記第
一相から成る基質の量の減少を測定することによつて間
接的に測定される、特許請求の範囲第37項に記載の方
法。 46)上記物質が螢光団、発色団、化学発光群、酵素、
および/または芳香化合物から成る群から選ばれる、特
許請求の範囲第35、36、37、38あるいは39項
に記載の方法。 47)水性第一相中で提供される基質からの検出可能物
質の形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相中に存在
できる物質の形成を触媒し、この第二の別の相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、および/または (c)ガス相、 から成る、特許請求の範囲第35項に記載の方法。 48)水性第一相中で提供される基質から検出可能物質
の形成を触媒する酵素標識部が第二の別の相から成る物
質の形成を触媒し、上記第二の別の相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第36項に記載の方法。 49)第一の別の相から成る基質からの検出可能物質の
形成または放出を触媒する上記酵素標識部が第一の別の
相から成る基質から第二の別の水性相中で存在できる物
質の形成または放出を触媒し、上記の第一の別の相が、 (a)上記第二相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第36項に記載の方法。 50)標識部が第一水性相中の酵素的処理の際に第二の
別の相中に存在できる検出可能物質に解離し、上記第二
の別の相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、および/または (c)ガス相、 から成る、特許請求の範囲第38項に記載の方法。 51)標識部が第一水性相中の酵素的処理の際に第二の
別の相から成る検出可能物質へ解離し、上記第二の別の
相が、 (a)上記第一相と部分的に非混和性である水性相、 (b)非水性液相、 (c)ガス相、および/または (d)固相、 から成る、特許請求の範囲第39項に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI853523A0 (fi) * | 1985-09-13 | 1985-09-13 | Labsystems Oy | Foerfarande foer utfoering av immunobestaemningar med hjaelp av enzymstaempel. |
DE3640318A1 (de) * | 1986-11-26 | 1988-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und testtraeger zur bestimmung eines analyten |
GB8724764D0 (en) * | 1987-10-22 | 1987-11-25 | Alcan Int Ltd | Enzyme assay method |
EP0347256A3 (en) * | 1988-06-17 | 1990-07-11 | Tosoh Corporation | Method for detecting a substance in a sample |
AU647459B2 (en) * | 1990-01-26 | 1994-03-24 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | A method for quantitatively measuring collagenase |
CA2055812A1 (en) * | 1990-11-20 | 1992-05-21 | Carl N. Skold | Method of stabilizing enzyme conjugates |
US6652808B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-11-25 | Nanotronics, Inc. | Methods for the electronic assembly and fabrication of devices |
US6569382B1 (en) | 1991-11-07 | 2003-05-27 | Nanogen, Inc. | Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices |
CA2138382C (en) * | 1992-07-07 | 2006-01-17 | Wlodzimierz Mandecki | Alkaline phosphatase enzymes having improved specific activity for use in indicator reagents |
US6331274B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-12-18 | Nanogen, Inc. | Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics |
US6225059B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-05-01 | Nanogen, Inc. | Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics |
US6706473B1 (en) | 1996-12-06 | 2004-03-16 | Nanogen, Inc. | Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides |
US6342397B1 (en) * | 1998-06-04 | 2002-01-29 | Erkki Soini | Homogeneous biospecific assay using a solid phase, two-photon excitation and confocal fluorescence detection |
US6368899B1 (en) | 2000-03-08 | 2002-04-09 | Maxwell Electronic Components Group, Inc. | Electronic device packaging |
AU2002305159B2 (en) * | 2001-03-28 | 2007-12-13 | Heska Corporation | Methods of detecting early renal disease in animals |
WO2004084841A2 (en) * | 2003-03-27 | 2004-10-07 | Heska Corporation | Novel anti-feline albumin antibodies and methods of detecting early renal disease |
US20050208671A1 (en) * | 2003-12-26 | 2005-09-22 | Nof Corporation | Method of analyzing the ratio of activation of terminals of polyoxyalkylene derivatives |
US7828954B2 (en) * | 2004-09-21 | 2010-11-09 | Gamida For Life B.V. | Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles |
US20080166792A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-10 | Attar Amir J | Detection of analytes in materials liquids using capillary colorimetric detection |
US20090203149A1 (en) * | 2008-02-13 | 2009-08-13 | General Electric Company | Enhanced methods for gas and/or vapor phase analysis of biological assays |
CN106324251B (zh) * | 2016-08-08 | 2019-03-29 | 上海睿康生物科技有限公司 | 小片段BMG抗体的制备方法及β2-微球蛋白检测试剂盒 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4407943A (en) * | 1976-12-16 | 1983-10-04 | Millipore Corporation | Immobilized antibody or antigen for immunoassay |
SE404553B (sv) * | 1977-03-04 | 1978-10-09 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
US4277560A (en) * | 1978-10-24 | 1981-07-07 | Technicon Instruments Corporation | Enzyme immunoassays using immobilized reagents in a flowing stream |
SE7812237L (sv) * | 1978-11-28 | 1980-05-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Koncentrationsbestemning av substanser med formaga att biospecifikt binda molekyler med biologiskt ursprung |
US4576912A (en) * | 1978-11-30 | 1986-03-18 | Technicon Instruments Corporation | Fluoroimmunoassaying |
US4268663A (en) * | 1979-04-10 | 1981-05-19 | Syva Company | Macromolecular glycosidase substrates |
US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
US4423143A (en) * | 1980-12-30 | 1983-12-27 | Syva Company | β-D-Galactosidase conjugate for enzyme immunoassays |
EP0095286B1 (en) * | 1982-05-26 | 1985-12-18 | Boots-Celltech Diagnostics Limited | Immunoassay |
US4530900A (en) * | 1982-09-13 | 1985-07-23 | Seragen Diagnostics Inc. | Soluble insoluble polymers in enzymeimmunoassay |
US4629689A (en) * | 1984-08-29 | 1986-12-16 | Allied Corporation | Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection |
-
1984
- 1984-09-27 US US06/656,011 patent/US4804625A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6218546B1 (en) | 1995-10-19 | 2001-04-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Reagent for the detection and isolation of carbohydrates or glycan receptors |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0180327B1 (en) | 1990-04-18 |
US4804625A (en) | 1989-02-14 |
ATE52140T1 (de) | 1990-05-15 |
DE3577230D1 (de) | 1990-05-23 |
EP0180327A1 (en) | 1986-05-07 |
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