JPH0145027B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、液体中のハプテン、抗原、抗体、ビ
オチン又はアビジン（対象物質）の存在を、特異
的結合（特定結合）の相手物質に対する該対象物
質の親和性に基づいて測定するための方法及び試
薬に関するものである。更に詳しくは、本発明
は、標識物質としてルミノールもしくはイソルミ
ノール又はこれらの誘導体を用いる分析方法及び
試薬に関するものである。なお、本明細書中では
「特異的」と「特定」とを同義に用いている。 液体中の低濃度の物質の存在を検出するための
便利かつ信頼性が高く、更に危険性のない方法へ
の要望があることは明白である。このことは、
10^-11モル濃度程度の低濃度で体液中に存在する
成分が病理学上重大である臨床化学の分野に於い
ては、特に該当する。そのような低濃度の物質を
検出することの困難さは、通常は試料の量が非常
に制限される臨床化学の分野に於いて増加する。 以前に於いては、物質は、その検出される物質
が必ず反応体であるような反応系に基づいて、液
体中で検出されていた。未知物質の存在は、反応
生成物の出現もしくは既知反応体の消失によつて
検出されている。ある場合に於いては、そのよう
な分析方法は、生成物の出現もしくは反応体の消
失の速度あるいは生成した生成物もしくは平衡に
達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの
分析の反応系は必然的に小さなグループの物質の
検出のみに限定されるか、あるいは特異性のない
もののいずれかである。 特異性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用
できる分析系の研究により、放射性免疫分析法が
生み出された。この方法によると、検出対象の物
質の放射性標識を付されたものの量は、未知のも
のに特異性を有する限られた量の抗体について、
未知のものと競い合わされるようにされる。そし
て、抗体に結合されるようになる標識を付された
ものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本
来、抗体に結合されるようになる標識を付された
形の検出対象物質（束縛相）を、そのような結合
を起さない物質（遊離相）と分離することが必要
となる。この必要とされる分離を遂行するための
種々の手段が、例えば米国特許第3505019号、
3555143号、3646346号、3720760号及び3793445号
に示されるように開発されてきた。しかし、それ
らの手段は全て、束縛相と遊離相の効率的な分離
を確実にするためにロ過、遠心分離、洗浄もしく
はカラムの溶出などの少なくとも一つの人手によ
る操作工程を必要としている。そのような分離は
応々にして、束縛相を含む不溶性部分と遊離相を
含む液体部分から成り、各部分中の放射性活性標
識の量が標識化物質の結合の大きさの関数、従つ
て検査された試料中の対象物質の量の関数となる
ようにされている系を形成させることにより行な
われている。科学の本分野に於いて一般に用いら
れ、かつ本明細書に於いて用いられる「不均一
系」とは、束縛相と遊離相の分離が行なわれるこ
とが含まれる特異的結合分析を意味している。こ
のような分離は、束縛相中の標識化物質が遊離相
中の標識化物質と区別がつきにくい系の特異的結
合分析を行なうときに必要である。 放射性物質を扱うための危険性及び困難さのた
めに、放射性免疫分析法と同程度に感度良く迅速
で、しかし結合反応を監視検出するための手段と
して放射性以外の性質を利用する使いやすい特異
的結合分析系を案出する多くの試みがなされてき
た。本明細書中に以下更に充分に記述されるよう
に、放射性原子もしくは分子の代りに標識物質と
して利用されてきたものとしては、酵素、螢光物
質及びバクテリオフアージのような種々のものが
含まれる。 標識物質として用いられる酵素を用いて開発さ
れた方法の例としては、米国特許第3654090号、
第3791932号、第3839153号、及び第3850752号、
そしてジヤーナル・オブ・イミユノロジカル・メ
ソツズ、１：247（1972）及びジヤーナル・オブ・
イミユノロジー、109：129（1972）に記載された
方法が挙げられる。記載された各々の方法に於い
ては、酵素は検出対象の物質（リガンド）もしく
はその結合の相手物質のいずれかに化学的に結合
されており、試料と共に置いた後に、不溶部分も
しくはリガンド部分のいずれかに含まれる酵素活
性の量が試料中のリガンド（対象物質）の量の関
数となるように適当な不均一系特異的結合反応の
図式が組み立てられる。従つて、酵素結合体の合
成及び特性付けに関連する問題が、この解決方向
の重大な隘路となる。 酵素付加免疫分析として興味あるものが米国特
許第3817837号に記載されている。この方法は分
離（即ち不溶性部分と液体部分）特異的結合反応
系を用いる必要がなく、従つてそれのための分離
操作を必要としない。これは、酵素付加された対
象物質が、対象物質の該結合の相手物質との反応
により酵素活性が阻害されるように作られている
からである。こうして、酵素付加された物質の束
縛（結合）状態にあるものと、遊離（自由）状態
にあるものとの比を、酵素活性の変化を測定する
ことにより決定する。しかしながらこの方法に
は、特性の優れた酵素付加結合体の調製及びこの
系の基本方式に適合する酵素を見いだすことの困
難さがある。 英国特許第1392403号及びフランス国特許第
2201299号には、標識物質として分光々度測定に
於いて活性な物質の不活性な前駆体を用いる特異
的結合分析が記されている。特異的結合反応系と
共に試料を保持した後、不溶性部分と液体部分を
分離し、試料中で検出されるべき対象物質の量の
関数であるところの液体部分に存在する標識物質
の量は、不活性な標識物質を色変化もしくは螢光
活性物質に変え、次いでこれを通常の手段で計測
することから成る反応工程により測定される。 異なつたタイプの標識物質を用いる他の特異的
結合分析方法は以下のように開示されている。即
ち、米国特許第3850578号には標識手段として電
子スピン共鳴を用いることが開示されており；米
国特許第3901654号には標識手段として螢光発光
の停止及び増大を用いることが開示されている。
米国商務省の国家技術情報サービス（NTIS）の
報告No.PB−224875（1973）には、化学発光反応に
より監視検出する不均一系分析系で標識物質とし
てヘミン・クロリドを用いた試み（成功していな
い）が記されている。ネイチヤー、219：186
（1968）には、ある種の放射性免疫分析操作につ
いて非常に詳し記載くされており、更に標識物質
として放射性同位元素の代わりに補酵素及びビー
ルスを用いることの可能性について、非常に概括
性な性質として付随的に言及している。しかし著
者は、そのような代りの標識物質を用いて如何に
分析を行なうかについて、あるいは実際問題とし
て、そのような分析法が実施可能であるかどうか
の点については教示していない。更に背景を記せ
ば、「競合蛋白−結合分析法の原理）（Prin−
ciples of Competitive Protein−Binding
Assays）オデル及びドウデイ編（ジエー・ビ
ー・リツペンコツト・カンパニー、フイラデイル
フイア、1972）には、種々の既知の分析方法及び
特異的結合分析用の標識として用いられてきた
様々な物質や特性などが広範囲に議論されてい
る。 これまでに多くの新しいタイプの特異的結合分
析方法が示唆され研究されてきたが、放射性免疫
分析法と種々の酵素付加免疫分析法が最も広く用
いられ改良されるものとして残つてきた。しか
し、両方のタイプのシステムは明白な欠点を有し
ている。即ち、放射性免疫分析に於いては、放射
性物質の取扱いが危険で、注意を必要とし、酵素
付加免疫分析に於いては、有用な酵素付加結合体
を調製するのが難しい。 従つて本発明の目的は、不便な放射性物質もし
くは部分変形酵素を標識物質として使用しない、
液体中の対象物質（リガンド）を検出するための
新規な方法及び試薬を提供することである。 更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広
く便利な不均一系特異的結合（特定結合）分析方
法及び試薬を提供することも目的の一つである。 対象物質もしくはその特異的結合の相手物質に
先行技術方法の酵素よりも更に都合よく組み合わ
せ結合することのできる標識物質を用いる不均一
系特異的結合分析方法及び試薬を提供することも
本発明の目的の一つである。 種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることによ
り、先行技術方法に於ける酵素の活性のいかなる
変化よりも更に都合良くいかなる活性の変化につ
いても検出できる標識物質を含む結合体を用いた
不均一系特異的結合分析方法及び試薬を提供する
こともまた本発明の目的の一つである。 本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ
鋭敏な不均一系特異的結合分析方法及び試薬を、
前以つて決められた反応の成分として賦与された
反応活性を示す物質を標識物質として使用するこ
とに基礎を置いて提供するものである。そのよう
な物質はここに於いて「反応体」として示され
る。 本発明の標識物質は、従来のいかなる不均一系
特異的結合分析方法に於いても使用することがで
きる。束縛相及び遊離相の各々に存在する反応体
についての量は、特異的結合反応を監視検出する
ための手段として働く前以つて決められた反応系
を反応体と共に形成する少なくとも一種の試薬と
各相を接触させることにより測定される。定量的
な測定は、既知量の測定対象の対象物質（リガン
ド）を含有する液体で同じ方法により得られた値
と一つの相で測定された反応体の活性とを比較す
ることにより行なわれる。 改良された液体中のハプテン、抗原、抗体、ビ
オチン又はアビジンを分析するための方法は、一
般には、次の(a)、(b)及び(c)工程を含んでいる。即
ち、 (a) 試験液体を、予め定められた特性を有する標
識物質とハプテン、抗原、抗体、ビオチン若し
くはアビジン又はそれに対する特異的結合の相
手物質との結合体からなる試薬と接触させる工
程、 ここで、該試薬と結合反応系を生成する対象
物質（リガンド）が標識化された結合体の束縛
相又は遊離相を生ずる； (b) 該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び (c) 分離された層の一における、該液体中のハプ
テン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジンの指
標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であつて、結合体
中の標識物質が、ルミノールもしくはイソルミノ
ール又はこれらの誘導体であることを特徴とする
ものである。この後に更に詳しく述べるように、
本結合反応系は、放射性免疫分析系や不均一系酵
素−免疫分析系に於いて用いられるような既知の
通常の技術のいかなる形をとることもできるであ
ろう。 監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好
ましい。通常は、監視検出反応は、結合体中の反
応体に対して高度に鋭敏なものから選ばれる。こ
の点に於いて、化学発光もしくは螢光発光反応系
は非常に有用である。特に好ましいのは循環反応
系で、反応体が循環する物質である反応系が特別
に好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵素
を触媒として利用する系が特に有利である。本発
明における結合体中の反応体はルミノールもしく
はイソルミノール又はこれらの誘導体である。 本明細書に於いて用いられる用語は以下のよう
に定義される。「リガンド」、「対象物質」もしく
は「対象物質（リガンド）」は、物質もしくは一
群の物質で、その液体中の存在もしくは量が測定
されるものである。「対象物質（リガンド）の特
異的結合の相手物質」とは、物質もしくは一群の
物質で、他の物質を排除して対象物質に対して特
定の結合の親和性を示すものである。「対象物質
の特異的結合に関する類似物質」とは、物質もし
くは一群の物質で、対象物質への特異的結合の相
手物質の結合親和性に関して対象物質と本質的に
同じ挙動をとるものである。 本発明の不均一系免疫分析試薬は、液体中のハ
プテン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジンを分
析するための： 予め定められた特性を有する標識物質とハプテ
ン、抗原、抗体、ビオチン若しくはアビジン又は
それに対する特異的結合の相手物質との結合体か
らなり、かつ、試薬とハプテン、抗原、抗体、ビ
オチン又はアビジンが結合反応系を形成して標識
化された結合体の束縛相又は遊離相を生成し、該
束縛相若しくは該遊離相のいずれかの特性が、該
液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチン又はア
ビジンの量の関数である不均一系免疫分析用の試
薬であつて、 結合体中の標識物質がルミノールもしくはイソ
ルミノール又はこれらの誘導体であることを特徴
とするものである。 特異的結合試薬は種々の形をとり得る。一般
に、そのような試薬は三種の基本成分を含有して
いる。即ち(1)検出対象物質（リガンド）、(2)リガ
ンドの特異的結合の相手物質、及び(3)、普通は標
識化された形の(a)リガンド、(b)リガンドの特異的
結合に関する類似物質もしくは(c)特異的結合の相
手物質である標識化成分、である。この結合反応
の成分は同時に一緒にされるか、あるいは順次添
加される。そして適当な保持（保存）期間の間
に、標識化成分は、例えば結合の相手物質に束縛
（結合）された標識化成分の量と不束縛（不結合）
の標識化成分の量との比率のような結合の量、大
きさ等が、存在する対象物質の量の関数となるよ
うに、対応する競合結合の相手物質に束縛（結
合）される。 以下に本発明の方法を実施する場合に用いられ
る種々の結合反応の概要のいくつかについて簡単
に記述する。 放射性免疫分析法や不均一系酵素免疫分析法の
ような通常の不均一系特異的結合分析法に於いて
は、放射活性や酵素活性のような標識化結合体に
於ける標識特性は、束縛（結合）状態及び遊離
（自由）状態の結合体にとつて本質的には同じで
ある。一方、本発明方法によれば、標識物質とし
ての反応体の活性は、場合によつては、標識化結
合体の結合に影響を受ける。そのような状況に於
いては、監視検出反応は、対象物質が液体中に存
在しない場合、或は有意でない程度に少ない量で
存在する場合、比較的に一定の性質を示す。液体
中に対象物質が存在する時は、監視検出反応の特
性もしくは性質が変化する。一般には、結合体中
の反応体の活性は、反応体が監視検出反応に関与
することができる量もしくは速度となるであろ
う。このようにして、監視検出反応の性質は液体
中の対象物質の存在により、通常はその全反応速
度、もしくは一種もしくは数種の生成する反応生
成物の平衡量について変化する。この場合に於い
て一般には、監視検出反応に関与する結合体の反
応体の活性能力は、それが結合する特異的結合物
質と該特異的結合物質の特異的結合の対応物質と
の間の反応により低下する。即ち、遊離（自由）
状態の結合体は監視検出反応に於いて、束縛（結
合）状態にある場合よりも活性が大きい。 次に示す概略式には、以下の記号が用いられ
る。記号 定 義 Ｌ 検出対象物質 対象物質もしくはその特異的結合に関す
る類似物質 Ｂ 対象物質の結合の相手物質 ＊ 標識物質、例、反応体 〓 不溶性の相 → 適当な分離に続く保持期間 (lim) 限定量：選択された保持期間中に選択さ
れた反応条件下で、結合可能箇所の全てに結
合することのできる量よりも少なく存在する
こと：例、他の成分と結合を競い合う成分 (exc) 過剰量；選択された保持期間中に選択さ
れた反応条件下で、結合可能箇所の全てに結
合することのできる量よりも多く存在するこ
と 不均一系分析の概略式 １ 結合分析法 (a) Ｌ＋^*＋Ｂ（lim）→＋Ｂもしくは^*の
不溶化剤 これは従来からの競合結合方法によるもの
である。この不溶化剤の例としては、特異的
沈降抗体、特異的不溶化抗体、Ｂもしくは
^＊が蛋白性物質である場合には硫酸アンモニ
ウムのような蛋白質沈殿剤、Ｂもしくは^*
が小さな吸収され得る分子である場合には、
デキストリンで被覆したチヤコール（木炭）
が挙げられる。同様な系についての記述はバ
イオケミカル・ジヤーナル、88：137（1963）
及び米国特許第3839153号に見られる。 (b) Ｌ＋^*＋〓Ｂ（lim）→ この方法は通常固相（ソリツド・フエー
ズ）技術と呼ばれる。同様な放射性免疫分析
法及び酵素免疫分析法の技術についての記述
は米国特許第3505019号、第3555143号、第
3646346号、及び第3654090号に見られる。 (c) Ｌ＋B^*＋〓（lim）→ 参考文献：米国特許第3654090号 (d) Ｌ＋〓＋B^*（lim）→ 参考文献：米国特許第3850752号 ２ 順次飽和分析法 (a) Ｌ＋Ｂ（exc）→＋^*（exc）→＋Ｂもし
くは^*の不溶化剤 順次飽和技術に於いては、最初の保持期間
後に残存するＢの結合箇所の一部もしくは全
部が標識化成分に結合されている。 (b) Ｌ＋〓Ｂ（exc）→＋^*（exc）→ 同様な放射性免疫分析法及び酵素免疫分析
法の技術についての記載は、米国特許第
3720760号及びジヤーナル・オブ・イミユノ
ロジー、209：129（1972）に見られる。 (c) Ｌ＋B^*（exc）→＋〓（exc）→ ３ サンドイツチ分析法 Ｌ＋〓Ｂ（exc）→B^*（exc）→ サンドイツチ分析法では、不活性化された結
合の相手物質に結合したリガンド（対象物質）
分子の一部もしくは全部が標識化成分に結合さ
れている。 参考文献：米国特許第3720760号 ４ 固相希薄化分析法 Ｌ＋^*＋〓（非特異的）→＋Ｂ（lim）→ この技術に於いて、リガンドと標識化成分は
非特異的結合剤に結合され、その比例する量は
その後リガンド及び標識化成分に更に大きな親
和性を示す結合の相手物質との結合により解離
する。この技術の最も有用な形としては、米国
特許第3659104号に記載された非特異的結合剤
のカラムを用いる方法がある。そのような技術
は、除去されない限り競合結合反応を妨害する
試料中の内因性結合物質にリガンドが結合して
いる場合に有用である。非特異性結合剤に結合
された後、内因性結合物質は適当な洗浄により
除去される。 通常の不均一系分析系に含まれる変数に関する
記載、例えば分析方法及び代替できる分離技術の
更に詳しい記述等については、「競合蛋白−結合
分析法の原理」（前出）を参考文献として挙げる
ことができる。 他の添加順序及び他の結合反応の構成もまた、
ここに述べた発明概念から逸脱せずに不均一系特
定結合分析を行なうために考案されるであろうこ
とは予測されることである。 前以つて決められた監視検出反応の成分の結合
体の反応体の活性を束縛相もしくは遊離相内で評
価する工程は、監視検出反応を結合体の反応体と
共にその相を形成する少なくとも一種の物質と接
触させ、次いでその反応の特性を測定することに
より、都合良く達成される。監視検出反応は一つ
のあるいは一連の複数の化学的に変形もしくは転
換する反応から成る。 結合体中の反応体と共に監視検出反応系を形成
する適当な反応成分は、特定結合反応の開始の
前、又はそれと同時に、あるいはそれに引き続
き、単独で或は結合した形で選ばれた分離された
相（分離相）に接触せしめられる。特定結合反応
の開始後、監視検出反応の必須成分の一部もしく
は全てを含む反応混合物は通常、得られた束縛相
及び遊離相の分離の前の前以つて決められた時間
培養される。分離の後、監視検出反応に必要で、
未だ選ばれた分離相中に充分な量存在していない
成分をこれに加える。そしてその中の反応体の活
性を評価測定して、液体中の対象物質の存在もし
くは量の指標とする。 監視検出反応の反応速度が、選ばれた束縛相も
しくは遊離相中の反応体の活性を評価測定するの
に用いられる特性である時（これが好ましい）に
は、その速度は通常、反応体の消失速度もしくは
反応生成物の出現速度を測定することにより決め
られる。そのような測定は、通常のクロマトグラ
フ、重量分析、電位差滴定、分光光度測定、螢光
測定、濁度測定、容量測定等の分析技術を含む広
範囲の種々の方法により行なわれる。本方法は第
一として低濃度の対象物質の検出を目的として考
えられているので、非常に感度の良い反応系が本
発明の新規な特定結合反応系と組合わせて用いる
ように開発された。 監視検出反応の一つの好ましい形態としては、
生物発光もしくは化学発光の現象を示す反応のよ
うに、好ましくは酵素触媒による発光反応系があ
る。結合体中の反応体は光発生反応もしくは酵素
によるか又はよらない発光反応の準備段階の反応
の反応体であつてもよい。結合体の反応体の活性
は、光発生速度（率）、発生する光の全量、ピー
ク強度もしくは性質により評価される。発光反応
系の例としてはＡ表に記されたものが挙げられ、
この表に於いては以下のような省略形が用いられ
ている。 ATP：アデノシン三燐酸 AMP：アデノシン一燐酸 NAD：ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チド NADH：還元型のニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド FMN：フラビン・モノヌクレオチド FMNH₂：還元型のフラビン・モノヌクレオチド hν：電磁波放射、通常は赤外、可視或は紫外領
域のもの

【表】 ＊ 又はカタラーゼ
本発明方法で利用することができる発光反応系
に関する更に詳細な事項及び議論は、次の文献に
見られる。 ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、236：48（1961） ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイテイ、89：3944（1967） コルニア（Cornier）他、生物発光の進歩、ジ
ヨンソン他編、プリンストン大学出版部（ニユ
ー・ジヤージー・1966）363−84頁 ピー・クライス（Kries）、レニラ・ルシフエ
ラーゼ（Renilla Luciferase）の精製と性質、ジ
ヨージア大学博士論文（1967） アメリカン・ジヤーナル・オブ・フイジオロジ
ー、41：454（1916） バイオロジカル・ビユレタン、51：89（1926） ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、243：4714（1968） 本発明は、特定結合の相手物質が存在するいか
なるハプテン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジ
ンの検出にも適用することができる。対象物質は
通常、ペプチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、
ステロイド、又は生物系内に特定結合の相手物質
が存在するか或は相手物質を合成することができ
る他の有機分子である。この対象物質は、機能面
の用語で言えば、抗原、その抗体、ハプテン（付
着体）、その抗体から成る群より選ばれる。本発
明を用いて検出することのできる対象物質を特に
例示すれば、フエリチン、ブラデキニン、プロス
タグランデイン及び腫瘍特異性抗原のような抗原
及びハプテン；ビオチン、；ミクロソーム抗体、
肝炎抗体、アレルゲン抗体のような抗体；そして
チロキシン結合グロブリン、アビジン、内因子及
びトランスコバラミンのような特定結合受容体等
が挙げられる。 本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応
体の測定可能な量の活性が維持されるような形
で、特定結合物質（選ばれた分析方法に依り、対
象物質、対象物質の特定の結合に関する類似物質
もしくは対象物質の特定結合の相手物質のいずれ
かである）に結合もしくは組合わされる。反応体
と特定結合物質との結合は、活性を有する反応体
を用いる前以つて決められた監視検出反応が、上
述の発光反応系及び循環反応系に於けるような結
合を化学的に壊すように設計されていない分析の
条件下では、通常実質的に変更できない。しか
し、ある場合には、そのような結合は、壊される
ように設計されるか、あるいは反応活性の変化を
評価するための手段としての選ばれた監視検出反
応により影響を与えられる。 反応体は特定結合物質に直接に組み合わされ結
合しても良く、その結果結合体の分子量は反応体
と特定結合物質の全分子量に等しいか、又は小さ
くなるようになる。しかし、通常は、反応体と特
定結合物質は、１から50個、好ましくは１から10
個の炭素原子もしくは窒素、酸素、硫黄、燐その
他のような複素原子を含む橋かけ基により連絡さ
れている。１個の原子を含む橋かけ基の例として
は、メチレン基（炭素原子１個）及びアミノ基
（複素原子１個）がある。橋かけ基は通常1000を
越えない分子量を持つており、好ましくは200よ
り小さいものである。橋かけ基は炭素原子もしく
は複素原子の鎖、もしくはそれらを組合わせたも
のを含んでおり、通常はエステル、アミド、エー
テル、チオエステル、チオエーテル、アセター
ル、メチレンもしくはアミノの如き基の形をした
連結基により、反応体と特定結合物質もしくはそ
の活性誘導体とに結合されている。 本発明の結合体中の反応体は、前以つて決めら
れた監視検出反応の成分として、賦与された（例
えば、一定の又は既知の）反応活性を有する物質
である。更に詳しく言えば、本明細書による開示
に於ては、「反応体」及び「反応活性を有する物
質」とは、自身とは異なる一もしくは数個の生成
物をもたらす、限定され、かつ測定可能な化学的
な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのよう
な化学的な変形もしくは変質に関与するような他
の型の物質）の如き反応開始手段との相互作用に
より、電磁的放射、熱エネルギー、もしくは音波
エネルギーをもたらす物質を意味する。従つて本
明細書に於いて「反応体」と定義した物質群の内
には通常の無機及び有機試薬及び生化学的物質が
含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射性
アイソトープのように監視検出反応に於ける反応
体でないものは除外される。特定の化学物質は化
学的環境に従つて種々の形で機能することができ
るため、一つの化学物質が種々の異なつた分類に
分類されることがあるが、そのような物質が本明
細書の開示に於いていかなる機能を有するかが決
定されるのは、本明細書に記された選ばれた監視
検出反応に関するその物質の反応性によるもので
あるということが認識されるであろう。 本発明の一形態として、対象物質が含有されて
いると考えられる液体と組合わされる特定結合反
応の成分は液体もしくは固体の形である。本分析
方法は、試験管のような標準の実験室用の容器中
で、固体もしくは液体の特定結合反応の成分及び
それに加えられる反応系の成分により実施され
る。 一もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又
は一もしくは数種の監視検出反応の成分は、担体
に包含されていても良い。一つの考え方として担
体は、それらの成分の一種もしくは数種をその内
側部分に例えば液体もしくはゆるい固体の形で、
あるいはその内部表面の被膜の中に、含有する試
験管又はカプセルのような液体保持用容器でもよ
い。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性で
あるマトリツクスの形態であつてもよい。そのよ
うなマトリツクスは例えば吸収性紙；重合体のフ
イルム、膜、けばもしくは塊状物；ゲル及びその
他の形である。そのような形の場合該装置は、試
験対象液体を接触させ、特定結合反応及び／又は
監視検出反応を行ない、かつ必要な分離を行なわ
しめ、そして得られる応答を観察するために都合
のよい手段を提供する。 試験対象となる液体は天然に存在するか或は人
工的に作られたものであつて、ハプテン、抗原、
抗体、ビオチン又はアビジン（対象物質）を含む
ことが知られているか或は推定されるものであ
る。通常は生物体の液状物又は、それを希釈もし
くは他の処理を施して得られた液体である。本発
明方法により分析することのできる生物体の液状
物には、血清、プラズマ、尿、羊水、脳液、せき
ずい液等が含まれる。細胞等の固体材料もしくは
気体状のもの等の他の材料も、固体もしくは気体
を溶解させるか又は固体を抽出する等の方法によ
り液体の形にして分析することができる。 先行技術の分析系とは対照的に、結合体中の標
識付与物質の反応活性と同じか又は類似した反応
活性を有する物質を含有する生物体の液体に於け
る対象物質を、バツクグラウンドに邪魔されるこ
となく分析することができる。内因性バツクグラ
ウンド反応体活性は種々の方法で容易に除くこと
ができる。生物体の液体は、内因性反応体活性を
選択的に破壊するように処理することができる。
そのような処理としては例えば、内因性活性を化
学的に破壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄
剤の破壊作用を不活性にする処理を行なう処理が
挙げられる。 実施例 ４ 標識物質として化学発光反応体を用いたチロキ
シンの特異的結合検定 Ａ チロキシン−イソルミノール標識複合体の合
成 ジエチル硫酸100ml（0.77mol）とＮ−メチ
ル−４−Ｎ−［４−（Ｎ−フタルイミド）−ブチ
ル］アミノフタルイミド38ｇ（0.1mol）を無
水の条件下に、オイルバス中で160℃に45分間
加熱した。 混合物を室温まで冷却し、次いで３の氷水
を注入した。生成する黄色の沈澱を過により
集め、乾燥した。 水混和酢酸から再結晶して、分析上純粋な４
−［Ｎ−エチル−Ｎ−４−（Ｎ−フタルイミド）
ブチル］アミノ−Ｎ−メチル−フタルイミド29
ｇを得た（収率72％）。mp164−165℃ 95％ヒドラジン80mlを無水エタノール300ml
に加え、これに４−［Ｎ−エチル−Ｎ−４−（Ｎ
−フタルイミド）ブチル］アミノ−Ｎ−メチル
−フタルイミド29ｇ（0.07mol）を化合させ
て、還流温度で３時間加熱した。次いで、真空
下で溶媒を除去し、残渣を110℃、0.05mmHgに
て乾燥した。 乾燥物に希塩酸を加えて撹拌した後、過し
て不溶性の副生成物を除去した。液をKOH
でPH9.0に調整すると、沈澱が生成した。 この固体を50％水混和ジメチルホルムアミド
から再結晶すると、分析上純粋な６−［Ｎ−（４
−アミノブチル）−Ｎ−エチル］アミノ−２，
３−ジヒドロ−１，４−フタラジン−１，４−
ジオン［中間体Ａ］6.5ｇ（収率33％）を得た。
mp255−257℃ カルボニルジイミダゾール0.8ｇ（5.0ｍmol）
を、乾燥テトラヒドロフラン50ml中にＮ−トリ
フルオロアセチルチロキシン4.4ｇ（5.0ｍmol）
を加えた溶液中に加え、この混合物を還流温度
で10分間加熱した。 低圧で溶媒を除去し、上記中間体A1.4ｇ
（5.0ｍmol）を乾燥ジメチルホルムアミドに加
えた懸濁液をこれに加え、室温で48時間撹拌し
た。減圧下で溶媒を除去し、残渣に10％HCl80
mlを加えて撹拌した。不溶物を過で集め、室
温で0.1mmHgにて乾燥した。 この物質の2.1ｇを0.5N NaOH35mlに溶解
し、室温で１時間反応させてトリフルオロメチ
ル保護基を除去した。溶液を濃HClでPH5.0に
調整すると、沈澱が生成し、これを過して集
め、水洗し、室温で0.1mmHgにて乾燥した。 この物質を、シリカゲル60 200ｇを用い、溶
媒としてエタノール／トリエチルアンモニウム
バイカーボネートPH7.5（７：３）を用いたカラ
ムクロマトグラフイーに供した。 生成物は溶出液の490mlと650mlの間で溶出し
た。次いで、溶媒を真空下で除去したところク
リーム色の固体680mgを得た。 この物質に50％ジメチルホルムアミド50mlを
加えて撹拌し、瀘過した後、水を加えると生成
物が沈澱した。白色沈澱を20000ｇで25分間遠
心分離して集め、室温で乾燥すると、分析上純
粋なチロキシン−イソルミノール結合体（T₄
−Ｌ）200mgを得た。 mp200℃（分解） T₄−Ｌのストツク溶液はガラスびん中で、
0.1M Na₂CO₃PH10.5の中に約１ｍＭとなるよ
うに作り、４℃に保持するか、又は４×10^-5M
で−70℃に保持した。さらに、希釈はガラス管
中で、75ｍＭのバルビタールナトリウム（Ｎ，
Ｎ−ジエチルバルビツエート）緩衝液PH8.6を
用いて行つた。 Ｂ チロキシン標準液 チロキシン（T₄）の一部を6.4ｍＭのNaOH
（0.5mg／ml）に加え、−20℃に保持した。T₄溶
液は0.1NのNaOHで10倍に希釈し、その濃度
は、325nｍにおける6210のモル吸光度を用い
て（Gemill、1955、Arch.Biochem.
Biophys.54：359）、分光分析的に測定した。 次いで、この溶液を75ｍＭのバルビタール緩
衝液PH8.6で希釈した。実験に用いる標準液は、
さらに10％血清中のT₄溶液（Biochem.
Biophys.Res.Commun.46：2107、1972、
Mitsumaらの方法によりT₄を分離した）を
0.1NのNaOHで種々に希釈して調製した。こ
れらの標準液の200μをセフアデツクスＧ−
25のカラムにかけ、イムノアツセイに供した。 Ｃ ミクロペルオキシダーゼ溶液 ストツク溶液は、ガラスびんの中で、ミクロ
ペルオキシダーゼ（M6756、Sigma Chem.
Corp.）１mgをPH7.4の10ｍＭトリス塩酸2.5ml
に溶解して調製した。この200μM溶液は０〜
４℃で少なくとも１ケ月は安定である。希釈し
た溶液は２時間以上安定ではあるが、使用直前
に、ストツク溶液をガラス管中で75ｍＭのバル
ビタール緩衝液PH8.6を用いて2μMに希釈した。 Ｄ チロキシンに対する抗体 トリヨードチロニンを用いた方法
（Alexander and Jennings、1974、Clin.
Chem20：1353）と同様な方法で調製した牛血
清アルブミンに結合したチロキシンをうさぎに
注射し、種々の時間経過後採血した。抗体は、
硫酸アンモニウムを用いて抗血清から沈澱させ
て部分的に精製し、確立されている方法
（Livingston、1974、Meth.Enzymol.34：725）
に従つて、透析した。 Ｅ セフアデツクスＧ−25カラムの調製 ２つのVION デイスクの間にはさまれたセ
フアデツクスＧ−25の１mlのベツド体積を有す
るSeralute RIAカラム（Ames Co.、Miles
Laboratories、Elkhart、IN 46514）を以下の
溶液４mlで続けて洗浄した（７％酢酸で６回、
水で２回、0.1N NaOHで６回）。カラムは貯
蔵中は両端に栓をしておいた。 Ｆ 化学発光反応 化学発光反応は、６mm×50mmの使い捨てチユ
ーブ（Kimble、Div.of Owens−Illinois、
Order No.73500）中で、デユポン760ケミルミ
ネツセンスバイオメータのフオトチユーブの前
面に載置して行つた。 75ｍＭバルビタール緩衝液PH8.6に溶かした
ミクロペルオキシダーゼの2μM溶液を0.2Mの
NaOHを用いて、２：3.5の比率（ｖ／ｖ）で
希釈し、少なくとも10分間おいた。この触媒の
55μを75ｍＭバルビタール緩衝液PH8.6の95μ
にT₄−Ｌを含む各応チユーブに加え、混合
した。混合液の最終PHは12.6であつた。10分間
のインキユベートの後、10ｍＭトリス−塩酸PH
7.4に溶かした90ｍＭ H₂O₂溶液10μを各反
応チユーブに注入し、１秒以内に光のピーク強
度（PLI）値に到達させて、化学発光を開始さ
せた。報告したPLIは３回の反応の平均値を表
す。 Ｇ チロキシンの化学発光イムノアツセイ 0.1N NaOH200μ中のT₄−L5ピコモルを
セフアデツクスカラムに供した。標識物質を
0.1N NaOH1mlを用いてベツドに洗い入れた。
次いで、T₄標準液を含むサンプルまたは0.1N
のNaOHで１：10に希釈された血清サンプル
を加え、カラムを75ｍＭバルビタール緩衝液PH
8.6 ４mlで洗浄した。 結合反応は0.3mlの抗体溶液を加えて開始さ
せた。この抗体溶液は、この検定条件下で、
T₄−Ｌ（5pmol）の60％に結合しうる。 １時間インキユベート後、抗体を0.8mlのバ
ルビタール緩衝液で溶出した。抗体結合T₄−
Ｌは、H₂O₂−ミクロペルオキシダーゼ系にお
ける溶出物の95μより得られるPLIから測定
した。臨床試料についての値は血清で調製した
T₄標準物質を用いて得た標準曲線から決定し
た。報告した値は３回の試料で分析した３回の
イムノアツセイの平均値である。 甲状腺機能低下疾患の試料は１：５に希釈
し、甲状腺機能亢進疾患の試料は１：20に希釈
して再検定に供した。 得られたPLIはサンプル中に存在するT₄の量
に比例していることがわかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチ
   ン又はアビジンを分析するための： (a) 試験液体を、予め定められた特性を有する標
   識物質とハプテン、抗原、抗体、ビオチン若し
   くはアビジン又はそれに対する特異的結合の相
   手物質との結合体からなる試薬と接触させる工
   程、 ここで、該試薬と結合反応系を生成する対象
   物質が標識化された結合体の束縛相又は遊離相
   を生ずる； (b) 該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び (c) 分離された相の一における、該液体中のハプ
   テン、抗原、抗体、ビオチン又はアビジンの指
   標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であつて、結合体
   中の標識物質が、ルミノールもしくはイソルミノ
   ール又はこれらの誘導体であることを特徴とする
   分析方法。 ２ 該特性が、発生する光の全量又は発生する光
   のピーク強度を測定することにより測定される特
   許請求の範囲第１項記載の分析方法。 ３ 試験液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチ
   ン又はアビジンを分析するための： 予め定められた特性を有する標識物質と、ハプ
   テン、抗原、抗体、ビオチン若しくはアビジン又
   はそれに対する特異的結合の相手物質との結合体
   からなり、かつ、試薬とハプテン、抗原、抗体、
   ビオチン又はアビジンが、結合反応系を形成して
   標識化された結合体の束縛相又は遊離相を生成
   し、該束縛相若しくは該遊離相のいずれかの特性
   が、該液体中のハプテン、抗原、抗体、ビオチン
   又はアビジンの量の関数である不均一系免疫分析
   用の試薬であつて、 結合体中の標識物質がルミノールもしくはイソ
   ルミノール又はこれらの誘導体であることを特徴
   とする試薬。 ４ (1)標識物質がハプテン又は抗原と結合してい
   る該結合体及び(2)ハプテン又は抗原に対する抗体
   からなる特許請求の範囲第３項記載の試薬。 ５ 担体マトリツクス中に包含されてなる特許請
   求の範囲第３項記載の試薬。