SE451895B - Kemiluminiscensforfarande for bestemning av en ligand i ett vetskemedium - Google Patents

Description

.,.'>.

Lil h-à CO x u) (fl 2 neminklorid såsom märkningssubstans i ett heterogent testsystem, där en kemilumimsanm -reaktion användes för indikering. I Nature 219:l86 ä (1968) beskrives i stor detalj vissa_testförfaranden med användning av radioaktiva ämnen, och i förbigàende nämnes också mycket allmänt, att det är möjligt att använda koenzym och virus såsom märkningssubstanser i stället för radioisotoper. I artikeln anges emellertid icke hur man skall genomföra ett testförfarande med användning av sådana alternativa märkningssubstanser, och det har alltså icke visats, att ett sådant testförfarande skulle vara genomförhart. Man kan också hänvisa till verket Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), i vilket de olika kända testmetoderna diskuteras med angivande av olika material, som har använts'säsom märkningssubstanser. ' I den amerikanska patentskriften 3.817.857 beskrives ett test- förfarande utnyttjande ett enzymmärkt konjugat. Detta förfiirande är av homogen typ, eftersom det icke kräver användning av ett uppdelat reak- tionssystem (dvs. en olöslig del och en flytande del) och separation av detta system. Den enzymmärkta liganden har nämligen sådana egenska- per, att den enzymatiska aktiviteten hämmas efter reaktion med ligandens bindningspartner. Förhållandet mellan det märkta materialet i bunden form och det märkta materialet i fri form kan sålunda bestämmas genom mätning av förändringen av den enzymatiska aktiviteten. Nackdelarna med denna metod är svårigheten att framställa väl karakteriserade enzym- märkta konjugat och svårigheten att finna lämpliga enzym. Även om manga nya typer av testförfaranden utnyttjande specifi- ka bindningar har föreslagits och undersökts, sà har förfaranden utnytt- jande radioaktiva ämnen och olika enzymmärkta konjugat hittills varit de mest använda. Båda dessa typer av förfaranden har emellertid uppen- bara nackdelar, eftersom man vid det förstnämnda förfarandet mest an- vänder radioaktiva ämnen, vilka är farliga och svära att hantera, och eftersom det är svårt att framställa enzymmärkta konjugat användbara vid det sistnämnda förfarandet.

Föreliggande uppfinning avser ett tcstförfarande utnyttjande en specifik bindningsrcaktšon för att 1 ett vätsknmedium bestämma en liaand vild bland antígrner och antikroppar därtill; haptenz. och antikroppar därtill; hormoner, vitaminer, metaboliter och farma- kologiska model samt deras receptorer och bindningssubstanser; vid vilket förfarande man (1) nringar vätskemediet i kontakt med ett reagens innefattande ett märkt konjugat till bildning av on bunden -B> LH OD vß (51 form av det märkta konjugatet och en fri form av det märkia kon- Jugatet, varvid proportionerna mellan den bundna formen och den 'ria formen av det märkta konjugatwt är en funktion av'knneentra- tionen av lígand i vätskemedjet, varefter man (2) mäter mängden närkn'ngssuhntans i den bundna formen eller den fria formen av det kännetecknas enligt uppfinning- "ärkta konjugatet. Detta förfarande en av att en kemiluminiscens-reædant användes såsom märkninge- substans.

Nedan definieras några av de termerna. Med ligand avses det ämne eller den grupp av ämnen, vars när- varo eller mängd i ett vätskemedium skall bestämmas. Med specifik bind- ningspartner för liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av imnen, som har en specifik bindningsaffinitet till liganden med uteslu- tande av andra ämnen. Med specifik bindningsanalog till liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som uppför sig pà i huvud- sak samma sätt som liganden med avseende pa bindningsaffiniteten till i föreliggande beskrivning använda ligandens specifika bíndningspartner. Kemiluminiscens~reaktan- ten kommer i det följande ofta att kallas enbart reaktant.

Den nya homogena testtekniken är delvis baserad på det faktum, att reaktionen mellan en ligand och en specifik bindningsparther därför, till en av vilka reaktanten är kopplad, förändrar aktiviteten av reak- tanten i den förutbestämda reaktionen, vilken reaktion sålunda tjänar såsom medel för indikering av den specifika bindningsreaktionen. På ¿rund av detta basfenomen kan olika bindningsmctoder omfattande olika testkompositioner och anordningar användas vid genomförande av förfaran- iet enligt uppfinningen. De föredragna grundmetoderna är tekniken med direkt bindning och tekniken med konkurrerande bindning.

O Vid tekniken med direkt bindning bringas ett vätskemedium, som misstänkcs innehålla den ligand som skall påvisas, i kontakt med ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till en specifik.bindnings- partner för liganden, och därefter mätes eventuell förändring i reak- tantens aktivitet. Vid tekniken med konkurrerande bindning bringas väts- kemediet i kontakt med en specifik bindningspartner för liganden och meJ ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till liganden och/eller till en specifik bindningsanalog därtill, och därefter mätes eventuell förändring i reaktantens aktivitet. Vid båda metoderna hestämmes reak- tantens aktivitet genom att vätskemediet bringas i kontakt med åtmin- stone ett reagens, som med reaktanten ger den förutbestämda indikerings- reaktionen. Kvalitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man Jämför en egenskap, vanligen hastigheten, hos den resul- terande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i ett vätskemedium fritt från ligand, varvid eventuell skillnad utgör en indikation på en förändring i reaktantens aktivitet. Kvantitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man Jämför en egenskap hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i vätskemedia innehållande kända mängder av li- ¿anden.

Vid den homogena metoden kan komponenterna i den specifika bindningsreaktionen, dvs. det vätskemedium som misstänkes innehålla ïiganden, konjugatet och/eller en specifik bindningspartner för ligan- den, vanligen kombineras.i vilka som helst mängder, pà vilket som helst sätt och i vilken som helst ordningsföljd, förutsatt att aktiviteten av reaktanten i konjugatet förändras mätbart, när vätskemediet inne- håller liganden i en mängd eller koncentration, som det är av betydelse att bestämma. Alla komponenterna i den specifika bindningsreaktionen ar företrädesvis lösliga i vätskemediet. , När man använder en homogen teknik med direkt bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det vätskemedium, som misstänks innehålla liganden, och en viss mängd av ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till en specifik bindningspartner för liganden. Vid kontakt med vätskemediet kommer aktiviteten av den konju- gerade reaktanten att variera omvänt med graden av bindning mellan li- ganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern i konjugatet.

Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av den konjugerade reaktanten att minska. 451 895 5 När man använder en homogen teknik med konkurrerande bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det väts- kemedium, som misstänkes innehålla liganden, en viss mängd av ett kon- jugat innefattande reaktanten kopplad till liganden eller till en spe- cifik bindningsanalog till liganden, och en viss mängd av en specifik bindningspartner för liganden. Den specifika bindningspartnern bringas i huvudsak samtidigt i kontakt med både konjugatet och vätskemediet.

Eftersom eventuell ligand i vätskemediet konkurrerar med liganden eller dennas specifika bindningsanalog i konjugatet när det gäller hind- ning till den specifika bindningspartnern, kommer aktiviteten av den konjugerade reaktanten att efter kontakt med vätskemediet variera direkt med graden av bindning mellan liganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern. Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av den konjugerade reaktanten att öka.

En variation av den homogena tekniken med konkurrerande bind- ning är den homogena tekniken med förträngningsbindning, där konjugatet först bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern för liganden och därefter bringas i kontakt med vätskemediet. Härvid uppstår konkurr- ens om den specifika bindningspartnern. Vid en dylik metod är den mängd konjugat, som bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern, vanligen så stor, att liganden eller dennas analog i konjugatet före- ligger i överskott över den mängd, som kan bindas till mängden specifik bindningspartner under den tid, som konjugatet och den specifika bind- ningspartnern är i kontakt med varandra före kontakten med det vätske- medium, som misstänkes innehålla liganden. Denna kontaktordning kan uppnås på ettdera av tva lämpliga sätt. Enligt den ena metoden bringas konjugatet i kontakt med den specifika bindningspartnern i en vätske- miljö före kontakten med'det vätskemedium, som misstänkes innehålla liganden. Enligt den andra metoden bringas det vätskemedium, som miss- tänkes innehålla liganden, i kontakt med ett komplex innefattande konju- gatet och den specifika bindningspartnern, varvid den specifika bind- ningssubstansen i konjugatet och den specifika bindningspartnern är reversibelt bundna till varandra. Den mängd konjugat, som blir bunden till den specifika bindningspartnern, vilken föreligger i komplexbund- en form enligt den andra metoden, är vanligen större än den mängd, som kan förträngas av all ligand i vätskemediet under den tid, som den specifika bindningspartnern, eller komplexet, och vätskemediet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell för- ändring i den konjugerade reaktantens aktivitet.

En annan variant av den homogena tekniken med konkurrerande bindning är den homogena tekniken med stegvis mättning, där komponenter- 451 895 F na i den specifika bindningsreaktionen är desamma som användes vid tek- niken med konkurrerande bindning, men där ordningen av komponenternas tillsättning eller kombination och de relativa mängderna därav är annor- lunda. Enligt tekniken med stegvis mättning bringas den specifika bind- ningspartnern för liganden i kontakt med det vätskemedium, som miss- tänks innehålla ligandcn, under en viss tid före vätskemediets kontakt med konjugatet. Den mängd specifik bindningspartner, som bringas i kon- takt med vätskemediet, är vanligen större än den mängd, som kan binda all den ligand, som antages vara närvarande i vätskemediet, under den tid som den specifika bindningspartnern och vätskemediêt är i kontakt med_varandra, innan vätskemediet bringas i kontakt med konjugatet.

Mängden ligand eller analog därtill i konjugerad form är dessutom van- ligen större än den mängd, som kan bindas till den kvarvarande obundna mängden av den specifika bindningspartnern under den tid, som vätske- mediet och konjugatet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell förändring i den_konjugerade reaktantens ak- tivitet.

Bestämningen av eventuell förändring i den konjugerade reaktan- tens aktivitet, vilken reaktant utgör en beståndsdel vid den förutbe- stämda indikeringsreaktionen, sker lämpligen genom att den specifika bindningsreaktionsblandningen bringas i kontakt med åtminstone ett ämne, som tillsammans med den konjugerade reaktanten ger den förutbestämda indikeringsreaktionen, och man bestämmer verkan av den specifika bind- ningsreaktionen pá en egenskap hos en dylik indikeringsreaktion.

Användningen av en kemilumíniscens-reaktant såsom märkníngssubstans kan också användas vid de konventionella metoderna av heterogen typ, där den bundna och den fria fasen av den märkta beståndsdelen separeras från varandra, och mängden märkningssubstans bestämmes i endera av dessa faser. Reagenset för genomförande av en dylik heterogen metod kan ha många olika former. Ett dylikt reagens innefattar vanligen tre grund- oestándsdelar, nämligen (1) den ligand som skall påvisas, (2) en spe- cifik bindningspartner för liganden, och (3) en märkt beståndsdel, som vanligen är en märkt form av antingen (a) liganden eller (b) en spebifik oindningsanalog till liganden eller (e) den specifika bindningspartnern Dessa beståndsdelar kan tillsättas samtidigt eller i en viss följd och med en lämplig inkubationsperiod eller lämpliga inkubationsperioder.

Den märkta bestándsdelen bindes till sin motsvarande konkurrerande bind- ningspartncr, så att graden av bindning, dvs. förhållandet mellan mängd- en märkt beståndsdel bunden till en bindningspartner och mängden obun- den märkt bcstàndsdel, är en funktion av mängden närvarande ligand.

Nedan ges en kort beskrivning Lv nägra av dc olika bindningsreaktions- 4-51 895 7 typer, som kan användas vid genomförande av förfarandet enligt före- liggande uppfinning.

Under det att vid konventionella heterogena metoder utnyttjande specifika bindningar, såsom metoder utnyttjande radioaktiva ämnen och enzymmärkta konjugat, märkningsegenskaperna hos det märkta konjugatet, såsom radioaktivitet eller enzymatisk aktivitet, är i huvudsak desamma -i den bundna och den fria formen av konjugatet, så påverkas enligt före- liggande uppfinning i vissa fall aktiviteten av reaktanten, dvs. märk- ningssubstansen, genom bindning av det märkta konjugatet. I ett dylikt fall uppvisar indikeringsreaktionen en relativt konstant karaktär, om liganden är frånvarande i vätskemediet eller är närvarande i en mycket liten mängd. Om vätskemediet innehåller ligand, så förändras en egen- skap hos indikeringsreaktionen, såsom ovan har angivits i samband med beskrivningen av den homogena tekniken.

I de nedan angivna diagrammen användes följande symboler: Symbol L (lim) (exe) Definition ligand som skall påvisas ligand eller specifik bindningsanalog därtill M bindningspartner för liganden märkningssubstans, dvs. reaktant olöslig fas inkubationsperiod efterföljd av lämplig separation begränsad mängd; ämnet närvarande i en mängd mindre än den mängd, som kan bindas till det totala antalet tillgängliga bind- ningsställen under de valda reaktionsbe- tingelserna under den valda inkubations- perioden; dvs. den beståndsdel, om vilken de andra beståndsdelarna konkurrerar. överskottsmängd; ämnet närvarande i en_ mängd större än den mängd, som kan bindas till det totala antalet tillgängliga bind- ningsstallen under de valda reaktionsbe- tingelserna under den valda inkubations- perioden. ^ íl) Heterogcn teknik med konkurrerande bindning. (a) L + (š)*+ B(lim)--+ + insolubiliseringsmedel för B eller (Ef Detta är den klazsíska metoden med konkurrerande bindning.

Såsom exempel på användbara insoluhiliseringsmedel kan 451 895 8 man nämna specifika utfällnings-antikroppar, specifika insolubíliserade antikroppar, och, om B eller ()* är ett proteinmaterial, proteínutfällningsmedel, såsom ammonium- sulfat, och, om B eller (:)'är en liten adsorberbar mole- kyl, dextranbelagt träkol. Beskrivning av liknande system återfinncs 1 Biochem. J. 88:13? (196)) och i_den amerikan- ska patentskriften 3.859.155. (b) L + @*+ 1- s(11m)---> Denna metod kallas vanligen metoden med fast fas. I de amerikanska patentskrifterna 5.505.019, 5.555.143, 3.646.546 och 3.654.090 beskrives liknande metoder utnytt- jande radioaktiva ämnen och enzymmärkta konjugat. (e) L + n* + |-@(11m)-____> Referens: U.S. Patent Nr. 3.654.090. (d) 1. + -L + n* (11m)----> Referens: U.S. Patent Nr. 5.850.752. ífi) Heteromen teknik med stegvis mättning. (a) L + B(exc)--Q-+ (ï)*(ex )-->+-insolubiliseringsmedel för B eller (iàí ' Vid tekniken med stegvis mättning bíndes den märkta be- stàndsdelen till en del av eller alla de bindningsställen pá B, som finns kvar efter den första inkubationsperioden. (b) L-+ 1- B(exe)--+ + (É)¥(exc)---> 7 I den amerikanska patentskriften 3.720.760 och i J. Immu- nol. 209:l2Q (1972) beskrivas liknande metoder utnyttjande radioaktiva-ämnen och enzymmärkta konjugat. (c) L + B*(exc)--++ (5) 'Heterogen teknik av sandwich-typ.

L + B(exc)-->B (exe)--> Vid sandwich-metoden bindes den märkta bestàndsdelen till några av eller alla de ligandmolekyler, som är bundna till den insolubíliserade bindningspartnern.

Referens: amerikanska patentskriften 5.720.760. (4) Hcteroncn teknik med utspädning av fast fas.

L + <:Y-+ (icke-specifik)--_++ B(1im)---Q Vid denna metod bindes liganden och den märkta bestånds- delen till en icle-specifik bindningssubstans, och däreftcr 9 frigöres proportionella mängder därifrån genom bindning till en bindningspartner, som har en större affinitet till liganden och den märkta bestàndsdelen. Vid den mest användbara utföringsformen av denna teknik använder man en kolonn av den icke-specifika bindningssubstansen, så- som heskrives i den amerikanska patentskriften j.659.lOü, En dylik teknik är användbar, om liganden bindes till en- dogena bindningssubstanser i provet, eftersom dylika sub- stanser skulle störa den konkurrerande bindningsreaktionen, om de icke avlägsnades. Efter det att de endogena bind- - ningssubstanserna har bundits till den icke-specifika bind- I' ningssubstansen, kan de avlägsnas genom lämplig tvättning.

För ytterligare upplysningar om den konventionella, heterogena tekniken, såsom mera detaljerade beskrivningar av testsystem och alter- nativa separationsmetoder, kan man hänvisa till Principles of Competi- tive Protein-Binding Assays, Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972).

Inom ramen för föreliggande uppfinning kan man naturligtvis genomföra homogena och heterogena testförfaranden innefattande andra nindningsreaktionssystem och annan ordningsföljd av komponenternas till- sättning. ' De reaktionsbestándsdelar, vilka tillsammans med reaktanten i konjugatet ger den förutbestämda indikeringsreaktionen, kan enligt den homogena metoden bringas i kontakt med den specifika bindningsreaktions- olandningen oeh'enligt den heterogena metoden bringas i kontakt med antingen den bundna eller den fria fasen efter separation av faserna frán varandra. Nämnda reaktionsbeståndsdelar kan tillsättas antingen var för sig eller i vilken som helst kombination och antingen före, «amtidigt med eller efter initiering av den specifika bindningsreaktion- en. Efter initiering av den specifika bindningsreaktionen inkuberas vanligen reaktionsblandningen, som kan innehålla några av eller alla de nödvändiga komponenterna för indikeringsreaktionen, under en förutbe- stämd tidsperiod, innan man bestämmer eventuell förändring i aktiviteten av reaktanten i konjugatet (homogen teknik) eller mängden reaktantaktivr tet i de separerade faserna (heterogen teknik). Efter inkuberingsperio- den sätter man till reaktionsblandningen eventuella komponenter, vilka är nödvändiga för indikeringsreaktionen och vilka icke redan är närva- rande i tillräckliga mängder i reaktionsblandningcn, och indikerings- reaktionen studeras för indikation av närvaro eller mängd av liganden 1 vätskemediet. s CW ._ .x RÖ (TI 10 Indikeringsreaktionen enligt uppfinningen är en lumi- niscerande reaktion, företrädesvis enzymkatalyserad, nämligen en reaktion uppvisande ett kemiluminisceringsfenomen_ Reaktanten i konjugatet är en reaktant i den ljusalstrande reaktionen.

Eventuell förändring i den konjugerade reaktantens aktivitet till följd av den specifika bindningsreaktionen åstadkommer en förändring i ljusalstringshastigheten eller i den totala mängden, toppintensiteten eller karaktären av det alstrande ljuset. Exem- pel pà luminiscerande reaktionssystem ges i nedanstående tabell A.

I denna tabell betecknar hv elektromagnetisk strålning, vanligen i det ínfraröda, synliga eller ultravioletta området. 11 Hnnfiñøflowfiflofiflfivflomfl Hoflfimmonha omnmonwwh Hocflfiflfi uwnmuflfimn fioflflmwomha vmnwofiwon Honflfiflfl nmßmuñnwn vcßuxmwu Umumm5.c0m mmflmumx.nmHHmx NZ + umflmumocwäm + v:mIlll||ll.mox + Hocfifisflowfl N4 + umflmwioflflëm + vs Allllllllllllll omm + fiocflfisflomfi . n . mmnfikonwaouxmfl _ . 1 0 mmüßhfl Umkm HNO + - 4|!lIflI|| OO + Mofl mmøhmfl flflhmoñvmh . v. 7 _ wmnmuæwo Hocflfiflfl wmnmvflxo + vn Alwmmmmwmm No + Hoßflñsfl Ummmonumn omm r floflflmmohnm Umnwnflmo + vx mlflflflflflflfld momm + floflflmwuhæa Umnmomnmn üüfiw» w-ACSO/L w N u O .T HUCHHÜH ÜMrmmwm-LMWWO .T + .mfiflflmhflfl ÜWLOUÜÜÜL Ewuwæwmcofluxmwu mflcmuwomflcfiëøq 4 Hfiwnmfi _13:- "l -\ :n xD (II 12 För ytterligare uppgifter om användbara luminiscerande reaktions- system kan man hänvisa till Följande litteraturställen: J. Biol. Chem. 256:48 (1961).

J. Amer. Chem. Soc. 89:}9H4 (1967).

Cornicr et al., Bioluminescense in Progress, ed. Johnson et al., Princeton University Press (New Jersey, 1966) p. }6}-BU.

Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, doktorsavhandling,University of Georgia (1967).

Am. J. Physiol. 4111:51: (1916). ' _ Biol. Bull. 51:89 (1926).

"J. moi. Chem. zlßflrziu (1968).

Ett reaktionssystem, som särskilt föredrages för indikering av den nya specifika bindningsreaktionen enligt uppfinningen, är ett cyk- liskt system (kretsloppssystem). I ett dylikt system är en produkt i en första reaktion en reaktant i en andra reaktion, och i den andra reaktionen är en av produkterna en substans, som också är en reaktant i den första'reaktionen.

Nedanstående diagram illustrerar ett dylikt cykliskt reaktions- system: I produkter A kretsloppsgående material reaktanter B (Form l) REAKTION A REAKTION B L reaktanter A kretsloppsgàende material produkter B (form 2) I ovanstående cykliska reaktionssystem alstrar en liten mängd kretsloppsgäende material stora mängder av produkterna A och B, om till- räckliga mängder av reaktnnterna A och B är närvarande. Eftersom reak- tionshastigheten och mängden produkt bildad av reaktionerna i det cyk- liska reaktionssystemet är mycket känsliga för mängden kretsloppsgàen- de material, förcdrager man att använda det krctsloppsgàende materialet såsom reaktant i konjugatet enligt föreliggande uppfinning. ..,'.”~». en ...à oo -Q en 13 Föreliggande uppfinning kan användas för att påvisa vilken som helst ligand, för vilken det finns en specifik bindningspartner. Ligan- den är vanligen en peptid, ett protein, ett kolhydrat, ett glykoprotein, en steroid eller någon annan organisk molekyl, för vilken en specifik bindninßspartner existerar i biologiska system eller kan syntetiseras. figanden väljes vanlinen bland antigener och antikroppar därför; hapte- ner och antikroppar därför; hormoner; vitaminer, metaboliter och farma- kologiska medel, samt receptorer och bindningssubstanser därför. Såsom specifika exempel på lígander, vilka kan påvisas med hjälp av förfaran- det enligt uppfinningen, kan man nämna hormoner, såsom insulin, korion- gonadotropin, tyroxin, liotyronin och estriol; antigener och haptener, såsom ferritin, bradykinin, prostaglandiner och tumörspecifika antige- ner; vitaminer, såsom biotin, vitamin B12, folinsyra, vitamin E och askorbinsyra; metaboliter, såsom 3',5'-adenosinmonofosfat och 3',5'- ñuanosinmonofosfat; farmakologiska medel, såsom dilantin, digoxin, morfin, digitoxin och barbiturater; antikroppar, såsom mikrosomala anti- kroppar och antikroppar till hepatit och allergener; och specifika bindningsreceptorer, såsom tyroxinbindande globulin, avidin, hemogenas och transkobalamin. - I konjugatet enligt föreliggande uppfinning är reaktanten kopp- lad eller bunden till en specifik bindningssubstans, vilken beroende på det valda testsystemet kan utgöras av liganden, en specifik bindnings- analog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden, så att en mïtbar mängd reaktantaktivitct kvarhàllcs. Bindningen mellan reaktanten och den specifika bindningssubstansen förstöres eller påverkas av den valda indikeringsreaktíonen såsom ett medel för bestämning av förändringen i reaktantens aktivitet.

Rcaktanten kan vara direkt kopplad till den specifika b1ndning5_ Isubstansen, så att konjugatets molekylvikt är mindre än eller lika med den sammanlagda molekylvikten för reaktanten och den specifika bindning» substansen. Vanligen är emellertid reaktanten och den specifika bind- ningssubstansen förbundna med varandra genom en brygg-èrupp innehållande :-50, företrädesvis 1-10, kolatomer eller heteroatomer, såsom kväveato- mer, syrcatomer, svavelatomer, fosforatomer, osv. Såsom exempel på en Orygß-Krupp innehållande en enda atom kan man nämna en metylengrupp (1 kolatom) och en aminogrupp (l hetercatom). Brygß-gruppen har vanligen en molekylvikt, som icke överstiger 1000 och företrädesvis är lägre än ¿0O. Brygg-gruppen innehåller en kedja av kolatomor eller heteroatomer 451 14 eller en kombination av bådadera, och den är förbunden med reaktanten och den specifika bindningssubstansen, eller ett aktivt derivat därav, genom en sammanhindnnde grupp, som vanligen utgöres av en estergrupp, en amidogrupp, en etergrupp, en tioestergrupp, en tioetergrupp; en ace- talgrupp, en metylengrupp eller en aminogrupp.

Enligt en utförinfisform av uppfinningen föreligger de komponen- ter i det specifika bindningsreaktionssystemet, vilka skall kombineras med det vätskemedium som misstänkes innehålla liganden, i flytande eller fast form. Enligt den föredragna homogena tekniken föreligger komponen- terna vanligen i lösning eller i en fast form, som lätt kan lösas i vdtskemediet. Eftersom det vütskemedíum som skall testas vanligen är vattenhaltigt, föreligger komponenterna vanligen i vattenlöslig form, dvs. antingen i en vattenlösning eller i en vattenlöslig, fast form, såsom ett pulver eller ett harts. Testförfarandet kan genomföras i ett vanligt laboratoriekärl, såsom ett provrör, varvid komponenterna för den specifika bindningsreaktionen och komponenterna för indikeringsreak- tionen tillsättes i fast eller flytande form.

En eller flera nv komponenterna för den specifika bindningsreak- tionen och/eller en eller flena av komponenterna för indiker1ngsreaktion~ ““ en kan dessutom införlivas med en bärare. En dylik bärare kan vara ett kirl, såsom ett provrör eller en kapsel innehållande en dylik komponent eller dylika komponenter i en inre del därav, t.ex. i form av en vätska eller ett luekert fast ämne eller en beläggning på kärlets inneryta.

Lnligt en annan utföringsform kan bäraren föreligga 1 form av en matris, som är olöslim och porös, och som företrädesvis kan absorbera det väts- kemedium som provas. En dylik matris kan vara ett fuktighetsabsorberan- 'de papper, en polymerfilm, ett membran, ett flor, ett block, ett gel, etc. I en dylik form utgör matrisen ett lämpligt medium för kontakt med det vätskemedium som skall provas, för genomförande av den specifika bindninesreaktionen och/eller indikeringsreaktionen, och för iakttagande av det resulterande gensvaret.

U Det vätskemedium, som skall provas, kan vara en naturligen före- kommande eller pá konstgjord väg framställd vätska, som misstänkes inne- hålla liganden. Vätskemediet är vanligen en biologisk vätska eller en vätska erhàllen genom utspädning eller annan behandling av en biologisk vätska. Såsom exempel pà biologiska vätskor, vilka kan testas enligt föreliggande uppfinning, kan man nämna serum, plasma, urin och amnio- .vi s) 4-51 895 15 tiska, eerebrala och spinala vätskor. Man kan även analysera andra ma- terial, såsom Fasta ämnen, t.ex. vävnader, eller gaser, om dessa materi- al först överföres i vätskeform, t.ex. genom upplösning av det fasta ämnet eller gasen i en vätska eller genom vätskeextraktion av det fasta ämnet.

I motsats till de förut kända homogena metoderna kan biologiska vätskor, vilka innehåller substanser med reaktantaktivitet liknande eller identiska med aktiviteten av den konjugerade märkningssubstansen, analyseras för bestämning av en ligand utan bakgrundsstörning. Endogen bakgrundsaktivitet kan lätt elimineras på flera sätt. Den biologiska vatskw1kan behandlas för selektiv förstöring av den endogena reaktant- aktiviteten. En dylik behandling kan ske med hjälp av ett medel, vilket kemiskt förstör den endogena aktiviteten, varefter man inaktiverar det använda medlet.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begränsan- de exempel. §šemQel_l. Framställning av biotin-isoluminol-konjugat. 6-(š~biotionoylamido-2-hydroxipropylamino)-2,5-dihydroxiftala- zin-1,4-dion.

(A) 4-(5-klor-2-hydroxipropylamino)-H-metylftalimid. 25 gram (0,lU2 mol) 4-amino-N-metylftnlamid, framställd enligt den metod som beskrives 1 J. Chem. Soe. 26: (l9j7), och 20,7 gram (O,2l mol) l-klor-2,3-epoxipropan sattes till 150 ml 2,2,2-trifluor- etanol; varefter den erhållna reaktionsblnndningen kokades under åter- flöde och under omrörning i H8 timmar. YO-HO ml 2,2,2-trifluoretanol zvlägsnades genom destillering, varvid en tung gul fällning bildades, när den kvarvarande lösningen kyldes till rumstemperatur. Denna fäll- ning revs med etylaeetat, nvskiljdes genom Filtrering och torkades. Man erhöll härvid 29,5 gram (utbyte 77 %) av den önskade mellanprodukten med en smältpunkt av lj6-lj3,5°C.

Beräknat För C12H13ClN2O3: c 53,614,- n 4,88,- n 10,115 Funnet: C 55,37; H 4,ö”; N lu,8l. -5> C71 -A CD _f"\ ß *a 16 (B) 4-/É-(N-ftalimido)-2-hydroXipropylamino7-N-metylftalimid. 15,5 gram (0,05 mol) av den i steg (A) framställda mellanproduk- zen och 15,7 gram (0,085 mol) kaliumftalimid i 150 ml dimetylformamid kokades under áterflöde och under omrörning i 24 timmar. Dimetylforma- miden avlägsnades, och återstoden tvättades med vatten och Filtrerades.

Qen gula filterknkan omkristalliserndes i en blandning av ättiksyra och vatten, varvid man erhöll 12,8 gram (utbyte 67 %) av den önskade produk- ten med en smältpunkt av 2H7-2U8,5oC. ' " f- W -70 : Beraknit for C2OH17N) 5 c 63,32,- H 11,52,- N 11,08 Funnet: C 6},l6; H 5,33; N 10.93.

(C) 6-/É-amino-2~hydroxipropylnmino7-2,j-dihydroFta]azin-l,4- dion.

En blandning av 5,0 gram (lj,2 mmol) av den i steg (B) erhållna mellanproduktcn, 90 ml absolut etanol och jß ml 95 %-lg hydrazin koka- des under àterflödc och under omrörning 1 H timmar. Lösningsmedlet av- lägsnades därefter i vakuum, och det resulterande fasta ämnet torkades under 2ü timmer vid 12000 under vakuum. Det Fdstn ämnet omrördes sedan -s under 1 timme med 70 ml 0,1 N saltsyra. Den olösliga 2,}-dihydroxifta1- azin~1,4-dionen avlägsnades genom filtrering, och filtratets pH-värde inctälldes på 6,5 med mättad nntriumbikarbonitlösning. Den härvid bil- dade vita fällníngcn avskiljdes genom Filtrering och torkades, varvid en erhöll 2,2 gram produkt (utbyte 67 %). Efter omkristallisering i vïtten smälte produkten vid 27}oC under sönderdelning.

Beräknwt För C11Hl"N203: C 52,79; H 5.6U; N 22,59 Funnet: C 52,7}; H 5,72; N 22,5".

(D) Biotin-isoluminol-konjugat_ __ 0,29 gram (1,2 mmol) biotin och 0,17 ml trietylamin löstes i JO ml torr dimctylformamid under vattenfria betingelser, varefter lös- ningen kyldes till -1000. En lösning av 0,141 ml etylkloroformiat i 2,86 ml eter tillsattes därefter långsamt, och den erhållna reaktions- nlandningen omrördes under 30 minuter. En bildad fällning avskiljdes genom Filtrering. Till filtratet sattes därefter snabbt en suspension oestáende av 600 mg (2,4 mmol) av den i steg (C) framställda mellanpro- dukten, 20 ml torr dímctylformamid och l ml torr pyridin. Den erhållna 17 reaktionsblandnlngen omrördes vid -1000 under 50 minuter och sedan vid rumstemperatur över natten. Under denna tid erhölls en lösning. Dimetyl- Formamiden ivlägsnades genom destillation vid 6000 och 0,10 mm Hg. Den oljíga återstoden omrördes under l timme med 50 ml O,l N saltsyra. Det härvid bildade vita fasta ämnet avfiltrerades och tvättades med 0,1 N saltsyra och sedan med vatten. Efter torkning under vakuum vid rumstem- peratur över natten erhölls 0,55 gram (utbyte 97 %) av den önskade pro- dukten med en smältpunkt av 170-17300.

Beräknat för C2lH28N6O5S: C 52,92; H 5,92; N l7,6H Famnet; c 51,69,- n 5,90,- N 17,63.

Exempel 2. Homogen kemiluminiscens-metod med konkurrerande nindníng för bestämning av biotin.

Det i detta exempel använda kemiluminiscens-reaktionssystemet var baserat på följande reaktion: biotin-isoluminol + KO, ---------à biotin-aminoftalat + N? + hv Man framställde sexton bindningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av l50/ul och innehöll 0,1 M tris-(hydroxi- metyl)aminometan-hydroklorid (nd 8,0), 42 mM biotin-luminol-konjugat (framställt enligt exempel 1), hiotin i den i nedanstående tabell 1 an- mivna koncentrationen och 0,l2 enheter avidin per milliliter (tillsatt sist). Efter inkubering vid 2500 under 5 minuter satte man till varje reaktionsblandning 10/ul dimetylformamid innehållande 0,15 M kalium- superoxid (K02)(fràn Alpha Products, Beverly, Massachusetts, USA) och 0,10 N l,4,7,10,15,16-hexaoxiacylkooktadekan (från Aldrich Chemical CO., Milwaukee, Wisconsin, USA).

Efter inkubering vid 25°C under ytterligare 2 minuter satte man 'till varje reaktionshlandníng l0/ul 0,95 mM väteperoxid i 10 mM tris- (hydroximetyl)aminometan~hydrokloridbuffert (pH 7,4). I varje reaktions- olandning mätte man därefter den maximala ljusintensiteten med använd- ning av en Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E. I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware, USA). Im erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 1. .fiu (J-Û CC? \ Q CPI reaktions- blandning ll 12 lj. 14 15 16 18 Égpell ]. koncentration av biotin (nM) m; maximal ljusin- tensitet ° 0 15 27 H0 55 67 101 153 166 200 267 335 400 534 667 800 Av ovanstående försöksrcsultat framgår, att den av kemilumini- scens-reaktionssystemet framkallade maximala ljusintensiteten var en omvänd funktion av mängden biotin i bindningsreaktionsblandningen. Man kan därför enligt föreliggande uppfinning åstadkomma en testkomposition och ett förfarande för bestämning av liganden biotln 1 ett vätskemedium med användning av en kcmiluminiscens-teknik med konkurrerande bindning, vilken teknik icke utnyttjar en vnzym-katalynernd indíkeríngsreaktion.

Claims (5)

.s Cr: ...å OO \O Lv 19 P a t e n t k r a v

1. Testförfarande utnyttjande en specifik bindningsreaktion för att i ett vätskemedium bestämma en ligand vald bland antigener och antikroppar därtill; haptener och antikroppar därtill; hormoner, vitaminer, metaboliter och farmakologiska medel samt deras recepto- rer och bindningssubstanser; vid vilket förfarande man (1) bringar vätskemediet i kontakt med ett reagens innefattande ett märkt kon- jugat till bildning av en bunden form av det märkta konjugatet och en fri form av det märkta konjugatet, varvid proportionerna mellan den bundna formen och den fria formen av det märkta konjugatet är en funktion av koncentrationen av ligand i vätskemediet, varefter man (2) mäter mängden märkningssubstans i den bundna formen eller den fria formen av det märkta konjugatet, k ä n n e t e c k n a t av att en kemiluminiscens-reaktant användes såsom märkningssubstans.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e ck n a t av att aktiviteten av den såsom märkningssubstans använda kemiluminiscens- reaktanten är olika i den bundna formen och i den fria formen.

3. Förfarande enligt krav 2 av homogen typ, k ä n n e t e c k- n a t av att kemiluminiscens-aktiviteten i den flytande reaktions- blandningen mätes utan att den bundna och den fria formen av det märkta konjugatet separeras från varandra.

4. å Förfarande enligt krav 1 av heterogen typ, k ä n n e t e c k- n a t av att den bundna och den fria formen av det märkta konjuga- tet separeras från varandra, och att kemiluminiscens-aktiviteten mätes i en av dessa former.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att kemiluminiscens-reaktanten är luminol eller isoluminol eller något derivat därav.