SE451895B - Chemiluminescence Procedure for Determination of a Ligand in a Liquid Medium - Google Patents
Chemiluminescence Procedure for Determination of a Ligand in a Liquid MediumInfo
- Publication number
- SE451895B SE451895B SE8007397A SE8007397A SE451895B SE 451895 B SE451895 B SE 451895B SE 8007397 A SE8007397 A SE 8007397A SE 8007397 A SE8007397 A SE 8007397A SE 451895 B SE451895 B SE 451895B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- ligand
- reaction
- liquid medium
- specific binding
- reactant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
- C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D237/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings
- C07D237/26—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D237/30—Phthalazines
- C07D237/32—Phthalazines with oxygen atoms directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/10—Spiro-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Description
.,.'>. .,. '>.
Lil h-à CO x u) (fl 2 neminklorid såsom märkningssubstans i ett heterogent testsystem, där en kemilumimsanm -reaktion användes för indikering. I Nature 219:l86 ä (1968) beskrives i stor detalj vissa_testförfaranden med användning av radioaktiva ämnen, och i förbigàende nämnes också mycket allmänt, att det är möjligt att använda koenzym och virus såsom märkningssubstanser i stället för radioisotoper. I artikeln anges emellertid icke hur man skall genomföra ett testförfarande med användning av sådana alternativa märkningssubstanser, och det har alltså icke visats, att ett sådant testförfarande skulle vara genomförhart. Man kan också hänvisa till verket Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), i vilket de olika kända testmetoderna diskuteras med angivande av olika material, som har använts'säsom märkningssubstanser. ' I den amerikanska patentskriften 3.817.857 beskrives ett test- förfarande utnyttjande ett enzymmärkt konjugat. Detta förfiirande är av homogen typ, eftersom det icke kräver användning av ett uppdelat reak- tionssystem (dvs. en olöslig del och en flytande del) och separation av detta system. Den enzymmärkta liganden har nämligen sådana egenska- per, att den enzymatiska aktiviteten hämmas efter reaktion med ligandens bindningspartner. Förhållandet mellan det märkta materialet i bunden form och det märkta materialet i fri form kan sålunda bestämmas genom mätning av förändringen av den enzymatiska aktiviteten. Nackdelarna med denna metod är svårigheten att framställa väl karakteriserade enzym- märkta konjugat och svårigheten att finna lämpliga enzym. Även om manga nya typer av testförfaranden utnyttjande specifi- ka bindningar har föreslagits och undersökts, sà har förfaranden utnytt- jande radioaktiva ämnen och olika enzymmärkta konjugat hittills varit de mest använda. Båda dessa typer av förfaranden har emellertid uppen- bara nackdelar, eftersom man vid det förstnämnda förfarandet mest an- vänder radioaktiva ämnen, vilka är farliga och svära att hantera, och eftersom det är svårt att framställa enzymmärkta konjugat användbara vid det sistnämnda förfarandet.Lil h-à CO xu) (fl 2 nemine chloride as a labeling substance in a heterogeneous test system, where a chemiluminescent reaction was used for indication. In Nature 219: 186 ä (1968) certain test procedures using radioactive substances are described in great detail, and in passing It is also mentioned very generally that it is possible to use coenzyme and viruses as labeling substances instead of radioisotopes, but the article does not specify how to carry out a test procedure using such alternative labeling substances, and thus it has not been shown that such a test procedure Reference can also be made to the work Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (JB Lippincott Co., Philadelphia, 1972), in which the various known test methods are discussed, indicating different materials which have been used. U.S. Pat. No. 3,817,857 discloses a test method utilizing an enzyme rkt conjugate. This procedure is of a homogeneous type, since it does not require the use of a divided reaction system (ie an insoluble part and a liquid part) and separation of this system. Namely, the enzyme-labeled ligand has such properties that the enzymatic activity is inhibited after reaction with the binding partner of the ligand. Thus, the ratio of the labeled material in bound form to the labeled material in free form can be determined by measuring the change in the enzymatic activity. The disadvantages of this method are the difficulty in producing well-characterized enzyme-labeled conjugates and the difficulty in finding suitable enzymes. Although many new types of test methods utilizing specific bonds have been proposed and investigated, methods utilizing radioactive substances and various enzyme-labeled conjugates have been the most widely used to date. However, both of these types of processes have obvious disadvantages, since the former process uses mostly radioactive substances, which are dangerous and difficult to handle, and because it is difficult to produce enzyme-labeled conjugates useful in the latter process.
Föreliggande uppfinning avser ett tcstförfarande utnyttjande en specifik bindningsrcaktšon för att 1 ett vätsknmedium bestämma en liaand vild bland antígrner och antikroppar därtill; haptenz. och antikroppar därtill; hormoner, vitaminer, metaboliter och farma- kologiska model samt deras receptorer och bindningssubstanser; vid vilket förfarande man (1) nringar vätskemediet i kontakt med ett reagens innefattande ett märkt konjugat till bildning av on bunden -B> LH OD vß (51 form av det märkta konjugatet och en fri form av det märkia kon- Jugatet, varvid proportionerna mellan den bundna formen och den 'ria formen av det märkta konjugatwt är en funktion av'knneentra- tionen av lígand i vätskemedjet, varefter man (2) mäter mängden närkn'ngssuhntans i den bundna formen eller den fria formen av det kännetecknas enligt uppfinning- "ärkta konjugatet. Detta förfarande en av att en kemiluminiscens-reædant användes såsom märkninge- substans.The present invention relates to a test method utilizing a specific binding reaction for determining in a liquid medium a wild-type wild among antibodies and antibodies thereto; haptenz. and antibodies thereto; hormones, vitamins, metabolites and pharmacological model and their receptors and binding substances; in which process the liquid medium is (1) contacted with a reagent comprising a labeled conjugate to form a bound -B> LH OD vß (51 form of the labeled conjugate and a free form of the labeled conjugate, wherein the proportions between the bound form and the raw form of the labeled conjugate are a function of the concentration of ligand in the liquid medium, after which the amount of proximity substance in the bound form or the free form thereof is characterized according to the invention. This process is one in which a chemiluminescent reedant is used as the labeling substance.
Nedan definieras några av de termerna. Med ligand avses det ämne eller den grupp av ämnen, vars när- varo eller mängd i ett vätskemedium skall bestämmas. Med specifik bind- ningspartner för liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av imnen, som har en specifik bindningsaffinitet till liganden med uteslu- tande av andra ämnen. Med specifik bindningsanalog till liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som uppför sig pà i huvud- sak samma sätt som liganden med avseende pa bindningsaffiniteten till i föreliggande beskrivning använda ligandens specifika bíndningspartner. Kemiluminiscens~reaktan- ten kommer i det följande ofta att kallas enbart reaktant.Some of those terms are defined below. Ligand refers to the substance or group of substances whose presence or amount in a liquid medium is to be determined. By specific binding partner for the ligand is meant any substance or group of substances which has a specific binding affinity to the ligand to the exclusion of other substances. By specific binding analogue to the ligand is meant any substance or group of substances which behaves in substantially the same manner as the ligand with respect to the binding affinity of the specific binding partner of the ligand used herein. In the following, the chemiluminescence reactant will often be called reactant only.
Den nya homogena testtekniken är delvis baserad på det faktum, att reaktionen mellan en ligand och en specifik bindningsparther därför, till en av vilka reaktanten är kopplad, förändrar aktiviteten av reak- tanten i den förutbestämda reaktionen, vilken reaktion sålunda tjänar såsom medel för indikering av den specifika bindningsreaktionen. På ¿rund av detta basfenomen kan olika bindningsmctoder omfattande olika testkompositioner och anordningar användas vid genomförande av förfaran- iet enligt uppfinningen. De föredragna grundmetoderna är tekniken med direkt bindning och tekniken med konkurrerande bindning.The new homogeneous test technique is partly based on the fact that the reaction between a ligand and a specific binding partner therefore, to one of which the reactant is linked, changes the activity of the reactant in the predetermined reaction, which reaction thus serves as a means of indicating the specific binding reaction. On the basis of this basic phenomenon, different bonding methods comprising different test compositions and devices can be used in carrying out the method according to the invention. The preferred basic methods are the direct bonding technique and the competing bonding technique.
O Vid tekniken med direkt bindning bringas ett vätskemedium, som misstänkcs innehålla den ligand som skall påvisas, i kontakt med ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till en specifik.bindnings- partner för liganden, och därefter mätes eventuell förändring i reak- tantens aktivitet. Vid tekniken med konkurrerande bindning bringas väts- kemediet i kontakt med en specifik bindningspartner för liganden och meJ ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till liganden och/eller till en specifik bindningsanalog därtill, och därefter mätes eventuell förändring i reaktantens aktivitet. Vid båda metoderna hestämmes reak- tantens aktivitet genom att vätskemediet bringas i kontakt med åtmin- stone ett reagens, som med reaktanten ger den förutbestämda indikerings- reaktionen. Kvalitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man Jämför en egenskap, vanligen hastigheten, hos den resul- terande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i ett vätskemedium fritt från ligand, varvid eventuell skillnad utgör en indikation på en förändring i reaktantens aktivitet. Kvantitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man Jämför en egenskap hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i vätskemedia innehållande kända mängder av li- ¿anden.In the direct binding technique, a liquid medium suspected of containing the ligand to be detected is contacted with a conjugate comprising the reactant linked to a specific binding partner for the ligand, and then any change in the activity of the reactant is measured. In the competitive binding technique, the liquid medium is contacted with a specific binding partner for the ligand and with a conjugate comprising the reactant coupled to the ligand and / or a specific binding analogue thereto, and then any change in the activity of the reactant is measured. In both methods, the activity of the reactant is inhibited by bringing the liquid medium into contact with at least one reagent which, with the reactant, gives the predetermined indication reaction. Qualitative determination of the ligand in the liquid medium can be done by comparing a property, usually the rate, of the resulting reaction with the corresponding property of the indicating reaction in a liquid medium free of ligand, any difference being an indication of a change in the activity of the reactant. Quantitative determination of the ligand in the liquid medium can be done by comparing a property of the resulting reaction with the corresponding property of the indicating reaction in liquid media containing known amounts of the ligand.
Vid den homogena metoden kan komponenterna i den specifika bindningsreaktionen, dvs. det vätskemedium som misstänkes innehålla ïiganden, konjugatet och/eller en specifik bindningspartner för ligan- den, vanligen kombineras.i vilka som helst mängder, pà vilket som helst sätt och i vilken som helst ordningsföljd, förutsatt att aktiviteten av reaktanten i konjugatet förändras mätbart, när vätskemediet inne- håller liganden i en mängd eller koncentration, som det är av betydelse att bestämma. Alla komponenterna i den specifika bindningsreaktionen ar företrädesvis lösliga i vätskemediet. , När man använder en homogen teknik med direkt bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det vätskemedium, som misstänks innehålla liganden, och en viss mängd av ett konjugat innefattande reaktanten kopplad till en specifik bindningspartner för liganden. Vid kontakt med vätskemediet kommer aktiviteten av den konju- gerade reaktanten att variera omvänt med graden av bindning mellan li- ganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern i konjugatet.In the homogeneous method, the components of the specific binding reaction, i.e. the liquid medium suspected of containing the ligand, the conjugate and / or a specific binding partner for the ligand, is usually combined in any amounts, in any manner and in any order, provided that the activity of the reactant in the conjugate changes measurably, when the liquid medium contains the ligand in an amount or concentration which it is important to determine. All the components of the specific binding reaction are preferably soluble in the liquid medium. Using a direct bond homogeneous technique, the components of the specific binding reaction are the liquid medium suspected of containing the ligand, and a certain amount of a conjugate comprising the reactant is attached to a specific binding partner for the ligand. Upon contact with the liquid medium, the activity of the conjugated reactant will vary inversely with the degree of binding between the ligand in the liquid medium and the specific binding partner in the conjugate.
Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av den konjugerade reaktanten att minska. 451 895 5 När man använder en homogen teknik med konkurrerande bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det väts- kemedium, som misstänkes innehålla liganden, en viss mängd av ett kon- jugat innefattande reaktanten kopplad till liganden eller till en spe- cifik bindningsanalog till liganden, och en viss mängd av en specifik bindningspartner för liganden. Den specifika bindningspartnern bringas i huvudsak samtidigt i kontakt med både konjugatet och vätskemediet.Thus, with increasing amount of ligand in the liquid medium, the activity of the conjugated reactant will decrease. When using a homogeneous technique with competitive binding, the components of the specific binding reaction of the liquid medium suspected of containing the ligand are a certain amount of a conjugate comprising the reactant coupled to the ligand or to a specific binding analog. to the ligand, and a certain amount of a specific binding partner for the ligand. The specific binding partner is brought into contact with both the conjugate and the liquid medium substantially simultaneously.
Eftersom eventuell ligand i vätskemediet konkurrerar med liganden eller dennas specifika bindningsanalog i konjugatet när det gäller hind- ning till den specifika bindningspartnern, kommer aktiviteten av den konjugerade reaktanten att efter kontakt med vätskemediet variera direkt med graden av bindning mellan liganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern. Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av den konjugerade reaktanten att öka.Since any ligand in the liquid medium competes with the ligand or its specific binding analog in the conjugate in terms of inhibition of the specific binding partner, the activity of the conjugated reactant will, after contact with the liquid medium, vary directly with the degree of binding between the ligand in the liquid medium and the specific binding partner. . Thus, with increasing amount of ligand in the liquid medium, the activity of the conjugated reactant will increase.
En variation av den homogena tekniken med konkurrerande bind- ning är den homogena tekniken med förträngningsbindning, där konjugatet först bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern för liganden och därefter bringas i kontakt med vätskemediet. Härvid uppstår konkurr- ens om den specifika bindningspartnern. Vid en dylik metod är den mängd konjugat, som bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern, vanligen så stor, att liganden eller dennas analog i konjugatet före- ligger i överskott över den mängd, som kan bindas till mängden specifik bindningspartner under den tid, som konjugatet och den specifika bind- ningspartnern är i kontakt med varandra före kontakten med det vätske- medium, som misstänkes innehålla liganden. Denna kontaktordning kan uppnås på ettdera av tva lämpliga sätt. Enligt den ena metoden bringas konjugatet i kontakt med den specifika bindningspartnern i en vätske- miljö före kontakten med'det vätskemedium, som misstänkes innehålla liganden. Enligt den andra metoden bringas det vätskemedium, som miss- tänkes innehålla liganden, i kontakt med ett komplex innefattande konju- gatet och den specifika bindningspartnern, varvid den specifika bind- ningssubstansen i konjugatet och den specifika bindningspartnern är reversibelt bundna till varandra. Den mängd konjugat, som blir bunden till den specifika bindningspartnern, vilken föreligger i komplexbund- en form enligt den andra metoden, är vanligen större än den mängd, som kan förträngas av all ligand i vätskemediet under den tid, som den specifika bindningspartnern, eller komplexet, och vätskemediet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell för- ändring i den konjugerade reaktantens aktivitet.A variation of the homogeneous technique of competitive binding is the homogeneous technique of displacement binding, where the conjugate is first contacted with the specific binding partner of the ligand and then contacted with the liquid medium. In this case, competition arises for the specific binding partner. In such a method, the amount of conjugate that is contacted with the specific binding partner is usually so large that the ligand or its analog in the conjugate is in excess of the amount that can be bound to the amount of specific binding partner during the time that the conjugate and the specific binding partner are in contact with each other prior to contact with the fluid medium suspected of containing the ligand. This contact order can be achieved in either of two suitable ways. In one method, the conjugate is contacted with the specific binding partner in a fluid environment prior to contact with the fluid medium suspected of containing the ligand. According to the second method, the liquid medium suspected of containing the ligand is brought into contact with a complex comprising the conjugate and the specific binding partner, the specific binding substance in the conjugate and the specific binding partner being reversibly bound to each other. The amount of conjugate that becomes bound to the specific binding partner, which is present in complexed form according to the second method, is usually greater than the amount that can be displaced by any ligand in the liquid medium during the time that the specific binding partner, or complex, , and the liquid medium are in contact with each other before the determination of any change in the activity of the conjugated reactant is completed.
En annan variant av den homogena tekniken med konkurrerande bindning är den homogena tekniken med stegvis mättning, där komponenter- 451 895 F na i den specifika bindningsreaktionen är desamma som användes vid tek- niken med konkurrerande bindning, men där ordningen av komponenternas tillsättning eller kombination och de relativa mängderna därav är annor- lunda. Enligt tekniken med stegvis mättning bringas den specifika bind- ningspartnern för liganden i kontakt med det vätskemedium, som miss- tänks innehålla ligandcn, under en viss tid före vätskemediets kontakt med konjugatet. Den mängd specifik bindningspartner, som bringas i kon- takt med vätskemediet, är vanligen större än den mängd, som kan binda all den ligand, som antages vara närvarande i vätskemediet, under den tid som den specifika bindningspartnern och vätskemediêt är i kontakt med_varandra, innan vätskemediet bringas i kontakt med konjugatet.Another variant of the homogeneous technique of competitive bonding is the homogeneous technique of stepwise saturation, where the components of the specific bonding reaction are the same as those used in the technique of competing bonding, but where the order of the addition or combination of components and the relative amounts thereof are different. According to the step-by-step saturation technique, the specific binding partner of the ligand is brought into contact with the liquid medium suspected of containing the ligand for a period of time prior to contact of the liquid medium with the conjugate. The amount of specific binding partner that is brought into contact with the liquid medium is usually greater than the amount that can bind all the ligand believed to be present in the liquid medium, during the time that the specific binding partner and the liquid medium are in contact with each other, before the liquid medium is brought into contact with the conjugate.
Mängden ligand eller analog därtill i konjugerad form är dessutom van- ligen större än den mängd, som kan bindas till den kvarvarande obundna mängden av den specifika bindningspartnern under den tid, som vätske- mediet och konjugatet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell förändring i den_konjugerade reaktantens ak- tivitet.In addition, the amount of ligand or analog thereof in conjugated form is usually greater than the amount that can be bound to the remaining unbound amount of the specific binding partner during the time that the liquid medium and the conjugate are in contact with each other before the completion of the determination of possible change in the activity of the_conjugated reactant.
Bestämningen av eventuell förändring i den konjugerade reaktan- tens aktivitet, vilken reaktant utgör en beståndsdel vid den förutbe- stämda indikeringsreaktionen, sker lämpligen genom att den specifika bindningsreaktionsblandningen bringas i kontakt med åtminstone ett ämne, som tillsammans med den konjugerade reaktanten ger den förutbestämda indikeringsreaktionen, och man bestämmer verkan av den specifika bind- ningsreaktionen pá en egenskap hos en dylik indikeringsreaktion.The determination of any change in the activity of the conjugated reactant, which reactant is a component of the predetermined indication reaction, is conveniently effected by contacting the specific binding reaction mixture with at least one substance which together with the conjugated reactant gives the predetermined indicating reaction. and determining the effect of the specific binding reaction on a property of such an indicating reaction.
Användningen av en kemilumíniscens-reaktant såsom märkníngssubstans kan också användas vid de konventionella metoderna av heterogen typ, där den bundna och den fria fasen av den märkta beståndsdelen separeras från varandra, och mängden märkningssubstans bestämmes i endera av dessa faser. Reagenset för genomförande av en dylik heterogen metod kan ha många olika former. Ett dylikt reagens innefattar vanligen tre grund- oestándsdelar, nämligen (1) den ligand som skall påvisas, (2) en spe- cifik bindningspartner för liganden, och (3) en märkt beståndsdel, som vanligen är en märkt form av antingen (a) liganden eller (b) en spebifik oindningsanalog till liganden eller (e) den specifika bindningspartnern Dessa beståndsdelar kan tillsättas samtidigt eller i en viss följd och med en lämplig inkubationsperiod eller lämpliga inkubationsperioder.The use of a chemiluminescent reactant as a labeling substance can also be used in the conventional methods of heterogeneous type, where the bound and the free phase of the labeled component are separated from each other, and the amount of labeling substance is determined in either of these phases. The reagent for carrying out such a heterogeneous method can take many different forms. Such a reagent usually comprises three basic components, namely (1) the ligand to be detected, (2) a specific binding partner for the ligand, and (3) a labeled component, which is usually a labeled form of either (a) ligand or (b) a specific binding analog to the ligand or (e) the specific binding partner These components may be added simultaneously or in a particular sequence and with an appropriate incubation period or periods.
Den märkta bestándsdelen bindes till sin motsvarande konkurrerande bind- ningspartncr, så att graden av bindning, dvs. förhållandet mellan mängd- en märkt beståndsdel bunden till en bindningspartner och mängden obun- den märkt bcstàndsdel, är en funktion av mängden närvarande ligand.The labeled component is bound to its corresponding competing binding partners, so that the degree of binding, ie. the ratio of the amount of a labeled component bound to a binding partner to the amount of unbound labeled component is a function of the amount of ligand present.
Nedan ges en kort beskrivning Lv nägra av dc olika bindningsreaktions- 4-51 895 7 typer, som kan användas vid genomförande av förfarandet enligt före- liggande uppfinning.A brief description is given below of some of the various binding reaction types which may be used in carrying out the process of the present invention.
Under det att vid konventionella heterogena metoder utnyttjande specifika bindningar, såsom metoder utnyttjande radioaktiva ämnen och enzymmärkta konjugat, märkningsegenskaperna hos det märkta konjugatet, såsom radioaktivitet eller enzymatisk aktivitet, är i huvudsak desamma -i den bundna och den fria formen av konjugatet, så påverkas enligt före- liggande uppfinning i vissa fall aktiviteten av reaktanten, dvs. märk- ningssubstansen, genom bindning av det märkta konjugatet. I ett dylikt fall uppvisar indikeringsreaktionen en relativt konstant karaktär, om liganden är frånvarande i vätskemediet eller är närvarande i en mycket liten mängd. Om vätskemediet innehåller ligand, så förändras en egen- skap hos indikeringsreaktionen, såsom ovan har angivits i samband med beskrivningen av den homogena tekniken.While in conventional heterogeneous methods utilizing specific bonds, such as methods utilizing radioactive substances and enzyme-labeled conjugates, the labeling properties of the labeled conjugate, such as radioactivity or enzymatic activity, are essentially the same in the bound and free form of the conjugate, the present invention in some cases the activity of the reactant, i.e. the labeling substance, by binding the labeled conjugate. In such a case, the indication reaction has a relatively constant character, if the ligand is absent in the liquid medium or is present in a very small amount. If the liquid medium contains ligand, then a property of the indication reaction changes, as indicated above in connection with the description of the homogeneous technique.
I de nedan angivna diagrammen användes följande symboler: Symbol L (lim) (exe) Definition ligand som skall påvisas ligand eller specifik bindningsanalog därtill M bindningspartner för liganden märkningssubstans, dvs. reaktant olöslig fas inkubationsperiod efterföljd av lämplig separation begränsad mängd; ämnet närvarande i en mängd mindre än den mängd, som kan bindas till det totala antalet tillgängliga bind- ningsställen under de valda reaktionsbe- tingelserna under den valda inkubations- perioden; dvs. den beståndsdel, om vilken de andra beståndsdelarna konkurrerar. överskottsmängd; ämnet närvarande i en_ mängd större än den mängd, som kan bindas till det totala antalet tillgängliga bind- ningsstallen under de valda reaktionsbe- tingelserna under den valda inkubations- perioden. ^ íl) Heterogcn teknik med konkurrerande bindning. (a) L + (š)*+ B(lim)--+ + insolubiliseringsmedel för B eller (Ef Detta är den klazsíska metoden med konkurrerande bindning.In the diagrams given below, the following symbols were used: Symbol L (glue) (exe) Definition ligand to be detected ligand or specific binding analog in addition M binding partner for the ligand labeling substance, ie. reactant insoluble phase incubation period followed by appropriate separation limited amount; the substance present in an amount less than the amount that can be bound to the total number of binding sites available during the selected reaction conditions during the selected incubation period; i.e. the component for which the other components compete. excess amount; the substance present in an amount greater than the amount that can be bound to the total number of available binding moieties during the selected reaction conditions during the selected incubation period. ^ íl) Heterogeneous technology with competing binding. (a) L + (š) * + B (glue) - + + insolubilizer for B or (Ef This is the classical method of competing bonding.
Såsom exempel på användbara insoluhiliseringsmedel kan 451 895 8 man nämna specifika utfällnings-antikroppar, specifika insolubíliserade antikroppar, och, om B eller ()* är ett proteinmaterial, proteínutfällningsmedel, såsom ammonium- sulfat, och, om B eller (:)'är en liten adsorberbar mole- kyl, dextranbelagt träkol. Beskrivning av liknande system återfinncs 1 Biochem. J. 88:13? (196)) och i_den amerikan- ska patentskriften 3.859.155. (b) L + @*+ 1- s(11m)---> Denna metod kallas vanligen metoden med fast fas. I de amerikanska patentskrifterna 5.505.019, 5.555.143, 3.646.546 och 3.654.090 beskrives liknande metoder utnytt- jande radioaktiva ämnen och enzymmärkta konjugat. (e) L + n* + |-@(11m)-____> Referens: U.S. Patent Nr. 3.654.090. (d) 1. + -L + n* (11m)----> Referens: U.S. Patent Nr. 5.850.752. ífi) Heteromen teknik med stegvis mättning. (a) L + B(exc)--Q-+ (ï)*(ex )-->+-insolubiliseringsmedel för B eller (iàí ' Vid tekniken med stegvis mättning bíndes den märkta be- stàndsdelen till en del av eller alla de bindningsställen pá B, som finns kvar efter den första inkubationsperioden. (b) L-+ 1- B(exe)--+ + (É)¥(exc)---> 7 I den amerikanska patentskriften 3.720.760 och i J. Immu- nol. 209:l2Q (1972) beskrivas liknande metoder utnyttjande radioaktiva-ämnen och enzymmärkta konjugat. (c) L + B*(exc)--++ (5) 'Heterogen teknik av sandwich-typ.Examples of useful insolubilizers are specific precipitating antibodies, specific insolubilized antibodies, and, if B or () * is a protein material, protein precipitating agents such as ammonium sulfate, and, if B or (:) 'is a small adsorbable molecule, dextran-coated charcoal. Description of similar systems can be found in Biochem. J. 88:13? (196)) and U.S. Pat. No. 3,859,155. (b) L + @ * + 1- s (11m) ---> This method is usually called the solid phase method. U.S. Patent Nos. 5,505,019, 5,555,143, 3,646,546 and 3,654,090 disclose similar methods utilizing radioactive substances and enzyme-labeled conjugates. (e) L + n * + | - @ (11m) -____> Reference: U.S. Pat. Patent no. 3,654,090. (d) 1. + -L + n * (11m) ----> Reference: U.S. Pat. Patent no. 5,850,752. í fi) Heterogeneous technology with stepwise saturation. (a) L + B (exc) - Q- + (ï) * (ex) -> + insolubilizer for B or (iàí 'In the stepwise saturation technique, the labeled component was bound to some or all of the the binding sites on B which remain after the first incubation period. (b) L- + 1- B (exe) - + + (É) ¥ (exc) ---> 7 In U.S. Pat. No. 3,720,760 and in J. Immunol. 209: 12Q (1972) describes similar methods using radioactive substances and enzyme-labeled conjugates. (C) L + B * (exc) - ++ (5) 'Heterogeneous sandwich-type technique.
L + B(exc)-->B (exe)--> Vid sandwich-metoden bindes den märkta bestàndsdelen till några av eller alla de ligandmolekyler, som är bundna till den insolubíliserade bindningspartnern.L + B (exc) -> B (exe) -> In the sandwich method, the labeled component binds to some or all of the ligand molecules that are bound to the insolubilized binding partner.
Referens: amerikanska patentskriften 5.720.760. (4) Hcteroncn teknik med utspädning av fast fas.Reference: U.S. Patent No. 5,720,760. (4) Hcteroncn technology with solid phase dilution.
L + <:Y-+ (icke-specifik)--_++ B(1im)---Q Vid denna metod bindes liganden och den märkta bestånds- delen till en icle-specifik bindningssubstans, och däreftcr 9 frigöres proportionella mängder därifrån genom bindning till en bindningspartner, som har en större affinitet till liganden och den märkta bestàndsdelen. Vid den mest användbara utföringsformen av denna teknik använder man en kolonn av den icke-specifika bindningssubstansen, så- som heskrives i den amerikanska patentskriften j.659.lOü, En dylik teknik är användbar, om liganden bindes till en- dogena bindningssubstanser i provet, eftersom dylika sub- stanser skulle störa den konkurrerande bindningsreaktionen, om de icke avlägsnades. Efter det att de endogena bind- - ningssubstanserna har bundits till den icke-specifika bind- I' ningssubstansen, kan de avlägsnas genom lämplig tvättning.L + <: Y- + (non-specific) --_ ++ B (1im) --- Q In this method, the ligand and the labeled component are bound to an icle-specific binding substance, and then proportional amounts are released therefrom by binding to a binding partner which has a greater affinity for the ligand and the labeled component. In the most useful embodiment of this technique, a column of the non-specific binding substance is used, as described in U.S. Patent No. 659,101. Such a technique is useful if the ligand binds to endogenous binding substances in the sample. since such substances would interfere with the competing binding reaction if they were not removed. After the endogenous binding substances have been bound to the non-specific binding substance, they can be removed by suitable washing.
För ytterligare upplysningar om den konventionella, heterogena tekniken, såsom mera detaljerade beskrivningar av testsystem och alter- nativa separationsmetoder, kan man hänvisa till Principles of Competi- tive Protein-Binding Assays, Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972).For further information on conventional heterogeneous techniques, such as more detailed descriptions of test systems and alternative separation methods, see Principles of Competitive Protein-Binding Assays, Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972).
Inom ramen för föreliggande uppfinning kan man naturligtvis genomföra homogena och heterogena testförfaranden innefattande andra nindningsreaktionssystem och annan ordningsföljd av komponenternas till- sättning. ' De reaktionsbestándsdelar, vilka tillsammans med reaktanten i konjugatet ger den förutbestämda indikeringsreaktionen, kan enligt den homogena metoden bringas i kontakt med den specifika bindningsreaktions- olandningen oeh'enligt den heterogena metoden bringas i kontakt med antingen den bundna eller den fria fasen efter separation av faserna frán varandra. Nämnda reaktionsbeståndsdelar kan tillsättas antingen var för sig eller i vilken som helst kombination och antingen före, «amtidigt med eller efter initiering av den specifika bindningsreaktion- en. Efter initiering av den specifika bindningsreaktionen inkuberas vanligen reaktionsblandningen, som kan innehålla några av eller alla de nödvändiga komponenterna för indikeringsreaktionen, under en förutbe- stämd tidsperiod, innan man bestämmer eventuell förändring i aktiviteten av reaktanten i konjugatet (homogen teknik) eller mängden reaktantaktivr tet i de separerade faserna (heterogen teknik). Efter inkuberingsperio- den sätter man till reaktionsblandningen eventuella komponenter, vilka är nödvändiga för indikeringsreaktionen och vilka icke redan är närva- rande i tillräckliga mängder i reaktionsblandningcn, och indikerings- reaktionen studeras för indikation av närvaro eller mängd av liganden 1 vätskemediet. s CW ._ .x RÖ (TI 10 Indikeringsreaktionen enligt uppfinningen är en lumi- niscerande reaktion, företrädesvis enzymkatalyserad, nämligen en reaktion uppvisande ett kemiluminisceringsfenomen_ Reaktanten i konjugatet är en reaktant i den ljusalstrande reaktionen.Within the scope of the present invention, it is of course possible to carry out homogeneous and heterogeneous test procedures involving other winding reaction systems and a different order of addition of the components. The reactants which, together with the reactant in the conjugate, give the predetermined indication reaction can be contacted by the homogeneous method according to the specific binding reaction scheme, or the heterogeneous method can be contacted with either the bound or the free phase after separation of the phases. apart. Said reactants may be added either singly or in any combination and either before, at the same time as or after initiation of the specific binding reaction. After initiation of the specific binding reaction, the reaction mixture, which may contain some or all of the necessary components for the indication reaction, is usually incubated for a predetermined period of time, before determining any change in the activity of the reactant in the conjugate (homogeneous technique) or the amount of reactant activity in the separated phases (heterogeneous technique). After the incubation period, any components which are necessary for the indication reaction and which are not already present in sufficient amounts in the reaction mixture are added to the reaction mixture, and the indication reaction is studied to indicate the presence or amount of the ligand in the liquid medium. The indicator reaction according to the invention is a luminescent reaction, preferably enzyme-catalyzed, namely a reaction having a chemiluminescence phenomenon. The reactant in the conjugate is a reactant in the light-generating reaction.
Eventuell förändring i den konjugerade reaktantens aktivitet till följd av den specifika bindningsreaktionen åstadkommer en förändring i ljusalstringshastigheten eller i den totala mängden, toppintensiteten eller karaktären av det alstrande ljuset. Exem- pel pà luminiscerande reaktionssystem ges i nedanstående tabell A.Any change in the activity of the conjugated reactant due to the specific binding reaction causes a change in the rate of light generation or in the total amount, peak intensity or character of the light generated. Examples of luminescent reaction systems are given in Table A below.
I denna tabell betecknar hv elektromagnetisk strålning, vanligen i det ínfraröda, synliga eller ultravioletta området. 11 Hnnfiñøflowfiflofiflfivflomfl Hoflfimmonha omnmonwwh Hocflfiflfi uwnmuflfimn fioflflmwomha vmnwofiwon Honflfiflfl nmßmuñnwn vcßuxmwu Umumm5.c0m mmflmumx.nmHHmx NZ + umflmumocwäm + v:mIlll||ll.mox + Hocfifisflowfl N4 + umflmwioflflëm + vs Allllllllllllll omm + fiocflfisflomfi . n . mmnfikonwaouxmfl _ . 1 0 mmüßhfl Umkm HNO + - 4|!lIflI|| OO + Mofl mmøhmfl flflhmoñvmh . v. 7 _ wmnmuæwo Hocflfiflfl wmnmvflxo + vn Alwmmmmwmm No + Hoßflñsfl Ummmonumn omm r floflflmmohnm Umnwnflmo + vx mlflflflflflflfld momm + floflflmwuhæa Umnmomnmn üüfiw» w-ACSO/L w N u O .T HUCHHÜH ÜMrmmwm-LMWWO .T + .mfiflflmhflfl ÜWLOUÜÜÜL Ewuwæwmcofluxmwu mflcmuwomflcfiëøq 4 Hfiwnmfi _13:- "l -\ :n xD (II 12 För ytterligare uppgifter om användbara luminiscerande reaktions- system kan man hänvisa till Följande litteraturställen: J. Biol. Chem. 256:48 (1961).In this table, hv denotes electromagnetic radiation, usually in the infrared, visible or ultraviolet range. 11 Hnn fi Nô fl ow fifl o fiflfi v fl about al Ho flfi mmonha omnmonwwh Hoc flfiflfi uwnmu flfi mn f o flfl mwomha vmnwo fi won She flfiflfl nmßmuñnwn vcßuxmwu Umumm5.c0m mm al mumx.nmHHmx NZ + um al mumocwäm + v: mIlll || ll.mox + Hoc fifi p fl ow al N4 + um al mwio flfl EM + vs Allllllllllllll iff + f oc flfi p f about f. n. mmn fi konwaouxm fl _. 1 0 mmüßh fl Umkm HNO + - 4 |! LI fl I || OO + Mo fl mmøhm fl flfl hmoñvmh. v. 7 _ wmnmuæwo Hoc flfiflfl wmnmv al xo + vn Alwmmmmwmm No + Hoess al NS al Ummmonumn iff r fl o flfl mmohnm Umnwn al Mo + vx ml flflflflflflfl d momm + fl o flfl mwuhæa Umnmomnmn üü f w »w ACSO / L w N u O .T HUCHHÜH ÜMrmmwm-LMWWO .T + .m fiflfl MH flfl ÜWLOUÜÜÜL Ewuwæwmco al uxmwu et al cmuwom f c f EOQ 4 H fi wnm fi _13: - "l - \: n xD (II 12 For further information on useful luminescent reaction systems, please refer to the following references: J. Biol. Chem. 256: 48 (1961).
J. Amer. Chem. Soc. 89:}9H4 (1967).J. Amer. Chem. Soc. 89:} 9H4 (1967).
Cornicr et al., Bioluminescense in Progress, ed. Johnson et al., Princeton University Press (New Jersey, 1966) p. }6}-BU.Cornicr et al., Bioluminescence in Progress, ed. Johnson et al., Princeton University Press (New Jersey, 1966) pp.} 6} -BU.
Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, doktorsavhandling,University of Georgia (1967).Kries, P. Purification and Properties of Renilla Luciferase, Ph.D., University of Georgia (1967).
Am. J. Physiol. 4111:51: (1916). ' _ Biol. Bull. 51:89 (1926).Am. J. Physiol. 4111: 51: (1916). '_ Biol. Bull. 51:89 (1926).
"J. moi. Chem. zlßflrziu (1968)."J. moi. Chem. Zlß fl rziu (1968).
Ett reaktionssystem, som särskilt föredrages för indikering av den nya specifika bindningsreaktionen enligt uppfinningen, är ett cyk- liskt system (kretsloppssystem). I ett dylikt system är en produkt i en första reaktion en reaktant i en andra reaktion, och i den andra reaktionen är en av produkterna en substans, som också är en reaktant i den första'reaktionen.A reaction system which is particularly preferred for indicating the new specific binding reaction according to the invention is a cyclic system (cycle system). In such a system, a product in a first reaction is a reactant in a second reaction, and in the second reaction one of the products is a substance which is also a reactant in the first reaction.
Nedanstående diagram illustrerar ett dylikt cykliskt reaktions- system: I produkter A kretsloppsgående material reaktanter B (Form l) REAKTION A REAKTION B L reaktanter A kretsloppsgàende material produkter B (form 2) I ovanstående cykliska reaktionssystem alstrar en liten mängd kretsloppsgäende material stora mängder av produkterna A och B, om till- räckliga mängder av reaktnnterna A och B är närvarande. Eftersom reak- tionshastigheten och mängden produkt bildad av reaktionerna i det cyk- liska reaktionssystemet är mycket känsliga för mängden kretsloppsgàen- de material, förcdrager man att använda det krctsloppsgàende materialet såsom reaktant i konjugatet enligt föreliggande uppfinning. ..,'.”~». en ...à oo -Q en 13 Föreliggande uppfinning kan användas för att påvisa vilken som helst ligand, för vilken det finns en specifik bindningspartner. Ligan- den är vanligen en peptid, ett protein, ett kolhydrat, ett glykoprotein, en steroid eller någon annan organisk molekyl, för vilken en specifik bindninßspartner existerar i biologiska system eller kan syntetiseras. figanden väljes vanlinen bland antigener och antikroppar därför; hapte- ner och antikroppar därför; hormoner; vitaminer, metaboliter och farma- kologiska medel, samt receptorer och bindningssubstanser därför. Såsom specifika exempel på lígander, vilka kan påvisas med hjälp av förfaran- det enligt uppfinningen, kan man nämna hormoner, såsom insulin, korion- gonadotropin, tyroxin, liotyronin och estriol; antigener och haptener, såsom ferritin, bradykinin, prostaglandiner och tumörspecifika antige- ner; vitaminer, såsom biotin, vitamin B12, folinsyra, vitamin E och askorbinsyra; metaboliter, såsom 3',5'-adenosinmonofosfat och 3',5'- ñuanosinmonofosfat; farmakologiska medel, såsom dilantin, digoxin, morfin, digitoxin och barbiturater; antikroppar, såsom mikrosomala anti- kroppar och antikroppar till hepatit och allergener; och specifika bindningsreceptorer, såsom tyroxinbindande globulin, avidin, hemogenas och transkobalamin. - I konjugatet enligt föreliggande uppfinning är reaktanten kopp- lad eller bunden till en specifik bindningssubstans, vilken beroende på det valda testsystemet kan utgöras av liganden, en specifik bindnings- analog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden, så att en mïtbar mängd reaktantaktivitct kvarhàllcs. Bindningen mellan reaktanten och den specifika bindningssubstansen förstöres eller påverkas av den valda indikeringsreaktíonen såsom ett medel för bestämning av förändringen i reaktantens aktivitet.The diagram below illustrates such a cyclic reaction system: In products A cyclic material reactants B (Form 1) REACTION A REACTION BL reactants A cyclic material products B (Form 2) In the above cyclic reaction system, a small amount of cyclic material A produces large amounts of products and B, if sufficient amounts of reactants A and B are present. Since the rate of reaction and the amount of product formed by the reactions in the cyclic reaction system are very sensitive to the amount of cyclic material, it is preferred to use the cyclic material as the reactant in the conjugate of the present invention. .., '. ”~». The present invention can be used to detect any ligand for which there is a specific binding partner. The ligand is usually a peptide, a protein, a carbohydrate, a glycoprotein, a steroid or any other organic molecule, for which a specific binding partner exists in biological systems or can be synthesized. the figure selects the vanline among antigens and antibodies therefore; haptens and antibodies therefore; hormones; vitamins, metabolites and pharmacological agents, as well as receptors and binding substances therefore. As specific examples of ligands which can be detected by the method of the invention, there may be mentioned hormones such as insulin, chorionic gonadotropin, thyroxine, liotyronine and estriol; antigens and haptens, such as ferritin, bradykinin, prostaglandins and tumor-specific antigens; vitamins such as biotin, vitamin B12, folic acid, vitamin E and ascorbic acid; metabolites such as 3 ', 5'-adenosine monophosphate and 3', 5'-nuanosine monophosphate; pharmacological agents such as dilantin, digoxin, morphine, digitoxin and barbiturates; antibodies, such as microsomal antibodies and antibodies to hepatitis and allergens; and specific binding receptors, such as thyroxine binding globulin, avidin, hemogenase and transcobalamin. In the conjugate of the present invention, the reactant is coupled or bound to a specific binding substance, which depending on the test system selected may be the ligand, a specific binding analog to the ligand or a specific binding partner for the ligand, so that a measurable amount of reactant activity is retained. . The bond between the reactant and the specific binding substance is destroyed or affected by the selected indication reaction as a means of determining the change in the activity of the reactant.
Rcaktanten kan vara direkt kopplad till den specifika b1ndning5_ Isubstansen, så att konjugatets molekylvikt är mindre än eller lika med den sammanlagda molekylvikten för reaktanten och den specifika bindning» substansen. Vanligen är emellertid reaktanten och den specifika bind- ningssubstansen förbundna med varandra genom en brygg-èrupp innehållande :-50, företrädesvis 1-10, kolatomer eller heteroatomer, såsom kväveato- mer, syrcatomer, svavelatomer, fosforatomer, osv. Såsom exempel på en Orygß-Krupp innehållande en enda atom kan man nämna en metylengrupp (1 kolatom) och en aminogrupp (l hetercatom). Brygß-gruppen har vanligen en molekylvikt, som icke överstiger 1000 och företrädesvis är lägre än ¿0O. Brygg-gruppen innehåller en kedja av kolatomor eller heteroatomer 451 14 eller en kombination av bådadera, och den är förbunden med reaktanten och den specifika bindningssubstansen, eller ett aktivt derivat därav, genom en sammanhindnnde grupp, som vanligen utgöres av en estergrupp, en amidogrupp, en etergrupp, en tioestergrupp, en tioetergrupp; en ace- talgrupp, en metylengrupp eller en aminogrupp.The reactant may be directly linked to the specific binding substance, so that the molecular weight of the conjugate is less than or equal to the total molecular weight of the reactant and the specific binding substance. Usually, however, the reactant and the specific binding substance are connected to each other by a bridging group containing: -50, preferably 1-10, carbon atoms or heteroatoms, such as nitrogen atoms, oxygen atoms, sulfur atoms, phosphorus atoms, etc. Examples of an Orygß-Krupp containing a single atom are a methylene group (1 carbon atom) and an amino group (1 heteroatom). The Brygß group usually has a molecular weight not exceeding 1000 and preferably lower than 0O. The bridge group contains a chain of carbon atoms or heteroatoms or a combination of both, and it is linked to the reactant and the specific binding substance, or an active derivative thereof, by a cohesive group, which is usually an ester group, an amido group, an ether group, a thioester group, a thioether group; an acetal group, a methylene group or an amino group.
Enligt en utförinfisform av uppfinningen föreligger de komponen- ter i det specifika bindningsreaktionssystemet, vilka skall kombineras med det vätskemedium som misstänkes innehålla liganden, i flytande eller fast form. Enligt den föredragna homogena tekniken föreligger komponen- terna vanligen i lösning eller i en fast form, som lätt kan lösas i vdtskemediet. Eftersom det vütskemedíum som skall testas vanligen är vattenhaltigt, föreligger komponenterna vanligen i vattenlöslig form, dvs. antingen i en vattenlösning eller i en vattenlöslig, fast form, såsom ett pulver eller ett harts. Testförfarandet kan genomföras i ett vanligt laboratoriekärl, såsom ett provrör, varvid komponenterna för den specifika bindningsreaktionen och komponenterna för indikeringsreak- tionen tillsättes i fast eller flytande form.According to one embodiment of the invention, the components of the specific binding reaction system, which are to be combined with the liquid medium suspected of containing the ligand, are in liquid or solid form. According to the preferred homogeneous technique, the components are usually in solution or in a solid form, which can be easily dissolved in the liquid medium. Since the liquid medium to be tested is usually aqueous, the components are usually in water-soluble form, i.e. either in an aqueous solution or in a water-soluble solid form, such as a powder or a resin. The test procedure can be carried out in an ordinary laboratory vessel, such as a test tube, the components of the specific binding reaction and the components of the indicating reaction being added in solid or liquid form.
En eller flera nv komponenterna för den specifika bindningsreak- tionen och/eller en eller flena av komponenterna för indiker1ngsreaktion~ ““ en kan dessutom införlivas med en bärare. En dylik bärare kan vara ett kirl, såsom ett provrör eller en kapsel innehållande en dylik komponent eller dylika komponenter i en inre del därav, t.ex. i form av en vätska eller ett luekert fast ämne eller en beläggning på kärlets inneryta.In addition, one or more of the nv components for the specific binding reaction and / or one or more of the components for the indication reaction may be incorporated into a carrier. Such a carrier may be a kirl, such as a test tube or a capsule containing such a component or components in an inner part thereof, e.g. in the form of a liquid or a liquid solid or a coating on the inner surface of the vessel.
Lnligt en annan utföringsform kan bäraren föreligga 1 form av en matris, som är olöslim och porös, och som företrädesvis kan absorbera det väts- kemedium som provas. En dylik matris kan vara ett fuktighetsabsorberan- 'de papper, en polymerfilm, ett membran, ett flor, ett block, ett gel, etc. I en dylik form utgör matrisen ett lämpligt medium för kontakt med det vätskemedium som skall provas, för genomförande av den specifika bindninesreaktionen och/eller indikeringsreaktionen, och för iakttagande av det resulterande gensvaret.According to another embodiment, the carrier may be in the form of a matrix which is insoluble and porous, and which may preferably absorb the liquid medium being tested. Such a matrix may be a moisture-absorbent paper, a polymer film, a membrane, a flor, a block, a gel, etc. In such a form, the matrix constitutes a suitable medium for contact with the liquid medium to be tested, for carrying out the specific binding reaction and / or indication reaction, and for observing the resulting response.
U Det vätskemedium, som skall provas, kan vara en naturligen före- kommande eller pá konstgjord väg framställd vätska, som misstänkes inne- hålla liganden. Vätskemediet är vanligen en biologisk vätska eller en vätska erhàllen genom utspädning eller annan behandling av en biologisk vätska. Såsom exempel pà biologiska vätskor, vilka kan testas enligt föreliggande uppfinning, kan man nämna serum, plasma, urin och amnio- .vi s) 4-51 895 15 tiska, eerebrala och spinala vätskor. Man kan även analysera andra ma- terial, såsom Fasta ämnen, t.ex. vävnader, eller gaser, om dessa materi- al först överföres i vätskeform, t.ex. genom upplösning av det fasta ämnet eller gasen i en vätska eller genom vätskeextraktion av det fasta ämnet.U The liquid medium to be tested may be a naturally occurring or artificially produced liquid which is suspected to contain the ligand. The liquid medium is usually a biological fluid or a fluid obtained by dilution or other treatment of a biological fluid. Examples of biological fluids which can be tested according to the present invention include serum, plasma, urine and amniotic fluid, eerebral and spinal fluids. You can also analyze other materials, such as solids, e.g. tissues, or gases, if these materials are first transferred in liquid form, e.g. by dissolving the solid or gas in a liquid or by liquid extraction of the solid.
I motsats till de förut kända homogena metoderna kan biologiska vätskor, vilka innehåller substanser med reaktantaktivitet liknande eller identiska med aktiviteten av den konjugerade märkningssubstansen, analyseras för bestämning av en ligand utan bakgrundsstörning. Endogen bakgrundsaktivitet kan lätt elimineras på flera sätt. Den biologiska vatskw1kan behandlas för selektiv förstöring av den endogena reaktant- aktiviteten. En dylik behandling kan ske med hjälp av ett medel, vilket kemiskt förstör den endogena aktiviteten, varefter man inaktiverar det använda medlet.In contrast to the previously known homogeneous methods, biological fluids which contain substances with reactant activity similar or identical to the activity of the conjugated label substance can be analyzed to determine a ligand without background disturbance. Endogenous background activity can be easily eliminated in several ways. The biological water quail can be treated for selective destruction of the endogenous reactant activity. Such treatment can take place with the aid of an agent, which chemically destroys the endogenous activity, after which the agent used is inactivated.
Uppfinningen illustreras genom följande, icke begränsan- de exempel. §šemQel_l. Framställning av biotin-isoluminol-konjugat. 6-(š~biotionoylamido-2-hydroxipropylamino)-2,5-dihydroxiftala- zin-1,4-dion.The invention is illustrated by the following, non-limiting examples. §ŠemQel_l. Preparation of biotin-isoluminol conjugate. 6- (β-Biotionoylamido-2-hydroxypropylamino) -2,5-dihydroxyphthalazine-1,4-dione.
(A) 4-(5-klor-2-hydroxipropylamino)-H-metylftalimid. 25 gram (0,lU2 mol) 4-amino-N-metylftnlamid, framställd enligt den metod som beskrives 1 J. Chem. Soe. 26: (l9j7), och 20,7 gram (O,2l mol) l-klor-2,3-epoxipropan sattes till 150 ml 2,2,2-trifluor- etanol; varefter den erhållna reaktionsblnndningen kokades under åter- flöde och under omrörning i H8 timmar. YO-HO ml 2,2,2-trifluoretanol zvlägsnades genom destillering, varvid en tung gul fällning bildades, när den kvarvarande lösningen kyldes till rumstemperatur. Denna fäll- ning revs med etylaeetat, nvskiljdes genom Filtrering och torkades. Man erhöll härvid 29,5 gram (utbyte 77 %) av den önskade mellanprodukten med en smältpunkt av lj6-lj3,5°C.(A) 4- (5-chloro-2-hydroxypropylamino) -H-methylphthalimide. 25 grams (0.1U2 mol) of 4-amino-N-methylphenamide, prepared according to the method described in J. Chem. Soe. 26: (19j7), and 20.7 grams (0.2 mol) of 1-chloro-2,3-epoxypropane were added to 150 ml of 2,2,2-trifluoroethanol; after which the resulting reaction mixture was boiled under reflux and with stirring for H8 hours. YO-HO ml of 2,2,2-trifluoroethanol was removed by distillation to give a heavy yellow precipitate when the residual solution was cooled to room temperature. This precipitate was triturated with ethyl acetate, separated by filtration and dried. 29.5 grams (yield 77%) of the desired intermediate were obtained, m.p.
Beräknat För C12H13ClN2O3: c 53,614,- n 4,88,- n 10,115 Funnet: C 55,37; H 4,ö”; N lu,8l. -5> C71 -A CD _f"\ ß *a 16 (B) 4-/É-(N-ftalimido)-2-hydroXipropylamino7-N-metylftalimid. 15,5 gram (0,05 mol) av den i steg (A) framställda mellanproduk- zen och 15,7 gram (0,085 mol) kaliumftalimid i 150 ml dimetylformamid kokades under áterflöde och under omrörning i 24 timmar. Dimetylforma- miden avlägsnades, och återstoden tvättades med vatten och Filtrerades.Calculated for C 12 H 13 ClN 2 O 3: c 53.614, - n 4.88, - n 10.115 Found: C 55.37; H 4, ö ”; N lu, 8l. 16 (B) 4- [E- (N-phthalimido) -2-hydroxypropylamino] -N-methylphthalimide. 15.5 grams (0.05 mol) of it in step (A) prepared the intermediate and 15.7 grams (0.085 moles) of potassium phthalimide in 150 ml of dimethylformamide were refluxed and stirred for 24 hours, the dimethylformamide was removed, and the residue was washed with water and filtered.
Qen gula filterknkan omkristalliserndes i en blandning av ättiksyra och vatten, varvid man erhöll 12,8 gram (utbyte 67 %) av den önskade produk- ten med en smältpunkt av 2H7-2U8,5oC. ' " f- W -70 : Beraknit for C2OH17N) 5 c 63,32,- H 11,52,- N 11,08 Funnet: C 6},l6; H 5,33; N 10.93.The yellow filter gel was recrystallized from a mixture of acetic acid and water to give 12.8 grams (yield 67%) of the desired product, m.p. 2H7-2U8.5 ° C. F-W -70: Calcd for C 2 OH 17 N) 5 c 63.32, - H 11.52, - N 11.08 Found: C 6}, 16; H 5.33; N 10.93.
(C) 6-/É-amino-2~hydroxipropylnmino7-2,j-dihydroFta]azin-l,4- dion.(C) 6- [1-Amino-2-hydroxypropylmino] -2,2-dihydrophthalazine-1,4-dione.
En blandning av 5,0 gram (lj,2 mmol) av den i steg (B) erhållna mellanproduktcn, 90 ml absolut etanol och jß ml 95 %-lg hydrazin koka- des under àterflödc och under omrörning 1 H timmar. Lösningsmedlet av- lägsnades därefter i vakuum, och det resulterande fasta ämnet torkades under 2ü timmer vid 12000 under vakuum. Det Fdstn ämnet omrördes sedan -s under 1 timme med 70 ml 0,1 N saltsyra. Den olösliga 2,}-dihydroxifta1- azin~1,4-dionen avlägsnades genom filtrering, och filtratets pH-värde inctälldes på 6,5 med mättad nntriumbikarbonitlösning. Den härvid bil- dade vita fällníngcn avskiljdes genom Filtrering och torkades, varvid en erhöll 2,2 gram produkt (utbyte 67 %). Efter omkristallisering i vïtten smälte produkten vid 27}oC under sönderdelning.A mixture of 5.0 grams (μl, 2 mmol) of the intermediate obtained in step (B), 90 ml of absolute ethanol and 5 ml of 95% hydrazine was boiled under reflux and with stirring for 1 hour. The solvent was then removed in vacuo, and the resulting solid was dried for 2 hours at 12,000 under vacuum. The first substance was then stirred for 1 hour with 70 ml of 0.1 N hydrochloric acid. The insoluble 2,4-dihydroxyphthalazine-1,4-dione was removed by filtration, and the pH of the filtrate was adjusted to 6.5 with saturated sodium bicarbonite solution. The white precipitate thus formed was separated by filtration and dried to give 2.2 grams of product (yield 67%). After recrystallization from the white, the product melted at 27 DEG C. with decomposition.
Beräknwt För C11Hl"N203: C 52,79; H 5.6U; N 22,59 Funnet: C 52,7}; H 5,72; N 22,5".Calculated for C 11 H 11 N 2 O 3: C 52.79; H 5.6U; N 22.59 Found: C 52.7}; H 5.72; N 22.5 ".
(D) Biotin-isoluminol-konjugat_ __ 0,29 gram (1,2 mmol) biotin och 0,17 ml trietylamin löstes i JO ml torr dimctylformamid under vattenfria betingelser, varefter lös- ningen kyldes till -1000. En lösning av 0,141 ml etylkloroformiat i 2,86 ml eter tillsattes därefter långsamt, och den erhållna reaktions- nlandningen omrördes under 30 minuter. En bildad fällning avskiljdes genom Filtrering. Till filtratet sattes därefter snabbt en suspension oestáende av 600 mg (2,4 mmol) av den i steg (C) framställda mellanpro- dukten, 20 ml torr dímctylformamid och l ml torr pyridin. Den erhållna 17 reaktionsblandnlngen omrördes vid -1000 under 50 minuter och sedan vid rumstemperatur över natten. Under denna tid erhölls en lösning. Dimetyl- Formamiden ivlägsnades genom destillation vid 6000 och 0,10 mm Hg. Den oljíga återstoden omrördes under l timme med 50 ml O,l N saltsyra. Det härvid bildade vita fasta ämnet avfiltrerades och tvättades med 0,1 N saltsyra och sedan med vatten. Efter torkning under vakuum vid rumstem- peratur över natten erhölls 0,55 gram (utbyte 97 %) av den önskade pro- dukten med en smältpunkt av 170-17300.(D) Biotin-isoluminol conjugate - 0.29 grams (1.2 mmol) of biotin and 0.17 ml of triethylamine were dissolved in 10 ml of dry dimethylformamide under anhydrous conditions, after which the solution was cooled to -1000. A solution of 0.141 ml of ethyl chloroformate in 2.86 ml of ether was then added slowly, and the resulting reaction landing was stirred for 30 minutes. A formed precipitate was separated by filtration. To the filtrate was then rapidly added a suspension consisting of 600 mg (2.4 mmol) of the intermediate prepared in step (C), 20 ml of dry dimethylformamide and 1 ml of dry pyridine. The resulting reaction mixture was stirred at -1000 for 50 minutes and then at room temperature overnight. During this time a solution was obtained. Dimethylformamide was removed by distillation at 6000 and 0.10 mm Hg. The oily residue was stirred for 1 hour with 50 ml of 0.1 N hydrochloric acid. The resulting white solid was filtered off and washed with 0.1 N hydrochloric acid and then with water. After drying under vacuum at room temperature overnight, 0.55 grams (yield 97%) of the desired product with a melting point of 170-17300 were obtained.
Beräknat för C2lH28N6O5S: C 52,92; H 5,92; N l7,6H Famnet; c 51,69,- n 5,90,- N 17,63.Calculated for C 21 H 28 N 6 O 5 S: C 52.92; H 5.92; N 17.6H Famnet; c 51.69, - n 5.90, - N 17.63.
Exempel 2. Homogen kemiluminiscens-metod med konkurrerande nindníng för bestämning av biotin.Example 2. Homogeneous chemiluminescence method with competitive biotin determination.
Det i detta exempel använda kemiluminiscens-reaktionssystemet var baserat på följande reaktion: biotin-isoluminol + KO, ---------à biotin-aminoftalat + N? + hv Man framställde sexton bindningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av l50/ul och innehöll 0,1 M tris-(hydroxi- metyl)aminometan-hydroklorid (nd 8,0), 42 mM biotin-luminol-konjugat (framställt enligt exempel 1), hiotin i den i nedanstående tabell 1 an- mivna koncentrationen och 0,l2 enheter avidin per milliliter (tillsatt sist). Efter inkubering vid 2500 under 5 minuter satte man till varje reaktionsblandning 10/ul dimetylformamid innehållande 0,15 M kalium- superoxid (K02)(fràn Alpha Products, Beverly, Massachusetts, USA) och 0,10 N l,4,7,10,15,16-hexaoxiacylkooktadekan (från Aldrich Chemical CO., Milwaukee, Wisconsin, USA).The chemiluminescence reaction system used in this example was based on the following reaction: biotin-isoluminol + KO, --------- à biotin-aminophthalate + N? Sixteen binding reaction mixtures were prepared, each having a total volume of 150 .mu.l and containing 0.1 M tris- (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (nd 8.0), 42 mM biotin-luminol conjugate ( prepared according to Example 1), hiotin in the concentration given in Table 1 below and 0.2 units of avidin per milliliter (added last). After incubation at 2500 for 5 minutes, to each reaction mixture was added 10 .mu.l of dimethylformamide containing 0.15 M potassium superoxide (CO 2) (from Alpha Products, Beverly, Massachusetts, USA) and 0.10 Nl, 4.7,10. , 15,16-hexaoxyacyl cooctadecane (from Aldrich Chemical CO., Milwaukee, Wisconsin, USA).
Efter inkubering vid 25°C under ytterligare 2 minuter satte man 'till varje reaktionshlandníng l0/ul 0,95 mM väteperoxid i 10 mM tris- (hydroximetyl)aminometan~hydrokloridbuffert (pH 7,4). I varje reaktions- olandning mätte man därefter den maximala ljusintensiteten med använd- ning av en Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E. I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware, USA). Im erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 1. .fiu (J-Û CC? \ Q CPI reaktions- blandning ll 12 lj. 14 15 16 18 Égpell ]. koncentration av biotin (nM) m; maximal ljusin- tensitet ° 0 15 27 H0 55 67 101 153 166 200 267 335 400 534 667 800 Av ovanstående försöksrcsultat framgår, att den av kemilumini- scens-reaktionssystemet framkallade maximala ljusintensiteten var en omvänd funktion av mängden biotin i bindningsreaktionsblandningen. Man kan därför enligt föreliggande uppfinning åstadkomma en testkomposition och ett förfarande för bestämning av liganden biotln 1 ett vätskemedium med användning av en kcmiluminiscens-teknik med konkurrerande bindning, vilken teknik icke utnyttjar en vnzym-katalynernd indíkeríngsreaktion.After incubation at 25 ° C for an additional 2 minutes, 10 .mu.l of 0.95 mM hydrogen peroxide in 10 mM tris- (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer (pH 7.4) was added to each reaction mixture. In each reaction landing, the maximum light intensity was then measured using a Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E. I. duPont de Nemours, Willmington, Delaware, USA). The results obtained are summarized in Table 1 below. .Fi u (J-Û CC? \ Q CPI reaction mixture ll 12 lj. 14 15 16 18 Egpell]. Concentration of biotin (nM) m; maximum light intensity ° 0 15 27 H0 55 67 101 153 166 200 267 335 400 534 667 800 From the above experimental results it appears that the maximum light intensity induced by the chemiluminescence reaction system was an inverse function of the amount of biotin in the binding reaction mixture.Therefore, according to the present invention, a test composition and a method for determining the ligand biotin in a liquid medium using a competitive binding chemiluminescence technique, which technique does not utilize an enzyme-catalyzing indication reaction.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57200875A | 1975-04-28 | 1975-04-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8007397L SE8007397L (en) | 1980-10-21 |
| SE451895B true SE451895B (en) | 1987-11-02 |
Family
ID=24285954
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE7604841A SE440280B (en) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | TEST PROCEDURE AND REAGENTS WITH COENSE SYMBOLS |
| SE8007396A SE447510B (en) | 1975-04-28 | 1980-10-21 | METHOD AND REAGENT OF DETERMINATION OF A LIGAND IN A SCIENTIFIC MEDIUM |
| SE8007397A SE451895B (en) | 1975-04-28 | 1980-10-21 | Chemiluminescence Procedure for Determination of a Ligand in a Liquid Medium |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE7604841A SE440280B (en) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | TEST PROCEDURE AND REAGENTS WITH COENSE SYMBOLS |
| SE8007396A SE447510B (en) | 1975-04-28 | 1980-10-21 | METHOD AND REAGENT OF DETERMINATION OF A LIGAND IN A SCIENTIFIC MEDIUM |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (6) | JPS604939B2 (en) |
| AT (1) | AT357685B (en) |
| AU (2) | AU502726B2 (en) |
| BE (1) | BE841179A (en) |
| BR (1) | BR7602561A (en) |
| CA (2) | CA1078712A (en) |
| CH (1) | CH635438A5 (en) |
| DD (1) | DD125231A5 (en) |
| DE (3) | DE2660548C2 (en) |
| DK (3) | DK149969C (en) |
| ES (1) | ES447378A1 (en) |
| FI (1) | FI68324C (en) |
| FR (1) | FR2332533A1 (en) |
| GB (2) | GB1552607A (en) |
| HU (1) | HU179542B (en) |
| IE (1) | IE42544B1 (en) |
| IL (1) | IL49354A (en) |
| IN (1) | IN142734B (en) |
| IT (1) | IT1064132B (en) |
| LU (1) | LU74834A1 (en) |
| NL (1) | NL181281C (en) |
| SE (3) | SE440280B (en) |
| ZA (1) | ZA762030B (en) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL51668A (en) | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
| SE7811630L (en) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | METHOD OF DETECTION OR QUANTITATION OF SUBSTANCES USING LABELING TECHNIQUES |
| USRE34394E (en) * | 1978-01-23 | 1993-09-28 | Baxter Diagnostics Inc. | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
| AU531777B2 (en) * | 1978-04-05 | 1983-09-08 | Syva Co. | Label/solid conjugate immunoassay system |
| US4233402A (en) * | 1978-04-05 | 1980-11-11 | Syva Company | Reagents and method employing channeling |
| FR2422956A1 (en) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | METHOD OF DETECTION AND CHARACTERIZATION OF A NUCLEIC ACID OR OF A SEQUENCE OF THE SAME, AND ENZYMATIC REAGENT FOR THE IMPLEMENTATION OF THIS PROCESS |
| US5605800A (en) * | 1978-04-13 | 1997-02-25 | Institut Pasteur | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method |
| IL57570A (en) * | 1978-06-22 | 1982-07-30 | Miles Lab | Method and reagent for specific binding assay with a prosthetic group as a label component |
| DE2924332A1 (en) * | 1978-06-22 | 1980-01-03 | Miles Lab | FLAVIN-ADENINE-DINUCLEOTIDE-MARKED CONJUGATE AND ITS USE IN SPECIFIC BINDING TRIALS |
| US4334069A (en) * | 1978-07-24 | 1982-06-08 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates |
| US4225485A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| US4288538A (en) | 1979-01-31 | 1981-09-08 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Test method and composition therefor |
| US4273866A (en) * | 1979-02-05 | 1981-06-16 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates and methods for use |
| US4446231A (en) * | 1979-10-03 | 1984-05-01 | Self Colin H | Immunoassay using an amplified cyclic detection system |
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| US4259232A (en) * | 1979-10-23 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates |
| AT367796B (en) * | 1979-10-29 | 1982-07-26 | List Hans | METHOD FOR DETERMINING A SUBSTANCE CONCENTRATION IN A SOLUTION |
| JPS56501583A (en) * | 1979-11-19 | 1981-10-29 | ||
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| DK256581A (en) * | 1980-06-13 | 1981-12-14 | Nat Res Dev | BINDING ASSAY |
| EP0049606A1 (en) * | 1980-10-02 | 1982-04-14 | Colin Henry Self | Detection method, use and diagnostic aid |
| CA1183450A (en) * | 1980-10-30 | 1985-03-05 | Alfred C. Greenquist | Homogeneous specific binding assay device and method |
| US4404278A (en) * | 1980-11-24 | 1983-09-13 | Syva Company | Methods and compositions for assaying for the production of 1,4-dihydropyridyl |
| US4378458A (en) * | 1981-03-30 | 1983-03-29 | Baker Instruments Corporation | Novel chromogenic and/or fluorogenic substrates for monitoring catalytic or enzymatic activity |
| ATE48140T1 (en) * | 1981-04-17 | 1989-12-15 | Univ Yale | MODIFIED NUCLEOTIDES AND PROCESSES FOR THEIR PRODUCTION AND USE. |
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US4366243A (en) | 1981-04-17 | 1982-12-28 | Miles Laboratories, Inc. | Stabilization of glucose oxidase apoenzyme |
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| JPS5818167A (en) * | 1981-07-24 | 1983-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | Analyzing film and analysis using said film |
| JPS5877843U (en) * | 1981-11-20 | 1983-05-26 | 株式会社三協精機製作所 | tape recorder |
| EP0082636B2 (en) * | 1981-12-11 | 2006-10-18 | The Welsh National School of Medicine | Luminescent labelling materials and procedures |
| FR2519005B1 (en) * | 1981-12-29 | 1985-10-25 | Pasteur Institut | DNA FRAGMENTS MARKED WITH AT LEAST ONE OF THEIR ENDS ENDANGERED BY MODIFIED RIBONUCLEOTIDES RECOGNIZABLE BY AFFINOUS MOLECULES AND METHOD FOR CARRYING OUT ANALYSIS OF SUCH DNA FRAGMENTS |
| FR2519004B1 (en) * | 1981-12-29 | 1985-09-27 | Pasteur Institut | MODIFIED ADENOSINE 5'-TRIPHOSPHORIC ACID AND METHOD FOR DETERMINING BIOLOGICAL SUBSTANCES LIKELY TO FIX ADENOSINE 5'-TRIPHOSPHORIC ACID DEGRADATION PRODUCTS |
| US4709016A (en) * | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US5650270A (en) * | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| IL67289A (en) * | 1982-03-18 | 1985-12-31 | Miles Lab | Homogeneous immunoassay with labeled monoclonal anti-analyte |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4495281A (en) * | 1982-10-21 | 1985-01-22 | Miles Laboratories, Inc. | Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4994373A (en) | 1983-01-27 | 1991-02-19 | Enzo Biochem, Inc. | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| EP0201211A1 (en) * | 1985-04-10 | 1986-11-12 | Whittaker Corporation | Method and compositions for visual solid phase immunoassays based on luminescent microspheric particles |
| JPS61271457A (en) * | 1985-05-28 | 1986-12-01 | Olympus Optical Co Ltd | Immunological analysis |
| JPH06100599B2 (en) * | 1985-06-27 | 1994-12-12 | 東亜医用電子株式会社 | How to measure body fluid components |
| JPS6321559A (en) * | 1986-07-16 | 1988-01-29 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Enzyme immunoassay for hapten |
| US6002007A (en) * | 1988-02-20 | 1999-12-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays |
| DE3844954C2 (en) * | 1988-02-20 | 1998-07-16 | Hoechst Ag | Special chemiluminescent acridine derivatives and their use in luminescent immunoassays |
| JP2525678B2 (en) * | 1989-10-03 | 1996-08-21 | 富士写真フイルム株式会社 | Immunoassay device |
| US6380377B1 (en) | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| CN100494399C (en) | 2003-06-30 | 2009-06-03 | 清华大学 | Genotype typing method based on DNA chip and use thereof |
| US7799534B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-09-21 | Beckman Coulter, Inc. | Nonseparation assay methods |
| US7732153B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-06-08 | Beckman Coulter, Inc. | Nonseparation assay methods |
| JP6214449B2 (en) * | 2014-03-31 | 2017-10-18 | シスメックス株式会社 | Method for measuring kinase activity |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (en) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | METHOD FOR THE DETERMINATION AND DETERMINATION OF SPECIFIC BINDING PROTEINS AND THEIR CORRESPONDING BINDABLE SUBSTANCES. |
| US3817837A (en) * | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3880934A (en) * | 1972-02-10 | 1975-04-29 | Syntex Inc | Nitrophenyloxy-butanediols |
| JPS5147347A (en) * | 1974-10-21 | 1976-04-22 | Nippon Electric Co | JOHOSHORISOCHI |
| JPS5147348A (en) * | 1974-10-21 | 1976-04-22 | Nippon Electric Co | JOHOSHORISOCHI |
-
1975
- 1975-09-30 IN IN1874/CAL/75A patent/IN142734B/en unknown
-
1976
- 1976-04-02 IE IE696/76A patent/IE42544B1/en unknown
- 1976-04-05 IL IL49354A patent/IL49354A/en unknown
- 1976-04-05 ZA ZA762030A patent/ZA762030B/en unknown
- 1976-04-07 CA CA249,744A patent/CA1078712A/en not_active Expired
- 1976-04-07 CA CA249,745A patent/CA1082577A/en not_active Expired
- 1976-04-21 CH CH497976A patent/CH635438A5/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-23 GB GB16610/76A patent/GB1552607A/en not_active Expired
- 1976-04-23 GB GB16609/76A patent/GB1548741A/en not_active Expired
- 1976-04-26 NL NLAANVRAGE7604420,A patent/NL181281C/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-26 IT IT49195/76A patent/IT1064132B/en active
- 1976-04-26 FI FI761148A patent/FI68324C/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-26 LU LU74834A patent/LU74834A1/xx unknown
- 1976-04-27 AT AT309376A patent/AT357685B/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 BR BR2561/76A patent/BR7602561A/en unknown
- 1976-04-27 HU HU76MI600A patent/HU179542B/en unknown
- 1976-04-27 JP JP51047347A patent/JPS604939B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 SE SE7604841A patent/SE440280B/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 AU AU13353/76A patent/AU502726B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 DE DE2660548A patent/DE2660548C2/en not_active Expired
- 1976-04-27 ES ES447378A patent/ES447378A1/en not_active Expired
- 1976-04-27 DD DD192528A patent/DD125231A5/xx unknown
- 1976-04-27 BE BE166499A patent/BE841179A/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 DK DK189176A patent/DK149969C/en not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 JP JP51047348A patent/JPS6052378B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 DE DE2618511A patent/DE2618511C3/en not_active Expired
- 1976-04-27 FR FR7612441A patent/FR2332533A1/en active Granted
- 1976-04-27 AU AU13352/76A patent/AU509182B2/en not_active Expired
- 1976-04-27 DE DE2618419A patent/DE2618419C2/en not_active Expired
-
1980
- 1980-10-21 SE SE8007396A patent/SE447510B/en not_active IP Right Cessation
- 1980-10-21 SE SE8007397A patent/SE451895B/en not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-12-23 DK DK576181A patent/DK158366C/en not_active IP Right Cessation
- 1981-12-23 DK DK576281A patent/DK150808C/en not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-07-07 JP JP58122465A patent/JPS5951353A/en active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122464A patent/JPS5942454A/en active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122466A patent/JPS5951354A/en active Granted
- 1983-07-07 JP JP58122463A patent/JPS5942453A/en active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE451895B (en) | Chemiluminescence Procedure for Determination of a Ligand in a Liquid Medium | |
| US4380580A (en) | Heterogenous chemiluminescent specific binding assay | |
| US4230797A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a coenzyme as label | |
| US4492751A (en) | Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label | |
| US4318980A (en) | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label | |
| US5731147A (en) | Luminescent metal chelate labels and means for detection | |
| US4104029A (en) | Procedure for the assay of pharmacologically immunologically and biochemically active compounds in biological fluids | |
| US4383031A (en) | Homogeneous chemiluminescent specific binding assay | |
| US4134792A (en) | Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance | |
| US4510251A (en) | Fluorescent polarization assay for ligands using aminomethylfluorescein derivatives as tracers | |
| EP3168619B1 (en) | Detection agent for detecting 25-hydroxy vitamin d, preparation method and use | |
| JP2004294443A (en) | Immunoassay for hiv protease inhibitor | |
| US4629688A (en) | Homogeneous specific binding assay method | |
| SE436522B (en) | HOMOGEN SPECIFIC BINDING ANALYSIS | |
| AU582341B2 (en) | Assay for immobilized reporter groups | |
| GB1578275A (en) | Procedure for the assay of pharmacologically immunologically and biochemically active compounds in biological fluids | |
| EP2997039B1 (en) | Stabilized liquid formulations containing receptors | |
| EP1651958B1 (en) | Novel chemiluminescent compounds and their use | |
| JPH0694712A (en) | Immunoassay using analog of label thyronine hapten | |
| FI68915C (en) | SPECIFIC BINDNINGSANALYSMETOD OCH REAGENS FOER ANVAENDNING DAERVID | |
| JP3474391B2 (en) | Novel high-sensitivity assay for cholera toxin and its neutralizing activity and kit | |
| JPH01280252A (en) | Detection of low molecular compound converted to glycoside by immunoassay | |
| JPH11512282A (en) | Analytical elements and methods for the determination of specific binding ligands using vanadium bromoperoxidase as a signal generating enzyme |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NAL | Patent in force |
Ref document number: 8007397-6 Format of ref document f/p: F |
|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8007397-6 Format of ref document f/p: F |