SE447510B

SE447510B - METHOD AND REAGENT OF DETERMINATION OF A LIGAND IN A SCIENTIFIC MEDIUM

Info

Publication number: SE447510B
Application number: SE8007396A
Authority: SE
Inventors: R C Boguslaski; R J Carrico; J E Christner
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1975-04-28
Filing date: 1980-10-21
Publication date: 1986-11-17
Also published as: SE8007397L; DK576281A; FI761148A; DK150808C; AU1335376A; AT357685B; CA1078712A; JPH0137694B2; ATA309376A; IT1064132B; JPS51146295A; HU179542B; JPH0137693B2; DK149969C; JPH0145026B2; JPS5951353A; DK150808B; DD125231A5; FR2332533B1; SE440280B

Description

447 510 2 al Technical Information Service (NTIS) of the United States Department of Commerce (1973) beskrives ett icke framgångsrikt försök att använda heminklorid såsom märkningssubstans i ett heterogent testsystem, där en kemiluminisæns -reaktion användes för indikering. I Nature 2l9:l86 (1968) beskrives i stor detalj vissa_testförfaranden med användning av radioaktiva ämnen, och i förbigáende nämnes också mycket allmänt, att det är möjligt att använda koenzym och virus såsom märkningssubstanser 1 stället för radioisotoper. I artikeln anges emellertid icke hur man skall genomföra ett testförfarande med användning av sådana alternativa märkningssubstanser, och det har alltså icke visats, att ett sådant testförfarande skulle vara genomförbart. Man kan också hänvisa till verket Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), i vilket de olika kända testmetoderna diskuteras med angivande av olika material, som har använtsfsàsom märkningssubstanser. ' I den amerikanska patentskriften 3.817.857 beskrives ett test- förfarande utnyttjande ett enzymmärkt konjugat. Detta förfarande är av homogen typ, eftersom det icke kräver användning av ett uppdelat reak- tionssystem (dvs. en olöslig del och en flytande del) och separation av detta system. Den enzymmärkta liganden har nämligen sådana egenska- per, att den enzymatiska aktiviteten hämmas efter reaktion med ligandens bindningspartner. Förhållandet mellan det märkta materialet i bunden form och det märkta materialet i fri form kan sålunda bestämmas genom mätning av förändringen av den enzymatiska aktiviteten. Nackdelarna med denna metod är svårigheter att framställa väl karakteriserade enzym- märkta konjugat och svårigheten att finna lämpliga enzym. Även om många nya typer av testförfaranden utnyttjande specifika bindningar har föreslagits och undersökts, så har förfaranden utnyttjande radioaktiva ämnen och olika enzym- märkta konjugat hittills varit de mest använda. Båda dessa typer av förfaranden har emellertid uppenbara nackdelar, efter-D som man vid det förstnämnda förfarandet mest använder radio- aktiva ämnen, vilka är farliga och svåra att hantera, och eftersom det är svårt att framställa enzymmärkta konjugat användbara vid det sistnämnda förfarandet. 447 510 2 al Technical Information Service (NTIS) of the United States Department of Commerce (1973) describes an unsuccessful attempt to use hemichloride as a labeling substance in a heterogeneous test system, where a chemiluminescent reaction was used for indication. Nature 219: 186 (1968) describes in great detail certain test procedures using radioactive substances, and in passing it is also mentioned very generally that it is possible to use coenzyme and viruses as labeling substances instead of radioisotopes. However, the article does not specify how to carry out a test procedure using such alternative labeling substances, and it has therefore not been shown that such a test procedure would be feasible. Reference may also be made to the work Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972), in which the various known test methods are discussed with reference to various materials which have been used as labeling substances. U.S. Pat. No. 3,817,857 discloses a test method utilizing an enzyme-labeled conjugate. This process is of the homogeneous type, since it does not require the use of a divided reaction system (ie an insoluble part and a liquid part) and the separation of this system. Namely, the enzyme-labeled ligand has such properties that the enzymatic activity is inhibited after reaction with the binding partner of the ligand. Thus, the ratio of the labeled material in bound form to the labeled material in free form can be determined by measuring the change in the enzymatic activity. The disadvantages of this method are difficulties in producing well-characterized enzyme-labeled conjugates and the difficulty in finding suitable enzymes. Although many new types of test methods utilizing specific bonds have been proposed and investigated, methods utilizing radioactive substances and various enzyme-labeled conjugates have been the most widely used to date. However, both of these types of processes have obvious disadvantages, since the former process uses mostly radioactive substances, which are dangerous and difficult to handle, and because it is difficult to produce enzyme-labeled conjugates useful in the latter process.

Föreliggande uppfinning avser ett mångsidigt och käns- ligt, förbättrat testförfarande utnyttjande en specifik bind- ningsreaktion för bestämning av en ligand i ett vätskemedium, 447 510 vilket förfarande innefattar följande steg: (a) vätskemediet bringas i kontakt med ett reagens inne- fattande ett konjugat av en märkningssubstans och en specifik bindningssubstans, varvid reagenset och liganden bildar ett bindningsreaktionssystem innefattande (i) en bunden form av det märkta konjugatet, vari den spe- cifika bindningssubstansen är bunden till en specifik bind- ningspartner därtill, och (ii) en fri form av det märkta konjugatet, vari den speci- fika bindningssubstansen icke är bunden till en specifik bind- ningspartner därtill; (b) märkningssubstansen bestämmes i antingen den bundna formen eller den fria formen såsom ett mått på mängden ligand i vätskemediet. Förfarandet kännetecknas av att märkningssubstan- sen är ett enzymsubstrat och att förfarandet är homogent, dvs man genomför icke någon fysikalisk separation av den bundna formen och den fria formen av det substrat-märkta konjugatet utan substrat-aktiviteten i hela den flytande reaktíonsbland- ningen mätes och sättes i relation till mängden ligand i det provade vätskemediet.The present invention relates to a versatile and sensitive, improved test method utilizing a specific binding reaction for determining a ligand in a liquid medium, which method comprises the steps of: (a) contacting the liquid medium with a reagent comprising a conjugate of a label and a specific binding substance, the reagent and ligand forming a binding reaction system comprising (i) a bound form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is bound to a specific binding partner therefor, and (ii) a free form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is not bound to a specific binding partner thereto; (b) the label substance is determined in either the bound form or the free form as a measure of the amount of ligand in the liquid medium. The process is characterized in that the labeling substance is an enzyme substrate and that the process is homogeneous, i.e. no physical separation of the bound form and the free form of the substrate-labeled conjugate is carried out but the substrate activity in the whole liquid reaction mixture is measured and is related to the amount of ligand in the tested liquid medium.

Uppfinningen avser även ett reagens för användning vid bestämning av en ligand i ett vätskemedium, vilket reagens innefattar ett konjugat av en märkningssubstans och en specifik bindningssubstans, och vilket reagens tillsammans med liganden bildar ett bindningsreaktionssystem innefattande en bunden form av det märkta konjugatet, vari den specifika bindningssubstan- sen är bunden till en specifik bindningspartner därtill, och en fri form av det märkta konjugatet, vari den specifika bind- ningssubstansen icke är bunden till en specifik bindningspart- ner därtill, varvid mängden märkningssubstans i antingen den bundna formen eller den fria formen är en funktion av mängden ligand i vätskemediet, och detta reagens kännetecknas av att märkningssubstansen är ett enzymsubstrat, och att det substrat- -märkta konjugatet uppvisar mätbart olika substrat-aktiviteter i den bundna formen och i den fria formen, vilket möjliggör homogen analys.The invention also relates to a reagent for use in determining a ligand in a liquid medium, which reagent comprises a conjugate of a label and a specific binding substance, and which reagent together with the ligand forms a binding reaction system comprising a bound form of the labeled conjugate, wherein the specific the binding substance is bound to a specific binding partner thereto, and a free form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is not bound to a specific binding partner thereto, the amount of labeling substance in either the bound form or the free form being a function of the amount of ligand in the liquid medium, and this reagent is characterized in that the labeling substance is an enzyme substrate, and that the substrate-labeled conjugate exhibits measurably different substrate activities in the bound form and in the free form, which enables homogeneous analysis.

Nedan definieras några av de i föreliggande beskriv- 447 510 ning använda termerna. Med ligand avses det ämne eller den grupp av ämnen, vars närvaro eller mängd i ett vätskemedium skall bestämmas. Med specifik bíndningspartner för liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som har en specifik bindningsaffinitet till liganden med uteslutande av andra ämnen. Med specifik bindningsanalog till liganden avses vilket som helst ämne eller grupp av ämnen, som uppför sig på i huvudsak samma sätt som liganden med avseende pà bindnings- affiniteten till ligandens specifika bindningspartner.Some of the terms used in the present description are defined below. Ligand refers to the substance or group of substances whose presence or amount in a liquid medium is to be determined. By specific binding partner for the ligand is meant any substance or group of substances which has a specific binding affinity to the ligand to the exclusion of other substances. By specific binding analogue to the ligand is meant any substance or group of substances which behaves in substantially the same manner as the ligand with respect to the binding affinity to the specific binding partner of the ligand.

Den nya homogena testtekniken enligt uppfinningen är delvis baserad på det faktum, att reaktionen mellan en ligand och en specifik bindningspartner därför, till en av vilka enzymsubstratet är kopplat, förändrar aktiviteten av enzym- substratet i den förutbestämda reaktionen, vilken reaktion sålunda tjänar såsom medel för indikering av den specifika bindningsreaktionen. Pà grund av detta basfenomen kan olika bindningsmetoder omfattande olika testkompositioner och anord- ningar användas vid genomförande av förfarandet enligt upp- finningen. De föredragna grundmetoderna är tekniken med direkt bindning och tekniken med konkurrerande bindning. ' Vid tekniken med direkt bindning bringas ett vätske- medium, som misstänkes innehålla den ligand som skall påvisas, i kontakt med ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till en specifik bindningspartner för liganden, och därefter mätes eventuell förändring i enzymsubstratets aktivitet. Vid tekniken med konkurrerande bindning bringas vätskemediet i kontakt med en specifik bindningspartner för liganden och med ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till liganden och/eller till en specifik bindningsanalog därtill, och där- efter mätes eventuell förändring i enzymsubstratets aktivitet.The new homogeneous test technique according to the invention is partly based on the fact that the reaction between a ligand and a specific binding partner therefore, to one of which the enzyme substrate is coupled, changes the activity of the enzyme substrate in the predetermined reaction, which reaction thus serves as a means of indication of the specific binding reaction. Due to this basic phenomenon, different bonding methods comprising different test compositions and devices can be used in carrying out the method according to the invention. The preferred basic methods are the direct bonding technique and the competing bonding technique. In the direct binding technique, a liquid medium suspected of containing the ligand to be detected is contacted with a conjugate comprising the enzyme substrate coupled to a specific binding partner for the ligand, and then any change in the activity of the enzyme substrate is measured. In the competitive binding technique, the liquid medium is contacted with a specific binding partner for the ligand and with a conjugate comprising the enzyme substrate coupled to the ligand and / or a specific binding analogue thereto, and then any change in the activity of the enzyme substrate is measured.

Vid båda metoderna bestämmas enzymsubstratets aktivitet genom att vätskemediet bringas i kontakt med åtminstone ett reagens, som med enzymsubstratet ger den förutbestämda indikerings- reaktionen. Kvalitativ bestämning av liganden i vätskemediet kan ske genom att man jämför en egenskap, vanligen hastigheten, hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indikeringsreaktionen i ett vätskemedium fritt från ligand, varvid eventuell skillnad utgör en indikation på en förändring 447 510 i enzymsubstratets aktivitet. Kvantitativ bestämning av ligan- den i vätskemediet kan ske genom att man jämför en egenskap hos den resulterande reaktionen med motsvarande egenskap hos indi- keringsreaktionen i vätskemedia innehållande kända mängder av liganden.In both methods, the activity of the enzyme substrate is determined by contacting the liquid medium with at least one reagent which, with the enzyme substrate, gives the predetermined indication reaction. Qualitative determination of the ligand in the liquid medium can be done by comparing a property, usually the rate, of the resulting reaction with the corresponding property of the indicating reaction in a liquid medium free of ligand, any difference being an indication of a change 447 510 in the activity of the enzyme substrate. Quantitative determination of the ligand in the liquid medium can be done by comparing a property of the resulting reaction with the corresponding property of the indicating reaction in liquid media containing known amounts of the ligand.

Vid den homogena metoden enligt uppfinningen kan kompo- nenterna i den specifika bindningsreaktionen, dvs det vätske- medium som misstänkes innehålla liganden, konjugatet och/eller en specifik bindningspartner för liganden, vanligen kombineras i vilka som helst mängder, på vilket som helst sätt och i vilken som helst ordningsföljd, förutsatt att aktiviteten av enzymsubstratet i konjugatet förändras mätbart, när vätske- mediet inneháller liganden i en mängd eller koncentration, som det är av betydelse att bestämma. Alla komponenterna i den specifika bindningsreaktionen är företrädesvis lösliga i väts- kemediet.In the homogeneous method of the invention, the components of the specific binding reaction, i.e. the liquid medium suspected of containing the ligand, the conjugate and / or a specific binding partner for the ligand, can usually be combined in any amounts, in any manner and in any order, provided that the activity of the enzyme substrate in the conjugate changes measurably when the liquid medium contains the ligand in an amount or concentration which it is important to determine. All the components of the specific binding reaction are preferably soluble in the liquid medium.

När man använder en homogen teknik med direkt bindning, utgöres komponenterna i. den specifika bindningsreaktionen av det vätskemedium, som misstänks innehålla liganden, och en viss mängd av ett konjugat innefattande enzymsubstratet kopplat till en specifik bindningspartner för liganden. Vid kontakt med vätskemediet kommer aktiviteten av det konjugerade enzym- substratet att variera omvänt med graden av bindning mellan liganden i vätskemediet och den specifika bindningspartnern i konjugatet. Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av det konjugerade enzymsubstratet att minska.When using a homogeneous direct binding technique, the components of the specific binding reaction are the liquid medium suspected to contain the ligand, and a certain amount of a conjugate comprising the enzyme substrate linked to a specific binding partner for the ligand. Upon contact with the liquid medium, the activity of the conjugated enzyme substrate will vary inversely with the degree of binding between the ligand in the liquid medium and the specific binding partner in the conjugate. Thus, with increasing amount of ligand in the liquid medium, the activity of the conjugated enzyme substrate will decrease.

När man använder en homogen teknik med konkurrerande bindning, utgöres komponenterna i den specifika bindningsreaktionen av det väts- kemedium, som misstänkes innehålla liganden, en viss mängd av ett kon- JUEšat innefattande eﬂïifffßubstratet KOPPIät till liganden eller till en spe- cifik bindningsanalog till liganden, och en viss mängd av en specifik bindningspartner för liganden. Den specifika bindningspartnern bringas ' i huvudsak samtidigt i kontakt med både konjugatet och vätskemediet.When using a homogeneous technique with competing binding, the components of the specific binding reaction of the liquid medium suspected of containing the ligand constitute a certain amount of a concentrate comprising the copy substrate to the ligand or to a specific binding analog to the ligand. and a certain amount of a specific binding partner for the ligand. The specific binding partner is brought into contact with both the conjugate and the liquid medium substantially simultaneously.

Eftersom eventuell ligand i vätskemediet konkurrerar med liganden eller dennas specifika bindningsanalog i konjugatet när det gäller bind- ning till den specifika bindningspartnern, kommer aktiviteten av det _ konjmenakaenmmsubsugmet att efter kontakt med vätskemediet variera direkt 447 510 med graden av bindning mellan liganden 1 vätskemediet och den specifika bindningspartnern, Med ökad mängd ligand i vätskemediet kommer sålunda aktiviteten av det konjugerade enzynsubstratet att öka.Since any ligand in the liquid medium competes with the ligand or its specific binding analog in the conjugate in terms of binding to the specific binding partner, the activity of the conjugated enzyme suction will vary directly upon contact with the liquid medium with the degree of binding between the ligand in the liquid medium and the Thus, with increasing amount of ligand in the liquid medium, the activity of the conjugated enzyme substrate will increase.

En variation av den homogena tekniken med konkurrerande bind- ning är den homogena tekniken med förträngningsbindning, där konjugatet först bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern för liganden och därefter bringas i kontakt med vätskemediet. Härvid uppstår konkurr- ens om den specifika bindningspartnern. Vid en dylik metod är den mängd konjugat, som bringas i kontakt med den specifika bindningspartnern, vanligen så stor, att liganden eller dennas analog i konjugatet före- ligger i överskott över den mängd, som kan bindas till mängden specifik bindningspartner under den tid, som konjugatet och den specifika bind- ningspartnern är i kontakt med varandra före kontakten med det vätske- medium, som misstänkes innehålla liganden. Denna kontaktordning kan uppnås på ettdera av två lämpliga sätt. Enligt den ena metoden brlngas konjugatet i kontakt med_den specifika bindningspartnern i en vätske- miljö före kontakten med'det vätskemedium, som misstänkes innehålla g liganden. Enligt den andra metoden bringas det vätskemedium, som miss- tänkes innehålla liganden, i kontakt med ett komplex innefattande konju gatet och den specifika bindningspartnern, varvid den specifika bind- ningssubstansen i konjugatet och den specifika bindningspartnern är reversibelt bundna till varandra. Den mängd konjugat, som blir bunden till den specifika bindningspartnern, vilken föreligger 1 komplexbund- en form enligt den andra metoden, är vanligen större än den mängd, som kan förträngas av all ligand i vätskemediet under den tid, som den specifika bindningspartnern, eller komplexet, och vätskemediet är 1 kontakt med vamuﬁra före avslutandet av bestämningen av eventuell för- ändring i det konjugerade enzymsubstratets akçivitèt _ En annan variant av den homogena tekniken med konkurre- rande bindning är den homogena tekniken med stegvis mättning, där komponenterna i den specifika bindníngsreaktionen är desamma som användes vid tekniken med konkurrerande bindning, men där ordningen av komponenternas tillsättning eller kombination och de relativa mängderna därav är annor- 447 510 lunda. Enligt tekniken med stegvis mättning bringas den specifika bind- ningspartnern för líganden i kontakt med det vätskemedium, som miss- tänks innehålla liganden, under en viss tid före vätskemediets kontakt -med konjugatet. Den mängd specifik bindningspartner, som bringas i kon- takt med vätskemediet, är vanligen större än den mängd, som kan binda all den ligand, som antages vara närvarande i vätskemediet, under den tid som den specifika bindningspartnern och vätskemediet är i kontakt med_varandra, innan vätskemediet bringas 1 kontakt med konjugatet.A variation of the homogeneous technique of competitive binding is the homogeneous technique of displacement binding, where the conjugate is first contacted with the specific binding partner of the ligand and then contacted with the liquid medium. In this case, competition arises for the specific binding partner. In such a method, the amount of conjugate that is contacted with the specific binding partner is usually so large that the ligand or its analog in the conjugate is in excess of the amount that can be bound to the amount of specific binding partner during the time that the conjugate and the specific binding partner are in contact with each other prior to contact with the fluid medium suspected of containing the ligand. This contact order can be achieved in either of two suitable ways. According to one method, the conjugate is brought into contact with the specific binding partner in a liquid environment prior to contact with the liquid medium suspected of containing the ligand. According to the second method, the liquid medium which is suspected to contain the ligand is contacted with a complex comprising the conjugate and the specific binding partner, the specific binding substance in the conjugate and the specific binding partner being reversibly bound to each other. The amount of conjugate that becomes bound to the specific binding partner that is present in a complexed form according to the second method is usually greater than the amount that can be displaced by any ligand in the liquid medium during the time that the specific binding partner or complex , and the liquid medium is in contact with the vamura before completing the determination of any change in the activity of the conjugated enzyme substrate. Another variant of the homogeneous technique with competitive binding is the homogeneous technique with stepwise saturation, where the components of the specific binding reaction are the same as those used in the competitive bonding technique, but where the order of addition or combination of the components and the relative amounts thereof are different. According to the step-by-step saturation technique, the specific binding partner of the ligand is brought into contact with the liquid medium suspected of containing the ligand for a period of time prior to contact of the liquid medium with the conjugate. The amount of specific binding partner that is brought into contact with the liquid medium is usually greater than the amount that can bind all the ligand believed to be present in the liquid medium, during the time that the specific binding partner and the liquid medium are in contact with each other, before the liquid medium is brought into contact with the conjugate.

Mängden ligand eller analog därtill i konjugerad form är dessutom van- ligen större än den mängd, som kan bindas till den kvarvarande obundna mängden av den specifika bindningspartnern under den tid, som vätske- mediet och konjugatet är i kontakt med varandra före avslutandet av bestämningen av eventuell förändring i det konjugerade enzymsubstratets ak- tivitet.In addition, the amount of ligand or analog thereof in conjugated form is usually greater than the amount that can be bound to the remaining unbound amount of the specific binding partner during the time that the liquid medium and the conjugate are in contact with each other before the completion of the determination of any change in the activity of the conjugated enzyme substrate.

Bestämningen av eventuellsförändring i det konjugerade enzymsubstratets aktivitet, vilket enzymsubstrat utgör en beståndsdel vid den förutbestämda indíkeringsreaktionen, sker lämpligen genom att den specifika bindningsreaktionsblandningen bringas i kontakt med åtminstone ett ämne, som tillsammans med det konjugerade enzymsubstratet ger den förutbestämda indi- keringsreaktionen, och man bestämmer verkan av den specifika bindningsreaktionen på en egenskap hos en dylik indikerings- reaktion.The determination of any change in the activity of the conjugated enzyme substrate, which enzyme substrate is a constituent of the predetermined indication reaction, is conveniently effected by contacting the specific binding reaction mixture with at least one substance which together with the conjugated enzyme substrate gives the predetermined indicia. the effect of the specific binding reaction on a property of such an indicating reaction.

De reaktionsbeståndsdelar, vilka tillsammans med enzym- substratet i konjugatet ger den förutbestämda indikerings- reaktionen, kan enligt den homogena metoden bringas i kontakt med den specifika bindningsreaktionsblandningen. Nämnda reak- tionsbeståndsdelar kan tillsättas antingen var för sig eller i vilken som helst kombination och antingen före, samtidigt med eller efter initiering av den specifika bindningsreaktionen.The reaction components which, together with the enzyme substrate in the conjugate, give the predetermined indication reaction can be contacted with the specific binding reaction mixture according to the homogeneous method. Said reaction components can be added either individually or in any combination and either before, simultaneously with or after initiation of the specific binding reaction.

Efter initiering av den specifika bindningsreaktionen inkuberas 'vanligen reaktionsblandningen, som kan innehålla några av eller alla de nödvändiga komponenterna för indikeringsreaktionen, under en förutbestämd tidsperiod, innan man bestämmer eventuell förändring i aktiviteten av enzymsubstratet i konjugatet. Efter inkuberingsperioden sätter man till reaktionsblandningen even- tuella komponenter, vilka är nödvändiga för indikeringsreak- 447 510 tionen och vilka icke redan är närvarande i tillräckliga mängder i reaktionsblandningen, och indikeríngsreaktionen studeras för indikation av närvaro eller mängd av liganden i vätskemediet.After initiation of the specific binding reaction, the reaction mixture, which may contain some or all of the necessary components of the indication reaction, is usually incubated for a predetermined period of time, before determining any change in the activity of the enzyme substrate in the conjugate. After the incubation period, any components which are necessary for the indication reaction and which are not already present in sufficient amounts in the reaction mixture are added to the reaction mixture, and the indication reaction is studied to indicate the presence or amount of the ligand in the liquid medium.

En föredragen, känslig índikeringsreaktion utnyttjar fluorescensfenomenet och är enzymkatalyserad. I ett dylikt reaktionssystem användes ett substrat i en enzymatisk reaktion, som ger en produkt med andra fluorescerande egenskaper än det konjugerade substratet. Eventuell förändring i aktiviteten av det konjugerade enzymsubstratet till följd av den specifika bindningsreaktionen förorsakar en förändring i reaktionsblandningens fluorescerande egenskaper. Ett allmänt reaktionsschema för en dylik enzym- katalyserad reaktion anges nedan: enzymsubstrat - X - Z ÅÉ2šXEL%>produkt där X betecknar en medelst enzym klyvbar bindning eller sammanbindande grupp, såsom en estergrupp eller en amidogrupp, och Z betecknar en spe- cifik bindningssubstans, som beroende på den använda specifika bindninrs- reaktionstekniken kan vara antingen liganden eller en specifik bindning-- analog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden.A preferred, sensitive indication reaction utilizes the fluorescence phenomenon and is enzyme catalyzed. In such a reaction system, a substrate is used in an enzymatic reaction which produces a product having fluorescent properties other than the conjugated substrate. Any change in the activity of the conjugated enzyme substrate due to the specific binding reaction causes a change in the fluorescent properties of the reaction mixture. A general reaction scheme for such an enzyme-catalyzed reaction is set forth below: enzyme substrate - X - Z ÅÉ2šXEL%> product where X represents an enzyme cleavable bond or linking group, such as an ester group or an amido group, and Z represents a specific binding substance, which depending on the specific binding reaction technique used may be either the ligand or a specific binding-- analogous to the ligand or a specific binding partner for the ligand.

Såsom exempel på specifika konjugat, vilka kan användas i denna typ av reaktionssystem, kan man nämna olika med enzym klyvbara derivat av fluorescein, umbelliferon, 3-indol , p-naftol, 3-Pyridol, resorufin och liknande. Nedan anges exempel på möjliga strukturformler för dylika derivat: Derivat Formel l .Examples of specific conjugates which can be used in this type of reaction system are various enzyme-cleavable derivatives of fluorescein, umbelliferone, 3-indole, p-naphthol, 3-pyridol, resorufin and the like. The following are examples of possible structural formulas for such derivatives: Derivatives Formula l.

\% C k / ,/'\\// \ IL Ü o v fluorescein .9 H2 //Q§,/ 0 0 umbelliferon | \ï, // // R3 2 l \ R j-indol I // I N,/ \/\ 2 p-naftol U\ | /' ,/ 2 3-pyridol ü;ï%ïï'R / N “ Oe \\«/0 //°§> RQ resorufín | ] \ än / där Rl betecknar -OH eller -X-Z enligt ovanstående definition, R2 beteck- nar -X-Z, och R? betecknar -H eller -Cﬂñ.\% C k /, / '\\ // \ IL Ü o v fluorescein .9 H2 // Q§, / 0 0 umbelliferon | \ ï, // // R3 2 l \ R j-indole I // I N, / \ / \ 2 p-naphthol U \ | / ', / 2 3-pyridol ü; ï% ïï'R / N “Oe \\« / 0 // ° §> RQ resorufín | where R 1 represents -OH or -X-Z as defined above, R 2 represents -X-Z, and R denotes -H or -C ﬂ ñ.

Ett reaktionssystem, som särskilt föredrages för indikering av den nya specifika bindningsreaktionen enligt uppfinningen, är ett cyk- lískt system (kretsloppssystem). I ett dylikt system är en produkt 1 en första reaktion en reaktant 1 en andra reaktion, och i den andra reaktionen är en av produkterna en substans, som också är en reaktant i den första'reaktionen.A reaction system which is particularly preferred for indicating the new specific binding reaction according to the invention is a cyclic system (circulation system). In such a system, a product in a first reaction is a reactant in a second reaction, and in the second reaction one of the products is a substance which is also a reactant in the first reaction.

Nedanstående diagram illustrerar ett dylikt cykliskt reaktions- system: produkter A kretsloppsgàende material. reaktanter B (form 1) REAKTION A REAKTION B reaktanter A kretsloppsgàende material produkter 6 (form 2) I ovanstående cykliska reaktionssystem alstrar en liten mängd kretsloppsgàende material stora ﬁängder av produkterna A och B, om till- räckliga mängder av reaktanterna A och B är närvarande. Eftersom reak- " 447 510 JO tionshastigheten och mängden produkt bildad av reaktionerna i det cyk- liska reaktionssystemet är mycket känsliga för mängden kretsloppsgåen- de material, föredrager man att använda det kretsloppsgående materialet såsom reaktant 1 konjugatet enligt föreliggande uppfinning. I nedan- stående tabeller B och C ges exempel pà cykliska reaktionssystem lämpa- de att använda i samverkan med det nya specifika bindningsreaktionssys- 'temet enligt föreliggande uppfinning.The diagram below illustrates such a cyclic reaction system: products A cyclic material. reactants B (form 1) REACTION A REACTION B reactants A cyclic material products 6 (form 2) In the above cyclic reaction system, a small amount of cyclic material produces large ﬁ lengths of products A and B, if sufficient amounts of reactants A and B are present . Since the reaction rate and the amount of product formed by the reactions in the cyclic reaction system are very sensitive to the amount of cyclic material, it is preferable to use the cyclic material as the reactant in the conjugate of the present invention. In the following tables B and C are examples of cyclic reaction systems suitable for use in conjunction with the novel specific binding reaction system of the present invention.

Tabell B produkt A *\\//* NAD* “\\//f' reaktant B enzym enzym u reaktant Ä./ß\\- NADH" \% produkt B reaktant A reaktant B eller eller reaktion produkt B enzym produkt A 1 laktaldehyd alkohol-de- propandiol hydrogenas 2 a-ketoglutar- glutaminsyra- glutamat at + NH; dehydrogenas 3 oxaloacetat äppelsyra-dehy- malat drogenas 4 acetaldehyd a1kohol-de- etanol hydrogenas 5 a-ketoglutar- isocitronsyra- isocitrat at + C02 dehydrogenas 6 dehydroxiace- a-glycerol- L-a-g1ycerol- tonfosfat fosfat-denydro- fosfat genas 7 pyruvat mJölksyra-dehy- laktat drogenas 8 l,3-defosfo- glyceraldehyd- glyceraldehyd- _glycerat 3-fosfat-dehy- 3-fosfat + fosfat drogenas * nikotinamid-adenin-dinukleotid nr reducerad NAD 447 510 .11 Tabell C produkt A NADP' reaktant B enzym enzym reaktant A NADPH" produkt B reaktant A reaktant B eller eller reaktion produkt B enzym produkt A 1 6-fosfoglu- glukos-6- glukos-6- konat fosfat-dehy- fosfat _ drogenas 2" oxiderad glutation- reducerad glu- glutation reduktas tation 3 P-bensokinon kinon-reduk- hydrokinon tas 4 nitrat nitrat-reduk- nitrit tas 5 a-ketogluta- glutaminsyra- glutamat rat + NH; dehydrogenas x nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat xx reducerad NADP Det bör påpekas, att de cykliska reaktionssystemen i tabellerna B och C kan omfatta en kombination av vilken som helst av de i respek- tive tabell angivna reaktionerna med vilken som helst annan angiven reaktion. Reaktion 1 i tabell B kan sålunda kombineras med vilken som helst av reaktionerna 2-9 till bildning av ett användbart cykliskt reak- tionssystem. Tabellerna B och C representerar sålunda 56 respektive 20 möjliga cykliska reaktionssystem.Table B product A * \\ // * NAD * “\\ // f 'reactant B enzyme enzyme u reactant Ä. / Ss \\ - NADH" \% product B reactant A reactant B or or reaction product B enzyme product A 1 lactaldehyde alcohol-de-propanediol hydrogenase 2 α-ketoglutar-glutamic acid glutamate at + NH; dehydrogenase 3 oxaloacetate malic acid-dehymalate drugase 4 acetaldehyde-alcohol-de-ethanol hydrogenase dehydroxyacea- α-glycerol-1α-glycerol-ton phosphate phosphate-denydrophosphate genase 7 pyruvate lactic acid dehylactate drogenase 8 1,3-dephosphoglyceraldehyde-glyceraldehyde-glycerate 3-phosphate-dehydrogen nicotinamide adenine dinucleotide No. reduced NAD 447 510.11 Table C product A NADP 'reactant B enzyme enzyme reactant A NADPH' product B reactant A reactant B or or reaction product B enzyme product A 1 6-phosphogluclucose-6-glucose -6- conate phosphate-dehyphosphate _ drugase 2 "oxidized glutathione- reduced gl- glutathione reductase tation 3 P-benz okinone quinone-reduced-hydroquinone taken 4 nitrate nitrate-reduced-nitrite taken 5 α-ketogluta-glutamic acid-glutamate rat + NH; dehydrogenase x nicotinamide adenine dinucleotide phosphate xx reduced NADP It should be noted that the cyclic reaction systems in Tables B and C may comprise a combination of any of the reactions listed in the respective table with any other indicated reaction. Reaction 1 in Table B can thus be combined with any of reactions 2-9 to form a useful cyclic reaction system. Tables B and C thus represent 56 and 20 possible cyclic reaction systems, respectively.

Förutom de i tabellerna B och C angivna cykliska reaktionssys- temen så kan en av reaktionerna 1 ett cykliskt reaktionssystem inne- fatta enzymatisk eller icke-enzymatisk omvandling av en spektrofotomet- risk indikator, företrädesvis en kolorimetrisk indikator. I ett dylikt system visar sig en eventuell förändring i reaktions- eller kretslopps- hastigheten såsom en förändring i indikatorns spektrofotometriska egen- skaper. Om man använder de föredragna kolorimetriska indikatorerna, så utgöres en dylik förändring av en färgförändring. Ett exempel pá-ett cykliskt reaktionssystem innefattande omvandling av en indikator är ett system bildat genom kombination av en av reaktant B-produkt B-reaktion- erna i tabell B med en reaktion innefattande en oxidations-reduktions- indikator och ett elektronöverförande medel. Såsom elektronöverförande medel kan man använda fenazinmetosulfat. Såsom exempel på användbara 447 510 12 indikatorer kan man nämna de oxiderade formerna av nitrotetrazolium, tiazolylblått och diklorfenolindofenol.In addition to the cyclic reaction systems set forth in Tables B and C, one of the reactions in a cyclic reaction system may involve enzymatic or non-enzymatic conversion of a spectrophotometric indicator, preferably a colorimetric indicator. In such a system, a possible change in the reaction or cycle speed is manifested as a change in the spectrophotometric properties of the indicator. If one uses the preferred colorimetric indicators, such a change is a color change. An example of a cyclic reaction system comprising converting an indicator is a system formed by combining one of the reactant B product B reactions in Table B with a reaction comprising an oxidation-reduction indicator and an electron transfer agent. Phenazine methosulfate can be used as the electron transfer agent. Examples of useful indicators are the oxidized forms of nitrotetrazolium, thiazolyl blue and dichlorophenolindophenol.

Det indikerande reaktionssystemet kan även innefatta ett expo- nentiellt cykliskt reaktionssystem. Nedan anges ett exempel på ett expc nensieiic cykiiskt reakcionssysnem: ' f” AMP + ATP W-“ïi-r-*íz ADP ADP + PEP Eïïgïâšïßígíë-»ATP + pyruvat Ett dylikt cykliskt reaktionssystem är autokatalytiskt i den meningen, att mängden kretsloppsgàende material fördubblas under varje cykel.'Kretsloppshastigheten ökar därför exponentiellt med tiden, vilkef ger en hög känslighetsgrad. För ytterligare uppgifter om cykliska reak- tioner hänvisas till J. Biol. Chem. 247;}558-70 (1972).The indicating reaction system may also include an exponential cyclic reaction system. The following is an example of an expansionary cyclic reaction system: 'AMP + ATP W-' ïi-r- * íz ADP ADP + PEP Eïïgïâšïßígíë- »ATP + pyruvate Such a cyclic reaction system is autocatalytic in the sense that the amount of material doubles during each cycle. 'The cycle speed therefore increases exponentially with time, which gives a high degree of sensitivity. For further information on cyclic reactions, see J. Biol. Chem. 247;} 558-70 (1972).

Föreliggande uppfinning kan användas för att påvisa vilken som helst ligand, för vilken det finns en specifik bindningspartner. Ligan- den är vanligen en pcptid, ett protein, ett kolhydrat, ett glykoprotein, en steroid eller någon annan organisk molekyl, för vilken en specifik *öindningspartner existerar i biologiska system eller kan syntetiseras.The present invention can be used to detect any ligand for which there is a specific binding partner. The ligand is usually a peptide, a protein, a carbohydrate, a glycoprotein, a steroid or any other organic molecule, for which a specific * binding partner exists in biological systems or can be synthesized.

Liganden väljes vanligen bland antigener och antikroppar därför; hapte- ner och antikroppar därför; hormoner; vitaminer, metaboliter och farma- kologiska medel, samt receptorer och bindningssubstanser därför. Såsom specifika exempel på ligander, vilka kan påvisas med hjälp av förfaran- det enligt uppfinningen, kan man nämna hormoner, såsom insulin, korion- gonadotropin, tyroxin, liotyronin och estriol; antigener och haptencr, såsom ferritin, bradykinin, prostaglandiner och tumörspecifika antire- ner; vitaminer, såsom biotin, vitamin B12, folinsyra, vitamin E och askorbinsyra; metaboliter, såsom 3',5'-adenosinmonofosfat och 3',5'- guanosinmonofosfat; farmakologiska medel, såsom dilantin, digoxin, morfin, digitoxin och barbiturater; antikroppar, såsom mikrosomala anti- kroppar och antikroppar till hepatit och allergener; och specifika bindningsreceptorer, såsom tyroxinbindande globulin, avidin, hemogenas och transkobalamin.The ligand is usually selected from antigens and antibodies therefore; haptens and antibodies therefore; hormones; vitamins, metabolites and pharmacological agents, as well as receptors and binding substances therefore. Specific examples of ligands which can be detected by the method of the invention include hormones such as insulin, chorionic gonadotropin, thyroxine, liotyronine and estriol; antigens and haptens, such as ferritin, bradykinin, prostaglandins and tumor-specific antigens; vitamins such as biotin, vitamin B12, folic acid, vitamin E and ascorbic acid; metabolites such as 3 ', 5'-adenosine monophosphate and 3', 5'-guanosine monophosphate; pharmacological agents such as dilantin, digoxin, morphine, digitoxin and barbiturates; antibodies, such as microsomal antibodies and antibodies to hepatitis and allergens; and specific binding receptors, such as thyroxine binding globulin, avidin, hemogenase and transcobalamin.

I konjugatet enligt föreliggande uppfinning är enzym- substratet. kopplat eller bundet till en specifik bindnings- substans, vilken beroende på det valda testsystemet kan ut- göras av liganden, en specifik bindningsanalog till liganden eller en specifik bindningspartner för liganden, så att en mät- 447 510 13 bar mängd reaktantaktivitet kvarhàlles. Bindningen mellan en- zymsubstratet och den specifika bindningssubstansen är vanligen i huvudsak irreversibel under testbetingelserna, t ex i det fall då indikeringsreaktíonen, i vilken enzymsubstratet är aktivt, icke är avsedd att kemiskt förstöra denna bindning såsom vid luminiscerande och cykliska reaktionssystem. I vissa fall förstöres eller påverkas emellertid denna bindning av den valda indikeringsreaktionen såsom ett medel för bestämning av förändringen i enzymsubstratets aktivitet. Ett dylikt fall är det ovan beskrivna enzymatiska, fluorescerande reaktions- systemet.In the conjugate of the present invention, the enzyme is the substrate. coupled or bound to a specific binding substance, which depending on the test system selected may be the ligand, a specific binding analog to the ligand or a specific binding partner for the ligand, so that a measurable amount of reactant activity is maintained. The bond between the enzyme substrate and the specific binding substance is usually substantially irreversible under the test conditions, for example in the case where the indicating reaction in which the enzyme substrate is active is not intended to chemically destroy this bond as in luminescent and cyclic reaction systems. In some cases, however, this binding is destroyed or affected by the selected indication reaction as a means of determining the change in the activity of the enzyme substrate. One such case is the enzymatic fluorescent reaction system described above.

Enzymsubstratet kan vara direkt kopplat till den speci- fika bindningssubstansen, så att konjugatets molekylvikt är mindre än eller lika med den sammanlagda molekylvikten för enzymsubstratet och den specifika bindningssubstansen. Vanligen är emellertid enzymsubstratet och den specifika bindningssubs- tansen förbundna med varandra genom en brygg-grupp innehållande 1-50, företrädesvis 1-10, kolatomer eller heteroatomer, såsom kväveatomer, syreatomer, svavelatomer, fosforatomer, osv. Såsom exempel pá en brygg-grupp innehållande en enda atom kan man nämnda en metylengrupp (1 kolatom) och en aminogrupp (1 hetero- atom). Brygg-gruppen har vanligen en molekylvikt, som icke överstiger 1 000 och företrädesvis är lägre än 200. Brygg-grup- pen innehåller en kedja av kolatomer eller heteroatomer eller en kombination av bådadera, och den är förbunden med enzym- substratet och den specifika bindningssubstansen, eller ett aktivt derivat därav, genom en sammanbindande grupp, som van- ligen utgöres av en estergrupp, en amidogrupp, en etergrupp, en tioestergrupp, en tioetergrupp, en acetalgrupp, en metylen- grupp eller en aminogrupp.The enzyme substrate may be directly linked to the specific binding substance, so that the molecular weight of the conjugate is less than or equal to the total molecular weight of the enzyme substrate and the specific binding substance. Usually, however, the enzyme substrate and the specific binding substance are connected to each other by a bridging group containing 1-50, preferably 1-10, carbon atoms or heteroatoms, such as nitrogen atoms, oxygen atoms, sulfur atoms, phosphorus atoms, etc. Examples of a bridge group containing a single atom are a methylene group (1 carbon atom) and an amino group (1 heteroatom). The bridge group usually has a molecular weight not exceeding 1,000 and preferably less than 200. The bridge group contains a chain of carbon atoms or heteroatoms or a combination of both, and it is linked to the enzyme substrate and the specific binding substance. , or an active derivative thereof, through a linking group, which is usually an ester group, an amido group, an ether group, a thioester group, a thioether group, an acetal group, a methylene group or an amino group.

Ett enzymsubstrat är en förening eller en grupp, som kan undergá en kemisk omvandling katalyserad av ett enzym.An enzyme substrate is a compound or group that can undergo a chemical transformation catalyzed by an enzyme.

Substratet har lämpligen en molekylvikt lägre än 9 000, före- trädesvis lägre än 5 000. Substrat av denna storlek är lämpli- gast att använda vid framställning av konjugatet, eftersom de saknar molekylär komplexitet. När ett dylikt substrat kopplas till en specifik bindningssubstans, påverkas dessutom lätt substratets aktivitet genom reaktion mellan konjugatet och den 447 510 14 specifika bindningssubstansen. Såsom exempel på enzymsubstrat, vilka kan användas vid förfarandet enligt uppfinningen, kan man nämna. medelst enzym klyvbara fluorescerande substrat såsom E fluorescein och umbelliferon-derivat; pH-indikatorer; och spektrofotometriska indikatorfärgämnen, särskilt av kromogen typ.The substrate suitably has a molecular weight lower than 9,000, preferably less than 5,000. Substrates of this size are most suitable for use in the preparation of the conjugate, since they lack molecular complexity. In addition, when such a substrate is coupled to a specific binding substance, the activity of the substrate is easily affected by reaction between the conjugate and the specific binding substance. Examples of enzyme substrates which can be used in the process according to the invention are. enzyme-cleavable fluorescent substrates such as E fluorescein and umbelliferone derivatives; pH indicators; and spectrophotometric indicator dyes, in particular of the chromogenic type.

Enligt en utföringsform av uppfinningen föreligger de komponen- ter i det specifika bindningsreaktionssystemet, vilka skall kombineras med det vätskemedium som misstänkes innehålla liganden, 1 flytande eller fast form. Enligt den homogena tekniken föreligger komponen- terna vanligen i lösning eller i en fast form, som lätt kan lösas i vätskemediet. Eftersom det vätskemedium som skall testas vanligen är vattenhaltigt, föreligger komponenterna vanligen i vattenlöslig form, dvs. antingen 1 en vattenlösning eller i en vattenlöslig, fast form, såsom ett pulver eller ett harts. Testförfarandet kan genomföras i ett vanligt laboratoriekärl, såsom ett provrör, varvid komponenterna för «den,specifika bindningsreaktionen och komponenterna för indikeringsreak- tionen tillsättes i fast eller flytande form.According to an embodiment of the invention, there are those components in the specific binding reaction system which are to be combined with the liquid medium which is suspected to contain the ligand, in liquid or solid form. According to the homogeneous technique, the components are usually present in solution or in a solid form, which can be easily dissolved in the liquid medium. Since the liquid medium to be tested is usually aqueous, the components are usually in water-soluble form, i.e. either in an aqueous solution or in a water-soluble solid form, such as a powder or a resin. The test procedure can be carried out in an ordinary laboratory vessel, such as a test tube, the components of the specific binding reaction and the components of the indicating reaction being added in solid or liquid form.

En eller flera av komponenterna för den specifika bindningsreak- tionen och/eller en eller flera av komponenterna för indikeringsreaktion- en kan dessutom införlivas med en bärare. En dylik bärare kan vara ett kärl, såsom ett provrör eller en kapsel innehållande en dylik komponent , eller dylika komponenter i en inre del därav, t.ex. i form av en vätska eller ett luckert fast ämne eller en beläggning på kärlets inneryta.In addition, one or more of the components of the specific binding reaction and / or one or more of the components of the indicating reaction may be incorporated into a carrier. Such a carrier may be a vessel, such as a test tube or a capsule containing such a component, or such components in an inner part thereof, e.g. in the form of a liquid or a loose solid or a coating on the inner surface of the vessel.

Enligt en annan utföringsform kan bäraren föreligga i form av en matris, som är olöslig och porös, och som företrädesvis kan absorbera det väts- kemedium som provas. En dylik matris kan vara ett fuktighetsabsorberan- 'de papper, en polymerfilm, ett membran, ett flor, ett block, ett gel, etc. I en dylik form utgör matrisen ett lämpligt medium för kontakt med det vätskemedium som skall provas, för genomförande av den specifika bindningsreaktionen och/eller indikeringsreaktionen, och för iakttagande av det resulterande gensvaret.According to another embodiment, the carrier may be in the form of a matrix, which is insoluble and porous, and which may preferably absorb the liquid medium being tested. Such a matrix may be a moisture-absorbent paper, a polymer film, a membrane, a flor, a block, a gel, etc. In such a form, the matrix constitutes a suitable medium for contact with the liquid medium to be tested, for carrying out the specific binding reaction and / or the indicating reaction, and for observing the resulting response.

W Det vätskemedium, som skall provas, kan vara en naturligen före- kommande eller pá konstgjord väg framställd vätska, som misstänkes inne- hälla liganden. Vätskemediet är vanligen en biologisk vätska eller en vätska erhàllen gendm utspädning eller annan behandling av en biologisk 447 510 15 vätska. Såsom exempel på biologiska vätskor, vilka kan testas enligt föreliggande uppfinning, kan man nämna serum, plasma, urin och amnio- tiska, cerebrala och spinala vätskor. Man kan även analysera andra ma- terial, såsom fasta ämnen, t.ex. vävnader, eller gaser, om dessa materi- al först överföres i vätskeform, t.ex. genom upplösning av det fasta ämnet eller gasen i en vätska eller genom vätskeextraktion av det ßasta ämnet.W The liquid medium to be tested may be a naturally occurring or artificially produced liquid which is suspected to contain the ligand. The liquid medium is usually a biological fluid or a fluid obtained by diluting or otherwise treating a biological fluid. Examples of biological fluids which can be tested according to the present invention include serum, plasma, urine and amniotic, cerebral and spinal fluids. You can also analyze other materials, such as solids, e.g. tissues, or gases, if these materials are first transferred in liquid form, e.g. by dissolving the solid or gas in a liquid or by liquid extraction of the solid.

I motsats till de förut kända homogena metoderna kan biologiska vätskor, vilka innehåller substanser med reaktantaktivitet liknande eller identiska med aktiviteten av den konjugerade märkningssubstanšen, analyseras för bestämning av en ligand utan bakgrundsstörning. Endogen bakgrundsaktivitet kan lätt elimineras på flera sätt. Den biologiska vätskw1knn behandlas för selektiv förstoring av den endogena reaktant- aktiviteten. En dylik behandling kan ske med hjälp av ett medel, vilket kemiskt förstör den endogena aktiviteten, varefter man inaktiverar det använda medlet.In contrast to the previously known homogeneous methods, biological fluids which contain substances with reactant activity similar or identical to the activity of the conjugated labeling substance can be analyzed to determine a ligand without background disturbance. Endogenous background activity can be easily eliminated in several ways. The biological fluid is treated for selective enhancement of the endogenous reactant activity. Such treatment can take place with the aid of an agent, which chemically destroys the endogenous activity, after which the agent used is inactivated.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begrän- sande exempel.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

Exemnel 1; Framställning av 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-kon- 'jugat. 5 Fluorescein-3',6'-bis-ÅF-(2,4-dinitroanilino)hexanoa§7.Example 1; Preparation of 2,4-dinitrophenyl-fluorescein conjugate. Fluorescein-3 ', 6'-bis-ÅF- (2,4-dinitroanilino) hexanoa§7.

Syntesen innefattade omsättning av syrakloriden av 6-(2,4-oi- nitroan1lino)hexansyra med dinatriumsaltet av fluorescein. 6-(2,4-di- nitroanilino)hexansyra framställdes enligt den metod som har beskrivits i Biochem. J. 42:28?-94 (1948).The synthesis involved reacting the acid chloride of 6- (2,4-o-nitroanolino) hexanoic acid with the disodium salt of fluorescein. 6- (2,4-Dinitroanilino) hexanoic acid was prepared according to the method described in Biochem. J. 42: 28? -94 (1948).

En lösning av 1,5 g (5 mmol) 6-(2,4-dinitroanilino)hexansyra omvandlades till syrakloriden genom omsättning med 10 ml varm tionyl- klorid under 15 minuter och efterföljande kylning och utspädning med 20 ml hexan. Den bildade fasta syrakloriden avskiljdes genom filtrering, och efter grundlig torkning sattes syrakloriden till 600 mg av dinatrium saltet av fluorescein i 10 ml torr aceton. Efter 5 timmars àterflödes- kylning avbröts reaktionen genom tillsättning av 2 ml vatten ach 5 ml aceton. Efter 30 minuter vid 2500 koncentrerades reaktionsblandningen till torrhet, och den erhållna återstoden fördelades mellan etylacetat och en vattenlösning av natriumbikarbonat. Den organiska fasen avskilj- des och tvättades med en l proeentig vattenlösning av svavelsyra, var- efter den torkades över vattenfritt magnesiumsulfat och indunstades.A solution of 1.5 g (5 mmol) of 6- (2,4-dinitroanilino) hexanoic acid was converted to the acid chloride by reaction with 10 ml of hot thionyl chloride for 15 minutes and subsequent cooling and dilution with 20 ml of hexane. The solid acid chloride formed was separated by filtration, and after thorough drying, the acid chloride was added to 600 mg of the disodium salt of fluorescein in 10 ml of dry acetone. After 5 hours of refluxing, the reaction was quenched by the addition of 2 ml of water and 5 ml of acetone. After 30 minutes at 2500, the reaction mixture was concentrated to dryness, and the resulting residue was partitioned between ethyl acetate and an aqueous solution of sodium bicarbonate. The organic phase was separated and washed with a 1% aqueous solution of sulfuric acid, then dried over anhydrous magnesium sulphate and evaporated.

Den erhållna röda oljan kromatograferades på 60 g silikagel 60 (från 447 510 16 E. Merck, Darmstadt, Tyskland), varvid man såsom elueringsmedel anvßnde en blandning av aceton och koltetraklorid i volymförhàllandet 2:8. Nan erhöll härvid 1,2 g oren bis-ester, som kromatograferades pà nytt på 60 g silikagel, varvid man såsom elueringsmedel använde en blandning av aceton och koltetraklorid 1 volymförhàllandet 1:9. De fraktioner, som innehöll den önskade produkten, förenades och indunstades, varvid man erhöll 180 mg av ett gult, glasartat fast ämne.The resulting red oil was chromatographed on 60 g of silica gel 60 (from 447 510 E. Merck, Darmstadt, Germany) using as eluent a mixture of acetone and carbon tetrachloride in a volume ratio of 2: 8. Nan obtained 1.2 g of crude bis-ester, which was chromatographed again on 60 g of silica gel, using as eluent a mixture of acetone and carbon tetrachloride in a volume ratio of 1: 9. The fractions containing the desired product were combined and evaporated to give 180 mg of a yellow glassy solid.

Beräknat för C¿uH58N6Ol5: C 59.33; H 4.30; N 9,43 x Funnec: c 60,92; H 4,35; N 6,65. ' Produktens IR-spektrum visade den väntade esterkarbonylabsorp- tionen vid 1765 em'1. ' Exempel ¿_. Försök enligt den homogena metoden för påvisande av derivat av 2,4-dinitrofenyl och antikroppar därtill med användning av ett enzymsubstrat (modifierad fluorescein) såsom märkningssubstans.Calculated for C 15 H 58 N 6 O 15: C 59.33; H 4.30; N 9.43 x Funnec: c 60.92; H 4.35; N 6.65. The product's IR spectrum showed the expected ester carbonyl absorption at 1765 cm -1. 'Example ¿_. Experiments according to the homogeneous method for the detection of derivatives of 2,4-dinitrophenyl and antibodies thereto using an enzyme substrate (modified fluorescein) as label.

Det 1 d°tta exempel använda specifika bindningsreaktionssystem- et var baserat pà den 1 nedanstående diagram l visade reaktionen.The specific binding reaction system used in this example was based on the reaction shown in Figure 1 below.

Diagram 1 esteras H20, pH 7,0 4 andra produkter 447 510 11 (maximal fluorescens vid 510 nm) R = - (cH2)5- NH-Qnog O2N (A) Homogen fluorescens-metod med direkt bindning för påvisan- de av antikroppar till 2,4-dinitrofenyl; inverkan av olika antikropp- koncentrntioner pá reaktionshastigheten.Diagram 1 esterase H 2 O, pH 7.0 4 other products 447 510 11 (maximum fluorescence at 510 nm) R = - (cH2) 5-NH-Qnog O2N (A) Homogeneous fluorescence method with direct binding for the detection of antibodies to 2,4-dinitrophenyl; effect of different antibody concentrations on the reaction rate.

Man framställde och analyserade sju bindningsreaktionsblandning- ar. Varje reaktionsblandning framställdes genom att 20/ul 1/uM 2;N i- nitrofenyl-Fluorescein-konjugat (framställt enligt exempel 1) i dimetyl- sulfoxid blandades med en sådan volym antiserum till 2,4-dinitrofenyl som anges i nedanstående tabell 1 och med en tillräcklig volym 0,1 M bis-hydroxietylglycin-hydrokloridbuffert (pH 7,0) för att ge en total volym av 2,0 ml. Hastigheten av bakgrundshydrolysen av esterbindningarna i konjugatet bestämdes under 3 minuter i varje reaktionsblandning genom att man mätte ökningen av fluorescensintensiteten vid 5lO,nm, när fluore- 'metern var anordnad för excitering vid 470 nm. Till varje reaktionsbland- ning sattes därefter 10)pl av en 0,1 M bis-hydroxietylglyein-hydroklorid- buffert (pH 7,0) innehållande 0.54 enheter esteras typ I (E. C. Nr. 3.l.l.l från Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri, USA). Den resulte- rande totala reaktionshastigheten mättes på samma sätt som bakgrunds- hydrolvshastigheten. De erhållna resultaten är sammanställda i nedan- stående tabell 1.Seven binding reaction mixtures were prepared and analyzed. Each reaction mixture was prepared by mixing 20 .mu.l of 1 .mu.M 2; N i-nitrophenyl-fluorescein conjugate (prepared according to Example 1) in dimethyl sulfoxide with such a volume of antiserum to 2,4-dinitrophenyl as given in Table 1 below. with a sufficient volume of 0.1 M bis-hydroxyethylglycine hydrochloride buffer (pH 7.0) to give a total volume of 2.0 ml. The rate of background hydrolysis of the ester bonds in the conjugate was determined for 3 minutes in each reaction mixture by measuring the increase in fluorescence intensity at 510 nm, when the fluorometer was arranged for excitation at 470 nm. To each reaction mixture was then added 10 μl of a 0.1 M bis-hydroxyethylglyeine hydrochloride buffer (pH 7.0) containing 0.54 units of type I esterase (EC No. 3.III from Sigma Chemical Co., St. Louis). , Missouri, USA). The resulting total reaction rate was measured in the same manner as the background hydrolysis rate. The results obtained are summarized in Table 1 below.

Tahell1.H mängd bakgrunds- total reak- reaktions- antiserum hydrolys- tionshastig- blandning Qul) hastighet het 1 o 0.02 2.68 2 5 0.07 2.48 3 1o 0.11' 1.91 4 20 0.17 1.08 5 30 0.21 0.63 6 110 0.22 0.145 7 60 0.26 0.30 447 510 _ 18 Av ovanstående resultat framgår, att nettohastigheten av hydro- lysreaktionen var en omvänd funktion av mängden antikroppar till 2,4- dinitrofenyl närvarande f bindningsreaktionsblandningen. Av resultaten framgår även, att hastigheten av bakgrundshydrolysreaktiaxen var en direkt funktion av mängden antikroppar närvarande i bindningsreaktions- blandningen. Enligt uppfinningen kan man därför åstadkomma en testkompo- sition och ett förfarande för bestämning av närvaro av antikroppar till 2,4-dinitrofenyl 1 ett vätskemedium med användning-av en fluorescens- teknik med direkt bindning.Tahell1.H amount of background- total reaction- reaction- antiserum hydrolysis rate- mixture Qul) velocity hot 1 o 0.02 2.68 2 5 0.07 2.48 3 1o 0.11 '1.91 4 20 0.17 1.08 5 30 0.21 0.63 6 110 0.22 0.145 7 60 0.26 0.30 The above results show that the net rate of the hydrolysis reaction was an inverse function of the amount of antibodies to the 2,4-dinitrophenyl present in the binding reaction mixture. The results also show that the rate of the background hydrolysis reaction axis was a direct function of the amount of antibodies present in the binding reaction mixture. According to the invention, therefore, there can be provided a test composition and method for determining the presence of antibodies to 2,4-dinitrophenyl in a liquid medium using a direct binding fluorescence technique.

(B) Homogen fluoresoens-metod med konkurrerande bindniﬂß “ör pávisande av derivat av 2,4-dinitrofenyl; verkan av olika halter av 2,4-dinitrofenyl-p-alanin på reaktionshastigheten.(B) Homogeneous fluorescence method with competitive binding to detect 2,4-dinitrophenyl derivatives; effect of different levels of 2,4-dinitrophenyl-β-alanine on the reaction rate.

Man framställde tio bindningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av 2,0 ml och innehöll 0,1 M bis-hydroxietylgly- cin-hydrckloridbuffert (pH 7,0) och 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin. fram- ställd enligt den metod som beskrivas i J. Amer. Chem. Soc. 76:l328 (1954), i de 1 nedanstående tabell 2 angivna koncentrationerna. Till reaktionsblandningarna 2-10 i tabell 2 sattes antiserum till 2,4-dinitro- ,fenyl i en mängd, som var tillräcklig för att med 60 procent sänka has- tigheten av den esteras-katalyserade reaktionen i reaktionsblandning 1.Ten bond reaction mixtures were prepared, each having a total volume of 2.0 ml and containing 0.1 M bis-hydroxyethylglycine hydrochloride buffer (pH 7.0) and 2,4-dinitrophenyl-β-alanine. prepared according to the method described in J. Amer. Chem. Soc. 76: 328 (1954), in the concentrations given in Table 1 below. To reaction mixtures 2-10 in Table 2, antiserum was added to 2,4-dinitro-, phenyl in an amount sufficient to reduce by 60 percent the rate of the esterase-catalyzed reaction in reaction mixture 1.

Efter blandning satte man till varje reaktionsblandning 20fﬂ.l/uM 2,4- dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1) i di- metylsulfoxid. Därefter satte man till varje reaktionsblandning 10 pl av en 0,1 M bis-hydroxietylglycin-hydrokloridbuffert (pH 7) innehållande 0,54 enheter esteras typ I (E. C. nr. 5.l.1.l från Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Den resulterande reaktionshastigheten mättes på samma sätt som har beskrivits under (A) ovan. För reaktionsbland- ningarna 2-10 beräknade man den procentuella reaktionshastigheten, räk- nad pà reaktionshastigheten i reaktionsblandning 1, som icke innehöll några antikroppar. De erhållna resultaten är sammanställda i nedanståen- de tabell 2. 447 510 19 Tabell 2. koncentration av procentuell reak- reaktions- 2,4-dinitrofenyl- reaktions- tionshastighet, räk- blandning ß-alanin (nM) hastighet nad på reaktion 1 1 o ' 2.78 - 2 O 1.04 57 3 5 1.01 36 4 1o 1.04 37 5 20 1 .24 45 6 30 1.51 54 7 5o_ 1.54 56 B 75 - 1.80 65 9 1oo 1 _85 67 10 150 2.}} 84 Av ovanstående resultat framgår, att hydrolysreaktionens has- tighet var en direkt funktion av mängden 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i reaktionsblandningen. Enligt uppfinningen kan man därför åstadkomma en testkomsssition och ett förfarande för bestämning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl i ett vätskemedium med använd- ning av en fluorescens-teknik med konkurrerande bindning.After mixing, 20 .mu.l / μM of 2,4-dinitrophenyl-fluorescein conjugate (prepared as in Example 1) in dimethyl sulfoxide were added to each reaction mixture. Then, 10 μl of a 0.1 M bis-hydroxyethylglycine hydrochloride buffer (pH 7) containing 0.54 units of esterase type I (EC No. 5.1.1.1 from Sigma Chemical Co., St. Louis) was added to each reaction mixture. Louis, Missouri, USA). The resulting reaction rate was measured in the same manner as described under (A) above. For reaction mixtures 2-10, the percentage reaction rate was calculated, based on the reaction rate in reaction mixture 1, which did not contain any antibodies. The results obtained are summarized in Table 2 below. 447 510 19 Table 2. concentration of percentage reaction-2,4-dinitrophenyl reaction rate, shrimp mixture ß-alanine (nM) rate nad on reaction 1 1 o '2.78 - 2 O 1.04 57 3 5 1.01 36 4 1o 1.04 37 5 20 1 .24 45 6 30 1.51 54 7 5o_ 1.54 56 B 75 - 1.80 65 9 1oo 1 _85 67 10 150 2.}} 84 Of the above results It can be seen that the rate of the hydrolysis reaction was a direct function of the amount of 2,4-dinitrophenyl-β-alanine in the reaction mixture. According to the invention, therefore, there can be provided a test composition and method for determining the presence of such ligands as derivatives of 2,4-dinitrophenyl in a liquid medium using a fluorescence technique with competitive binding.

(C) Homogen spektrofotometrisk metod med konkurrerande bind- ning för bestämning av derivat av 2,4-dinitrofenyl; verkan av olika halter 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin pà reaktionshastigheten.(C) Homogeneous spectrophotometric method with competitive binding for determination of 2,4-dinitrophenyl derivatives; effect of different levels of 2,4-dinitrophenyl-β-alanine on the reaction rate.

Man framställde åtta bïndningsreaktionsblandn1ngar, som var och en hade en total volym av 1,0 nl och innehöll 0.1 M tris-(hydroximetyl)- aminometan-hydrokloridbuffert (pH 7,0). Reaktionsblandningarna innehöll dessutom 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i de 1 nedanstående tabell3 angivna koncentrationerna. Till reaktionsblandningarna 2-8 1 tabell3 sattes antiserum till 2,4-dinitrofenyl i en mängd, som var tillräcklig för att med 82 procent sänka hastigheten av den esteras-katalyserade reaktionen i reaktionsblandning 1. Efter blandning satte man till varqe reaktions- blandning 10/ul 0,1 mM 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1) i dimetylsulfoxid. Till varje reaktionsblandning satte man därefter 20/ul av en 0,1 M tris-(hydroximetyl)aminometan- hydrokloridbuffert (pH 7,0) innehållande 2,16 internationella enheter esteras typ I (E. Q. nr. 3.l.l.l från Sigma Chemical Co., St. Louis, 447 510 20 Missouri, USA). Med hjälp av en spektrofotometer Gilford 2000 mätte man i varje reaktionsblandning absorbansförändringen per minut vid 489 nm. De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 3.Eight binding reaction mixtures were prepared, each having a total volume of 1.0 nl and containing 0.1 M tris- (hydroxymethyl) -aminomethane hydrochloride buffer (pH 7.0). The reaction mixtures also contained 2,4-dinitrophenyl-β-alanine in the concentrations given in Table 3 below. To the reaction mixtures 2-8 in Table 3, antiserum was added to 2,4-dinitrophenyl in an amount sufficient to reduce by 82 percent the rate of the esterase-catalyzed reaction in reaction mixture 1. After mixing, each reaction mixture was added 10 / μl of 0.1 mM 2,4-dinitrophenyl-fluorescein conjugate (prepared as in Example 1) in dimethyl sulfoxide. To each reaction mixture was then added 20 .mu.l of a 0.1 M tris- (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer (pH 7.0) containing 2.16 international units of esterase type I (EQ No. 3.III from Sigma Chemical Co.). , St. Louis, 447 510 20 Missouri, USA). Using a Gilford 2000 spectrophotometer, the absorbance change per minute at 489 nm was measured in each reaction mixture. The results obtained are summarized in Table 3 below.

Tabell 3. koncentration av reaktions- 2,4-dinitrofenyl- absorbans- blandning p-alanin (PM) förändring l 0 ' 0.026l 2 O 0.004? 3 1.25 0.0llB 4 2.5 0.0l}l 5 5.0 0.0l85 6 7.5 0.0202 7 10.0 0.0l92 8 12.5 0.0223 Av ovanstående resultat framgår, att reaktionshastigneten var en direkt fdnktion av mängden 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i reaktions- blandningen. Enligt uppfinningen kan man sålunda åstadkomma en test- komposition och ett förfarande för bestämning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl 1 ett vätskemedium med använd- ning av en spektrofotometrisk teknik med konkurrerande bindning. _ (D) Homogen fluorescens-metod med konkurrerande bindning för bestämning av derivat av 2,4-dinitrofenyl; användning av en icke-eq:ym- atisk indikeringsreaktion. - Bet använda bindningsreaktionssystemet var detsamma som visas i diagram l med det undantaget, att inget esteras användes för att kata- lysera hydrolysen av esterbindníngarna i konjugitet.Table 3. concentration of reaction 2,4-dinitrophenyl absorbance mixture p-alanine (PM) change l 0 '0.026l 2 O 0.004? 3 1.25 0.0lB 4 2.5 0.0l} l 5 5.0 0.0l85 6 7.5 0.0202 7 10.0 0.0l92 8 12.5 0.0223 The above results show that the reaction rate was a direct function of the amount of 2,4-dinitrophenyl-β-alanine in the reaction mixture. . Thus, according to the invention, there can be provided a test composition and method for determining the presence of such ligands as derivatives of 2,4-dinitrophenyl in a liquid medium using a spectrophotometric technique with competing binding. (D) Homogeneous fluorescence method with competitive binding for determination of 2,4-dinitrophenyl derivatives; use of a non-eq: imatic indication reaction. The binding reaction system used was the same as shown in Figure 1, except that no esterase was used to catalyze the hydrolysis of the ester bonds in conjugation.

Man framställde åtta blndningsreaktionsblandningar, som var och en hade en total volym av 2 ml och innehöll 0,1 M tris-(hydroximetv1)- aminometan-hydrokloridbuffert (pH 7,5)- Blandningarna innehöll dessutom 2,4-dinitrofenyl-ß-alanin i de i nedanstående tabell 4 angivna koncen- trationerna. Till varje reaktionsblandning sattes 50/ul antiserum till 2,4-dinitrofenyl. Efter blandning satte man till varje reaktionsbland- 'ning 20/ul 2/uM 2,4-dinitrofenyl-fluorescein-konjugat (framställt såsom i exempel 1)i dimetylsulfoxid. Den resulterande reaktionshastigheten mättes på samma sätt som har angivits under (A) ovan. De erhållna resul- taten är sammanställda i nedanstående tabell 4. 447 510 21 Tabell 4._ koncentration av reaktions- 2,#-dinitrofenyl- reaktions- blandning p- alanin (nM) hastighet 1 o 0.96 2 12.5 0.94 3 31.2 0.84 4 62-5 0.78 5 94.0 0.70 6 125 å 0,59 7 187 0.57 8 250 0,55 Av ovanstående resultat framgår, att bakgrundshydrolyshastíg- heten i frånvaro av esteras var en omvänd funktion av mängden 2,4-dí- nitrofenyl-ß-alanin i reaktionsblandningen. Enligt uppfinningen kan man sålunda åstadkomma en testkomposition och ett förfarande för bestäm- ning av närvaro av sådana ligander som derivat av 2,4-dinitrofenyl L ett vätskemedium med användning av en fluorescens-teknik med konkurre- rande bindning, där bindningspartnern deltager 1 indikeringsreaktionen efter att ha bundits till liganden 1 konjugatet.Eight blending reaction mixtures were prepared, each having a total volume of 2 ml and containing 0.1 M tris- (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride buffer (pH 7.5). The mixtures also contained 2,4-dinitrophenyl-β-alanine. in the concentrations given in Table 4 below. To each reaction mixture was added 50 ul of antiserum to 2,4-dinitrophenyl. After mixing, to each reaction mixture was added 20 .mu.l of 2 .mu.m of 2,4-dinitrophenyl-fluorescein conjugate (prepared as in Example 1) in dimethyl sulfoxide. The resulting reaction rate was measured in the same manner as in (A) above. The results obtained are summarized in the following Table 4. 447 510 21 Table 4._ concentration of reaction 2, # - dinitrophenyl- reaction mixture p- alanine (nM) rate 1 o 0.96 2 12.5 0.94 3 31.2 0.84 4 62 -5 0.78 5 94.0 0.70 6 125 å 0.59 7 187 0.57 8 250 0.55 From the above results it appears that the background hydrolysis rate in the absence of esterase was an inverse function of the amount of 2,4-dinitrophenyl-β-alanine in the reaction mixture. Thus, according to the invention, there can be provided a test composition and method for determining the presence of such ligands as derivatives of 2,4-dinitrophenyl L a liquid medium using a competitive binding fluorescence technique, in which the binding partner participates in the indication reaction after to have bound to the ligand 1 conjugate.

§§§¶Q§l_â¿ Framställning av biotin-umbelliferon-konjugat. (2-oxo-2-H-1-bensopyran-7-yl)-5-[His-hexahydro-2-oxo-lH-tieno- (3,4-d)-imidazolfvalerinsyraester.§§§¶Q§l_â¿ Preparation of biotin-umbelliferone conjugate. (2-oxo-2-H-1-benzopyran-7-yl) -5- [His-hexahydro-2-oxo-1H-thieno- (3,4-d) -imidazole valeric acid ester.

En lösning av 300 mg (1,2 mmol) vattenfritt biotin 1 20 ml torr dimetylformamid omrördes vid -lO°C under en atmosfär av torr kvävgas, och 0,17 ml (1,2 mmol) torr trietylamin tillsattes. Man tillsatte sedan droppvis en lösning av nydestillerat etylkloroformiat (O,lÄ1 ml 1 3 ml 'torr eter). Efter inkubering under 30 minuter under omrörning avfiltre- rades den resulterande fällningen under en atmosfär av torr kvävgas och kyldes omedelbart till -lO°C. Till fällningen sattes därefter en lösning av 197 mg (1,2 mmol) vattenfri 7-hydroxikumarin i 3 ml torr pyridin.A solution of 300 mg (1.2 mmol) of anhydrous biotin in 20 ml of dry dimethylformamide was stirred at -10 ° C under an atmosphere of dry nitrogen, and 0.17 ml (1.2 mmol) of dry triethylamine was added. A solution of freshly distilled ethyl chloroformate (0.1 ml in 3 ml of dry ether) was then added dropwise. After incubation for 30 minutes with stirring, the resulting precipitate was filtered off under an atmosphere of dry nitrogen and cooled immediately to -10 ° C. To the precipitate was then added a solution of 197 mg (1.2 mmol) of anhydrous 7-hydroxycoumarin in 3 ml of dry pyridine.

Blandningen omrördes under 1 timme vid -10°C och därefter under 20 tim- mar vid 2506. Lösningsmedlen avdunstades sedan under högvakuum vid ÄOCCThe mixture was stirred for 1 hour at -10 ° C and then for 20 hours at 2506. The solvents were then evaporated under high vacuum at

Claims

After cooling, the solid formed was filtered off and recrystallized from methanol. The desired product with a melting point of 216-218 ° C was obtained. Calculated for C 19 H 21 ON 2 P 5 S: c 48.75: H 4.19; N 7.21 Found: C 58.4; H 5.12; N 5.85- “Patent claim

A test method using a specific binding reaction for determining a ligand in a liquid medium, which method comprises the steps of: g (all the liquid medium is contacted with a reagent comprising a conjugate of a label and a specific binding substance, wherein the reagent and the ligand forms a binding reaction system comprising (i) a bound form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is bound to a specific binding partner thereto, and (ii) a free form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is not is bound to a specific binding partner thereto; (b) the label is determined in either the bound form or the free form as a measure of the amount of ligand in the liquid medium, characterized in that the label is an enzyme substrate and that the process is homogeneous, that is, one does not perform any physical separation of the bound form and the free form of the substrate-labeled conjugate without the substrate activity in the entire liquid reaction mixture is measured and related to the amount of ligand in the liquid medium tested.

2. A method according to claim 1, characterized in that the substrate-labeled conjugate is a substrate for an enzyme which can act on the conjugate and by enzymatic cleavage release a product which has a detectable property which differs from the conjugate. 447 510 23

3. A method according to claim 2, characterized in that the released product is fluorescent.

A reagent for use in determining a ligand in a liquid medium, which reagent comprises a conjugate of a label substance and a specific binding substance, and which reagent together with the ligand forms a binding reaction system comprising a bound form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is bound to a specific binding partner therefor, and a free form of the labeled conjugate, wherein the specific binding substance is not bound to a specific binding partner thereto, the amount of labeling substance in either the bound form or the free form being a function of the amount of ligand in the liquid medium, characterized in that the labeling substance is an enzyme substrate, and that the substrate-labeled conjugate exhibits measurably different substrate activities in the bound form and in the free form, which enables homogeneous analysis.

Reagent according to claim 4, characterized in that it comprises (1) a labeled conjugate comprising the label substance bound to the ligand or a specific binding analogue thereto, and (2) a binding partner to the ligand.

Reagent according to claim 4, characterized in that the substrate-labeled conjugate is a substrate for an enzyme which can act on the conjugate and by enzymatic cleavage release a product which has a detectable property which distinguishes it from the conjugate.

Reagent according to claim 6, characterized in that the released product is fluorescent.