DK150808B - Kemiluminiscent specifik bindings-analysefremgangsmaade og reagensmiddel til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i 150808

Den foreliggende opfindelse angår en specifik bindings-analyse-fremgangsmåde til analyse af et væskeformigt medium for en ligand af typen: antigener og hertil svarende antistoffer, haptener og hertil svarende antistoffer samt hormoner, vitaminer, metabolitter og far-5 makologiske midler samt deres receptorer og bindingssubstanser, hvilken fremgangsmåde omfatter: 1) at det væskeformige medium kontaktes med reagensmidler, der omfatter et mærket konjugat, hvorved der dannes en bundet form af det mærkede konjugat og en fri form af det 10 mærkede konjugat, hvorhos forholdet mellem den resul terende bundne form af det mærkede konjugat i relation til den frie form er en funktion af ligandens koncentration i det væskeformige medium, og 2) at mængden af mærkningssubstans i den resulterende 15 bundne form eller den resulterende frie form bestemmes.

På grund af risikoen og vanskeligheden ved at håndtere radioaktive materialer er der blevet gjort mange forsøg på at udtænke hensigtsmæssige, specif i ktbindende analysemetoder, der er lige så følsomme og hurtige som radioimmunoanalyser, men som benytter sig 20 af andre kendetegn end radioaktivitet som middel til kontrol af bindingsreaktionen. Som det vil blive omtalt nærmere i det følgende, omfatter de materialer, der er blevet anvendt som mærkningsmateriale i stedet for radioaktive atomer eller molekyler, sådanne forskellige materialer som enzymer, fluorescerende molekyler og bakteriofager.

25 De specifikke bindings-analysemetoder, som først vil blive omtalt, er af den "heterogene" type, hvori adskillelse af de bundne og frie faser gennemføres. En sådan adskillelse er nødvendig for at gennemføre en specifik bindingsanalyse, når det mærkede materiale i den bundne fase ikke kan skelnes fra materialet i den frie fase.

30 Fra beskrivelsen til DS patent nr. 3.654.090, nr. 3.791.932, nr. 3.839.153, nr. 3.850.752 og nr. 3.879.262 og fra the Journal of Immunological Methods 1:247 (1972) og the Journal of Immunology 109:129 (1972) kendes eksempler på heterogene metoder, som er blevet udviklet med anvendelse af et enzym som mærkningsmateriale.

35 Ved hver af de beskrevne metoder kobles et enzym kemisk med enten den ligand, som skal bestemmes, eller en bindingspartner for denne, og der opbygges et passende heterogent specifikt bindingsreaktionsskema, hvorved mængden af enzymatisk aktivitet, som er knyttet til enten den uopløselige del eller den væskeformige del, efter inkube- 2 150808 ring med en prøve er en funktion af mængden af ligand i prøven. De med syntesen og karakteriseringen af enzym-konjugaterne forbundne problemer er alvorlige ulemper ved denne metode.

Fra beskrivelsen til GB patent nr. 1.392.403 og FR patent nr.

5 2.201.299 kendes en heterogen specifik bindingsanalysemetode, som anvender en ikke-aktiv precursor for et spektrofotometrisk aktivt materiale som mærkningsmateriale. Efter inkubering af prøven med det specifikke bindingsreaktionssystem adskilles de uopløselige og væskeformige dele, og den mængde mærkningsmateriale, som er til 10 stede i den væskeformige del, og som er en funktion af den mængde ligand, som skal påvises i prøven, bestemmes ved at gennemføre reaktionstrin, hvorved det inaktive mærkningsmateriale omdannes til et chromogent eller fluometrisk aktivt materiale, som derefter måles på sædvanlig måde.

15 Andre heterogene specifikke bindingsanalysemetoder, som an vender forskellige typer mærkningsmaterialer, er beskrevet i følgende trykskrifter: Report No. PB-224.875 fra the National Technical Information Services (NTIS) under USA's Department of Commerce (1973) beskriver et ikke-vel lykket forsøg på at anvende heminchlorid 20 som mærkningsmateriaie i et heterogent analysesystem, der følges ved hjælp af en kemiluminescensreaktion. I Nature 219:186 (1968) beskrives meget detaljeret visse radioimmunoanalysefremgangsmåder og omtaler en passent og i meget generelle vendinger den mulige brug af coenzymer og virus'er i stedet for radioisotoper som mærk-25 ningsmaterialer. Forfatteren belyser imidlertid ikke, hvorledes en analyse, ved hvilken sådanne alternative mærkningsmaterialer anvendes, skal gennemføres, eller om en sådan analyse er gennemførlig. Der kan endvidere henvises til Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughaday (J. B. Lippincott 30 Co., Philadelphia, 1972), som bredt omtaler de forskellige kendte analyseskemaer og de forskellige materialer og midler, der er blevet anvendt som mærkningsmidler i specifikke bindingsanalyser.

Af interesse er den enzymmærkede immunoanalyse, som er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.817.837. Denne frem-35 gangsmåde er af den "homogene" type, idet den ikke kræver brug af et opdelt specif iktbindende reaktionssystem (dvs. med en uopløselig del og en væskeformig del) og den deraf nødvendiggjorte adskillelsesprocedure, da den enzymmærkede ligand er af en sådan form, at den enzymatiske aktivitet efter reaktion med ligandens bindingspart- 3 150808 ner inhiberes. Forholdene mellem bundet, mærket materiale og frit materiale kan således bestemmes ved at kontrollere enzymatiske aktivitetsændringer. Ikke desto mindre lider denne fremgangsmåde af vanskeligheden med at fremstille vel karakteriserede enzymmærkede 5 konjugater og med at finde enzymer, som passer til systemets grund-udformning.

Skønt mange nye typer specifikke bindingsanalyser er blevet foreslået og undersøgt, er radioimmunoanalysen og de forskellige enzymmærkede immunoanalyser forblevet de mest almindeligt anvendte.

10 Begge systemtyper har imidlertid indlysende mangler, radioimmunoanalysen som følge af dens anvendelse af radioaktivt materiale, som er farligt og kræver påpasselig håndtering, og de enzymmærkede immunoanalyser som følge af vanskeligheden ved at fremstille anvendelige enzymmærkede konjugater.

15 Hvad angår anvendelsen af et fluorescerende mærkestof ved fremgangsmåder til specifik bindingsanaiyse gælder, at fluorescenssystemer omfatter lys både som excitationsmiddel og som signal, der skal måles. Eftersom noget af energien i det exciterede, fluorescerende stof forspildes på ikke-strålingsemitterende måde, har det 20 emitterede lys mindre energi og derfor længere bølgelængde end det absorberede excitationslys. Analytiske systemer, som er baseret på fluorescens, kræver derfor opløsning i indfaldende excitationslys og emitteret lys ved hjælp af instrumenter, som fordrer monokromatisk styrede lyskilder, filtre samt registrering af fluoresceret lys i en 25 vinkel på 90°C fra det indfaldende lys for at gøre målingen af strejflys mindst mulig. Baggrundslys er et væsentligt problem ved fluorescensmålinger på grund af forekomsten af indfaldende, ufiltreret strejflys fra den lyskilde, som kræves til excitationen.

Endvidere indeholder kliniske undersøgelsesemner, såsom serum, 30 plasma og urin forskellige fluorescerende stoffer, navnlig proteiner.

Det til excitation af de fluorescerende mærkestoffer krævede lys vil også på ikke specifik måde excitere andre fluoroscen s komponenter i prøven, hvorved der frembringes yderligere ikke-specifik baggrundsemission. Selv særligt effektive fluorescensstoffer kan derfor højst 35 detekteres i koncentrationer på 10 picomolær eller derover.

Den specifikke bindingsanalysefremgangsmåde ifølge opfindelsen kræver ikke anvendelse af noget kompliceret udstyr eller specifikt regulerede forhold men giver alligevel mulighed for at detektere stofkoncentrationer af størrelsesordenen 0,1 picomolær.

4 150808

Dette opnås ved, at den specifikke bindings-analysefremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der som mærkningssubstans anvendes en kemiluminiscent substans.

Da en lyskilde ikke er påkrævet ved kemiluminiscens, kan reak-5 tionerne udføres i absolut mørke, hvorved problemer på grund af ude fra kommende baggrundslys elimineres, eftersom al lys i reaktionsblandingsområdet udelukkende vil være lys, der er emitteret af luminiscente stoffer. I kemiluminiscenssystemer kan al lys derfor opsamles i en sammenhængende sfære, der omgiver reaktionen, og 10 alle opsamlede fotoner kan tælles med et simpelt fotomultiplikationsrør eller lignende. Da kemiluminiscensreaktioner endvidere er forholdsvis specifikke for det kemiluminiscente mærkestof, vil baggrunds-lysemission fra ikke-specifik kemiluminiscens fra prøvekomponenter kunne holdes pi et minimum.

15 Mærkningssubstansen, der anvendes ved den specifikke bin dingsanalysefremgangsmåde ifølge opfindelsen, og som heri betegnes reaktanten, kan anvendes ved en ny homogen analysemetode eller ved en hvilken som helst af de kendte heterogene analysemetoder.

Opfindelsen angår også et reagensmiddel til anvendelse ved den 20 specifikke bindings-analysefremgangsmåde ifølge opfindelsen, hvilket reagensmiddel omfatter: 1) et konjugat af en mærkningssubstans og liganden eller en specifik bindingsanalog hertil, og 2) en bindingspartner til liganden, 25 og hvilket reagensmiddel er ejendommeligt ved, at den benyttede mærkningssubstans er en kemiluminiscent substans.

Overvågningsreaktionssystemet er fortrinsvis enzymkatalyseret. Sædvanligvis vælges et overvigningsreaktionssystem, som er yderst følsomt over for reaktanten i konjugatet. De kemiluminiscente reak-30 tionssystemer er meget anvendelige i denne henseende. Særligt foretrukne er cykliske reaktionssystemer, navnlig sådanne, hvori reaktanten er det cirkulerende materiale. Af de foretrukne cykliske reaktionssystemer er de enzymkatalyserede specielt fordelagtige.

I denne sammenhæng defineres ovenstående betegnelser på 35 følgende måde: ligand er det stof eller den gruppe af stoffer, hvis tilstedeværelse eller mængde i et væskeformigt medium skal bestemmes; specifik bindingspartner for liganden er et hvilket som helst stof eller en hvilket som helst gruppe af stoffer, som har en specifik bindingsaktivitet for liganden med udelukkelse af andre stoffer; og specifik bindingsanalog til liganden er et hvilket som helst stof eller 5 150808 en hvilket som helst gruppe af stoffer, som opfører sig stort set på samme måde som liganden med hensyn til bindingsaktiviteten for den specifikke bindingspartner for liganden.

Den nye homogene analyseteknik er delvis baseret på, at reak-5 tionen mellem en ligand og en specifik bindingspartner, hvor reaktanten er koblet til en af disse, ændrer aktiviteten af reaktanten i den forudbestemte reaktion, hvilken reaktion dermed tjener som middel til overvågning af den specifikke bindingsreaktion. I lyset af dette grundlæggende fænomen kan forskellige manipulationssystemer, 10 som indbefatter forskellige analysemidler og -anordninger, anvendes til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. De foretrukne fundamentale manipulationssystemer er den direkte bindingsteknik og den kompetitive bindingsteknik.

Ved den direkte bindingsteknik bringes et væskeformigt 15 medium, som antages at indeholde den ligand, som skal påvises, i kontakt med et konjugat omfattende reaktanten koblet til en specifik bindingspartner for liganden, og derefter måles en eventuel forandring af reaktantens aktivitet. Ved den kompetitive bindingsteknik bringes det væskeformige medium i berøring med en specifik bin-20 dingspartner for liganden og med et konjugat omfattende reaktanten koblet til liganden og/eller en specifik bindingsanalog for denne, og derefter måles en eventuel forandring af reaktantens aktivitet. Ved begge metoder bestemmes aktiviteten af reaktanten ved at bringe det væskeformige medium i kontakt med mindst ét reagens, som med 25 reaktanten frembringer den forudbestemte kontrol reaktion. Kvalitativ bestemmelse af liganden i det væskeformige medium indbefatter sammenligning af en egenskab, sædvanligvis hastigheden, for den resulterende reaktion med samme egenskab ved kontrol reaktionen i et væskeformigt medium uden liganden, idet en eventuel forskel er en 30 indikation på en forandring af reaktantens aktivitet. Kvantitativ bestemmelse af liganden i det væskeformige medium indbefatter sammenligning af en egenskab ved den resulterende reaktion med samme egenskab ved kontrol reaktionen i væskeformige medier indeholdende kendte mængder af liganden.

35 Når det homogene analyseskema følges, gælder generelt, at komponenterne i den specifikke bindingsreaktion, dvs. det væskeformige medium, som antages at indeholde liganden, konjugatet og/eller en specifik bindingspartner for liganden kan kombineres i alle forhold, på alle måder og i en hvilken som helst rækkefølge, 6 150808 forudsat at aktiviteten af reaktanten i konjugatet ændres måleligt,, når det væskeformige medium indeholder liganden i en mængde eller koncentration, der er signifikant i relation til analysemetoden. Fortrinsvis er alle bestanddelene i den specifikke bindingsreaktion 5 opløselige i det væskeformige medium.

Når der anvendes en homogen direkte bindingsteknik, er komponenterne i den specifikke bindingsreaktion det væskeformige medium, som antages at indeholde liganden, og en mængde af et konjugat omfattende reaktanten koblet til en specifik bindingspartner 10 for liganden. Aktiviteten af den konjugerede reaktant efter kontakt med det væskeformige medium varierer omvendt med bindingsgraden mellem liganden i det væskeformige medium og den specifikke bindingspartner i konjugatet. Når mængden af ligand i det væskeformige medium øges, falder således aktiviteten af den konjugerede reaktant.

15 Når der anvendes en homogen kompetitiv bindingsteknik, er komponenterne i den specifikke bindingsreaktion det væskeformige medium, som antages at indeholde liganden, en mængde af et konjugat omfattende reaktanten koblet til liganden eller en specifik bindingsanalog for liganden og en mængde af en specifik bindingspart-20 ner for liganden. Den specifikke bindingspartner kontaktes stort set samtidig med såvel konjugatet som det væskeformige medium. Da en hvilken som helst ligand i det væskeformige medium konkurrerer med liganden eller den specifikke bindingsanalog til denne i konjugatet om binding med den specifikke bindingspartner, varierer aktiviteten af 25 den konjugerede reaktant ved kontakt med det væskeformige medium i samme forhold som bindingsgraden mellem liganden i det væskeformige medium og den specifikke bindingspartner. Når mængden af ligand i det væskeformige medium stiger, stiger således aktiviteten af den konjugerede reaktant.

30 En variation af den homogene kompetitive bindingsteknik er den homogene fortrængningsbindingsteknik, hvor konjugatet først kontaktes med den specifikke bindingspartner for liganden og derefter med det væskeformige medium. Der forekommer da konkurrence om den specifikke bindingspartner. Ved en sådan fremgangsmåde er den 35 mængde af konjugatet, som bringes i berøring med den specifikke bindingspartner, sædvanligvis den mængde, som omfatter liganden eller analogen for denne i overskud i forhold til den mængde, som er i stand til at danne binding med den tilstedeværende mængde af den specifikke bindingspartner i løbet af den tid, hvor konjugatet og den 7 150808 specifikke bindingspartner er i kontakt med hinanden inden kontakten med det væskeformige medium, som mistænkes for at indeholde liganden. Denne kontaktorden kan opnås på to hensigtsmæssige måder. Ved den ene fremgangsmåde bringes konjugatet i kontakt med 5 den specifikke bindingspartner i et væskeformigt miljø inden kontakt med det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden.

Ved den anden fremgangsmåde bringes det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden, i berøring med et kompleks omfattende konjugatet og den specifikke bindingspartner, hvor den 10 specifiktbindende substans i konjugatet og den specifikke bindingspartner er reversibelt bundet til hinanden. Den mængde af konjugatet, der bliver bundet til den specifikke bindingspartner, som ved den anden fremgangsmåde er på kompleks form, er sædvanligvis større end den mængde, som kan fortrænges af hele mængden af 15 liganden i det væskeformige medium i den tid, hvor den specifikke bindingspartner eller komplekset og mediet er i kontakt med hinanden inden afslutningen af målingen af aktivitetsforandringen for den konjugerede reaktant.

En anden variation af den homogene kompetitive bindingsteknik 20 er den homogene sekventielle mætningsteknik, hvor komponenterne i den specifikke bindingsreaktion er de samme som de, der anvendtes ved den kompetitive bindingsteknik, men tilsætningsrækkefølgen eller kombinationen af komponenterne og de deraf anvendte relative mængder er forskellige. Ved en sekventiel mætningsteknik bringes den 25 specifikke bindingspartner for liganden i kontakt med det væskeformige medium, som formodes at indeholde liganden, i et tidsrum inden det væskeformige medium kontaktes med konjugatet. Den mængde af den specifikke bindingspartner, som kontaktes med det væskeformige medium, er sædvanligvis større end den, som er i stand til at danne 30 binding med hele den mængde af ligand, som antages at være til stede i det væskeformige medium i løbet af det tidsrum, hvor den specifikke bindingspartner og det væskeformige medium er i kontakt med hinanden inden det tidspunkt, hvor det væskeformige medium kontaktes med konjugatet. Yderligere er mængden af liganden eller 35 ligandanalogen på konjugeret form sædvandligvis større end den mængde, som er i stand til at danne binding med den resterende ubundne mængde af den specifikke bindingspartner i løbet af det tidsrum, hvor det væskeformige medium og konjugatet er i kontakt 8 150808 med hinanden inden afslutningen af målingen af ændringen af den konjugerede reaktants aktivitet.

Målingen af aktivitetsændringen for den konjugerede reaktant som led i den forudbestemte kontrol reaktion opnås bekvemt ved at 5 kontakte den specif i ktbindende reaktionsblanding med mindst ét stof, som med den konjugerede reaktant danner kontrol reaktionen, og bestemme virkningen af den specifikke bindingsreaktion på en egenskab ved denne reaktion.

10 Heterogene analyseskemaer

Brugen af en reaktant som mærkningsstof kan også anvendes i forbindelse med de sædvanlige analysesystemer af heterogen art, hvori de bundne og frie faser af den mærkede bestanddel adskilles, og mængden af mærkningsstof i den ene eller den anden bestemmes.

15 Reagensudstyret til gennemførelse af en sådan heterogen analyse kan foreligge i mange forskellige former. Sædvanligvis omfatter udstyret tre grundbestanddele, som er: (1) den ligand, som skal bestemmes, (2) en specifik bindingspartner for liganden og (3) en mærket bestanddel, som normalt er en mærket form af (a) liganden, (b) en 20 specifik bindingsanalog for liganden eller (c) den specifikke bin-dingspartner. Deltagerne i bindingsreaktionen forenes samtidig eller ved en række tilsætninger, og i én eller flere passende inkubationsperioder bliver den mærkede bestanddel bundet til tilsvarende konkurrerende bindingspartnere, således at bindingsgraden, dvs. for-25 holdet mellem den mængde mærket bestanddel, som er bundet til en bindingspartner, og den ubunde mængde er en funktion af mængden af tilstedeværende ligand. Nedenfor gives en kort beskrivelse af nogle af de forskellige bindingsreaktioner, som kan anvendes ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

30 Medens mærkningsegenskaber som radioaktivitet eller enzymatisk aktivitet stort set er de samme for de bundne og frie former af kon-jugatet ved sædvanlige heterogene specifikke bindingsanalysemetoder, påvirkes aktiviteten af reaktanten som mærkningsstof ved den foreliggende metode i visse tilfælde ved binding af det mærkede konju-35 gat. I denne situation er overvågningsreaktionen forholdsvis konstant, når liganden er fraværende fra det væskeformige medium eller er til stede i en ubetydelig ringe mængde. Når liganden er til stede i det væskeformige medium, ændres en karakteristisk egenskab ved overvågningsreaktionen som tidligere omtalt i forbindelse med den homogene teknik.

9 150808 I nedenstående diagrammer anvendes følgende symbolik:

Symbol Definition L Ligand, som skal bestemmes.

Ligand eller specifik bindingsanalog 5 herfor.

B Bindingspartner for liganden, * Mærkningsstof, dvs. reaktant.

j“ Uopløselig fase.

Inkubationsperiode efterfulgt af pas-10 sende adskillelse.

(lim) Til stede i en mængde mindre end den mængde, som er i stand til at blive bundet til samtlige tilgængelige bindingspladser under de valgte reak-15 tionsbetingelser i løbet af den valgte inkubationstid, dvs. den bestanddel, som de andre bestanddele konkurrerer om at binde.

(exe) Overskud til stede i en mængde, som 20 er større end den mængde, der er i stand til at blive bundet af samtlige tilgængelige bindingspladser under de valgte reaktionsbetingelser i løbet af den valgte inkubationstid.

25 1. Heterogene kompetitive bindingsformer a) L +Q* + B(lim) -» insolubiliseringsmiddel for B eller(]£f.

Dette er den klassiske kompetitive bindingsmetode. Eksemp- 30 ler på insolubiliseringsmidler er specifikke udfældende antistoffer, specifikke uopløseliggjorte antistoffer, og i de tilfælde hvor B ellerQ er et proteinmateriale, proteinud-fældere såsom ammoniumsulfat, eller i de tilfælde, hvor B eller 0 er et lille adsorberbart molekyle, dextranbelagt 35 trækul. Beskrivelser af parallelle systemer findes i

Biochem. J. 88:137 (1963) og beskrivelsen til US patent nr. 3.839.153.

b) L +(£f + f~B(lim) *

Denne metode betegnes almindeligvis fastfaseteknikken.

10 150808

Beskrivelser af parallelle radioimmunoanalyse- og enzymim-munoanalysemetoder findes i beskrivelserne til US patenterne nr. 3.505.019; 3.555.143; 3.646.346 og 3.654.090.

c) L + B + [-©(lim) * 5 Reference: US patent nr. 3.654.090.

d) L + l\y+B (lim) -*

Reference : US patent nr. 3.850.752.

2. Heterogene sekventielle mætningsformer 10 a) L + B(exc) + (exe) + insolubiliseringsmiddei for B eller^^*.

Ved den sekventielle mætningsteknik bindes nogle eller alle bindingspladserne pi B, som er tilbage efter den første 15 inkubationsperiode af den mærkede bestanddel.

b) L + }~B(exc) -> <D (exe) ·*

Beskrivelser af parallelle radioimmunoanalyse- og enzymim-munoanalysemetoder findes i beskrivelsen til US patent nr. 3.730.760 og J. Immunol. 209:129 (1972).

20 c) L + B*(exc) » + KD (exe) * 3. Heterogen “Sandwichs-form L + f-B(exc) ->B (exe) 25 Ved sandwich-metoden bindes nogle eller alle de ligandmoleky ler, som er bundet til de uopløseliggjorte bindingspartnere af den mærkede bestanddel.

Reference: US patent nr. 3.720.760.

30 4. Heterogen fastfaseopløsningsform L +© + J—(nonspecifik) + B(iim) ·*

Ved denne teknik bindes liganden og den mærkede bestanddel til en nonspecifik binder, og derefter dissocieres proportionale mængder derfra ved binding med en bindingspartner med en 35 større affinitet for liganden og den mærkede bestanddel. Den mest anvendelige form for denne teknik benytter sig af en søjle af den nonspecifikke binder som beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 3.659.104. En sådan teknik er anvendelig, når liganden bindes til endogene bindingsmaterialer i prøven, som, 11 150808 med mindre de fjernes, generer den kompetitive bindingsreaktion. Efter at de endogene bindingsmaterialer er blevet bundet til den nonspecifikke binder, kan de fjernes ved passende udvaskninger.

5

For en nærmere omtale af de i sædvanlige heterogene analysesystemer involverede parametre, sisom mere detaljerede beskrivelser af analyseformer og alternative separationsmetoder henvises til Principles of Competitive Protein-Binding Assays, ed. Odell and Daughday 10 (J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 1972).

Manipulationsskemaer, som indbefatter andre tilsætningsrækkefølger og andre bindingsreaktionsformer, kan udtænkes til gennemførsel af homogene og heterogene specifikke bindingsanalyser uden at afvige fra den heri beskrevne opfinderiske idé.

15

Overvågningsreaktionssystemer

De reaktionsbestanddele, som sammen med reaktanten i konjuga-tet frembringer overvågningsreaktionen, kan bringes i kontakt med (i) den specifikke bindningsreaktionsblanding ved en homogen teknik 20 eller (ii) med enten den fraskilte, bundne eller frie fase ved en heterogen teknik alene eller i en hvilken som helst kombination, enten inden, samtidig med eller efter initiering af den specifikke bindingsreaktion. Efter initiering af den specifikke bindingsreaktion inkuberes reaktionsblandingen, som kan indbefatte enhver af eller 25 alle de til overvågningsreaktionen nødvendige bestanddele, sædvanligvis i et i forvejen fastlagt tidsrum inden en eventuel ændring af aktiviteten af reaktanten i konjugatet (homogen teknik) vurderes, eller mængden af reaktantaktivitet i de adskilte faser (heterogen teknik) bedømmes. Efter inkubationsperioden tilsættes der til reak-30 tionsblandingen eventuelle komponenter, som er nødvendige for overvågningsreaktionen, og som ikke allerede er til stede i tilstrækkelige mængder i reaktionsblandingen, og overvågningsreaktionen bedømmes som indikation på tilstedeværelsen eller mængden af ligand i det væskeformige medium.

35 Overvågningsreaktionen omfatter et kemiluminescensreaktions- system, fortrinsvis enzym kata lyseret, i hvilken den kemiluminiscente mærkningssubstans deltager. Den specifikke binding af den kemiluminiscente mærkningssubstans kan bevirke en ændring af lysproduktionshastigheden eller af den totale mængde, den maksimale inten 12 150808 sitet eller karakteren af det dannede lys. Eksempler på kemi-lumlnescensreaktionssystemer er angivet i Tabel A, hvori følgende forkortelser er anvendt: ATP adenosintriphosphat 5 AMP adenosinmonophosphat NAD nicotinamidadenindinucleotid NADH reduceret nicotinamidadenindinucleotid FIS/IN flavinmononucleotid FMNHg reduceret flavinmononucleotid 10 Hu elektromagnetisk stråling, sædvanligvis i det infrarøde, synlige eller uitraviolette område.

„ 150808

1 to E

“ -D Q.S) £ ? 3 1¾ 55 +3 <U 0> Q.— O S, O 2.

jc υ c z ·- 2 5? c S’ 05 3 fe ^ Τ3·Μ .hoio p ό - if E 2 £ E ^ 8 *- W <D 2 q_ 2 Q.

H-> *- a> OU — i-L — U.

<U s_ = ϋ C 3 4_) +j 4_i +J — — ίδ « ® Ό « -8¾ Ϊ f C c g> © C «V >. I «*- 8 3 8 8 ε ε ™ n S_ φ -£ Q Γη i- 3 3 3 3 3 3 c r- cd Z <d ej η ό XI Ό ή ή Ο Η Sr 2 Ρ 5 -"=: ω α> ω ω § £ ΙΧΙ < cj u_ ro Ζ co Φ ε- s_ s— s— .— .— c 's.

φ +- u 3 +> _

CD O

s- CM

c a <D t T O O ^ 5n CM CM 3 + t -1- ^ © Id i~cvi Te 3 + + · © ^ X = - CD Φ ro + C + 5L _ +J S_ E t +- +J T n ° CD >- CM > T V) Π3 5 7Γ £ = aj Mxz"wc:fcgg£. S _w

ό ξ^12Φ 2 ^ S F a_ g’Z cM

V 2^21L^ ^ 8 2 § ^ o $- + 2 0 ^1^+1 Pif. - Ϊ - a p + * o ? η I ? ±:$|^8Ρ21£ω™ Q- r- j~ m D -C “Π <D X -C rø 2 ^ J5 < . .2 wa-S-SS-Hoi-H™ x? riX·- ω Ό -C i < y»i+^-^+ -,b- oX + 1-‘”CLr . Λ ©r i.in°S+©xo-g * C g Si {j * , = 5 “ i » ^ 3 oji- d) l. -c 2 q Λ + ε,Ε -C t/)Q) ϋ)<ϋ^ 3“E_CO/kO fQj- © ii> E w c © ,, S A © r -C + ™ .a +? λ «2 «Ρ © 3 · ω Jc *Λ g o a, -> + )_><u υ·0 ^ CD?· S"0 $ "C Ο

^©</>/^3 0. £_ .. U - rav /s S A SZ

« gffl -V> -a o = ? -a o ® c cd 5 <2 «Η cm .c + ©. E X » ” S S Λ S O 2 O ® ^ g 2 ^ S > 2 ^ aj3o+ P + S © a * x « - + i £ 4j S >°o w -ΟΩφ © -£ CM cTo © S c £ < 1 £” o N °N° «g oi_ ® Zm <λ + o 1 O t*

St cd χ © -£ c x + O + — SLq -‘“X5 Q.·— — — 12 Φ + « =5 © + 2 + 2

3 Ό _ -JE C t — nj — Π5 CM

—1 -¾ ffi ? 5* wSSenSenO-^ r x SC o 3 .E o c o cvj o φ O) u. J2 3 ^ + + xj<D2a2a+ + L + I X -OCDCDCDCDOOg *- « i LO3s_s_J_i.CC.™ , cm 4: ^ -πΦ<ϋΦΦ*?:·^05 + X <2 - PuuuoES+j ίχ. z Z if ^^C3 3. 333Φ 1 — X3 X3 XT q q Γ- 2 r-S^-S /^1 /^1 (D CD (D CD in m < LL r-CM r-CMeei-S_.S.S^ 15 <CQ U Q ui LL O X -5 * 14 150808

Yderligere enkeltheder ved og omtale af luminescensreaktionssystemer, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende fremgangsmåde, kan ses i nedenstående referencer: J. Bio). Chem. 236:48 (1961) 5 J. Amer. Chem. Soc. 89:3944 (1967)

Cornier et al., Bioluminescens in Progess, ed. Johnson et al., Princeton University Press (new Jersey, 1966) pp. 363-84.

Kries, P., Purification and Properties of Renilla Luciferase, doktordisputats Unverisity of Georgia (1967).

10 Am. J. Physiol. 41:454 (1916).

Biol. Bull. 51:89 (1926).

J. Biol. Chem. 243:4714 (1968).

Opfindelsen vil nu blive illustreret af følgende eksempler: 15 Eksempel 1

Fremstilling af nicotinamidadenindinucleotid-biotinkonjugat.

A. Nicotinamid-6-(2-aminoethylenamino)punndinucleotid.

2 g Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) opløstes i 10 ml vand, 20 og 0,6 ml ethylenimin tilsattes dråbevis, idet pH blev holdt under 7 ved tilsætning af 1 N perchlorsyre. Da ethyleninin-tilsætningen var afsluttet, indstilledes pH på 4,5, og reaktionsblandingen inkuberedes ved 20-25°C. Med 24 timers mellemrum tilsattes 0,6 ml ethylenimin, og pH genindstilledes på 4,5. Efter 96 timer udhældtes opløsningen i 25 10 rumfang acetone ved -10°C. Den dannede olie opsamledes, vaske des med ether og opløstes i ca. 50 ml vand i en kolbe.

I den resulterende opløsning indstilledes pH på 7,0-7,5 med 1 N natriumhydroxid, og der tilsattes 1 gram natriumbicarbonat. Nitrogen bobledes gennem opløsningen i fra 4 til 5 minutter, og der tilsattes 1 30 g natriumhydrogensulfit. Kolben blev lukket tæt og fik lov at henstå ved stuetemperatur i 45 minutter. Opløsningen oxygeneredes derefter i 15 minutter, og et pH på 11,3 indstilledes med natriumhydroxid. Opløsningen opvarmedes til 75°C i 1 time. Reaktionsblandingen afkøledes derefter til stuetemperatur, og der tilsattes 0,6 g tris-(hydroxy-35 methyl)aminomethan efterfulgt af 5 N saltsyre til indstilling af pH på 7,5. Til den fremkomne opløsning tilsattes 1000 internationale enheder alkohol dehydrogenase og 1 ml acetaldehyd. Den faldende optiske tæthed af reaktionsblandingen fulgtes ved 340 nm, og da der ikke iagttoges noget yderligere fald, indstilledes pH pi 3,5. Opløsningen 15 150808 udhældtes i 10 rumfang acetone ved -10°C. Den olie, som dannedes, fraskiltes og vaskedes med ether, hvorefter den opløstes i 10-15 ml vand.

Den fremkomne opløsning indførtes i en 2,5 x 90 cm søjle af 5 Sephadex G-10, der leveres af Pharmacia AB, Uppsala, Sverige, og som var ækvilibreret med vand. Fraktioner med rumfang på 12 ml opsamledes. Bølgelængden for den maksimale optiske absorption i det ultraviolette område og den optiske tæthed ved denne bølgelængde bestemtes for hver fraktion. Den optiske tæthed ved 340 nm bestem-10 tes også for hver fraktion efter reduktion med alkoholdehydrogenase. Fraktionerne, som havde et optisk absorptionsmaksimum ved 264 nm og havde et forhold mellem den optiske tæthed ved 340 nm og den optiske tæthed ved 264 nm på over 0,05, forenedes. Det forenede materiale koncentreredes til fra 15 til 20 ml på en rotationsfordamper 15 og passerede gennem en 2,5 x 28 cm søjle af Dowex 1-X8, som leveres af Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien, ækvilibreret med vand. Yderligere vand tilsattes til at vaske det forenede materiale gennem søjlen, og der opsamledes 10 ml fraktioner. Fraktionerne, som havde et optisk absorptionsmaximum ved 264 nm og havde 20 et forhold mellem den optiske tæthed ved 340 nm og tætheden ved 264 nm på over 0,1, forenedes.

Det forenede materiale blev ført gennem en 5 x 45 cm søjle af Dowex 50-X2, som leveres af BioRad Laboratories, Richmond, Californien, ækvilibreret med vand. Yderligere vand tilsattes til at vaske 25 det forenede materiale gennem søjlen, og der opsamledes 20 ml fraktioner, Fraktionerne, som havde et optisk absorptionsmaximum ved 264 nm og et forhold mellem den optiske tæthed ved 340 nm og den optiske tæthed ved 264 nm på over 0,18, forenedes. Det forenede materiale koncentreredes til fra 4 til 5 ml og rensedes ved elektro-30 forese på følgende måde:

Det koncentrerede materiale påførtes et ark Whatman 3MM papir, som leveres af Reeve Angel, Clifton, New Jersey, i en 1-2 cm bred stribe vinkelret på strømretningen. Papiret befugtedes derefter med 0,02 M natriumphosphat ved pH 6,0. Elektroforese gennemførtes 35 ifølge Durrummetoden med hængende papir som beskrevet i Science 121:829 (1955) i 4-7 timer med en potentiel gradient på ca. 8,5 volt/cm. Placeringen af det ønskede pyridinnucleotidderivat bestemtes ved fluorescens udviklet efter sprøjtning af en prøvestrimmel af papiret med 0,5 M natriumcyanid ifølge den i J. Biol. Chem. 191:447 16 150808 (1951) beskrevne fremgangsmåde. Det areal, som indeholder det ønskede derivat, blev udskåret af papiret og ekstraheret med tre 50 m! rumfang vand. De fremkomne ekstrakter indeholdende nicotinamid- 6-(2-aminoethylamino)purindinukleotid forenedes, koncentreredes til 5 fra 3 til 4 ml og opbevaredes ved -20°C.

B. Nicotinamidadenindinukleotid-biotinkonjugat.

En 16 mg mængde biotin suspenderedes i 1 ml vand indeholdende 22 mg nicotinamid 6-(2-aminoethylamino)purindinukleotid frem-10 stillet som beskrevet ovenfor under punkt A. Nogle få dråber 0,1 N natriumhydroxid tilsattes til fremme af opløsning af biotinet. En 240 mg mængde 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinethyl)carbodiimidmetho1p-tolulensulfonat tilsattes til den fremkomne opløsning og blev bragt i opløsning ved dråbevis tilsætning af 0,1 N saltsyre. Reaktionsblan-15 dingen fik lov at henstå ved stuetemperatur i 5 timer og udhældtes derefter i 10 mi acetone ved -10°C. Den olie, som dannedes, fraskiltes, vaskedes 2 gange med fra 5 til 10 ml ether og opløstes i fra 1 til 2 ml vand. Det fremkomne materiale rensedes ved elektroforese på papir som i eksempel 1. To fluorescerende bånd fremkom efter 20 sprøjtning med natriumcyanid, hvoraf det ene var vandret mod katoden og det andet mod anoden. Det sidste bånd, som indeholdt NAD-biotinkonjugatet, elueredes med vand og opbevaredes ved -20°C.

25 Eksempel 2

Homogen kompetitiv-bioluminescensanalyse; virkning af forskellige biotinniveauer på den dannede maksimale lysintensitet.

Det i dette eksempel anvendte bioluminescensreaktionssystem var baseret på følgende reaktioner: 30 (c) NAD-ligand + ethano! deKycJrc^inase"^ NADH-ligand + acetaldehyd.

(d) NADH-ligand 1 FMN1 ♦ H+ ........

25 NADH-ligand + FMNHg (e) FMNH2 + langkædet aldehyd + 02 Ι·υ-'—Γ-··-> FMN + lang kædet syre + H20 + hu flavinmononukleotid.

17 150808

En lysgenererende opløsning til udførelse af reaktionerne (d) og (e) fremstilledes som følger: En reagensblanding indeholdende 0,13 NI phosphatpuffer ved pH 7,0, 0,67 vægtprocent okseserumalbumin, 15,7 μΜ flavinmononucleotid (FNIN) og 13,3 mM natriumacetat blev 5 fremstillet, og denne blanding opbevaredes i mørke ved -20°C. En emulsion af 5 μΙ dodecanal i 5 ml vand fremstilledes den dag, hvor den lysgenererende opløsning skulle anvendes. Frysetørret luciferase ekstraheret fra Photobacterium fisheri (enzym, som leveres af Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey) tilsattes til 0,013 10 NI phosphatpuffer ved pH 7,3 til en koncentration pi 20 mg/ml. Efter 30 minutter centrifugeredes den resulterende suspension ved 1500 g i 10 minutter, og bundfaldet kasseredes. Den lysgenererende opløsning fremstilledes derefter inden for 5 minutter før brug ved at kombinere 75 μΙ af reagensblandingen, 5 μΙ af dodecanalemulsionen og 20 μΙ af 15 iuciferaseopløsningen.

Til detektering af det ved reaktion (e) dannede lys konstrueredes et fotometer bestående af en fotodetektor og en 6 x 50 mm kuvette anbragt inden i en lysintegrerende kugle, således at lys dannet i kuvetten reflekteredes på fotodetektoren. Det af fotodetek-20 toren dannede elektroniske signal førtes til en baneskriver. Den maksimale lysintensitet i den betydning betegnelsen anvendes heri, måltes ud fra skriverens spor og blev målt i arbitrære enheder baseret på diagrampapirets inddeling.

Der fremstilledes syv specifiktbindende reaktionsblandinger, 25 hver med et samlet rumfang på 0,2 ml og hver indeholdende 0,1 NI tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlroidpuffer med pH 8,0, 0,6 Ni ethanol, 0,01 NI semicarbazidhydrochlorid, 343 nM NAD-biotin-konjugat fremstillet som i eksempel 1, 0,025 internationale enheder alkoholdehydrogenase og 0,055 enheder avidin. Biotin sattes til seks 30 af de syv reaktionsblandinger, dvs. blandingerne med numrene 2-7 i tabel 2, i de i tabellen angivne koncentrationer.

Reaktionsblandingerne inkuberedes ved stuetemperatur i ca. 30 minutter. Et 10 μΙ af hver reaktionsblanding indsprøjtedes i en separat kuvette monteret i det ovenfor beskrevne fotometer indehoi-35 dende 100 μΙ af en lysgivende opløsning fremstillet på den ovenfor beskrevne måde og præinkuberet ved 28°C i 2-3 minutter. Der gennemførtes under hele proceduren dobbeltforsøg, og de gennemsnitlige resultater ses i tabel 1.

150808 18 Tabel 1

Gennemsnitlig

Reaktions- Koncentration af maksimal blanding biotin (nM) lysintensitet 5 1 0 36 2 25 44 3 50 57 4 100 79 5 150 90 10 6 200 97 7 300 104

Det ses således af dette eksempel, at størrelsen af den ved bioluminescensreaktionssystemet dannede maksimale lysintensitet og 15 dermed aktiviteten af NAD i NAD-biotinkonjugatet er en direkte funktion af den tilstedeværende mængde biotin i den specifikke bindingsreaktionsblanding. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor et analysemiddel og en analysemetode til kvantitativ bestemmelse af tilstedeværende af liganden biotin ί et væskeformigt medium 20 under anvendelse af en kompetitiv bindings-bioluminescensanalyse-teknik.

Eksempel 3

Fremstilling af 2,4-dinitrophenyl-ATP konjugat (6-stillingsderivat).

C

N -f2-(2,4-Din?trophenyl)aminoethyljadenosin-5l-triphosphat.

25 g A. N -(2-aminoethyl)adenosin-5'~monophosphat.

To g (7 millimol 6-chlorpurinribosid (som leveres fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) omrørtes med 17 ml triethylphos-phat og omsattes med phosphorylchlorid i nærværelse af vand som 30 beskrevet i Chem. Scrip. 19:165*70 (1972). Efter hydrolyse af phos-phordichloridatet tilsattes 9,5 ml ethyiendiamin (140 mmol) og fik lov at reagere ved stuetemperatur i 3 timer. Reaktionsblandingen fortyndedes til 4 liter med vand, og pH indstilledes til 12 med natriumhydroxid. Opløsningen blev ledt gennem en 5 x 30 cm søjle af Dowex 35 1x8 (som fås fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien) pi acetatformen. Derefter vaskedes søjlen med 3 I 0,01 M ammonium-chlorid, og kromatogrammet udvikledes med en lineær gradient frembragt ud fra 3 liter vand og 3 liter 1 M eddikesyre.

19 150808

En isoleret top af UV-absorberende materiale elueret mellem 1800 ml og 2050 ml af gradienten koncentreredes til ca. 25 ml under vakuum. Medens denne opløsning henstod ved 7°C natten over, dannedes hvide krystaller, og disse opsamledes og tørredes, hvorved 5 der opnåedes et produktudbytte på 65%. En prøve til analyse omkrystalliseredes fra varmt vand.

Beregnet for C12HigN607P.2H20: C:33,8; H: 5,45; N:19,7

Fundet: C:34,3; H: 5,22; N:19,7 10 Separate tyndtlagskromatogrammer fremkaldt med to opløsnings middelsystemer, hvoraf det første bestod af 4 dele 0,5 M ammoniumacetat og 1 del ethanol, og det andet bestod af 3 dele isosmørsyre og 5 dele 1M ammoniumhydroxid, viste begge én komponent, som udslukkede fluorescens og reagerede med ninhydrin. Forbindelsen i 0,1 N 15 saltsyre havde et absorptionsmaksimum ved 264 nm og den millimolære e kstr i ktion s koefficient var 17,7, hvilke spektralegenskaber er ejen- 6 dommelige for N -alkylerede adenosinderivater.

6 B. N “[2-(2,4-dinitrophenyl)aminoethyl]adenosin-5'-monophosphat.

g 20 Der opløstes 250 mg N -[2-(2-aminoethyi)adenosin-5'-monophos-

phat (0,65 millimol) fra del A i dette eksempel i 20 ml vand ved pH

8. Derefter tilsattes 168 mg natriumbicarbonat efterfulgt af 0,2 ml 1-fluor-2,4-dinitrobenzen (1,58 millimol opløst i 2 ml ethanol). Reaktionsblandingen omrørtes i mørke ved stuetemperatur i 4 timer, og 25 derefter tilsattes yderligere 0,1 ml 1-fluor-2,4-dinitrobenzen i 1 ml ethanol. Efter at reaktionsblandingen var blevet omrørt natten over indstilledes den til pH 2,0 med saltsyre og udhældtes i 200 ml ethanol. Det dannede bundfald blev opløst i 200 ml vand, og denne opløsning indstilledes til pH 8,0 med natriumhydroxid og kromato-30 graferedes på en 2,5 x 30 søjle af DEAE-cellulose på bicarbonatform (som leveres fra Reeve Angel, Clifton, New Jersey). Kromatogrammet udvikledes med en lineær gradient frembragt ud fra 1,5 liter vand og 1,5 liter 0,7 M ammoniumbicarbonat. En større top af gult materiale, som absorberede UV-lys, elueredes mellem 1200 og 1500 ml af 35 gradienten. Ammoniumbicarbonat fjernedes ved gentagen inddampning til tørhed, hvorved der opnåedes et udbytte på 40% af det ønskede produkt. Dette produkt vandrede som én gul plet på tyndtlagskromatogrammer udviklet med de samme to opløsningsmidler, som er angivet i del A i dette eksempel, og på epichlorhydrintriethanolamin- 2o 150808 anionbytningspapir udviklet med 0,25 M natriumacetat-eddikesyre-puffer, pH 5,0. J 0,02 N saltsyre havde produktet optiske absorptionsmaksima på 264 nm og 363 nm med millimolære ekstinktions-koeffienter på henholdsvis 21,8 og 14,2.

5 C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-konjugat.

g N -[2-(2,4-dinitrophenyl)aminoethyl)adenosin-5'-monophosphat (fra del B i dette eksempel) (0,3 millimol) omdannedes til pyridi-niumsaltet ved kromatografi på en 1,5 x 20 cm søjle af Dowex 50 x 2 10 på pyridiniumformen (som leveres af Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien). Det gule udløb koncentreredes til tørhed, og der tilsattes 15 ml dimethylformamid og 0,3 millimol tri-n-butylamin. Denne blanding inddampedes til tørhed, og remanensen tørredes yderligere ved gentagen fordampning. Monophosphatmellemproduktet omdannedes 15 derefter til triphosphatformen under anvendelse af den i J. Amer.

Chem. Soc. 87: 1785-8 (1965) beskrevne fremgangsmåde. De reaktionsprodukter, som var opløselige i dimethylformamid, sattes til 250 ml vand, som derefter indstilledes til pH 8,0. Denne opløsning førtes gennem en 2,5 x 58 cm søjle af DEAE-cellulose pi bicarbonatform og 20 kromatogrammet udvikledes med en liniaer gradient frembragt ud fra 3 I vand og 3 I 0,5 M ammoniumcarbonat. Den første eluerede top af gult materiale identificeredes som diphosphatderivatet. En anden top af gult materiale, som elueredes mellem 4,15 og 4,4 liter af gradienten, inddampedes til tørhed, hvorved der fremkom et udbytte på 20% af 25 det ønskede konjugat, som ved analyse viste sig at indeholde 3,0 phosphatrester pr. riboserest.

Eksempel 4

Fremstilling af 2,4-dinitrophenyl-ATP-koniugat (8-stillingsderivat). (8-[2-(2,4-Dinitrophenyl)am?noethyl)am?noadenosin-5l-triphosphat.

30 A. 8-(2-Aminoethyl)aminoadenosin-5'-monophosphat.

En reaktionsblanding bestående af 2,2 millimol 8-bromadenosin-5'~monophosphat fremstillet ved den i Arch. Biochem. Biophys. 163:561-9 (1974) beskrevne fremgangsmåde, 66 millimol ethylendiamin 35 og 25 ml vand opvarmedes i et oliebad ved 140° i 2 timer. Den afkølede blanding indstilledes derefter til pH 11,5 med natriumhydroxid og førtes gennem en 2,5 x 55 cm søjle af Dowex 1x8 (200 - 400 mesh, bicarbonatform). Søjlen vaskedes med 300 ml vand og derefter med en lineær gradient frembragt ud fra 3 liter vand og 150808 .

21 3 liter 0,5 M ammoniumbicarbonat. Absorbansen for udløbet ved 254 nm måltes, og en betydelig top af absorberet materiale elueredes mellem 4,6 og 5,8 liter af gradienten.

Ammoniumbicarbonat fjernedes ved gentagen fordampning (fem 5 gange, 20-30 ml vand hver gang) til tørhed under vakuum, og den endelige remanens opløstes i 20 ml vand ved tilsætning af ammoniumhydroxid til pH 8,0. Opløsningen filtreredes, pH indstilledes til 5.0 med myresyre og fik lov at henstå ved 5°C i én dag. Krystaller, som dannedes, opsamledes, opløstes ved pH 8,0 og omkrystalliseredes 10 ved pH 5,0 med myresyre og fik lov at henstå ved 5°C i én dag.

Krystaller, som dannedes, opsamledes, opløstes ved pH 8,0 og om-krystaJliseredes ved pH 5,0. Udbyttet af det ønskede mellemprodukt var 27%. Ved tyndtlagskromatografisk undersøgelse med et opløsningsmiddel bestående af 4 dele 0,5 M ammoniumacetat og 1 del 15 ethanol vandrede produktet som en enkelt ninhydrinpositiv plet som udslukkede fluorescens. Det optiske absorptionsmaximum i 0,02 N saltsyre var 275 nm, og den mil limolære ekstinktionskoeffient var 17,5, hvilke spektralegenskaber er ejendommelige for alkylerede 8-aminoadenosinderivater.

20 Beregnet for C12H2()N707P.H20: C: 34,0; H: 5,33; N: 23,2

Fundet: C: 34,1; H; 5,28; N: 23,9.

B. 8-[2-(2,4-Dinitrophenyl)aminoethyl]aminoadenosin-5'-monophos-phat.

25 8-(2-Aminoethyl)aminoadenosin-5'-monophosphat fra del A i dette eksempel (0,64 miliimol) opløstes i 20 ml vand ved tilsætning af natriumhydroxid til pH 8,0. Derefter tilsattes 168 mg natriumbicar-bonat efterfulgt af 0,2 mi 1-fluor-4-dinitrobenzen (1,58 miliimol opløst i 2 ml ethanol). Reaktionen omrørtes i 18 timer ved stuetempe- 30 ratur, og derefter tilsattes 0,1 ml 1-fluor-2,4-dinitrobenzen i 1 ml ethanol. Efter omrøring i yderligere 4 indstilledes blandingens pH til 2.0 med saltsyre, og blandingen udhældtes i 200 ml kold acetone (-10°C). Det gule bundfald, som dannedes, opsamledes ved filtrering, opløstes i 200 ml vand og førtes geen 2,5 x 45 cm søjl af 35 DEAE-celiulose i bicarbonatform. Kromatogrammet udvikledes med en lineær saltgradient frembragt ud fra 2 I vand og 2 I 0,7 M ammo-niumcarbonat. En top af gult materiale med et absorptionsmaksimum ved 275 nm elueredes mellem 2 og 3 liter af gradienten. Ammoniumbicarbonat fjernedes fra dette materiale ved inddampning under va- 22 150808 kuum, og udbyttet af det ønskede mellemprodukt var 37%. Optiske absorptionsmaksima milt i Q,02 N saltsyre viste sig ved 275 og 363 nm, og de millimolære ekstinktionskoefficienter var henholdsvis 21,8 og 15,5. Yderligere analyser viste 1,07 phosphatrest pr. riboserest.

5 C. 2,4-Dinitrophenyl-ATP-konjugat.

Monophosphatmeliemproduktet (0,5 millimol) omdannedes til tri-n-butyiammoniumsaltet tilsætning af 0,8 millimol tri-n-butyiamin. Blandingen tørredes ved gentagen fordampning fra tør dimethyl-10 formamid (fire gange, 10-5 ml hver gang). Slutremanensen opløst i 1 ml dimethylformamid blandedes med 2,0 millimol carbonyldiimidazol, også i 1 ml dimethylformamid, og fik lov at reagere ved stuetemperatur i 4 timer. Det overskydende carbonyldiimidazol blev nedbrudt ved omsætning med 15 μΐ methanol i 30 minutter. Endelig tilsattes 3 15 millimol tri-n-butylammoniumpyrophosphat i 4 ml dimethylformamid og fik lov at reagere i 20 timer. Den faste rest, som dannedes, fraskiltes ved centrifugering og vaskedes 2 gange med 5 ml portioner af dimethylformamid. De forenede supernatanter tilsattes til 200 ml vand, som derefter indstilledes til pH 8 og kromatograferedes på en 20 2,5 x 25 cm søjle af DEAE-ceilulose på bicarbonatform. Kromato- grammet udvikledes med en lineær gradient frembragt ud fra 2 liter vand og 2 liter 0,5 M ammoniumbicarbonat. En top af gult materiale med optiske absorptionsmaksima ved 275 og 363 nm elueredes mellem 2,0 og 2,9 liter af gradienten. Ammoniumbicarbonatet fjernedes ved 25 inddampning, hvorved der fremkom et udbytte af det ønskede kon-jugat på 22%. Analyseresultater viste, at dette produkt indeholdt 3,2 phosphatrester pr. riboserest.

Eksempel 5 30 Homogen kompetitiv bindings-bioluminescensanalyse for derivater af 2,4-dinitrophenyl; anvendelse af ATP som mærkningsstof.

Det i dette eksempel anvendte bioluminescensreaktionssystem var baseret på følgende reaktion: 35 ATP-ligand + reduceret luciferin AMP-ligand + oxideret luciferin + hu A. Analyse med anvendelse af 6-stillingsderivat af ATP.

Der fremstilledes tre specif i ktbindende reaktionsblandinger, hver med et samlet rumfang på 100 μΙ og hver indeholdende 10 mM

23 150808 tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer ved pH 7,4, 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre, 20 μΙ 2,4-dinitrophenyl-antiserum, 512 nM 2,4-dinitrophenyl-ATP-konjugat (6-stillingsderivat, fremstillet ifølge eksempel 6) og 2,4-dinitrophenyl-p-alanin ved de i tabel 7 5 angivne koncentrationer. Efter in kubering ved 25°C i 2 timer analyseredes 10 μΙ prøver af hver reaktionsblanding (med dobbeltbestemmelser) ved indsprøjtning i et rumfang på 0,1 ml af ovenstående lysgenererende opløsning, som i forvejen havde været inkuberet ved 25°C i mindst to minutter og var indeholdt i et reagensglas 10 monteret i et Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E.l. duPont de Nemours, Willmington, Delaware). Den maksimale lysintensitet aflæstes fra fotometeret. Den gennemsnitlige lysintensitet for hver reaktionsblanding beregnedes ligesom den relative intensitet (100% gange forholdet mellem prøvens gennemsnitlige lysintensitet og 15 lysintensiteten i fravær af antiserum). Resultaterne er anført i tabel 2.

Tabel 2

Koncentration af Gennemsnitlig 20 Reaktions- 2,4-dinitrophenyl- maksimal blanding β-alanin (μΜ) lysintensitet 1 0 7 2 25 14 3 2500 185 25 B. Analyse med anvendelse af et 8-stillingsderivat af ATP.

Fire specif i ktbindende reaktionsblandinger fremstilledes, hver med et totalt rumfang på 100 μΙ og hver indeholdende 20 mM tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer ved pH 7,4, 10 mM 30 ethylendiamintetraeddikesyre, 20 μΙ 2,4-dinitrophenyl-antiserum, 594 nM 2,4-dinitrophenyl-ATP-konjugat (8-stillingsderivat, fremstillet ifølge eksempel 7) og 2,4-dinitrophenyl-p-alanin ved de i tabel 8 angivne koncentrationer. Efter inkubering ved 25°C i 2 timer gennemførtes dobbeltbestemmelser af 10 μΙ prøver af hver reaktions-35 blanding som i ovenstående del A, og den gennemsnitlige maksimale lysintensitet beregnedes for hver prøve. Resultaterne er anført i tabel 3.

Tabel 3 24 150808

Koncentration af Gennemsnitlig

Reaktions- 2,4-dinitrophenyl- maksimal 5 blanding β-alanin (μΜ) lysintensitet 1 0 18 2 25 51 3 250 191 4 2500 190 10

Resultaterne af dette eksempel viser, at mærkningsstoffet, ATP, kan derivatiseres i forskellige stillinger af dets struktur til fremstilling af et brugbart konjugat til brug ved den specifikke bindingsanalysemetode ifølge opfindelsen.

15

Eksempel 6

Fremstilling af biotin-isoluminolkonjugatet 6-(3-biotinylamido-2-hydroxypropylamin)- 2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion.

20 A. 4-(3-Chlor-2-hydroxypropylamino)-N-methylphthalimid.

25 g (0,142 mol) 4-amino-N-methylphthalamid fremstillet ved den i J. Chem. Soc, 26: (1937) beskrevne fremgangsmåde og 20,7 g (0,21 mol) 1-chlor-2,3-epoxypropan sattes til 150 ml 2,2,2-trifIuor-25 ethanol, og reaktionsblandingen opvarmedes ti! reflux under omrøring i 48 timer. 70-80 ml 2,2,2-TrifluorethanoI fjernedes ved destillation, og der dannedes et kraftigt gult bundfald, da den resterende opløsning afkøledes til stuetemperatur. Dette bundfald opstemmedes i ethylacetat, opsamledes ved filtrering og tørredes, hvorved der 30 fremkom 29,5 g (77% udbytte) af det ønskede mellemprodukt med smp. 136 - 138,5°C.

Beregnet for C^H^CIN^O^: C: 53,64; H: 4,88; N: 10,45.

Fundet: C: 53,87; H: 4,85; N: 10,81.

35 B. 4- [3-(N-phthalamido)-2-hydroxypropylamin j -N-methylphthal- imid.

Det i del A fremstillede mellemprodukt (13,5 g, 0,05 mol) og 15,7 g (0,085 mol) kaliumphthalimid opvarmedes til kogning under tilbagesvaling og omrøring i 150 ml dimethylformamid i 24 timer.

25 150808

Dimethylformamidet fjernedes, og remanensen vaskedes med vand og filtreredes. Den gule filterkage om krystal I i seredes fra eddikesyre-vand, hvorved der fremkom 12,8 g (67% udbytte) produkt, smp. 247-248,5°C.

5 Beregnet for C20H17N3°5: C: 63/32; H: 4,52; N: 11,08,

Fundet: C: 63,16; H; 4,38; N: 10,93.

C. 6-[3-Amino-2-hydroxypropylamino]-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion.

10 Mellemproduktet fra del B (5,0 g, 13,2 millimol), 90 ml absolut ethanol og 35 ml 95% hydrazin blev opvarmet under tilbagesvaling og omrøring i 4 timer. Opløsningsmidlet fjernedes under vakuum, og det fremkomne faste stof tørredes i 24 timer under vakuum ved 120°C.

Dette materiale omrørtes i 1 time med 70 ml 0,1 N saftsyre. Den 15 uopløselige 2,3-dihydroxyphtha!azin-1,4-dion fjernedes ved filtrering, og filtratet indstilledes til pH 6,5 med mættet natriumbicarbonat. Det hvide bundfald, som dannedes, opsamledes ved filtrering og tørredes, hvorved der fremkom 2,2 g af produktet (67% udbytte). Efter om kry stal I isation fra vand dekomponerede forbindelsen ved 273°C.

20 Beregnet for C: 52,79; H: 5,64; N: 22,39.

Fundet: C: 52,73; H: 5,72; N: 22,54.

D. Biotin-isoluminol-konjugat.

Biotin (0,29 g, 1,2 millimol) og 0,17 ml triethylamin opløstes i 25 20 ml tør dimethylformamid under vandfrie betingelser og afkøledes til -10°C. En opløsning af 0,141 ml ethylchlorformiat i 2,86 ml ether tilsattes langsomt, og reaktionen omrørtes i 30 minutter. Et bundfald, som dannedes, fraskiltes ved filtrering. En suspension bestående af 600 mg (2,4 millimol) af mellemproduktet fra del C, 20 ml 30 tør dimethylformamid og 1 mi tør pyridin tilsattes hurtigt til filtratet.

Denne blanding omrørtes ved -10°C i 30 minutter og derefter ved stuetemperatur natten over. I løbet af dette tidsrum fremkom der en opløsning. Dimethylformamidet fjernedes ved destillation ved 60°C og 0,10 mm Hg-tryk. Den olieagtige remanens omrørtes med 50 ml 0,1 N 35 saltsyre i 1 time. Et hvidt fast stof, som dannedes, frafiltreredes og vaskedes med 0,1 N saltsyre og derpå med vand. Efter tørring under vakuum ved stuetemperatur natten over fremkom der 0,55 g (97% udbytte) af produktet, smp. 170-173°C.

Beregnet for C21H28N6°5S: C: 52,92; H: 5,92; N: 17,64.

Fundet: C: 51,69; H: 5,90; N: 17,63.

.26 150808

Eksempel 7

Homogen kompetftiv bindings-chemoluminescensanalyse for biotin.

Det i dette eksempel anvendte chemoluminescensreaktionssystem 5 var baseret pi følgende reaktion: biotin-isolumlnol + ^2°2 -^ biotin-aminophthalat + Ng + hu

Seksten specifiktbindende reaktionsblandinger fremstilledes/ 10 hver med et samlet rumfang pi 150 μΐ og hver indeholdende 0,1 M tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid ved pH 8,0, 42 nM biotin-luminolkonjugat (fremstillet som i eksempel 9), biotin i de i tabel 9 angivne koncentrationer og 0,12 enheder/ml avidin (tilsat sidst). Efter inkubering ved 25°C i 5 minutter indsprøjtedes 10 μΙ 15 dimethyiformamid indeholdende 0,15 M kaiiumperoxid (KgOg) (som leveres fra Alpha Products, Beverley, Massachusetts) og 0,10 M 1,4,7,10,13,16-hexaoxyacylcooctadecan (der er opnåelig fra Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) i hver reaktionsblanding.

Efter inkubering ved 25°C i yderligere 2 minutter indsprøjtedes 20 10 μΙ 0,95 .mM hydrogenperoxid i 10 mM tris-(hydroxymethyl)amino- methanhydrochloridpuffer med pH 7,4 i hver reaktionsblanding, og den maksimale lysintensitet, som frembragtes i hver blanding, måltes under anvendelse af et Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E.l. duPont de Nemours, Willmington, Delaware). Resultaterne er 25 anført i tabel 4.

27 150808

Tabel 4

Reaktions- Koncentration af Maksimal lysblanding biotin (nM) intensitet 1 0 38,5 5 2 13 38,5 3 27 34,3 4 40 36,1 5 53 35,2 6 67 36,2 10 7 101 34,0 8 133 31,7 9 166 29,1 10 200 24,2 11 267 22,8 15 12 333 20,5 13 400 13,4 14 534 8,6 15 667 8,3 16 800 7,0 20

Det påvistes, at størrelsen af den maksimale lysintensitet, som blev frembragt af kemoluminescensreaktionssystemet, var en omvendt funktion af den i den specifiktbindende reaktionsblanding tilstedeværende mængde biotin. Den foreliggende opfindelse tilveje-25 bringer derfor et analysemiddel og en anaiysemetode til bestemmelse af tilstedeværelsen af liganden biotin i et væskeformigt medium ved anvendelse af en kompetitiv kemoiuminescens-bindingsanalyseteknik, som ikke benytter en enzymkatalyseret kontrol reaktion.

30 Eksempel 8

Heterogen kompetitiv bioluminescens-bindingsanalyse for biotin; virkning af forskellige biotinindhold på den dannede maksimale lysintensitet.

35 Det i dette eksempel anvendte bioluminescensreaktionssystem var baseret på de i eksempel 2 viste reaktioner.

A. Fremstilling af en lysgenererende opløsning.

En lysgenererende opløsning fremstilledes som i eksempel 2.

,28 150808 B. Fremstilling af uopiøseliggjort bindingspartner.

Avidin, som har bindingsaffinitet for biotin, blev uopiøseliggjort ved at blive covalent bundet til vanduopløseligt polymert kuglemateriale på følgende måde. En portion Sepharose 4B (som leveres fra 5 Pharmacia AB, Uppsala, Sverige) aktiveredes til binding til avidirt under anvendelse af den af March m.fl. i Analytical Biochemistry 60:149 (1974) beskrevne fremgangsmåde. Ca. 4 ml af det aktiverede Sepharose 4B suspenderedes i 8 ml 0,1 M citratpuffer med pH 7,0.

Til suspensionen sattes 6 mg avidin med en aktivitet på 9,9 enheder/ 10 mg i 3 ml vand. Én enhed avidinaktivitet er den mængde avidin, som er i stand til at binde 1 pg biotin. Den fremkomne reaktionsblanding omrørtes i 6 timer ved 7°C. Det avidinbundne Sepharose 4B frafiltre-redes derefter, vaskedes med 100 ml 0,1M natriumbicarbonatpuffer ved pH 9,0 og resuspenderedes i 240 ml 0,1 M tris-(hydroxymethyl)-15 aminomethanhydrochloridpuffer med pH 8,0.

C. Kontrolforsøg.

Der fremstilledes ni specif i ktbindende reaktionsblandinger, hver med et samlet rumfang på 0,19 ml og hver indeholdende 0,1 M tris-20 (hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer med pH 8,0, 0,6M

ethanol, 0,01 M semicarbazidhydrochlorid, og de i tabel 10 angivne respektive mængder eller koncentrationer af NAD, NAD-biotinkonju-gat, avidin-bundet Sepharose 4B suspension (fremstillet ifølge del B i dette eksempel) og Sepharose 4B suspension (fremstillet ved sus-25 pension af 1 ml pakket Sepharose 4B i 60 ml 0,1 M tris-(hydroxy- methyOaminomethanhydrochloridpuffer med pH 8,0). Reaktionsblan dingerne rystedes derefter forsigtigt i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsattes 0,22 internationale enheder alkoholdehydro-genase til hver reaktionsblanding til initiering af reduktionsreak-30 tionen. Semicarbazid reagerer med det ved reaktion (c) dannede acetaldehyd under dannelse af en semicarbazon, og dermed drives reaktion (c) i den ønskede retning.

Reaktionsblandingerne omrystedes igen i 15 minutter ved stuetemperatur. En 10 μΙ prøve af supernatanten fra hver reaktionsblan-35 ding indsprøjtedes derpå i en separat kuvette monteret i et Dupont Model 760 Bioluminescence Photometer (E.l. duPont de Nemours, Willmington, Delaware) indeholdende 100 μΙ af den tidligere fremstillede lysgenererende opløsning, som var blevet præinkuberet i 2-3 minutter ved 25°C. Resultaterne er anført i tabel 5.

29 150808 70

(D

αι x cooo^icncnj^wpo-i-.

ο 3 *

Z 3 > O

i i ro i i i ro i\3 i D 2 _i -> Γ+

—v 3 Ο ID

3 r+ 2 5’ ^ 3 0) —h Z * > 3 (Ω ? 8 ^ ° r+ 5‘ 3- ? a 2 z4 3 r+ s X o '—'On 2. n H c EL ω σ fD_ w (Λ > Oi C CD < W ΊΟ -.

Ό 3- Q; j ΓΟΙ ΙΓΟΙ I ΓΟ I I 2 K 3’ Ο ο o w ο σ ° 8 § t* Φ g oo ft w (/) C CD (Λ XJ Ό 3Γ 1-,-,1 I I I I I 2 2

° ° W O

n‘ w § ® ς' ro l< s w £.

3 V)

-,0100-,014^01^25 cn -fc. ·' o “vjcoro-^HL

ui to 2.

H· fl> r+ 30 150808

Resultaterne af kontrolreaktionerne 1 og 9 viser, at der i fravær af NAD og NAD-biotinkonjugat dannedes meget lidt lys. Reaktionerne 2 og 3 gav resultater, som indicerer, at den lysdannende reaktion forekom efter tilsætning af frit NAD, og at denne 5 reaktion var stort set upåvirket af tilstedeværelsen af avidinbundet Sepharose 4B. Resultaterne af reaktionerne 4, 5 og 6 viser, at NAD-biotinkonjugatet var aktivt i den lysproducerende reaktion, at den dannede maksimale lysintensitet øgedes, jo mere NAD-biotinkonjugat, der var til stede, og at tilstedeværelsen af avidinbundet 10 Sepharose 4B inhiberede lysdannelsen. Sammenligning af resultaterne for reaktionerne 3 og 5 med resultaterne for 7 og 8 viser, at den lysproducerende reaktion ikke påvirkedes af tilstedeværelsen af ikke-modificeret Sepharose 4B.

15 D. Analysemetode.

Yderligere fem specifiktbindende reaktionsblandinger fremstilledes, hver med et rumfang på 0,19 ml og hver indeholdende 0,1 M tris-(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer med pH 8,0, 0,6 IVl ethanol, 0,01 semicarbazid og de i tabel 6 angivne respektive 20 mængder eller koncentrationer af NAD-biotinkonjugat, frit biotin og avidinbundet Sepharose 4B suspension. Hver reaktionsblanding behandledes på samme mide som kontroireaktionsblandingerne i del C i dette eksempel. Resultateterne er anført i tabel 6.

31 150808 73

CD

CU

7Γ _ι _» _i _i _i <i t» w ro -i o o 0 2 ^ > § *> ? i ro ru ru ru rutucr?

—i —i —i _i r+ -J

0 1 3 £+ S χ- o

' O T

U

1 4

O

S n tn tn to ' 1 ϋ. 3 00 oo 3 ς· 0) ^ Γ+ g ° S 3

^ H

0) 01 -** σ ro O) w C/5 > C CD < t/> "D —.

n rr Q.

1 ru ru iu i § ^ 5' 0 0 0 w o er x w c 2 ro 3 e W ft \< s m ro 5’ ^ •"J tn -i 'J J? 3* tD tD W <D t Ξ > > > S > m* Ui ^ to ^ -i 2, H* m r+ 32 150808

Resultaterne af reaktionerne 11, 12 og 13 viser, at frit biotin og NAD-biotinkonjugat konkurrerer om bindingspladserne på det uopløseliggjorte avidin eftersom den dannede maksimale lysintensitet afhang af den tilstedeværende mængde af frit biotin. Reaktionerne 10 5 og 14 gav resultater, som indicerer, at den dannede maksimale lys-intensitet i fravær af uopløseliggjort avidin var konstant for meget forskellige koncentrationer af frit biotin.

Det er således i dette eksempel påvist, at mængden af NAD-biotinkonjugat i væskefasen var omvendt forbundet med den 10 tilstedeværende mængde fri biotin, og dermed er anaiysemetoden og -midlet ifølge opfindelsen anvendeligt til bestemmelse af en ligand i en ukendt væskeprøve.

Claims (6)

150808

1. Specifik bindings-analysefremgangsmåde til analyse af et væskeformigt medium for en ligand af typen: antigener og hertil 5 svarende antistoffer, haptener og hertil svarende antistoffer samt hormoner, vitaminer, metabolitter og farmakologiske midler samt deres receptorer og bindingssubstanser, hvilken fremgangsmåde omfatter: 1. at det væskeformige medium kontaktes med reagensmidler, 10 der omfatter et mærket konjugat, hvorved der dannes en bundet form af det mærkede konjugat og en fri form af det mærkede konjugat, hvorhos forholdet mellem den resulterende bundne form af det mærkede konjugat i relation til den frie form er en funktion af ligandens koncentration i 15 det væskeformige medium, og 2. at mængden af mærkningssubstans i den resulterende bundne form eller den resulterende frie form bestemmes, kendetegnet ved, at der som mærkningssubstans anvendes en kemiluminiscent substans.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at aktiviteten af den som mærkningssubstans benyttede kemilumini-scente substans i den bundne form er forskellig fra den i den frie form.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, 25 at fremgangsmåden er af den homogene type, ved hvilken kemilumi- niscensaktiviteten i den væskeformige reaktionsblanding males, uden at det mærkede konjugats bundne og frie form adskilles.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fremgangsmåden er af den heterogene type, ved hvilken det 30 mærkede konjugats resulterende bundne og frie form adskilles, og at kemiluminiscensaktiviteten bestemmes på en af dem.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den kemiluminiscente substans er luminol eller isoiuminoi eller et derivat heraf.

6. Reagensmiddel til anvendelse ved den specifikke bindingsana lysefremgangsmåde ifølge krav 1, hvilket reagensmiddel omfatter: 1. et konjugat af en mærkningssubstans og liganden eller en specifik bindingsanalog hertil, og 2. en bindingspartner til liganden