JP2003070499A - cAMP及びcGMPの同時高感度測定法 - Google Patents
cAMP及びcGMPの同時高感度測定法Info
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Abstract
料中のcAMP及びcGMP量を同時に高感度で定量で
きる測定方法を提供すること。 【解決手段】 生物学的試料中のGMP、AMP、AD
P及びATPを、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ
及びアデノシンデアミナーゼを用いて分解し、次いで、
試料中のGDPを、クレアチンキナーゼ及びクレアチン
−1リン酸を用いてGTPに変換し、反応液中に残存す
るGTPをカラム吸着処理した後、選択的に溶出させた
cAMP及びcGMPをを、環状ヌクレオチド選択性ホ
スホジエステラーゼを用いて、それぞれAMP及びGM
Pに変換し、次にADP及びGDPに変換して、続いて
酵素増幅反応システムによりATP及びGTPに変換す
る際に生成する各ピルビン酸を2−ヒドロキシニコチン
アルデヒドに変換して、蛍光強度を測定する。
Description
内在する非環状アデニンヌクレオチド類及び非環状グア
ニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であ
るcAMP及びcGMPを同時に分離する方法や、該分
離方法により分離された同一サンプルにおけるcAMP
及びcGMPの測定方法や、該測定方法に用いる同一サ
ンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定用キットに
関する。
も細胞内シグナリングの起点となる物質であり、細胞内
二次メッセンジャーといわれている。また、心筋細胞な
どではcAMPのシグナリング経路とcGMPのシグナ
リング経路が、陰陽の関係にあると考えられている。従
って、両環状ヌクレオチドによって調節を受ける細胞機
能発現や遺伝子発現を研究する際には、細胞レベルでこ
れらの量的変化を高感度にかつ正確に比較検討する必要
がある。
れらに特異的な抗体を用いた高感度なラジオイムノアッ
セイ法やエンザイムイムノアッセイ法が開発されてきた
が、被爆の可能性や検量線が対数的で微細な変化をとら
えるのが困難であり、また同時に測定することができな
いといった問題を抱えてきた。また、精度が悪く、かつ
多大な時間を要する等の欠点があった。最近、酵素増幅
法を用いた高感度蛍光測定法が開発され、cAMPの定
量法については杉山ら(Anal. Biochem., 218,20-25, 1
994)が、cGMPの定量法については瀬谷ら(Anal. B
iochem., 272,243-249, 1999)が既に報告している。こ
れらの方法では検量線が直線的に得られるため、微細な
変化をとらえることができる。しかし、細胞内cAMP
やcGMPは、ホスホジエステラーゼで迅速に分解され
るため、基底状態ではそれぞれ平均50fmol/m
g、5fmol/mgとごく微量しか存在しない。従っ
て、前処理や測定手法が異なると、夾雑物などによる影
響も異なるため、cAMPやcGMPの微細な変化を同
時にかつ正確にとらえ、比較検討するには困難が生じて
いた。
ド類を含む生物学的試料中のcAMP量またはアデニル
酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用することなく迅
速に測定する方法として、特開2000−262296
号公報には、内因性アデニル酸シクラーゼによって生成
されるcAMPと、ATP、AMP、ADPおよびこれ
らの混合物からなる群から選択される内因性の非環状ア
デニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のcAMP
量またはアデニル酸シクラーゼ活性を測定するため、
(1)上記試料中のcAMP以外の内因性非環状アデニン
ヌクレオチドおよびグルコース-6-リン酸を酵素的に除
去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよ
びアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、(2)c
AMPをAMPに酵素的に変換し、(3)放射性物質を用
いることなくAMPの量を測定する方法が記載されてい
る。
発現に関与する細胞内シグナリング物質であるcAMP
やcGMPは、細胞内に極微量しか存在しないので、こ
れまではラジオイムノアッセイ法とかエンザイムイムノ
アッセイ法で測定されていたが、検量線が対数的であり
微細な変化を正確に捉えることが難しく、また、同一試
料中のcAMP及びcGMPの両者を同時に測定できな
いという問題があった。本発明の課題は、細胞や組織等
の生物学的試料における同一試料中のcAMP及びcG
MP量を同時に高感度で定量できる測定方法を提供する
ことにある。
解決するために鋭意検討し、同一試料中のcAMP及び
cGMP量を同時に高感度で定量する方法として、酵素
蛍光法に注目したが、この酵素蛍光法の適用における最
大の問題は、試料中に混在するcAMPやcGMP以外
の非環状アデニン及びグアニンヌクレオチド類等の測定
妨害物質の効率的除去の点にあり、この問題は酵素反応
と弱アニオン性イオン交換カートリッジを組み合わせる
ことにより解決することができ、cAMPとcGMPを
同時に精製できることを見い出した。また、cAMPと
cGMPを同時に定量するために、それぞれ酵素増幅法
で増幅された結果生成するピルビン酸量を同時に蛍光定
量することにより、cAMPは1fmol、cGMPは
5fmolから直線的に検量線を引くことができ、cA
MPは0.1×1018mol(0.1amol)、cG
MPは0.5×1018mol(0.5amol)という
高感度で正確に定量することができることを見い出し
た。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったも
のである。
する非環状アデニンヌクレオチド類及び非環状グアニン
ヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であるc
AMP及びcGMPを同時に分離する方法であって、試
料中のGMP、AMP、ADP及びATPを、アピラー
ゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナー
ゼを含むクリーニング1反応液を用いて分解し、次い
で、試料中のGDPを、クレアチンキナーゼ及びクレア
チン−1リン酸を含むクリーニング2反応液を用いてG
TPに変換し、反応液中に残存するGTPをカラム吸着
処理した後、cAMP及びcGMPを選択的に溶出させ
ることを特徴とするcAMP及びcGMPの同時分離方
法(請求項1)や、クリーニング1反応液を用いての分
解反応を、塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液中
で行うことを特徴とするcAMP及びcGMPの同時分
離方法(請求項2)や、クリーニング2反応液を用いて
のGTPへの変換反応を、トリス塩酸緩衝液中で行うこ
とを特徴とするcAMP及びcGMPの同時分離方法
(請求項3)や、カラム吸着処理に弱アニオン性イオン
交換カートリッジを用いることを特徴とする請求項1〜
3のいずれか記載のcAMP及びcGMPの同時分離方
法(請求項4)や、選択的に溶出されたcAMP及びc
GMP含有画分を、遠心濃縮することを特徴とする請求
項1〜4のいずれか記載のcAMP及びcGMPの同時
分離方法(請求項5)や、生物学的試料に、ホスホジエ
ステラーゼ阻害剤の存在下に前処理を施すことを特徴と
する請求項1〜5のいずれか記載のcAMP及びcGM
Pの同時分離方法(請求項6)に関する。
載のcAMP及びcGMPの同時分離方法により得られ
るcAMP及びcGMP含有試料を、環状ヌクレオチド
選択性ホスホジエステラーゼを用いて、それぞれAMP
及びGMPに変換するStep1、Step1で生成す
るAMP及びGMPをそれぞれADP及びGDPに変換
するStep2、Step2で生成するADP及びGD
PをそれぞれATP及びGTPに変換するStep3、
Step3の酵素増幅法により生成する各ピルビン酸を
2−ヒドロキシニコチンアルデヒドに変換するStep
4、Step4で生成する2−ヒドロキシニコチンアル
デヒドの蛍光強度を測定することを特徴とする同一サン
プルにおけるcAMP及びcGMPの測定方法(請求項
7)や、Step1でそれぞれカルモジュリン及び3,
5−サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエステラ
ーゼを用い、Step2でミオキナーゼ又はグアニル酸
キナーゼを用い、Step3でそれぞれホスホエノール
ピルビン酸、ピルビン酸キナーゼを用い、Step4で
それぞれ乳酸脱水素酵素を用いることを特徴とする請求
項7記載の同一サンプルにおけるcAMP及びcGMP
の測定方法(請求項8)や、失活させた環状ヌクレオチ
ド選択性ホスホジエステラーゼを用いて測定した蛍光強
度をバックグラウンドとすることを特徴とする請求項7
又は8記載の同一サンプルにおけるcAMP及びcGM
Pの測定方法(請求項9)に関する。
記載の同一サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測
定方法に用いることができ、前記クリーニング1反応液
及びクリーニング2反応液調製用試薬、並びに前記St
ep1〜4の各反応液調製用試薬を含有することを特徴
とする同一サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測
定用キット(請求項10)や、アピラーゼ、アルカリホ
スファターゼ及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化
マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニ
ング1反応液調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びク
レアチン−1リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるク
リーニング2反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、
塩化カルシウム、カルモジュリン及び3,5−サイクリ
ックヌクレオチドホスホジエステラーゼを含むトリス塩
酸緩衝液からなるStep1反応液調製用試薬と、塩化
マグネシウム、塩化カリウム、ATP、クレアチン−1
リン酸、ミオキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むト
リス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリ
ウム、ATP及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸
緩衝液からなるStep2反応液調製用試薬と、塩化マ
グネシウム、フルクトース、ホスホエノールピルビン
酸、ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン
酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグ
ネシウム、コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチ
オスレイトール、補酵素A、ピルビン酸キナーゼ及びコ
ハク酸チオキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるS
tep3反応液調製用試薬と、NADH及び乳酸脱水素
酵素を含むイミダゾール緩衝液からなるStep4反応
液調製用試薬とを含有することを特徴とする請求項10
記載の同一サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測
定用キット(請求項11)に関する。
同時分離方法としては、各種動物細胞や生体組織等の生
物学的試料中に内在するAMP、ADP、ATP等の非
環状アデニンヌクレオチド類やGMP、GDP、GTP
等の非環状グアニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌク
レオチド類であるcAMP及びcGMPを同一試料から
同時に分離する方法であって、試料中のGMP、AM
P、ADP、ATP等をアピラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むクリーニング
1反応液を用いて分解し、次いで、試料中のGDPをク
レアチンキナーゼ及びクレアチン−1リン酸を含むクリ
ーニング2反応液を用いてGTPに変換し、生成したG
TPを含め反応液中に残存するGTPをカラム吸着処理
した後、cAMP及びcGMPを選択的に溶出させるc
AMP及びcGMPの同時分離方法であれば特に制限さ
れるものではない。
等を例示することができ、これら生物学的試料に、イソ
ブチルメチルキサンチン(IBMX)、ペントキシフィ
リン、テオフィリン等のキサンチン誘導体、フェノチア
ジン、ビンポセチン、シロスタミド、ミルリノン、トレ
キンシン、インドリダン、クアジノン、ロリプラム、ザ
プリナスト、ジピリダモール、パパベリンなどのホスホ
ジエステラーゼ阻害剤の存在下にあらかじめ前処理を施
すことが好ましく、かかる前処理としてはcAMP及び
cGMPの分解を防ぐ上記ホスホジエステラーゼ阻害剤
又はトリクロロ酢酸(TCA)を含む生理溶液中でのイ
ンキュベーションを挙げることができる。また上記生理
溶液としては、体液と等張の塩類混合液で、血漿に極く
近い、イオン、浸透圧、pHが調整された、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリ
ウムの混合液であるリンガー(リンゲル)液、該リンガ
ーにブドウ糖等が添加されたタイロード液等を用いるこ
とができる。さらに、生体試料中のcAMP及びcGM
P含量を亢進させる目的で、一酸化窒素(NO)ドナ
ー、例えば、三硝酸グリセリン(GTN)、四硝酸ペン
タエリトリチル(PETN)、一硝酸−5−イソソルビ
トール(ISMN)、二硝酸イソソルビトール(ISD
N)、六硝酸マンニトール、六硝酸イノシトール、硝酸
プロパチル、硝酸トロール、ニコランジル等の有機硝酸
エステル、亜硝酸イソアミル、チオ亜硝酸エステル、チ
オ硝酸エステル等の有機亜硝酸エステル、S−ニトロソ
−N−アセチル−D,L−ペニシラミン(SNAP)等
のS−ニトロソチオール、ニトロソタンパク質、一酸化
窒素放出性フロキサン誘導体、メソカルブ、モルシドミ
ン等の一酸化窒素放出性シドノニミン誘導体、鉄−ニト
ロシル化合物、ニトロプルシッド−ナトリウム等のニト
ロシル錯体化合物で処理したり、カテコールアミンの一
種で交感神経刺激剤としての作用が確立しているイソプ
ロテレノールで処理することもできる。
反応は、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、アデノ
シンデアミナーゼに加えて塩化マグネシウムを含むトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.0)中で行うことが好ましく、
かかる酵素による分解反応後に、例えば90℃10分間
の加熱により酵素類を失活させることが好ましい。ま
た、上記クリーニング2反応液を用いてのGDPのGT
Pへの変換は、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−1
リン酸を含むトリス塩酸緩衝液(pH8.0)中で行う
ことが好ましく、かかる酵素による変換反応後に加熱に
より酵素類を失活させることが好ましい。クリーニング
1反応液により試料中のGMP、AMP、ADP、AT
P等を分解した後、クリーニング2反応液を用いて試料
中のGDPをGTPに変換し(化1参照)、生成したG
TPを含め反応液中に残存するGTPはカラム吸着処理
により除去されるが、かかるカラム吸着処理としてはG
TPを選択的に吸着し、cAMP及びcGMPを溶出し
うる処理であれば特に制限されず、例えばSEP−PA
K NH2カートリッジ等の弱アニオン性イオン交換カー
トリッジを用いる処理を挙げることができる。このよう
に、選択的に溶出されたcAMP及びcGMP含有画分
は、cAMP及びcGMPが分解されない温度、例えば
60℃で遠心濃縮することが好ましい。
分離方法により得られるcAMP及びcGMPを含有す
るサンプル中のcAMP及びcGMPは、本発明の同一
サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定方法によ
り、cAMPは0.1×10 18mol(0.1amo
l)、cGMPは0.5×1018mol(0.5amo
l)という高感度で正確に定量することができる。かか
る本発明の測定方法としては、同一サンプル中に含まれ
るcAMP及びcGMPを、3,5−サイクリックヌク
レオチドホスホジエステラーゼ等の環状ヌクレオチド選
択性ホスホジエステラーゼを用いて、それぞれAMP及
びGMPに変換するStep1(化2参照)と、Ste
p1で生成するAMP及びGMPをそれぞれADP及び
GDPに変換するStep2(化3参照)と、Step
2で生成するADP及びGDPをそれぞれATP及びG
TPに変換するStep3(酵素増幅反応;化4参照)
と、Step3の酵素増幅法により生成する各ピルビン
酸を2−ヒドロキシニコチンアルデヒドに変換するSt
ep4(化5参照)と、Step4で生成する2−ヒド
ロキシニコチンアルデヒドの蛍光強度を測定する方法で
あれば特に制限されるものではなく、蛍光強度を励起波
長(em)370nm、蛍光波長(ex)460nmで
測定して蛍光定量することにより、cAMPは1fmo
l、cGMPは5fmolから直線的に検量線を引くこ
とができる。
cGMP測定の場合とも、カルモジュリン及び3,5−
サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエステラー
ゼ、好ましくはさらに塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Step2のcA
MP測定の場合に、ミオキナーゼ好ましくはさらに塩化
マグネシウム、塩化カリウム、ATP、クレアチン−1
リン酸、クレアチンキナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液
を用い、Step2のcGMP測定の場合に、グアニル
酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、塩化カ
リウム、ATP等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、St
ep3のcAMP測定の場合に、ホスホエノールピルビ
ン酸、ピルビン酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネ
シウム、フルクトース、ジチオスレイトール、ヘキソキ
ナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Step3の
cGMP測定の場合に、ホスホエノールピルビン酸、ピ
ルビン酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、
コハク酸、ジチオスレイトール、補酵素A、コハク酸チ
オキナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Step
4でcAMP測定及びcGMP測定の場合とも、乳酸脱
水素酵素好ましくはさらにNADH等を含むイミダゾー
ル緩衝液を用いることが望ましい。
MP及びcGMPの測定方法において、上記3,5−サ
イクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ等の環状
ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼに代えて、加
熱等により失活させた環状ヌクレオチド選択性ホスホジ
エステラーゼを用いて測定した蛍光強度をバックグラウ
ンドとして検量線を作成することにより、より一層正確
に同一サンプルにおけるcAMP及びcGMPを測定す
ることができる。
びcGMPの測定用キットとしては、上記本発明の同一
サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定方法に用
いることができ、前記クリーニング1反応液及びクリー
ニング2反応液調製用試薬、並びに前記Step1〜4
の各反応液調製用試薬を含有するものであればどのよう
なものでもよく、例えば、アピラーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化マグ
ネシウムを含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング
1反応液調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びクレア
チン−1リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリー
ニング2反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化
カルシウム、カルモジュリン及び3,5−サイクリック
ヌクレオチドホスホジエステラーゼを含むトリス塩酸緩
衝液からなるStep1反応液調製用試薬と、塩化マグ
ネシウム、塩化カリウム、ATP、クレアチン−1リン
酸、ミオキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むトリス
塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリウ
ム、ATP及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸緩
衝液からなるStep2反応液調製用試薬と、塩化マグ
ネシウム、フルクトース、ホスホエノールピルビン酸、
ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キ
ナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシ
ウム、コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチオス
レイトール、補酵素A、ピルビン酸キナーゼ及びコハク
酸チオキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるSte
p3反応液調製用試薬と、NADH及び乳酸脱水素酵素
を含むイミダゾール緩衝液からなるStep4反応液調
製用試薬とを含有する、同一サンプルにおけるcAMP
及びcGMPの測定用キットを具体的に挙げることがで
きる。
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例1(本発明のcAMP、cGMPの同時測定) 1−1 非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除
去 各種濃度のcAMP、cGMPに、濃度5〜10nmo
lのそれぞれAMP、ADP、ATPからなる非環状ア
デニンヌクレオチド類、及びそれぞれGMP、GDP、
GTPからなる非環状グアニンヌクレオチド類を含む試
料を作製し、本発明のcAMP及びcGMPの検出限界
を調べてみた。まず各試料を、20mMのトリス緩衝液
(10μl)に溶かした後、10μlのクリーニング1
反応液(20mMのトリス緩衝液(pH8.0)、2m
Mの塩化マグネシウム、4U/mlのアピラーゼ、40
U/mlのアルカリホスファターゼ、20U/mlのア
デノシンデアミナーゼ)を加え、30℃で3時間インキ
ュベーションすることによりGMP、AMP、ADP及
びATPを分解させ、反応終了後90℃で10分間加熱
して酵素類を失活させた。加熱した各反応溶液に10μ
lのクリーニング2反応液(20mMのトリス緩衝液
(pH8.0)、2mMの塩化マグネシウム、1mMの
クレアチンリン酸、80U/mlのクレアチンキナー
ゼ)を加え、30℃で1時間インキュベーションするこ
とによりGDPをGTPに誘導させ、反応終了後、90
℃で5分間加熱して失活させた。
各試料に純水を加えて総量500μlとし、SEP−P
AK NH2カートリッジカラム(0.5g;ウォータ
ーズ製)に吸着させ、0.5mlの純水で洗浄した後、
3mlの純水でcAMP及びcGMPを濃縮用チューブ
に溶出させた。溶出したcAMP及びcGMP画分を減
圧濃縮装置(大洋化学工業社製)を用いてそれぞれ60
℃にて減圧濃縮し、測定に使用するまで−80℃で保存
した。
蛍光測定 (ステップ1)上記減圧濃縮した各試料のcAMP及び
cGMP画分を、20mMのトリス緩衝液(pH8.
0)40μlに溶かし、10×75mmガラスチューブ
に8μlずつ4本に分けてcGMPアッセイ用とし、残
りの8μlに20mMのトリス緩衝液(pH8.0)を
加えて10倍希釈した溶液から2μlずつ4本に分けc
AMPアッセイ用とした。cGMPアッセイ用チューブ
2本と、cAMPアッセイ用チューブ2本にそれぞれS
tep1(PDE+)反応液[20mMのトリス緩衝液
(pH7.5)、5mMの塩化マグネシウム、0.1m
Mの塩化カルシウム、300U/mlのカルモジュリ
ン、0.1U/mlの環状ヌクレオチド選択性ジホスホ
エステラーゼ]5μlを加えて30℃で1時間インキュ
ベーションし、cAMP、cGMPからAMP、GMP
へと誘導した。また、残りのcGMPアッセイ用チュー
ブ2本と、cAMPアッセイ用チューブ2本にStep
1(PDE−)反応液[Step1(PDE+)反応液
を90℃15分加熱し、生体由来cAMP、cGMPが
AMP、GMPに変換されないので、バックグラウンド
として用いた。]5μlを加えて上記と同様にインキュ
ベーションした。
cAMPアッセイ用チューブ中の環状ヌクレオチド由来
AMPをStep2(cAMP)反応液[20mMのト
リス緩衝液(pH7.5)、5mMの塩化マグネシウ
ム、100mMの塩化カリウム、10nMのATP、
0.1mMのクレアチン−1リン酸、120U/mlの
ミオキナーゼ、40U/mlのクレアチンキナーゼ]中
で、一方、各cGMPアッセイ用チューブ中の環状ヌク
レオチド由来GMPをStep2(cGMP)反応液
[20mMのトリス緩衝液(pH7.5)、5mMの塩
化マグネシウム、100mMの塩化カリウム、50μM
のATP、1U/mlのグアニル酸キナーゼ]中で、3
0℃,1時間反応させてADPやGDPを導き、反応
後、各チューブを90℃で5分間加熱して酵素を失活さ
せた。
チド由来ADP、GDPを、酵素増幅反応システムによ
り2時間の増幅反応処理し、ADPは最大約50000
倍、GDPは約10000倍に増幅した。各cAMPア
ッセイ用チューブには、Step3(cAMP)反応液
[20mMのトリス緩衝液(pH7.5)、5mMの塩
化マグネシウム、8mMのフルクトース、1mMのホス
ホエノールピルビン酸、0.5mMのジチオスレイトー
ル、30.8U/mlのヘキソキナーゼ、70U/ml
のピルビン酸キナーゼ]25μlを加え、各cGMPア
ッセイ用チューブには、Step3(cGMP)反応液
[20mMのトリス緩衝液(pH7.5)、5mMの塩
化マグネシウム、1mMのコハク酸、1mMのホスホエ
ノールピルビン酸、0.5mMのジチオスレイトール、
0.5mMの補酵素A、80U/mlのピルビン酸キナ
ーゼ、2U/mlのコハク酸チオキナーゼ]25μlを
加え、30℃で2時間インキュベーションした後、各チ
ューブに0.5MのEDTA水溶液10μlを加えて反
応を停止させた。
が終了した各チューブにStep4反応液(100mM
のイミダゾール緩衝液(pH6.0)、5mMのNAD
H、4U/mlの乳酸脱水素酵素)10μlを加え、常
温下に10分間放置し反応させた。次に2NのHCl水
溶液10μlを加えて常温下に10分静置し、未反応N
ADHを分解した後、6NのNaOH水溶液10μlを
加え、60℃で10分間反応させた(この反応でNAD
+が2−ヒドロキシニコチンアルデヒドに分解され
る。)。室温静置20分後に2−ヒドロキシニコチンア
ルデヒドの蛍光強度を蛍光分光光度計(日本分光社製)
を用いてem:370nm、ex:460nmで測定し
た。その結果、蛍光定量の検出限界は約50pmolで
あることがわかった。従って、cAMP、cGMPの測
定感度はそれぞれ1及び5fmolとなり、100fm
olまで直線検量線を作ることができることが明らかと
なり、cAMP、cGMP以外のアデニンおよびグアニ
ンヌクレオチドによる影響はいずれも10nmolまで
受けないことが確認された。また、この方法の開発によ
り、測定時間は従来の2分の1(約7時間)に短縮され
た。以上のことから、cAMP、cGMP同時測定法は
高感度かつ簡便であることから、cAMPとcGMP量
の同時比較が必要な細胞を含む幅広い生体試料への適用
が期待できる。
MP及びcGMP量の測定) 上記実施例1の方法を用いて細胞内又は組織内のcAM
P、cGMP量の測定が可能かどうかを、ラット大動脈
平滑筋細胞内におけるcAMP及びcGMP量の測定を
行うことにより調べてみた。35mmディッシュ中でセ
ミコンフルエントに達したラット大動脈平滑筋細胞を
0.2mMのIBMX(ホスホジエステラーゼ阻害薬)
含有又は非含有のタイロード液に置き換えて15分間イ
ンキュベートし、その後、かかる細胞溶液に100μM
のSNAP(S−ニトロソ N−アセチルペニシラミ
ン、NOドナー)又は10μMのイソプロテレノール
(ISP)を加えて更にインキュベーションし、5分後
に10%のトリクロロ酢酸水溶液を加えて反応を終了さ
せた。得られた細胞溶液に氷冷した10%のトリクロロ
酢酸水溶液500μlを加え、氷冷下に30分静置し
た。得られた上澄み液に5倍量の水飽和エーテルを加え
て洗浄し、トリクロロ酢酸を取り除く操作を4回繰り返
し行った。洗浄した上澄み液を60℃で遠心濃縮し、測
定に使用するまで−80℃で保存した。
に試料における非環状アデニン及びグアニンヌクレオチ
ドの除去し、cAMP及びcGMPの同時酵素蛍光測定
を行った。なお、試料における非環状アデニン及びグア
ニンヌクレオチドの除去する際、同時に検量線作成用の
cAMPスタンダード溶液(0、50、100fmol
のcAMP溶液)又はcGMPスタンダード溶液(0、
50、100fmolのcGMP溶液)も並行して反応
を行い、cAMP及びcGMPの同時酵素蛍光測定を行
った。検量線を図1に、酵素蛍光測定の結果を図2に示
す。なお、35mmディッシュ中の培養平滑筋細胞に含
まれるタンパク量は平均83.5±7.5μg/ディッ
シュであった。これらのことから、IBMX(イソブチ
ルメチルキサンチン)を存在せしめることによりcAM
P、cGMP量の増加が認められた。また、イソプロテ
レノールを含有したものは細胞内cAMP量を著しく上
昇させたが、cGMP量を変化させなかった。一方、S
NAP(NOドナー)は細胞内cGMP量を著しく上昇
させたが、cAMP量には影響しなかった。以上のこと
から、本発明のcAMP、cGMP同時測定法は高感度
かつ簡便に細胞内cAMPとcGMP量を同時測定でき
ることがわかった。
測定) 次に まず、ラット大動脈平滑筋細胞内におけるcAM
P及びcGMP量の測定を行った。エーテル麻酔したラ
ットから心臓を摘出し、左心房、左心室乳頭筋標本を作
製し、マグヌス装置に装着した後、心房筋には0.5g
の、心室筋には1gの張力をかけ、1Hz閾値の1.5
〜2倍の電圧をかけて等尺性収縮を測定した。1時間か
けて安定化させ、その間15分ごとにタイロード液で洗
浄した。洗浄後、100μMのSNAP(NOドナー)
存在下又は非存在下で90秒間インキュベーションし、
その後標本を迅速に液体窒素で凍結して−80℃で保存
した。
10%のトリクロロ酢酸水溶液を加えてホモジナイズ
し、4℃で2000g×15分間遠心した。遠心後、上
澄み液を採取し、残渣に再度、同量の10%のトリクロ
ロ酢酸水溶液を加えて強く撹拌洗浄して4℃で2000
g×15分間遠心し上澄み液を採取した。得られた上澄
み液を2mlの水飽和エーテルで4回洗浄した後(洗浄
のたびにエーテルを除く)、洗浄した上澄み液を60℃
で遠心濃縮し、測定に使用するまで−80℃で保存し
た。その後、試験例1記載の方法と同様に試料における
非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除去し、c
AMP及びcGMPの同時酵素蛍光測定を行い、cGM
Pの量を測定した。その結果、ペーシング下でのラット
心筋標本中cGMP量は左心房が29±22.5、左心
室が18.9±13.0fmol/mg−protei
nであったが、SNAP(NOドナー)存在下ではそれ
ぞれ、189.3±34.4、124.8±23.5f
mol/mg−proteinに上昇することがわかっ
た。
析によるピルビン酸の超高感度測定) 実施例1記載のStep3で得られた反応液をシリカゲ
ルカートリッジに吸着させ、クロロホルム−メタノール
−酢酸(1:1:0.04)混合液でピルビン酸を選択
的に溶出し、反応液中に存在する妨害物質、ホスホエノ
ールピルビン酸やコハク酸を取り除いた。溶出されたピ
ルビン酸をガスクロマトグラフィー質量分析計(日本電
子社製)で定量した。この結果、ガスクロマトグラフィ
ー質量分析計を用いることにより5fmolの感度で測
定できることがわかった。以上のことより、cAMP、
cGMPの測定感度はそれぞれ0.1及び0.5amo
lとなる。従って、単一細胞内cAMP、cGMPを介
するシグナリングの動態を調べることができると考えら
れる。
的試料における同一試料中のcAMP及びcGMP量を
同時に高感度で定量することができ、本発明の測定方法
によると、脳や心臓などの細胞内のcAMPやcGMP
を介したシグナリングによる細胞機能発現、遺伝子発現
研究におけるcAMPやcGMP動態を知ることが可能
となる。
光強度変化(n=5)を示す図である。
P両の各種薬物による変化を示す図である。
Claims (11)
- 【請求項1】 生物学的試料中に内在する非環状アデニ
ンヌクレオチド類及び非環状グアニンヌクレオチド類を
除去し、環状ヌクレオチド類であるcAMP及びcGM
Pを同時に分離する方法であって、試料中のGMP、A
MP、ADP及びATPを、アピラーゼ、アルカリホス
ファターゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むクリーニ
ング1反応液を用いて分解し、次いで、試料中のGDP
を、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−1リン酸を含
むクリーニング2反応液を用いてGTPに変換し、反応
液中に残存するGTPをカラム吸着処理した後、cAM
P及びcGMPを選択的に溶出させることを特徴とする
cAMP及びcGMPの同時分離方法。 - 【請求項2】 クリーニング1反応液を用いての分解反
応を、塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液中で行
うことを特徴とするcAMP及びcGMPの同時分離方
法。 - 【請求項3】 クリーニング2反応液を用いてのGTP
への変換反応を、トリス塩酸緩衝液中で行うことを特徴
とするcAMP及びcGMPの同時分離方法。 - 【請求項4】 カラム吸着処理に弱アニオン性イオン交
換カートリッジを用いることを特徴とする請求項1〜3
のいずれか記載のcAMP及びcGMPの同時分離方
法。 - 【請求項5】 選択的に溶出されたcAMP及びcGM
P含有画分を、遠心濃縮することを特徴とする請求項1
〜4のいずれか記載のcAMP及びcGMPの同時分離
方法。 - 【請求項6】 生物学的試料に、ホスホジエステラーゼ
阻害剤の存在下に前処理を施すことを特徴とする請求項
1〜5のいずれか記載のcAMP及びcGMPの同時分
離方法。 - 【請求項7】 請求項1〜6のいずれか記載のcAMP
及びcGMPの同時分離方法により得られるcAMP及
びcGMP含有試料を、環状ヌクレオチド選択性ホスホ
ジエステラーゼを用いて、それぞれAMP及びGMPに
変換するStep1、Step1で生成するAMP及び
GMPをそれぞれADP及びGDPに変換するStep
2、Step2で生成するADP及びGDPをそれぞれ
ATP及びGTPに変換するStep3、Step3の
酵素増幅法により生成する各ピルビン酸を2−ヒドロキ
シニコチンアルデヒドに変換するStep4、Step
4で生成する2−ヒドロキシニコチンアルデヒドの蛍光
強度を測定することを特徴とする同一サンプルにおける
cAMP及びcGMPの測定方法。 - 【請求項8】 Step1でそれぞれカルモジュリン及
び3,5−サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエ
ステラーゼを用い、Step2でミオキナーゼ又はグア
ニル酸キナーゼを用い、Step3でそれぞれホスホエ
ノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼを用い、Ste
p4でそれぞれ乳酸脱水素酵素を用いることを特徴とす
る請求項7記載の同一サンプルにおけるcAMP及びc
GMPの測定方法。 - 【請求項9】 失活させた環状ヌクレオチド選択性ホス
ホジエステラーゼを用いて測定した蛍光強度をバックグ
ラウンドとすることを特徴とする請求項7又は8記載の
同一サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定方
法。 - 【請求項10】 請求項7〜9のいずれか記載の同一サ
ンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定方法に用い
ることができ、前記クリーニング1反応液及びクリーニ
ング2反応液調製用試薬、並びに前記Step1〜4の
各反応液調製用試薬を含有することを特徴とする同一サ
ンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定用キット。 - 【請求項11】 アピラーゼ、アルカリホスファターゼ
及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化マグネシウム
を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング1反応液
調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−1
リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング2
反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム、カルモジュリン及び3,5−サイクリックヌクレオ
チドホスホジエステラーゼを含むトリス塩酸緩衝液から
なるStep1反応液調製用試薬と、塩化マグネシウ
ム、塩化カリウム、ATP、クレアチン−1リン酸、ミ
オキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むトリス塩酸緩
衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリウム、AT
P及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液から
なるStep2反応液調製用試薬と、塩化マグネシウ
ム、フルクトース、ホスホエノールピルビン酸、ジチオ
スレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナーゼ
を含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、
コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイト
ール、補酵素A、ピルビン酸キナーゼ及びコハク酸チオ
キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるStep3反
応液調製用試薬と、NADH及び乳酸脱水素酵素を含む
イミダゾール緩衝液からなるStep4反応液調製用試
薬とを含有することを特徴とする請求項10記載の同一
サンプルにおけるcAMP及びcGMPの測定用キッ
ト。
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