JPH10511260A - 個々のタンパクキナーゼ活性の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチド基質に対する選択されたタンパクキナーゼの活性を定量化する方法が提供される。ペプチド基質は結合化合物に接合される。次に修正されたペプチド基質は選択されたタンパクキナーゼを含有する溶液に添加される。タンパクキナーゼ及びペプチドは標識と共に、結合化合物及び標識を有する修正ペプチド化合物を形成するのに充分な時間培養される。修正ペプチド生成物は次に高い結合化合物親和性を有するマトリックスに結合される。結合ペプチドは次に洗浄され、図に示されるようにタンパクキナーゼの活性が測定される。かかる方法のためのキットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 個々のタンパクキナーゼ活性の定量法 発明の属する分野 本発明は酵素活性を測定するアッセイプロトコールを提供する方法を指向する ものである。より詳細には、本発明はタンパクキナーゼの酵素活性を正確にそし て簡単に定量する方法を指向するものであり、更には他のタンパクキナーゼの存 在下において個々のタンパクキナーゼに特異的なアッセイを提供するものである 。 引用文献 本出願において引用される文献の目録は、特許請求の範囲より前の部分に記載 されている。 従来技術の記載 酵素は生体細胞内の反応に触媒作用を及ぼす大型タンパク質である。酵素は他 の分子を造りだし又破壊する。例えば、酵素は脂肪酸からの脂肪の合成に触媒作 用を及ぼし、ぶどう糖及び果糖から複合ショ糖を形成し、アミノ酸から他のタン パク質を形成する手助けをする。また、酵素はより複雑な構造体を破壊すること によって生成行程を逆進させる。一般的に、酵素は各々の反応における特定の基 質に特異的である。例えば、ある酵素がただ１つの基質のみが関与する反応に触 媒作用を及ぼす場合があり、また関連する基質の群に作用を及ぼす場合もある。 健康なヒトの場合、殆どの酵素は細胞内において見い出される。しかしながら 、ある種の病気は死にかけている細胞から酵素を血中に放出させる。従って、酵 素の増加レベルを測定することができる。血中の異常な酵素レベルは特定の病状 を特徴付けるものである。例えば、血中のクレアチンキナーゼの異常レベルを検 出する酵素アッセイは心臓病の診断測定に有用である。同様に、骨又は肝臓病は 血 流中のアルカリホスファターゼの増加レベルを観察することにより診断すること が可能である。前立腺癌は血流中のアシドホスファターゼの増加レベルにより診 断される。 酵素はそれらが触媒作用を及ぼす反応の一般的種類に従って群に分類される。 本発明は、１つの基質から他へある基を転移させる反応に触媒作用を及ぼす転移 酵素と総称される特定の酵素群に関するものである。本発明は特にタンパクキナ ーゼと呼ばれる転移酵素亜群を指向するものである。 タンパクキナーゼとはリン酸基をタンパク質に転移させる全ての酵素の総称で ある。ヒトゲノムの約３〜４パーセントはタンパクキナーゼ形成のための転写情 報を含有している。現在、２００種程度のタンパクキナーゼが知られている。し かしながら、ヒトゲノムの３〜４パーセントがタンパクキナーゼ形成のための暗 号であるので、ヒトの体内には何千種もの異なる別個のキナーゼが存在するかも 知れない。 タンパクキナーゼはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はグアノシン三リン酸（ ＧＴＰ）からリン酸基を標的タンパク質に転移させ、リン酸化タンパク質及びア デノシン二リン酸（ＡＤＰ）又はグアノシン二リン酸（ＧＴＰ）を生じさせる反 応に触媒作用を及ぼす酵素である。ＡＴＰ又はＧＴＰは先ず加水分解され、ＡＤ Ｐ又はＧＴＰ及び無機リン酸塩を形成する。無機リン酸塩は次に標的タンパク質 に付加される。キナーゼに標的にされるタンパク質基質は、細胞壁等の膜物質中 に見い出される構造タンパク質、又は機能性タンパク質である他の酵素である場 合がある。 それらの生理学的関連性、多様性、及び偏在性の故にタンパクキナーゼは生化 学及び医学研究において最も重要で広く研究される酵素の科の一つとなった。研 究においてタンパクキナーゼは、シグナル形質導入、転写調節、細胞運動、及び 細胞分裂を含む多くの細胞機能の調節の鍵となっていることが示されている。幾 つかの発癌遺 伝子もまたタンパクキナーゼをコード化していることが示されており、これはキ ナーゼが発癌にある種の役割を果たしていることを示唆するものである。 タンパクキナーゼはそれらがリン酸化させるアミノ酸残基に基づいて通常２つ の群に分割される。第一の群はセリン−トレオニンキナーゼと呼ばれ、環状ＡＭ Ｐ及び環状ＧＭＰ依存タンパクキナーゼ、カルシウム及びカルモジュリン依存タ ンパクキナーゼ、カゼインキナーゼ、細胞分裂周期タンパクキナーゼ等を含む。 通常、これらのキナーゼは細胞質性であり、又はアンカータンパク質等によって 細胞の微細な分画に付随している。 チロシンキナーゼと呼ばれる第二の群は、リン酸化チロシン残基である。これ らはより少ない量で存在しているが、細胞調節において同等の重要な役割を果た している。これらのキナーゼは、表皮細胞成長因子レセプター、インシュリンレ セプター、血小板由来成長因子レセプター等を含む成長因子及びホルモン等の分 子に対する幾つかのレセプターを包含する。研究によれば、多くのチロシンキナ ーゼはそのレセプター領域が細胞の外側に位置しキナーゼ領域が内側に位置する 膜内外タンパク質である。 セリン、トレオニン、及びチロシン含有タンパク質のキナーゼによるリン酸化 は、リン酸化タンパク質生成物が発癌、細胞形質導入、細胞成長及び開口分泌を 含む様々な細胞プロセスに関連するという理由により重要である。現在、キナー ゼに関連した癌細胞の成長を阻害する又は癌細胞死を促進させるための多くの実 験が行われている。癌細胞の成長阻害又は細胞死の促進に関与する特定のキナー ゼを決定することは社会にとって重要である。従って、キナーゼ活性レベルの認 識の向上は非常に重要なものであるということになる。 活性測定 ある酵素の活性を測定する方法の一般的記述としてここに引用と して参照されるロビット及びホワイト(Robyt and White，1990)を参照した。ロ ビット及びホワイトは酵素活性を、ある量の酵素が特定の時間内に生成する反応 の量と定義している。活性は、生成される生成物の量を測定することにより、或 いは高濃度又は飽和状態の基質の下で単位時間毎に減少する基質の量を測定する ことにより決定される。これは、通常、生成物又は基質に対して化学分析を行う ことにより行われる。 特定のキナーゼ活性に対するアッセイにおいて典型的に使用される基質には、 牛乳から分離されたカゼイン、子牛から分離されたヒストン、黄卵から分離され たホスホビチン、及びウシ脊髄から分離されたミエリン塩基性タンパク質が包含 される。適切なキナーゼを選択すると仮定すれば、これらの基質をアッセイにお いてリン酸化することが可能である。これらの基質を用いてキナーゼ活性を測定 するアッセイは斯界に広く知られている。 キナーゼ活性の放射性検出 タンパクキナーゼ活性を測定する最新の方法は放射性検出法を基礎とするもの である。これらの方法において、目的とするキナーゼを含有するサンプルがγ−³² Ｐ−ＡＴＰ又はγ−³²Ｐ−ＧＴＰの存在下で活性剤及び基質と共に培養される 。ヒストン又はカゼイン等の一般的で安価な基質がしばしば使用される。適切な 培養期間の後に反応を停止させ、反応混合物のアリコットを基質を結合させるフ ィルターに直接添加する。次に、過剰放射標識遊離ＡＴＰを除去するためにフィ ルターを数回洗浄し、シンチレーション・カウンターによって基質に取り込まれ た放射標識リン酸基の量を測定する。この方法は広く使用されており、祖及び精 製サンプル双方におけるタンパクキナーゼ活性の正確な測定方法を提供するもの である。 バブコック(Babcook，1991)等もまたタンパク質−チロシンキナーゼ及びタン パク質−チロシンホスファターゼの活性を測定する ためのモノクローナル抗体及び免疫蛍光検査法を用いたアッセイを記述している 。この方法はｐ５６^lck又はｐ６０^srcを使用して行われた。 バド(Budde，1991)等はタンパクキナーゼの酸性ペプチド基質を使用したアッ セイ技術を開示している。この技術は試験される基質中に配置された放射性リン 酸基を使用する。キナーゼ活性の後、個々の放射性リン酸基、ＡＴＰ及びタンパ ク質が妨害されている間にホスフォペプチドが溶出される。 ゴパラクリシュナ(Gopalakrishna，1992)等はタンパクキナーゼ活性を測定す るために従来のアプローチを用いている。その方法はろ過ディスクを設置したマ ルチウェルプレートを用いて、タンパクキナーゼ活性を測定するのに必要な培養 及びろ過を組み合わせるものである。チャクラバルシー(Chakravarthy，1990)等 による関連文献においては、放射性リン酸基を基質中に組み入れることによりタ ンパクキナーゼＣ（ＰＫＣ）選択性ペプチド基質を用いてキナーゼＣ活性が測定 される。放射活性は液体シンチレーションによって測定される。 キナーゼ活性の非放射性測定 抗リンチロシン抗体を使用することによってチロシンリン酸化を検出する非放 射性キナーゼ活性検出法が進展してきた（リクセン(Rijksen)等、1991）。非標 識のＡＴＰ及び適切な基質と共にチロシンキナーゼを培養した後に、反応混合物 がポリビニリデンジフロリド(PVDF)膜におけるドットブロットアッセイに供され る。リン酸化の程度は抗リンチロシン抗体との反応、それに続くイムノゴールド (immunogold)染色法による検出によって決定される。存在するリンチロシンの量 は濃度計によって測定される。 ドットブロット法の欠点はそれがチロシンキナーゼの測定に限定されているこ とである。リンチロシンに対する抗体は抗原の大きさ によって生成することが可能である。リンセリン及びリントレオニンに対する同 様の抗体を作りだす試みは、リンセリン−及びリントレオニン−含有タンパク質 のアッセイに対して用いることには成功していない。加えて、かかるアッセイは 相当の時間を要する数度に渡る培養及び洗浄段階を必要とし、それがアッセイ完 了までの時間を非常に長くすることになる。アッセイの結果はブロット上の色付 きドットとして表れる。かかる色付きドットはアッセイの効果的サンプル範囲を 制限する場合があり、全ての研究室に装備されているわけではない高価な装置で ある走査濃度計を用いて最終結果を定量化することを使用者に要求する場合もあ る。かかる濃度計は生成されたドットの少なくとも標的断面をカバーするビーム 寸法を有していなければならない。 発明の要約 本発明は、結合化合物をペプチド基質に接合させて修正ペプチド基質を形成し 、充分な量の修正ペプチド基質を選択されたタンパクキナーゼを含有する溶液に 添加し、タンパクキナーゼが修正ペプチド生成物を形成するのに十分な時間活性 である条件下でタンパクキナーゼを修正ペプチド基質と共に培養し、そしてタン パクキナーゼの活性を測定する、ことを含む選択されたタンパクキナーゼ活性の 存在を測定する方法を提供するものである。 また、本発明は、タンパクキナーゼに対して特異的反応性を有し定量化を可能 ならしめるために化学反応によって修正された修正ペプチド基質を包含する容器 と使用説明書とを含む選択されたタンパクキナーゼの存在又は活性を測定するた めのキットを更に指向するものである。 また、本発明は、ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）並びにそれ らの類似物及び組合せよりなる群から選択される修正ペプチド基質を包含する容 器、ビオチン結合マトリックスを含有 する容器、及び使用説明書、を含むチロシンキナーゼの存在又は活性を測定する ためのキットを指向する。 また、本発明は、ビオチン化プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、ビオチン 化プロメガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、ビオチン化プロメガペプチドＣ（配列 ＩＤ．３）、ビオチン化プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、ビオチン化プロ メガペプチドＥ（配列ＩＤ．５）、ビオチン化プロメガペプチドＦ（配列ＩＤ． ６）、ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、ビオチン化プロメガペ プチドＨ（配列ＩＤ．８）並びにそれらの類似物及び組合せよりなる群から選択 される修正ペプチド基質を有する容器、ビオチン結合マトリックスを有する容器 、及び使用説明書、を含むセリン−トレオニンキナーゼの存在又は活性を測定す るためのキットを指向するものである。 更に、本発明は、体液を充分な量のビオチン化ペプチド基質と反応させ、タン パクキナーゼが検出可能量の修正ペプチド生成物を形成するのに充分な時間活性 である条件下で修正ペプチド生成物を形成し、修正ペプチド生成物の量を測定す ることを含む体液中の選択されたタンパクキナーゼの存在又は活性を測定する方 法を指向するものである。 本発明は組織抽出物中の幾つかの他のタンパクキナーゼの存在下において特定 のタンパクキナーゼに対するアッセイを可能にするものである。この型のアッセ イは目的とする特定のタンパクキナーゼの精製を必要としないという理由により 研究者の強く所望されているものである。従来は組織中の他のタンパクキナーゼ を除去するために精製が必要とされていた。この長時間を要するアプローチは特 異的ビオチン化ペプチド基質アプローチによって回避することが可能である。 加えて、精製が不要であるという理由により研究者は様々な生理学的条件下に おいて酵素の損失を最小にして特定のキナーゼの発現 レベルを測定することが可能になる。これは、アッセイされた活性が発現された 活性酵素総計の正確な概算であるということを意味するものである。 ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼ（ＰＫＡ）、ｃＧＭＰ依存タンパクキナーゼ（ ＰＫＧ）、Ｃａ²⁺／リン脂質依存タンパクキナーゼ（ＰＫＣ）、カゼインキナー ゼ１及び２（ＣＫ−１及びＣＫ−２）、成長因子受容体、非成長因子受容体、及 び活性チロシンキナーゼを含有する可溶タンパク質、細胞周期依存タンパクキナ ーゼ（ｐ３４ｃｄｃタンパクキナーゼ）、Ｓ６タンパクキナーゼ、Ｃａ²⁺／カル モジュリン依存又は多機能（ＣＡＭ）タンパクキナーゼ、ＤＮＡ依存タンパクキ ナーゼ、及びカルボキシ末端ドメイン（ＣＤＴ）キナーゼ等の幾つかのタンパク キナーゼに対するペプチド基質は、ビオチン化アミノ酸をペプチドのＮ末端に組 み入れるペプチド合成プロトコールを用いてカスタム合成される。従って、様々 なタンパクキナーゼに使用できる幾つかのキットを作成する能力を提供する本発 明の手順によってアッセイすることのできるタンパクキナーゼは幾つかある。 本アッセイは非常に迅速であり、典型的には反応の終了後１０分未満で完了す るものである。同様の目的を達成するのに現在のプロトコールは２時間を要して いることからして、このことは重要なことである。 殆どの研究室に現在ある標準的な設備以外は必要ではない。この方法は従来の プロトコールに見られるようなリン酸、酢酸、アセトン、又はエタノール等の特 別な無機又は有機溶媒は必要としない。 本発明は薬剤研究に携わる大きな研究所又は製薬研究所に要求される大規模ア ッセイに適合するように修正することも可能である。 本発明に要するコストは従来のアッセイのコストと大差がない。アビジン及び ビオチン化試薬により増加するコストは、他のアッセイにより必要とされる高価 な溶媒を使用しないことにより相殺する ことが可能である。 更に、本発明には外生基質から内生ペプチドを分離するゲル電気泳動を要する アッセイシステムの使用の必要がない。ゲル電気泳動は有用である様々なモノ− 及びリン酸化形態の基質を分離する。しかしながら、この方法はリン酸基転移総 数の定量化を更に複雑なものにする。 細胞抽出物の組織内に存在しリン酸化されている強度に正に帯電した分子を結 合する従来の濾紙結合アッセイを用いる際にしばしば問題が発生する。本発明は 基質と生成物がそれらのみがビオチン化された成分であるという故に結合するの でその問題を解消するものである。 本発明は、分析される酵素の目的とする主要アミノ酸配列であるコンセンサス 配列の主構造を変化させる必要性を、インビボで存在する酵素の主要配列を維持 するために追加アルギニン残基を添加することにより除去するものである。フィ ルター結合を用いる従来のアッセイは、基質の特異性を基質が他のキナーゼに適 するように変化させる多アルギニン残基を基質が含有していることを必要とする 。この変化の例は、ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼ及びこの配列を認識する他の キナーゼによって認識されるＣＤＴキナーゼペプチド基質 Arg-Arg-Arg(Tyr-Ser -Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)₄に存在する配列 Arg-Arg-Arg-Tyr-Ser（アミノ酸略号の 鍵は表１に記載されている）によって与えられる。 本発明の成果は、最終的に全てのリン酸化ペプチド分子が強結合性アビジン又 はストレプトアビジン被覆マトリックスによって捕捉されるという理由によって より確実な精度と共に得られるものである。それとは逆にリンセルロース紙にア リコットされたリン酸化タンパク質は、それ程強くない静電作用によって結合さ れる。従って、洗浄プロセスの間にリン酸化タンパク質は失われてしまうのであ る。 本発明の好ましい具体例につき詳細に説明する。その例は添付さ れた図に説明されている。 図面の簡単な説明 図１は修正ケンプチド(Kemptide)基質を使用したＰＫＡのキナーゼ活性におけ る酵素濃度の影響を説明するグラフである。ペプチドは１００μＭで存在し、酵 素は例１で記述するようにアッセイされた 図２はＰＫＡのタンパクキナーゼ活性におけるビオチン化ケンプチド基質の濃 度を増加させることによる影響を説明するグラフである。反応中には２ケンプチ ド単位のＰＫＡが存在した。残りの反応成分は例１に記述するように存在した。 図３は例１に記述するように、反応毎に２単位の基質としてケンプチドを使用 するＰＫＡのカイネティック分析を説明するグラフである。 図４は例１に記述するように、ＰＫＡのペプチド阻害物質がタンパクキナーゼ 活性に与える影響を説明するグラフである。 図５は例２に記述するように、様々なラット組織におけるＰＫＡのタンパクキ ナーゼ活性を説明するグラフである。 図６は例３に記述するように、基質としてビオチン化ニューログラニン_{(28-43 )} を用いたＰＫＣのキナーゼ活性における酵素濃度の影響を説明するグラフであ る。 図７は例３に説明するように、ＰＫＣのタンパクキナーゼ活性におけるビオチ ン化ニューログラニン_(28-43)基質濃度を増加させることによる影響を説明する グラフである。 図８は例３に記述するように、基質としてビオチン化ニューログラニン_{(28-43 )} を用いたＰＫＣ阻害物質のＰＫＣ活性に対する影響を説明するグラフである。 図９は例４に記述するように、ラット脳抽出物中のＰＫＣ及び部分精製ＰＫＣ のタンパクキナーゼ活性の影響を説明するグラフであ る。 発明の詳細な説明 定義 本発明の意図において以下の定義が適用される； 酵素の活性：基質に作用する一定量の酵素が特定の時間内に生成する反応生成 物の量。 修正ペプチド：第二化学部分(chemical moeity)、この場合ビオチン、と反応 させられ、第二化学部分の特性によって監視されることが可能になるペプチドか ら構成される化学種(chemical species)。かかる部分は検出用断片(detector se gment)又は修正用タッグ(modification tag)と称されることがある。 ペプチド：水を除去することによって第一アミノ酸のα−カルボキシル基のペ プチド結合と第二アミノ酸のαーアミノ基とを共有結合させることを含む更なる 修正を行うことが可能な２〜３０の天然又は合成アミノ酸から一般的になる化合 物。かかるアミノ酸は、自然発生アミノ酸或いはそれらのアミノ酸の化学合成変 種又は自然発生化合物中に共有的に結合していることが見い出される他の化学基 を付加することによってそれらの基本化学構造から変化させられることができる 前述のアミノ酸の修正形態の何れかであることができる。 リン酸化：基質に対するリン酸基の付加。 修正ペプチド生成物：元の結合パターンが変えられた修正ペプチド基質に対す る酵素の作用により形成される化学種。かかる変化は修正ペプチド基質に新しい 化学種を付加する又は除去することを含む。修正ペプチド基質における特定の変 化は、修正ペプチド基質の変化に関与する特定の酵素に依存する。修正ペプチド 生成物の例には、それに制限されるわけではないが、ＡＴＰ又はＧＴＰ等のリン 酸基供与体からリン酸基をペプチドに付加することによってタンパ クキナーゼが修正ペプチド基質を変化させる条件下において修正ペプチド基質を タンパクキナーゼと共に培養することにより形成される生成物が含まれる。 配列要求：基質のペプチド配列によって反応を認識し触媒する酵素の特性。 基質：酵素が作用する物質。 修正ペプチド基質：酵素の働きによって変化させられることが可能な修正ペプ チド。かかる変化は修正ペプチドに対する化学種の付加又は除去を包含すること ができる。目的とする特定の酵素のアッセイのために特定の修正ペプチド基質を 設計することがしばしば所望される。タンパクキナーゼ用の可能な修正ペプチド 基質は、セリン等のようにリン酸基受容体として作用するアミノ酸を必ず有して いなければならない。特定の酵素活性のアッセイに対する可能性のある修正ペプ チド基質の使用は、その酵素が活性であるとして知られている状況下で可能性の ある修正ペプチド基質を酵素と共に培養し、修正ペプチド生成物が生成される速 度を観察することによって決定することができる。 本発明は酵素による反応を経た特定の修正ペプチド基質の量を測定することに よってキナーゼ酵素の活性を定量化するものである。キナーゼ 本発明において定量化されるキナーゼは、リン酸基供給体としてＡＴＰ又はＧ ＴＰを使用し、かかる分子からγ−リン酸基をセリン、トレオニン又はチロシン アミノ酸に転移させることが好ましい。タンパクキナーゼは別個の配列において 基質をリン酸化させる能力によって識別される。これらの配列は、リン酸化部位 の周りのアミノ酸を配列決定することにより決定され、通常はそれぞれのタンパ クキナーゼにより異なるものである。個々の基質の認識配列は特異的キナーゼ触 媒のためである。 キナーゼの基質結合部位は酵素の触媒ドメインに存在すると信じられている。 このドメインは全てのタンパクキナーゼにとって非常に重要なものである。それ は典型的に２４０を越える残基を含んでおり、またキナーゼのＡＴＰ又はＧＴＰ 結合部位をも含有している。活性の測定 酵素の活性は生成される生成物、つまり修正ペプチド生成物、の量を測定する ことによって決定される。酵素活性の測定は反応におけるタッグ生成物の量を定 量化することによって行うことが可能である。タンパクキナーゼの活性は、本発 明のペプチド基質にリン酸基を付加させることによって特異的ペプチド基質を修 正するそれらの能力により測定することが可能である。酵素の培養 酵素は、酵素が活性な状況下において修正ペプチド基質が修正ペプチド生成物 を生成すると斯界に知られている状況下で培養される。それぞれの酵素は、通常 は、その最適ｐＨ、温度及び他の条件においてアッセイされる。アッセイプロトコール 様々なタンパクキナーゼの酵素活性を特異的に、迅速に、そして簡単に測定す るアッセイプロトコールが進展されてきた。かかるアッセイプロトコールは他の タンパクキナーゼの混合物の存在下において特定のタンパクキナーゼのアッセイ を意図するものである。この酵素アッセイはキット(kit)形態にまとめることが でき、要求される特異的タンパクキナーゼ用に個々のキットを提供することが可 能である。加えて、このアッセイを高処理量形態に適応させる規模にすることも 可能である。ペプチド基質 以下の表に記述される非常に多くの特殊化ペプチド基質、それらのペプチド基 質の類似物及び組合せを含む、が本方法において使用されるために発展された。 プロメガペプチドＡ〜Ｃはセリン−トレオニンキナーゼに特異的な適した配列 を含有している。プロメガペプチドＧはチロシンキナーゼに対する適した基質を 形成する。 呈示した配列がインビトロで化学合成されるペプチドを利用し、そのうちの幾 つかは市販されている一方で、本発明はより大きな前駆体タンパク質又はペプチ ドの分解を含む天然源からのペプチドの分離及び斯界に広く知られている方法に よる適切な断片の分離とそれに続く定義された検出用断片への付加によって行う ことができることは言及されるべきことである。 アッセイは対象とするタンパクキナーゼに要求されるビオチン化標識ペプチド を使用する。タンパクキナーゼアッセイにしばしば使用されるタンパク質基質と 対比して、対象とする酵素によって認識されるコンセンサス配列を模倣するペプ チドを合成することによりペプチドを特定のキナーゼに対して選択的な基質に設 計することが可能である。γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下においてその酵素に取って 最適なリン酸転移酵素条件の下でビオチン化ペプチドを対応するタンパクキナー ゼによってリン酸化することができる。リン酸化及び非リン酸化ペプチド双方が ビオチン化されるために、それらをビオチン結合マトリックス上で捕捉すること ができ、残りの遊離γ−³²Ｐ−ＡＴＰを数回の洗浄によって除去することが可能 である。 ビオチン結合マトリックスは、ろ過ディスク、ビード、又は可溶マトリックス 等のアビジン又はストレプトアビジン分子に共有結合する全てのマトリックスで あることができる。ＦＭＣ社(Pine Brook，New Jersey)は、ストレプトアビジン 結合ポリビニルカーボネート（ＰＶＣ）シリカ、ミクロポアプラスチックシート 又は１２．５ｍｍディスク等のアビジン及びストレプトアビジンマトリックスの 製造会社の例である。捕捉したペプチドは、ペプチド中に組み入れられた³²Ｐを 測定するため、つまりは対象とする酵素のタンパクキナーゼ活性を測定するため に液体シンチレーションスペクトロメー タに入れられる。 ビオチン化ペプチドによるアプローチの基本原理は、特定のタンパクキナーゼ に対するペプチド基質をビオチンと結合させ、ビオチン化ペプチドを目的とする 酵素のアッセイに対する基質として使用することを可能にするというものである 。反応の終了後、リン酸化及び非リン酸化ペプチドは、ストレプトアビジン又は アビジン被覆ろ過膜、ＥＬＩＳＡ形式プレート或いはアビジン被覆磁気粒子にア リコットされ、そこでペプチドが結合する。遊離ＡＴＰは洗浄手順によって除去 することができ、次にろ過膜、粒子、又はプレートい結合したＡＴＰフリーのペ プチドを液体シンチレーションスペクトロメータで測定することができ、組み入 れられた³²Ｐから酵素の活性を決定することが可能である。以下の基準に適合す る場合にペプチドに結合したビオチン基をタンパクキナーゼ活性測定用の基質と して使用することが可能である。 １．ビオチン基はＮ末端アミノ基に共有結合していなければならず、内部に存 在する他のアミノ基又はペプチド基質のＣ末端に結合していてはならない。この ことは、ビオチン分子を内部リシンのεアミノ基に共有結合させると全体のペプ チド電荷が変化してしまうという理由から非常に重要なことである。つまり、Ｐ ＫＡ、ＰＫＣ、及びＣＡＭキナーゼ等の幾つかのタンパクキナーゼに対する基質 としてのペプチドの効果が変化させられてしまうということである。 ２．ペプチドへのビオチン部分の付加は、ペプチド基質の目的とする酵素への アクセスに対する立体障害を生じさせてはならない。立体障害を最小限にするた めに６個の炭素原子がビオチンを基質に結合することが好ましい。 ３．ビオチン化−リン酸化ペプチドを結合するマトリックスは、目的とするタ ンパクキナーゼの活性を放射標識ペプチド生成物の量を測定することにより決定 することが可能になるように利用できなくてはならない。結合は修正リンペプチ ドに特異的であるべきであ り、サンプル中に存在する全てのリン酸化タンパク質又は他のペプチドはマトリ ックスに結合してはならない。従って、活性は結合したリン酸化−ビオチン化ペ プチドの量に比例することになる。 ４．反応に関与しなかった過剰γ−³²Ｐ−ＡＴＰは完全に除去されるべきであ る。これは背景ノイズレベルを低く抑さえること、更には目的とする酵素アッセ イの迅速な方法を提供することを目的とするものである。 ５．マトリックスのビオチン化ペプチドへの結合能力は、ペプチド基質のＫｍ 値の数倍の濃度を使用するのに十分な高さであるべきである。この条件は反応の 初期速度が相応な時間内にあって直線になることを確実にするためのものである 。更には、反応の初期速度は反応における酵素の量に比例するべきである。 小規模の実験にあっては、２５ｍｍ直径のアビジン被覆膜ディスクを鉛筆で番 号付けすることができる。その代わりに、エペンドーフ管中の既知量のアビジン 被覆磁気粒子を使用することも可能である。キナーゼアッセイ キナーゼアッセイは、緩衝液、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺、及びＭｇ²⁺等の二価の陽イオ ン、並びにγ−³²Ｐ−ＡＴＰ等の他の試薬の存在下において、精製酵素又は組織 抽出物を酵素源として及びビオチン化ペプチドを基質として使用することによっ て上述したように行うことができる。幾つかのタンパクキナーゼにあっては、リ ン脂質及びカルモジュリン等の他の補助因子を必要とする場合がある。反応の終 了後、アリコットが取り出されアビジン被覆ディスクに直接添加される。このデ ィスクは遊離γ−³²Ｐ−ＡＴＰを洗浄するために２ＭのＮａＣｌを含有するビー カーに入れられる。或いは、アリコットをピペットを用いて粒子含有管に移しよ く混合する。ビーカー中のＮａＣｌを１分おきに５回換えることにより操作を５ 分で終了させ る。粒子を使用する場合には、ＡＴＰ及び内生タンパク質を含む遊離可溶反応成 分を除去するために従来法によってそれらを洗浄することができる。 マトリックスの僅かな修正によってアッセイを高処理容量アッセイにまで規模 拡大させることが可能である。２４又は９６ウェル含有ストレプトアビジン被覆 プレートを使用することができる。アッセイ反応の終了後に採取したアリコット をピペットで個々のディスクではなく個々のウェルに直接添加する。続いてプレ ート全体を２ＭのＮａＣｌでウェルをゆすぐことによって洗浄する。反応終了混 合物を個々のウェルに添加する従来よりの装置が存在する。ウェルの洗浄は自動 化システムによって行うことが可能である。次に、コネティカット州メリデン市 にあるパッカード社及びメリーランド州ガイセルズバーグ市にあるワラック(Wal lac)社によって製造されたトップカウントミクロプレートシンチレーション及び 発光計数器等の液体シンチレーションスペクトロメータを使用してプレートの計 数を行うことができる。本発明を使用したアッセイの非制限的例が以下に記載さ れている。ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼ（ＰＫＡ） ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼ（ＰＫＡ）が調査される際には、この酵素に特 異的であると報告されているペプチド基質のＮ−末端基がビオチン化される。修 正ペプチド*-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly （プロメガペプチドＡ；配列ＩＤ． １）がペプチド合成装置を使用して合成される。このペプチドはＰＫＡに対する 基質として異なる濃度−０、１０、２０、５０、及び１００μＭで数回の希釈を 受けた精製ＰＫＡと共に斯界に知られる方法により試験される。この調査に使用 される酵素は、３７℃において１分で１μｇにつき５０ρmol の³²Ｐをカゼイン に転移させる又は３７℃において１分で１μｇにつき１００００ρmol の³²Ｐを ケンプチド基質Lys-Arg-Ar g-Ala-Ser-Leu-Gly （プロメガペプチドＡ；配列ＩＤ．１）に転移させる比活性 を有するＰＫＡ(#V5161,プロメガ社、マジソン、ＷＩ)の触媒サブユニットであ る。タンパクキナーゼのリン酸転移酵素活性 このアッセイは対応するビオチン化ペプチド基質を用いて他のタンパクキナー ゼのリン酸転移酵素活性を測定する試験を行う。例えば、Ｃａ²⁺及びリン脂質依 存タンパクキナーゼ（ＰＫＣ）のキナーゼ活性のアッセイを行うために、ＰＫＣ タンパクキナーゼ活性の最適条件の下でビオチン化ニューログラニン依存ペプチ ド*-Ala-Ala-lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys （プ ロメガペプチドＢ；配列ＩＤ．２）が基質として使用される。その他のアッセイ その他のタンパクキナーゼも適切なペプチド基質を用いて対応する最適アッセ イ条件の下でアッセイを行うことによりＰＫＡ及びＰＫＣに関して上述したよう にアッセイを行うことができる。例えば、ペプチド基質*-Asp-Asp-Asp-Glu-Glu- Ser-Ile-Thr-Arg-Arg （プロメガペプチドＥ、配列ＩＤ．５）をカゼインキナー ゼＩ（ＣＫ−１）のアッセイに使用することが可能である。ペプチド*-Arg-Arg- Arg-Glu-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Glu(CK-2)（プロメガペプチドＣ、配列ＩＤ．３ ）はカゼインキナーゼII（ＣＫ−２）のアッセイに用いられる。ペプチド*-Asp- Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe （プロメガペプチドＧ、配列ＩＤ．７）は活性化 表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性のアッセイに使用され る。 それぞれの場合において調査対象となるタンパクキナーゼの酵素活性は、適切 なペプチド基質のビオチン化誘導体及びストレプトアビジン結合マトリックスを 使用して向上された方法、次に非修正ペプチド基質を用いたホスホセルロースデ ィスク方法によってアッセ イされる。 タンパクキナーゼは、反応において非修正ペプチド基質及びカスネリー(Casne llie)、Ｊ．Ｅ．、１９９１に記述された推奨される行程手順を用いることを除 いて以下に記述されるその最適条件下でアッセイされる。簡潔には、反応は４０ μＬのアリコットを抜き取りそれをＰ８１紙（ワットマン、クリフトン、ＮＪ） に添加することによって終了する。そのフィルターを即座に０．５％のリン酸を 含有するビーカーに入れ、ビーカーを絶え間なく揺らしながら５分間放置する。 リン酸溶液をデカントし、新しい溶液を加える。この段階を総計で４回、それぞ れ５分づつ、繰り返す。フィルターを乾燥させ、シンチレーションバイアルに入 れ、５ｍｌのシンチレーション溶液を加える。酵素活性をアッセイシステムにお いて上述したように決定する。 様々なキナーゼのタンパクキナーゼ活性を測定するためには、以下のような特 定の基準が順守されなければならない。 １．ペプチドのビオチン化誘導体は非修正ペプチド基質と同様に目的とする酵 素に対して特異的及び適切な基質として作用しなければならない。 ２．ビオチン化ペプチドのリン酸化は、アビジン結合マトリックス又はストレ プトアビジン結合マトリックスへのその結合に影響を与えるものであってはなら ない。 ３．ビオチン化ペプチドのリン酸化は添加される酵素量及びアッセイの特定の 期間に比例すべきである。 ４．リン酸化タンパク質はビオチン化されない限りはマトリックスに結合すべ きでない、つまり、リン酸化され且つビオチン化されたペプチドのみがマトリッ クスに結合すべきものである。 ５．アビジン結合又はストレプトアビジン結合マトリックスはマトリックスに 添加されるビオチン化ペプチドに対して十分な結合能力を有しているべきである 。 ６．反応の終了後に遊離過剰γ−³²Ｐ−ＡＴＰを除去するための手段が準備さ れるべきである。 これらの基準を達成するために、幾つかのタンパクキナーゼに特異的な基質で あるペプチドが合成される(Kemp，B.E．及びPearson，R.B.，1991)。これらのペ プチドのそれぞれは対応する酵素によるリン酸化に必要となるコンセンサス配列 を含有している。負に帯電しているホスホセルロース紙に結合するように正の電 荷を与えるために、これらのペプチドを塩基性アミノ酸に結合させることが通常 必要である。 本発明においては、マトリックスに強固に結合するようにペプチドが修正され る。ビオチン化部分は６個の炭素原子リンカーを通してペプチド基質のＮＨ₂末 端に結合される。 ビオチン修正ペプチドは、確立された固相ペプチド合成法(Nova Biochem/Calb iochem，サンジエゴ、カリフォルニア)を用いてペプチド合成器によって合成さ れる。ビオチン基はレズンからペプチドが分離する前に添加される。ビオチン化 ペプチドの同一性及び純度は、アミノ酸定量分析、２高圧液体クロマトグラフィ ー（ＨＰＬＣ）溶媒システム、及び高速原子照射質量分析によって確認される。 本アッセイの結果に影響を与える具体的及び抽象的パラメターが調査された。 これらはディスクの直径、ディスク毎のストレプトアビジンの密度、ディスクの 乾燥の程度、修正ペプチド基質の濃度及び使用可能な酵素の量である。 アッセイは３７℃において５分間行われた。存在する酵素の量の増加に比例す るキナーゼ活性の増加が観察された。 アビジン又はストレプトアビジンに結合するシリカを基礎とするフィルターを 製造した。２つの異なる大きさのものである。一つは２５ｍｍ(i.d.)であり、他 は１２．５ｍｍ(i.d.)であった。フィルターを０．５、１．０、又は２．０ｍｇ のストレプトアビジン又はアビジンに結合させた。１ディスク毎に０．５ｍｇの ストレプトア ビジンを有する１２．５ｍｍ直径のディスクが最良の結果を与えた。加えて、湿 潤、１時間乾燥ディスク、２時間乾燥ディスク、及び２週間乾燥ディスクといっ た幾つかの乾燥レベルのこのアッセイへの適性を検査した。これはアッセイを使 用者に使いやすくすることを確実にするためのものである。結果は乾燥ディスク と同様に半湿潤ディスクも本アッセイにおいて満足に使用できることを示すもの であった。 本アッセイの特異性はＰＫＡ源として組織抽出物を使用して更に検査された。 基質濃度を増加させることによりビオチン化ペプチドへの³²Ｐの組み入れの直線 性もまた確認された。 実験結果はペプチド基質のビオチン化がペプチドの基質としての適性に影響を 与えないことを示した。２５ｍｍ(i.d.)のディスクに１ｍｇのアビジン（又はス トレプトアビジン）（１２．５ｍｍ(i.d.)のディスクでは０．５ｍｇ／ディスク ）が最終濃度として２００μＭ（２０μＬの反応量）を与える５ηmol までのビ オチン化ペプチドの結合に十分である。このペプチド濃度は要求される目的のう ちの殆どに対して十分なものである。アビジン及びストレプトアビジン両方を本 アッセイにおいて使用することができ、ストレプトアビジンがより安価であると いう理由により、研究の殆どはストレプトアビジンを使用して行われる。 最後に全ての洗浄液が遊離アミノ酸を除去するために試験され、２ＭのＮａＣ ｌによって最良の背景を得た。従って、この溶液を洗浄液として使用した。 データを得るために以下の条件を用いた。 １．終了溶液（２Ｍ尿素、１２５ｍＭ・ＥＤＴＡ、及び１％ＳＤＳ）を用いて 反応を終了させ、２５μＬのアリコットを１２．５ｍｍのストレプトアビジン結 合ディスク（ストレプトアビジン：０．５ｍｇ）又は２４ウェルプレートに添加 した。 ２．ディスク又はウェルを２ＭのＮａＣｌを用い１回につき１分 をかけて５回ゆすぎ又は洗浄した。 ３．ディスク又はプレートを乾燥させ、液体シンチレーション計数器を用いて 計数を行った。キット 本発明はまた上述した方法を用いるキットを指向するものである。酵素活性を 定量する基本的キットは、定量できるように化学反応によって修正され、酵素に 対する特異的反応性を有する修正ペプチド基質であるバイオ試薬を含有する容器 及び使用説明書を含むものである。 キットに供給される修正ペプチド基質は結合化合物ビオチンを含む。このキッ トはまた、選択された酵素に相溶性である少なくとも１種の緩衝液を含んでいる 。 キットはセリン−トレオニンキナーゼ及びチロシンキナーゼの群から選択され た酵素から活性を選択的に検出することを指向するものである。このキットは結 合化合物ビオチンが付加した修正ペプチド基質を入れる容器を含む。基質修正ペ プチドは選択された酵素に特異的なものである。 キットはキナーゼよりなる群から選択される酵素の活性を定量化することを指 向するものである。基本的キットは結合化合物ビオチンを含む修正ペプチド基質 を有する少なくとも１つの容器を包含するものである。基質修正ペプチドは選択 された酵素に特異的なものである。 キットにおける修正ペプチド基質は、説明したようにアッセイされる酵素のタ イプに依存して、以下のペプチドのうちの１種であることができる：プロメガペ プチドＡ（配列ＩＤ．１）、プロメガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、プロメガペ プチドＣ（配列ＩＤ．３）、プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、プロメガペ プチドＥ（配列ＩＤ．５）、プロメガペプチドＦ（配列ＩＤ．６）、プロメガペ プ チドＧ（配列ＩＤ．７）、及びプロメガペプチドＨ（配列ＩＤ．８）。選択され た酵素に対して特異的な修正ペプチド基質を示す表１が参照される。 使用説明書もまた含まれる。「使用説明書」とは、試薬濃度、又は混合される 試薬及びサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝液条 件等の少なくとも１つのアッセイ方法パラメターを記述する効果的表現である。 キットはまたフィルターディスク、ビーズ、可溶性マトリックス又はプレート 等のアビジン又はストレプトアビジン分子に結合されたビオチン結合マトリック スを含むことができる。ビオチン結合マトリックスを修正ペプチド基質及びビオ チン含有修正ペプチド生成物を結合するために用いることが可能である。 キットにおける様々な試薬の量は、アッセイの最適感度等の因子の数に依存し て変化させることが可能である。使用説明書は分析者が所望するアッセイを行う ことができるようにすることに適している。 手動試験キット又は自動分析器に使用される試験キットを提供することは本発 明の範囲内である。 以下の例は本発明の特長を説明するため及び当業者の一人がそれを行い使用す るのを援助するために提供される。この例はいかなる意味においても開示範囲又 は特許により与えられる保護を限定する意図のものではない。タンパクキナーゼ のアッセイの正確な記述が与えられる一方で、当業者にとっては本発明の結果を 広範囲の選択された酵素のアッセイに適用することができることが明確である。 呈示した物質がインビトロで化学的に合成されるペプチドを利用し、そのうち の幾つかは市販されている一方で、本発明を天然源からペプチドを分離すること によって行うことができることは言及されるべきことである。 実施例 これらの例におけるアッセイは特定の酵素に特異的なビオチン化ペプチド基質 の使用に基礎を置くものである。 例１ ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼの キナーゼ活性 Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（４０ｍＭ）、ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ₂（２０ｍＭ）、γ−^{3 2} Ｐ−ＡＴＰ（１００−２００cpm/ρmol の特異活性、１００μＭ）、ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ）、及び適切なビオチン化ペプチド基質 ：*-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly （プロメガペプチドＡ；配列ＩＤ．１、分子 量９９８．４）を含有する反応容量（５０μＬ）で様々なペプチド基質濃度のそ れぞれにおいて二重でｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼ（ＰＫＡ）のキナーゼ活性 を行った。 反応を２ケンプチド単位を与える適切な量の酵素（プロメガ＃Ｖ５２２１）を 添加することによって開始し、３７℃で０、５、１０分間培養した（１ケンプチ ド単位は、１ρmol のリン酸基を１分間でケンプチド基質に組み入れる触媒反応 に要求される酵素の量と定義される）。適切な温度で一定時間経過後、上述した 終了溶液（１０μＬ）を添加することによって終了させた。 アリコット（２５μＬ）を取り出して１２．５ｍｍ(i.d.)のストレプトアビジ ン結合ディスク（０．５ｍｇストレプトアビジン／ディスク）に添加し、ＮａＣ ｌ（２Ｍ）を含有するビーカーに入れた。室温で１分間静かにビーカーを揺らし た後、新しいＮａＣｌを加えた。この洗浄手順をそれぞれ１分間で５回繰り返し た。次に、ディスクを水でもう一度洗浄し、乾燥させ、シンチレーションバイア ルに入れた。次に、シンチレーション液（５ｍｌ）を加えた。 液体シンチレーションスペクトロメータにより放射活性を測定することによっ て酵素活性を計算した。リン酸化がＰＫＡによって特 異的に触媒されたことを確認するために、ＰＫＡ（＃Ｖ５６８１、プロメガ社、 マジソン、ＷＩ．）の特異的及び強力阻害剤を反応に加えた。阻害剤の添加によ り全てのＰＫＡリン酸転移酵素活性は阻害されたはずである。測定済ＰＫＡを用いた結果 プロトコール及び上述の条件下で測定された反応速度（ＰＫＡの初速度）と反 応における酵素の量の関係が図１に示されている。反応に１００μＭの修正ペプ チド基質を用いて、反応における酵素量の増加と共にＰＫＡ活性の直線的反応が 得られた。ビオチン化ペプチド基質濃度と酵素活性との関係もまた調査された。 図２に示されるように、反応速度のグラフは典型的なミカエリス・メンテン飽 和形態（双曲線）を示している。同じデータを転換すると、図３に示されるよう に基質のＫｍ値が３３μＭ及びＶ_max値が１．４５ρmol/分となる。ケンプチド を基質として用いたリンセルロース紙アッセイによっても類似した値が得られ、 図４に示されるように非修正基質のＫｍ値はビオチン化によって影響を受けなか った。Kemp，B.E.及びPearson，R.B．1991。５０μＭのＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ） の添加により酵素活性が劇的に減少したということによってタンパクキナーゼ活 性はＰＫＡに特異的なものであった。 例２ ラット組織におけるＰＫＡのキナーゼ活性 上述の修正ペプチド基質及びアッセイプロトコールを用いて様々なラット組織 におけるＰＫＡのキナーゼ活性もまた調査した。 図５に示すように、ＰＫＡのタンパクキナーゼ活性は、肝臓、卵巣、心臓、及 び脳において、それぞれ、２．２、１．７５、３．２、及び１．９ηmol ³²Ｐ／ 分／ｍｇであり、非修正ペプチド及びリンセルロース紙方法を用いて得られたも のと類似するものであった。 修正基質へのリン酸基の搬入は、１００μＭのＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ）を反応に 加えることによって完全に終了された。従って、上述の条件下でプロトコールに よりアッセイされた修正ペプチド基質のリン酸化はＰＫＡにより触媒反応を受け たものであって、組織抽出物中に存在する他のタンパクキナーゼによるものでは ない。 反応においてリン酸化され塩基性電荷を有する全てのタンパク質はマトリック スに結合しない。リン酸化修正ペプチド基質のみがマトリックスに結合する。従 って、アッセイプロトコールを用いたリン酸基搬入は、ペプチド基質への³²Ｐの 真の搬入を反映するものである。抽出物中の全てのリン酸化された塩基性タンパ ク質が濾紙に結合し、酵素のキナーゼ活性の過剰概算につながるリンセルロース 紙アッセイにあってはそれは真実ではない。 例３ Ｃａ²⁺及びリン脂質依存タンパクキナーゼの タンパクキナーゼ活性 ビオチン化ペプチド基質がニューログラニンの誘導体、つまりビオチン化ニュ ーログラニン_(28-43)Chen，S-J,等、1993、であった点を除いて上述のＰＫＡ活 性と同様の方法を用いてＣａ²⁺及びリン脂質依存タンパクキナーゼ活性（ＰＫＣ ）のタンパクキナーゼ活性を測定した。 *-Ala-Ala-lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys （プ ロメガペプチドＢ；配列ＩＤ．２、分子量２１３９．６）部分を含有するビオチ ンを添加することによってペプチドを修正し、１００μＭの濃度で使用した。酵 素（＃Ｖ５２６１、プロメガ社）を１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中で５倍に希釈し た。 ＰＫＡのキナーゼ活性を、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（４０ｍＭ）、ｐＨ７．４、Ｍｇ Ｃｌ₂（１０ｍＭ）、ＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、及びγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（１ ００−２００cpm/ρmol の特異活性、１０ ０μＭ）を含有する反応容量（５０μＬ）中で測定した。活性は、ホスファチジ ルセリン（１００μｇ／ｍｌ）、ジアシルグリセロル（１０μｇ／ｍｌ）、及び 塩化カルシウム（０．４ｍＭ）の存在下及び非存在下で測定した。５μＬの酵素 を添加することによって反応を開始し、２５℃で培養した。一定時間計過後、１ ０μＬの終了溶液を加えることによって反応を終了させた（上を参照）。２５μ Ｌのアリコットをディスクに添加し、ＰＫＡについて上述したのと同様に処理し た。測定済ＰＫＡを用いた結果 得られたＰＫＣの活性を、非修正ペプチド基質を用いて得られリンセルロース 紙法によってアッセイされたものとまた比較した。１００μＭの濃度の修正ペプ チド基質を使用した図６に示される結果は、ＰＫＣ活性が反応における酵素タン パク質量の増加に対して直線的であったことを示している。ＰＫＡにおいて示さ れたのと同様に、基質濃度のＰＫＣキナーゼ活性に対する影響もまた調査された 。 図７に示されるように、ミカエリス・メンテン反応速度、つまり双曲線が得ら れ、酵素活性は１００μＭの修正基質濃度付近で最高に達した。しかしながら、 ＰＫＣ活性はリンセルロース紙法を用いたアッセイの場合よりも約６〜７倍高か った。アッセイシステムにおけるＰＫＣ活性の増加は、リン酸化ペプチドの促進 され特異的な結合及び洗浄行程間におけるリン酸化ペプチド生成物のマトリック スからの僅かな損失によるものと思われる。これは、ビオチン化ニューログラニ ン_(28-43)アッセイシステムを用いることにより酵素のキナーゼ活性を正確に測 定することが可能であることを証明するものである。 図８に示されるように、活性は特異的ミリストイル化ＰＫＣペプチド阻害剤に よって完全に阻害された。従って、ＰＫＣのキナーゼ活性を阻害するには１０〜 ２０μＭの阻害剤で充分であり、ペプチ ド基質に搬入された全ての³²ＰがＰＫＣを通して触媒作用を受けたことを示すも のである。 例４ ラット組織を用いたＰＫＣのキナーゼ活性 ラットの脳におけるＰＫＣのキナーゼ活性もまた例３の物質及び方法を用いて 調査された。 図９に示されるように、ラット脳抽出物の高速回転による上澄みの富化フラク ションにおけるＰＫＣ活性は約５００ρmol ³²Ｐ／ｍｇ／分であり、部分精製Ｐ ＫＣのそれは２２００ρmol ³²Ｐ／ｍｇ／分であった。 本発明は、ここに説明され記述される特定の構成及び配列に制限されるもので はなく、その修正形態を含むものであり、目録の後に続く特許請求の範囲内にあ るものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月１５日 【補正内容】特許請求の範囲 １．ａ．ビオチン化試薬をペプチド基質に接合させて、ビオチン部分を含有す るビオチン化ペプチド基質を形成し（ビオチン部分はビオチン化ペプチド基質の タンパクキナーゼへのアクセスに対する立体障害を生じさせない）、 ｂ．充分な量のビオチン化ペプチド基質を選択されたタンパクキナーゼを含有 する溶液に添加し、 ｃ．選択されたタンパクキナーゼがビオチン化ペプチド生成物を形成するのに 十分な時間活性である条件下で選択されたタンパクキナーゼをビオチン化ペプチ ド基質と共に培養し、 ｄ．ビオチン化ペプチド生成物を、ビオチン化ペプチド生成物に対して充分な 結合容量及び特異性を有するビオチン結合マトリックスに結合させ、 ｅ．選択されたタンパクキナーゼの活性を測定する、 ことを含む選択されたタンパクキナーゼ存在又は活性を測定する方法。 ３．マトリックスがタンパク質を包含することを特徴とする特許請求の範囲１ に記載の方法。 ４．タンパク質がアビジン及びストレプトアビジンよりなる群から選択される 特許請求の範囲３に記載の方法。 ５．選択されたタンパクキナーゼの活性の測定に先立って、結合したビオチン 化ペプチド生成物を洗浄することを更に含む特許請求の範囲２に記載の方法。 ９．マトリックスがタンパク質被覆ディスクを包含する特許請求の範囲２に記 載の方法。 １０．マトリックスがタンパク質被覆ビーズを包含する特許請求の範囲２に記載 の方法。 １１．ビオチン化ペプチド基質及び標識の存在下で選択されたタンパクキナーゼ を培養する特許請求の範囲１に記載の方法。 １２．標識が放射性標識である特許請求の範囲１１に記載の方法。 １３．放射性標識がγ³²Ｐである特許請求の範囲１２に記載の方法。 １４．修正ペプチド生成物の量がシンチレーションスペクトロメータによって測 定される特許請求の範囲１１に記載の方法。 １５．ビオチン化ペプチド基質が、プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、プロ メガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、プロメガペプチドＣ（配列ＩＤ．３）、プロ メガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、プロメガペプチドＥ（配列ＩＤ．５）、プロ メガペプチドＦ（配列ＩＤ．６）、プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、プロ メガペプチドＨ（配列ＩＤ．８）よりなる群から選択される特許請求の範囲１に 記載の方法。 １６．選択されたタンパクキナーゼがセリン−トレオニンキナーゼ及びチロシン キナーゼよりなる群から選択される特許請求の範囲１に記載の方法。 １７．選択されたタンパクキナーゼに対して特異的反応性を有し定量化を可能な らしめるために化学反応によって修正されたビオチン部分を含有するビオチン化 ペプチド基質（ビオチン部分はビオチン 化ペプチド基質のタンパクキナーゼへのアクセスに対する立体障害を生じさせな い）を包含する容器を含む選択されたタンパクキナーゼの活性を測定するための キット。 １８．修正ペプチド基質が結合化合物を含む特許請求の範囲１７に記載のキット 。 １９．結合化合物がビオチンである特許請求の範囲１８に記載のキット。 ２０．選択されたタンパクキナーゼと相溶性である少なくとも１種の緩衝液を包 含する容器を更に含む特許請求の範囲１７に記載のキット。 ２１．ビオチン結合マトリックスを包含する容器を含む特許請求の範囲１７に記 載のキット。 ２２．ビオチン化ペプチド基質が、ビオチン化プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ． １）、ビオチン化プロメガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、ビオチン化プロメガペ プチドＣ（配列ＩＤ．３）、ビオチン化プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、 ビオチン化プロメガペプチドＥ（配列ＩＤ．５）、ビオチン化プロメガペプチド Ｆ（配列ＩＤ．６）、ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、ビオチ ン化プロメガペプチドＨ（配列ＩＤ．８）よりなる群から選択される特許請求の 範囲１７に記載のキット。 ２３．選択されたタンパクキナーゼがセリン−トレオニンキナーゼ及びチロシン キナーゼよりなる群から選択される特許請求の範囲１７に記載のキット。 ２４．ａ．ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）よりなる群から選択 されるビオチン化ペプチド基質を包含する容器と、 ｂ．チロシンキナーゼ−ビオチン化ペプチド基質に対して充分な結合容量及び 特異性を有するビオチン結合マトリックスを含有する容器と、 を含むチロシンキナーゼの活性を測定するためのキット。 ２５．ａ．ビオチン化プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、ビオチン化プロメ ガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、ビオチン化プロメガペプチドＣ（配列ＩＤ．３ ）、ビオチン化プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、ビオチン化プロメガペプ チドＥ（配列ＩＤ．５）、ビオチン化プロメガペプチドＦ（配列ＩＤ．６）、ビ オチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、ビオチン化プロメガペプチドＨ （配列ＩＤ．８）よりなる群から選択されるビオチン化ペプチド基質を包含する 容器と、 ｂ．ビオチン化ペプチド基質に対して充分な結合容量及び特異性を有するビオ チン結合マトリックスを有する容器と、 を含むセリン−トレオニンキナーゼの活性を測定するためのキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．結合化合物をペプチド基質に接合させて修正ペプチド基質を形成し、 ｂ．充分な量の修正ペプチド基質を選択されたタンパクキナーゼを含有する溶 液に添加し、 ｃ．タンパクキナーゼが修正ペプチド生成物を形成するのに十分な時間活性で ある条件下でタンパクキナーゼを修正ペプチド基質と共に培養し、そして ｄ．タンパクキナーゼの活性を測定する、 ことを含む選択されたタンパクキナーゼ活性の存在を測定する方法。 ２．ｃ段階の後に高い結合化合物親和性を有するマトリックスを用いて修正ペ プチド生成物を結合させることを更に含む特許請求の範囲１に記載の方法。 ３．マトリックスがタンパク質を包含することを特徴とする特許請求の範囲２ に記載の方法。 ４．タンパク質が実質的にアビジン及びストレプトアビジンよりなる群から選 択される特許請求の範囲３に記載の方法。 ５．タンパクキナーゼ活性の測定に先立って、結合した修正ペプチド生成物を 洗浄することを更に含む特許請求の範囲２に記載の方法。 ６．結合化合物がビオチンを包含する特許請求の範囲２に記載の方法。 ７．ペプチド基質がビオチン化されている特許請求の範囲６に記 載の方法。 ８．修正ペプチド基質及び修正ペプチド生成物が酵素活性を測定するためにビ オチン結合マトリックスに結合される特許請求の範囲６に記載の方法。 ９．マトリックスがタンパク質被覆ディスクを包含する特許請求の範囲２に記 載の方法。 １０．マトリックスがタンパク質被覆ビーズを包含する特許請求の範囲２に記載 の方法。 １１．修正ペプチド基質及び標識の存在下でタンパクキナーゼを培養する特許請 求の範囲１に記載の方法。 １２．標識が放射性標識である特許請求の範囲１１に記載の方法。 １３．放射性標識がγ³²Ｐである特許請求の範囲１２に記載の方法。 １４．修正ペプチド生成物の量がシンチレーションスペクトロメータによって測 定される特許請求の範囲１１に記載の方法。 １５．修正ペプチド基質が、プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、プロメガペ プチドＢ（配列ＩＤ．２）、プロメガペプチドＣ（配列ＩＤ．３）、プロメガペ プチドＤ（配列ＩＤ．４）、プロメガペプチドＥ（配列ＩＤ．５）、プロメガペ プチドＦ（配列ＩＤ．６）、プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、プロメガペ プチドＨ（配列ＩＤ．８）並びにそれらの類似物及び組合せよりなる群から選択 される特許請求の範囲１に記載の方法。 １６．タンパクキナーゼがセリン−トレオニンキナーゼ及びチロシンキナーゼよ りなる群から選択される特許請求の範囲１に記載の方法。 １７．ａ．タンパクキナーゼに対して特異的反応性を有し定量化を可能ならしめ るために化学反応によって修正された修正ペプチド基質を包含する容器、と ｂ．使用説明書、 とを含む選択されたタンパクキナーゼの存在又は活性を測定するためのキット。 １８．修正ペプチド基質が結合化合物を含む特許請求の範囲１７に記載のキット 。 １９．結合化合物がビオチンである特許請求の範囲１８に記載のキット。 ２０．タンパクキナーゼと相溶性である少なくとも１種の緩衝液を包含する容器 を更に含む特許請求の範囲１７に記載のキット。 ２１．ビオチン結合マトリックスを包含する容器を含む特許請求の範囲１７に記 載のキット。 ２２．修正ペプチド基質が、ビオチン化プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、 ビオチン化プロメガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、ビオチン化プロメガペプチド Ｃ（配列ＩＤ．３）、ビオチン化プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、ビオチ ン化プロメガペプチドＥ（配列ＩＤ．５）、ビオチン化プロメガペプチドＦ（配 列ＩＤ． ６）、ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、ビオチン化プロメガペ プチドＨ（配列ＩＤ．８）並びにそれらの類似物及び組合せよりなる群から選択 される特許請求の範囲１７に記載のキット。 ２３．タンパクキナーゼがセリン−トレオニンキナーゼ及びチロシンキナーゼよ りなる群から選択される特許請求の範囲１７に記載のキット。 ２４．ａ．ビオチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）並びにそれらの類似 物及び組合せよりなる群から選択される修正ペプチド基質を包含する容器、 ｂ．ビオチン結合マトリックスを含有する容器、及び ｃ．使用説明書、 を含むチロシンキナーゼの存在又は活性を測定するためのキット。 ２５．ａ．ビオチン化プロメガペプチドＡ（配列ＩＤ．１）、ビオチン化プロメ ガペプチドＢ（配列ＩＤ．２）、ビオチン化プロメガペプチドＣ（配列ＩＤ．３ ）、ビオチン化プロメガペプチドＤ（配列ＩＤ．４）、ビオチン化プロメガペプ チドＥ（配列ＩＤ．５）、ビオチン化プロメガペプチドＦ（配列ＩＤ．６）、ビ オチン化プロメガペプチドＧ（配列ＩＤ．７）、ビオチン化プロメガペプチドＨ （配列ＩＤ．８）並びにそれらの類似物及び組合せよりなる群から選択される修 正ペプチド基質を有する容器、 ｂ．ビオチン結合マトリックスを有する容器、及び ｃ．使用説明書、 を含むセリン−トレオニンキナーゼの存在又は活性を測定するためのキット。