DE69535119T2

DE69535119T2 - Quantifizierung einer individuellen Proteinkinaseaktivität

Info

Publication number: DE69535119T2
Application number: DE69535119T
Authority: DE
Inventors: Said Fitchburg Goueli
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1995-03-06
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2015-03-07
Also published as: US6066462A; EP0760678B1; AU2097595A; EP1340816A2; EP0760678A1; DE69535119D1; US6753157B2; JPH10511260A; DE69531734T2; ES2268178T3; EP0760678A4; US20020106701A1; EP1340816A3; ATE333514T1; US6348310B1; ES2204946T3; WO1995023612A1; EP0760678B9; ATE249237T1; DE69531734D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung eines Assay-Protokolls mit dem enzymatische Aktivität gemessen wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur präzisen und einfachen Quantifizierung der enzymatischen Aktivität von Proteinkinasen und weiter einen Assay, der spezifisch für individuelle Proteinkinasen in Gegenwart von weiteren Proteinkinasen ist.
Zitierte Literaturstellen
Eine Bibliographie der in dieser Anmeldung zitierten Literaturstellen findet sich in dem den Ansprüchen vorhergehenden Abschnitt.
Beschreibung des Standes der Technik
Enzyme sind große Proteine, die Reaktionen in lebenden Zellen katalysieren. Enzyme bauen andere Moleküle auf oder ab. Beispielsweise katalysieren Enzyme die Synthese von Fett aus Fettsäuren, bilden komplexe Zucker aus Glucose und Fructose und helfen bei der Bildung von anderen Proteinen aus Aminosäuren. Enzyme kehren auch den Aufbauprozess um, indem sie komplexe Strukturen aufbrechen.
Bei ihren Reaktionen sind Enzyme üblicherweise spezifisch für bestimmte Substrate. Beispielsweise kann ein individuelles Enzym eine Reaktion katalysieren, an der lediglich ein einziges Substrat beteiligt ist, oder es kann mit einer Gruppe von verwandten Substraten reagieren.
Bei gesunden Personen befinden sich die meisten Enzyme innerhalb der Zellen. Einige Krankheiten bewirken jedoch die Freisetzung der Enzyme aus den sterbenden Zellen in das Blut. Der erhöhte Enzymgehalt kann dann gemessen werden. Ein abnormaler Enzymgehalt im Blut charakterisiert bestimmte medizinische Zustände. Beispielsweise ist ein Enzymnachweis für abnormale Gehalte des Enzyms Kreatinkinase im Blut ein nützliches diagnostisches Mittel auf Herzkrankheiten. Ähnlich können Knochen- oder Lebererkrankungen durch Auftreten von erhöhten Gehalten an Alkalinphosphatase im Blutstrom diagnostiziert werden. Prostatakrebs kann durch erhöhte Gehalte an Säurephosphatase im Blutstrom diagnostiziert werden.
In Abhängigkeit des allgemeinen Reaktionstyps, den sie katalysieren, werden Enzyme in Gruppen eingeteilt. Die vorliegende Erfindung betrifft eine spezifische Gruppe von Enzymen, die Transferasen genannt werden, die die Übertragung einer Gruppe von einem Substrat auf ein anderes katalysieren. Die vorliegende Erfindung betrifft genauer die Transferaseuntergruppe, die Proteinkinasen genannt wird.
Proteinkinase ist eine generische Bezeichnung für alle Enzyme, die Phosphat auf ein Protein übertragen. Etwa 3 bis 4 % des menschlichen Genoms enthält Transkriptionsinformation für die Bildung von Proteinkinasen.
Gegenwärtig gibt es bis zu 200 bekannte verschiedene Proteinkinasen. Da jedoch 3 bis 4 % des menschlichen Genoms die Bildung von Proteinkinasen kodiert, könnten viele tausende von unterschiedlichen Kinasen im menschlichen Körper vorhanden sein.
Proteinkinasen sind Enzyme, die die Übertragung von Phosphor aus Adenosintriphosphat (ATP) oder Guanosintriphosphat (GTP) auf das Targetprotein katalysieren, wodurch ein phosphoryliertes Protein und Adenosindiphosphat (ADP) beziehungsweise Guanosindiphosphat (GDP) erhalten werden. Zunächst wird ATP oder GTP hydrolysiert, wobei ADP oder GDP und anorganisches Phosphat gebildet werden. Das anorganische Phosphat wird dann an das Targetprotein gebunden. Das Proteinsubstrat, das das Target für die Kinasen ist, kann ein Strukturprotein sein, wie es in Membranmaterial wie Zellwänden gefunden wird, oder ein anderes Enzym, das ein funktionelles Protein ist.
Aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung, Vielzahl und Einzigartigkeit wurden Proteinkinasen eine der wichtigsten und umfangreich untersuchte Familie von Enzymen der biochemischen und medizinischen Forschung. Untersuchungen haben gezeigt, dass Proteinkinasen Schlüsselregulatoren von vielen Zellfunktionen sind, wie Signaltransduktion, Regulation der Transkription, Zellsterblichkeit und Zellteilung. Es konnte auch gezeigt werden, dass verschiedene Onkogene Proteinkinasen kodieren, was darauf hindeutet, dass Kinasen eine Rolle in der Onkogenese spielen.
Abhängig von dem Aminosäurerest, den sie phosphorylieren, werden Proteinkinasen häufig in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe, die Serin/Threoninkinasen bezeichnet wird, umfasst von zyklischen AMP und zyklischen GMP abhängige Proteinkinasen, von Kalzium und Phospholipid abhängige Proteinkinase, Kalzium und Calmodulin abhängige Proteinkinasen, Caseinkinasen, Zellteilungszyklusproteinkinasen usw. Diese Kinasen sind üblicherweise cytoplasmisch oder mit den festen Bestandteilen von Zellen verbunden, gegebenenfalls über Ankerproteine.
Die zweite Gruppe von Kinasen, die Tyrosinkinasen, phosphorylieren Tyrosinreste. Sie liegen in wesentlich geringerer Menge vor, spielen jedoch eine gleichermaßen wichtige Rolle bei der Zellregulation. Diese Kinasen umfassen verschiedene Rezeptoren für Moleküle wie Wachstumsfaktoren und Hormone, wie epidermischen Wachstumsfaktorrezeptor, Insulinrezeptor, Rezeptoren für Blutblättchen basierte Wachstumsfaktoren usw. Untersuchungen haben gezeigt, dass viele Tyrosinkinasen Transmembranproteine sind, wobei sich deren Rezeptordomänen außerhalb und deren Kinasedomänen innerhalb der Zellen befinden.
Die Phosporylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosin enthaltenden Proteinen durch Kinasen ist wichtig, da die phosphorylierten Proteinprodukte an zahlreichen zellulären Prozessen beteiligt sind wie der Onkogenese, Zelltransformation, Zellwachstum und Exocytose. Zurzeit werden zahlreiche Versuche durchgeführt, die Kinasen betreffen, die das Krebswachstum inhibieren oder den Krebszelltod fördern können. Die Bestimmung der spezifischen Kinase, die bei der Inhibierung von Krebswachstum oder der Förderung des Zelltods beteiligt ist, ist für die Allgemeinheit wichtig. Daher sind die Fortschritte bei der Erkennung von Kinaseaktivitätsgraden außerordentlich wichtig.
Aktivitätsbestimmung
Für eine allgemeine Beschreibung der Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms wird auf Robyt and White (1990) verwiesen. Robyt and White definieren die Aktivität eines Enzyms als die Reaktionsmenge, die eine bestimmte Enzymmenge in einer bestimmten Zeitspanne erzeugt. Die Aktivität wird bestimmt, indem die Menge an erzeugten Produkt oder die Substratmenge gemessen wird, die pro Zeiteinheit bei hoher Konzentration oder Sättigungsbedingung in Bezug auf das Substrat verbraucht wird. Üblicherweise geschieht dies, indem eine chemische Analyse hinsichtlich des Produkts oder Substrats durchgeführt wird.
Substrate, die typischerweise für den Nachweis der Aktivität einer bestimmten Kinase eingesetzt werden, umfassen Casein, das aus Milch isoliert wird, Histone, die aus Kälbern isoliert werden, Phosphovitin, das aus Eigelb isoliert wird, und Myelin basierte Proteine, die aus Rückenmark von Rindern isoliert werden. Bei dem Nachweis können diese Substrate phosphoryliert werden, vorausgesetzt, dass die richtige Kinase eingesetzt worden ist. Assays, für die diese Substrate zur Bestimmung der Kinaseaktivität eingesetzt werden, sind auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt.
Radioaktiver Nachweis der Kinaseaktivität
Die jüngsten Verfahren zur Messung der Proteinkinaseaktivität beruhen auf radioaktiven Nachweisverfahren. Bei diesen Verfahren wird eine Probe, die die interessierende Kinase enthält, mit Aktivatoren und einem Substrat in Gegenwart von y-³²P-ATP oder y-³²P-GTP inkubiert. Häufig wird ein allgemeines und billiges Substrat wie Histon oder Casein eingesetzt.
Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die Reaktion gestoppt und ein Aliquot der Reaktionsmischung direkt auf einen Filter gegeben, das das Substrat bindet. Das Filter wird dann mehrere Male gewaschen, um überschüssiges radioaktiv markiertes freies ATP zu entfernen, und die Menge an radiomarkiertem Phosphat in dem Substrat wird im Szintillationszähler gemessen. Dieses Verfahren ist weit verbreitet und ist ein genaues Verfahren zur Bestimmung der Proteinkinaseaktivität sowohl in rohen als auch in gereinigten Proben.
Babcook et al. (1991) beschreiben einen Nachweis unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern und Immunofluoreszenztechnologie zur Bestimmung der Aktivitäten von Protein-Tyrosinkinase und Protein-Tyrosinphosphatase. Dieses Verfahren wurde mit p56^kk oder p60^etc durchgeführt.
Budde et al. (1991) beschreiben Nachweistechniken mit sauren Peptidsubstraten für Proteinkinasen.
Für diese Technologien wird radioaktiver Phosphor eingesetzt, der in ein zu untersuchendes Substrat eingeführt ist. Nach Einwirkung der Kinase wird das Phosphopeptid eluiert während freier radioaktiver Phosphor, ATP und Protein zurückgehalten werden.
Gopalakrishna et al. (1992) beschreiben ein Verfahren, für das die herkömmlichen Methoden zur Messung der Proteinkinaseaktivität eingesetzt wird. Für dieses Verfahren werden die Inkubationen und Filtrationen kombiniert, die zur Bestimmung der Proteinkinaseaktivität mit Mikrotiter-Platten mit eingepassten Filterscheiben erforderlich sind. Gemäß einer ähnlichen Publikation von Chakravarthy et al. (1990) wird die Aktivität von Kinase C mit für Proteinkinase C (PKC) selektiven Peptidsubstraten gemessen, indem radioaktiver Phosphor in das Substrat inkorporiert wird.
Die Radioaktivität wird mittels Flüssigszintillation gemessen.
Bestimmung der Kinaseaktivität ohne Radioaktivität
Ein nicht-radioaktives Verfahren zur Bestimmung der Kinaseaktivität wurde entwickelt, wobei die Phosphorylierung von Tyrosin mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern (Rijksen et al. 1991) bestimmt wird. Nach der Inkubation von Tyrosinkinase mit nicht-markiertem ATP und einem geeigneten Substrat wird die Reaktionsmischung einem Dot-Blot-Assay auf einer Polyvinylidendiflorid-(PVDF)-Membran unterzogen. Der Grad der Phosphorylierung wird durch Reaktion mit dem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper bestimmt und dann mittels Immunogoldfärbung ermittelt. Die Menge an vorhandenen Phosphotyrosin wird mit einem Densitometer bestimmt.
Ein Nachteil der Dot-Blot-Methode ist, dass sie auf den Nachweis von Tyrosinkinasen beschränkt ist. Antikörper für Phosphotyrosin können aufgrund der Größe der Antigene hergestellt werden. Versuche zur Herstellung von ähnlichen Antikörpern für Phosphoserin und Phosphothreonin für den Nachweis von Phosphoserin und Phosphothreonin enthaltenden Proteinen waren bisher nicht erfolgreich. Zudem werden für diesen Nachweis mehrere Inkubations- und Waschschritte notwendig, von denen jeder eine beträchtliche Zeitspanne in Anspruch nimmt, wodurch sich die Durchführungszeit für den Nachweis erheblich verlängert. Als Ergebnis wird ein gefärbter Punkt auf dem Blot erhalten. Der gefärbte Punkt kann den wirksamen Probenbereich des Nachweises beschränken und für die Quantifizierung des Endergebnisses den Einsatz eines Scanning Densitometers erforderlich machen, der ein teurer Ausrüstungsgegenstand ist, der nicht in jedem Labor verfügbar ist. Der Densitometer muss Strahlausdehnungen aufweisen, die wenigstens den Targetquerschnitt der erhaltenen Punkte abdecken.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins der Aktivität einer ausgewählten Proteinkinase umfassend die Konjugation einer bindenden Verbindung an ein Peptidsubstrat unter Ausbildung eines modifizierten Peptidsubstrats; Zugabe einer ausreichenden Menge des modifizierten Peptidsubstrats zu einer Lösung, die die ausgewählte Proteinkinase enthält; Inkubation der Proteinkinase mit dem modifizierten Peptidsubstrat unter Bedingungen, bei denen die Proteinkinase ausreichend lange aktiv ist um ein modifiziertes Peptidprodukt auszubilden; und Messung der Aktivität der Proteinkinase.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Kit für den Nachweis des Vorliegens oder der Aktivität einer ausgewählten Proteinkinase, das einen Behälter mit einem modifizierten Peptidsubstrat mit spezifischer Reaktivität für die Proteinkinase und das mittels chemischer Reaktion modifiziert ist, um die Quantifizierung zu ermöglichen; und Gebrauchsanweisungen enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Kit für den Nachweis des Vorliegens oder der Aktivität einer Tyrosinkinase mit einem Behälter mit einem modifizierten Peptidsubstrat, das ausgewählt ist unter der Gruppe bestehend aus biotinyliertem Promegapeptid G (SEQ.ID.7) und Analogen und Kombinationen davon; einen Behälter mit einer Biotin bindenden Matrix; und Gebrauchsanweisungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Kit zum Nachweis des Vorliegens oder der Aktivität von Serin-Threonin-Kinasen mit einem Behälter mit einem modifizierten Peptidsubstrat ausgewählt unter der Gruppe bestehend aus biotinyliertem Promegapeptid A (SEQ.ID.1), biotinyliertem Promegapeptid B (SEQ.ID.2), biotinyliertem Promegapeptid C (SEQ.ID.3), biotinyliertem Promegapeptid D (SEQ.ID.4), biotinyliertem Promegapeptid E (SEQ.ID.5), biotinyliertem Promegapeptid F (SEQ.ID.6), biotinyliertem Promegapeptid G (SEQ.ID.7), biotinyliertem Promegapeptid H (SEQ.ID.8) und Analogen und Kombinationen davon; einem Behälter mit einer Biotin bindenden Matrix; und Gebrauchsanweisungen.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens oder der Aktivität einer ausgewählten Proteinkinase in einer Körperflüssigkeit, wobei man die Körperflüssigkeit mit einer ausreichenden Menge eines biotinyliertem Peptidsubstrats reagieren lässt, sodass ein modifiziertes Peptidprodukt unter Bedingungen ausgebildet wird, bei denen die Proteinkinase ausreichend lang aktiv ist, um das modifizierte Peptidprodukt in einer solchen Menge auszubilden, dass das modifizierte Peptidprodukt nachgewiesen werden kann und Messung der Menge an modifiziertem Peptidprodukt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Nachweis einer spezifischen Proteinkinase in Gegenwart von verschiedenen anderen Proteinkinasen in einem Gewebeextrakt. Diese Art von Nachweis ist von Versuchsdurchführenden besonders erwünscht, da keine Reinigung der spezifischen Proteinkinase, die untersucht werden soll, erforderlich ist. Herkömmlicherweise ist eine Reinigung erforderlich um andere Proteinkinasen in dem Extrakt zu entfernen. Diese langwierige Prozedur kann mit dem Verfahren unter Verwendung des spezifischen biotinylierten Peptidsubstrats umgangen werden.
Zusätzlich wird der Versuchsdurchführende wegen der minimalen Verluste an Enzym beim Nachweis des Expressionsgrades der spezifischen Kinase unter verschiedenen physiologischen Bedingungen unterstützt, da eine Reinigung überflüssig ist. Das bedeutet, dass die nachgewiesene Aktivität eine genaue Abschätzung des gesamten exprimierten aktiven Enzyms darstellt.
Peptidsubstrate für verschiedene Proteinkinasen wie cAMP abhängige Proteinkinase (PKA), cGMP abhängige Proteinkinase (PKG), Ca²⁺/Phospholipid abhängige Proteinkinasen (PKC), Caseinkinasen 1 und 2 (CK-1 und CK-2), Wachstumsfaktorrezeptoren, Nicht-Wachstumsfaktorrezeptoren und lösliche Proteine, die eine aktive Tyrosinkinase enthalten, Zellzyklus abhängige Proteinkinase (p34cdc2 Proteinkinase), S6 Proteinkinase, Ca²⁺/Calmodulin abhängige oder multifunktionale (CAM) Proteinkinasen, DNA abhängige Proteinkinase und Kinasen mit carboxylterminaler Domäne (CDT) werden üblicherweise nach einem Peptidsyntheseprotokoll synthetisiert, gemäß dem eine biotinylierte Aminosäure am N-Terminus des Peptids inkorporiert wird.
Daher gibt es verschiedene Proteinkinasen, die nach der vorliegenden Vorgehensweise nachgewiesen werden können, sodass verschiedene Kits für die verschiedenen Proteinkinasen bereitgestellt werden können.
Der Nachweis ist sehr schnell und kann üblicherweise in weniger als 10 Minuten nach Beendigung der Reaktion fertiggestellt sein. Das ist wichtig, da nach gegenwärtigen Protokollen annähernd 2 Stunden für die Erzielung derselben Ergebnisse benötigt werden.
Es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich abgesehen von der Standardausrüstung, die heutzutage in den meisten Laboratorien verfügbar ist. Das Verfahren erfordert keine speziellen anorganischen oder organischen Lösungsmittel wie phosphorige Säure, Essigsäure, Aceton oder Ethanol wie für die bekannten Protokolle.
Die vorliegende Erfindung kann an einen large scale Nachweis angepasst werden, wie er heutzutage von großen Laboratorien oder pharmazeutischen Laboratorien gefordert wird, die sich mit Wirkstoffforschung beschäftigen.
Die Kosten der vorliegenden Erfindung sind vergleichbar mit den Kosten für die bekannten Nachweise. Die möglicherweise höheren Kosten für Avidin und biotinyliertem Reagenz können dadurch ausgeglichen werden, dass teurere Lösungsmittel, wie sie bei den anderen Nachweisen erforderlich sind, nicht notwendig sind.
Zudem ist für die vorliegende Erfindung nicht länger der Einsatz eines Nachweissystems erforderlich, bei dem zur Abtrennung der exogenen Peptide von endogenen Substraten eine Gelelektrophorese notwendig ist. Gelelektrophorese trennt die verschiedenen Mono- und phosphorylierten Formen des Substrats auf, was nützlich sein kann. Jedoch verkompliziert dieses Verfahren die Quantifizierung des gesamten Phosphattransfers.
Bei dem bekannten Nachweis mit Filterbindungspapier zur Bindung von stark positiven Molekülen, die in dem Gewebe des Zellextrakts vorhanden sind und phosphoryliert sind, treten häufig Probleme auf. Mit der vorliegenden Erfindung können diese Probleme überwunden werden, da nur das Substrat und das Produkt gebunden werden, da diese die einzigen Komponenten sind, die biotinyliert sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nicht länger erforderlich, die Primärstruktur der Konsensussequenz zu ändern, die das primäre Aminosäuresequenztarget des zu analysierenden Enzyms ist, indem zusätzliche Argininreste eingeführt werden, um die primäre Sequenz für das Enzym zu erhalten, das in vivo vorliegt. Bekannte Assays mit Filterbindung erfordern Substrate, die zahlreiche Argininreste enthalten, wodurch sich die Spezifität des Substrats ändern kann, sodass das Substrat auch von anderen Kinasen erkannt wird. Ein Beispiel für eine derartige Änderung ist die Sequenz Arg-Arg-Arg-Tyr-Ser (eine Legende der Abkürzungen für die Aminosäuren findet sich in Tabelle 1), die in dem CDT Kinasepeptidsubstrat Arg-Arg-Arg (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)₄ vorliegt, die von cAMP abhängiger Proteinkinase und anderen Kinasen erkannt werden kann.
Mit der vorliegenden Erfindung werden Ergebnisse mit höherer Genauigkeit erzielt, da nahezu alle der phosphorylierten Peptidmoleküle durch die mit stark bindenden Avidin oder Streptavidin beschichtete Matrix gebunden werden. Im Gegensatz dazu werden die phosphorylierten Proteine an das Phosphocellulosepapier durch elektrostatische Wechselwirkung gebunden, die nicht stark ist. Daher kommt es zu einem Verlust an phosphoryliertem Peptid während des Waschvorgangs.
Es wird nun im Einzelnen Bezug genommen auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, wobei Beispiele dafür in den anliegenden Figuren dargestellt sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm das den Einfluss der Enzymkonzentration auf die Kinaseaktivität von PKA mit modifziertem Kemptid-Substrat zeigt. Das Peptid lag in einer Menge von 100 μM vor und das Enzym wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, nachgewiesen.
2 ist ein Diagramm, das den Einfluss der Erhöhung der Konzentration von biotinyliertem Kemptid-Subrat auf die Proteinkinaseaktivität von PKA zeigt. 2 Kemptid-Units PKA lagen in der Reaktion vor. Die übrigen Reaktionsbestandteile waren wie in Beispiel 1 beschrieben.
3 ist ein Diagramm, das die kinetische Analyse von PKA mit Kemptid als Substrat mit zwei Units pro Reaktion zeigt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
4 ist ein Diagramm, das den Einfluss des Peptidinhibitors für PKA auf deren Proteinkinaseaktivität zeigt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
5 ist ein Diagramm, das die Proteinkinaseaktivität von PKA in verschiedenen Geweben von Ratten zeigt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
6 ist ein Diagramm, das den Einfluss der Enzymkonzentration auf die Kinaseaktivität von PKC mit biotinyliertem Neurogranin _(28-43) als Substrat zeigt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
7 ist ein Diagramm, das den Einfluss der Erhöhung der Konzentration von biotinyliertem Neurogranin _(28-43) Substrat auf die Proteinkinaseaktivität von PKC zeigt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
8 ist ein Diagramm, das den Einfluss des PKC-Inhibitors auf die Aktivität von PKC zeigt, wobei biotinyliertes Neurogranin_(28-43) als Substrat verwendet wurde, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist.
9 ist ein Diagramm, das den Einfluss der Proteinkinaseaktivität von PKC in Rattenhirnextrakt und von teilweise gereinigter PKC zeigt, wie es in Beispiel 4 beschrieben wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen:
Für die vorliegende Erfindung gelten die folgenden Definitionen:
Aktivität eines Enzyms: Die Menge an Reaktionsprodukt(en), das eine bestimmte Menge Enzym, die auf ein Substrat einwirkt, in einer vorgeschriebenen Zeitspanne erzeugt.
Modifiziertes Peptid: Eine chemische Spezies, die aus einem Peptid aufgebaut ist, das nachträglich mit einem zweiten chemischen Anteil umgesetzt worden ist, hier Biotin, wodurch das Peptid aufgrund der Eigenschaften des zweiten chemischen Anteils kontrolliert werden kann. Dieser Anteil kann als Detektorsegment oder Modifizierungstag bezeichnet werden.
Peptid: Eine Verbindung, die üblicherweise aus 2-30 natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäuren besteht, die zusätzlich modifiziert sein können beispielsweise durch kovalente Verknüpfung der Peptidbindungen der Alpha-Carboxylgruppe einer ersten Aminosäure und der Alpha-Aminogruppe einer zweiten Aminosäure durch Abspaltung eines Wassermoleküls. Die Aminosäuren können entweder natürlich vorkommende Aminosäuren oder chemisch synthetisierte Varianten von solchen Aminosäuren oder modifizierte Formen dieser Aminosäuren sein, deren chemische Basisstruktur durch Addition anderer chemischer Gruppen abgeändert sein kann, wie sie in natürlich vorkommenden Verbindungen kovalent an diese gebunden vorgefunden werden.
Phosphorylierung: Die Einführung einer Phosphatgruppe in ein Substrat.
Modifziertes Peptidprodukt: Eine chemische Spezies, die durch die Einwirkung eines Enzyms auf ein modifziertes Peptidsubstrat ausgebildet wird, dessen ursprüngliches Bindungsmuster abgeändert worden ist. Derartige Abänderungen können die Einführung oder Entfernung von neuen chemischen Spezien zu/aus dem modifizerten Peptidsubstrat umfassen. Die konkreten Änderungen, die in dem modifizierten Peptidsubstrat vorgenommen werden, hängen von dem jeweiligen Enzym ab, das an der Abänderung des modifzierten Peptidsubstrats beteiligt ist. Beispiel für ein modifziertes Peptidprodukt kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, ein Produkt sein, das durch Inkubation eines modifzierten Peptidsubstrats mit einer Proteinkinase unter Bedingungen ausgebildet wird, unter denen durch die Kinase das modifizierte Peptidsubstrat durch Einführung einer Phosphatgruppe in das Peptid aus einem Phosphatdonor wie ATP oder GTP abgeändert wurde.
Sequenzerfordernis: Die Eigenschaft eines Enzyms zur Erkennung und Katalyse einer Reaktion anhand der Peptidsequenz des Substrats.
Substrat: Die Substanz, auf die das Enzym einwirkt.
Modifiziertes Peptidsubstrat: Ein modifiziertes Peptid, das durch die Einwirkung eines Enzyms verändert werden kann. Solche Änderungen können die Einführung oder Entfernung von chemischen Spezien in oder aus dem modifzierten Peptid sein. Oft ist es vorteilhaft ein besonderes modifiziertes Peptidsubtrat für den Nachweis eines besonderen interessierenden Enzyms zu gestalten. Ein potentielles modifiziertes Peptidsubstrat für Proteinkinase muss eine Aminosäure aufweisen, die als Phosphatakzeptor wirken kann, wie Serin. Die Tauglichkeit eines potentiell modifizierten Peptidsubstrats zum Nachweis einer besonderen enzymatischen Aktivität kann bestimmt werden, indem das potentielle modifizierte Peptidsubstrat mit dem Enzym unter Bedingungen inkubiert wird, von denen bekannt ist, dass das Enzym aktiv ist, und indem die Geschwindigkeit verfolgt wird, mit der ein modifiziertes Peptidprodukt erzeugt wird.
Mit der vorliegenden Erfindung können die Aktivitäten von Kinaseenzymen quantifiziert werden, indem die Menge an spezifischem modifizierten Peptidsubstrat gemessen wird, das durch das Enzym einer Reaktion unterzogen worden ist.
Kinasen
Die Kinasen, die erfindungsgemäß quantifiziert werden, nutzen vorzugsweise ATP oder GTP als Phosphatdonor und übertragen Gamma-Phosphat aus dem Molekül auf Serin-, Threonin- oder Tyrosinaminosäure. Proteinkinasen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, Substrate an bestimmten Sequenzen zu phosphorylieren. Diese Sequenzen wurden durch Sequenzierung der Aminosäuren im Bereich der Phosphorylierungsstelle bestimmt und sind üblicherweise für jede Proteinkinase verschieden. Die Erkennungssequenz eines Substrats ist spezifisch für einen Kinasekatalysator.
Es wird angenommen, dass sich die Substratbindungsstelle der Kinase in der katalytischen Domäne des Enzyms befindet. Diese Domäne ist für alle Proteinkinasen essentiell. Sie enthält typischerweise über 240 Reste und enthält die Bindungsstelle der Kinase für ATP oder GTP.
Messung der Aktivität
Die Aktivität eines Enzyms wird bestimmt, indem die Menge an hergestelltem Produkt gemessen wird, das heißt das modifizierte Peptidprodukt. Die Messung der Aktivität der Enzyme kann durch Quantifizierung der Menge an Zielprodukt der Reaktion durchgeführt werden. Die Aktivität von Proteinkinasen kann aufgrund ihrer Fähigkeit zur Modifizierung spezifischer Peptidsubstrate durch Übertragung von Phosphatgruppen auf die Peptidsubstrate der Erfindung gemessen werden.
Inkubation des Enzyms
Das Enzym wird unter bekannten Bedingungen mit dem modifizierten Peptidsubstrat unter Ausbildung von modifizierten Peptidprodukten unter Bedingungen inkubiert, bei denen das Enzym aktiv ist. Jedes Enzym wird üblicherweise bei dem für das Enzym optimalen pH-Wert, Temperatur oder anderen Bedingungen bestimmt.
Assay-Protokoll
Es wurde ein Assay-Protokoll entwickelt, mit dem die enzymatische Aktivität von verschiedenen Proteinkinasen auf spezifische, schnelle und einfache Weise bestimmt werden kann. Das Assay-Protokoll ist dafür bestimmt, einzelne Proteinkinasen in Gegenwart einer Mischung von anderen Proteinkinasen nachzuweisen. Der Enzymassay kann in einem Kitformat verpackt sein und es können gesonderte Kits für die gewünschte spezifische Proteinkinase bereitgestellt werden. Weiter kann der Assay an ein high through-put Format angepasst werden.
Peptidsubstrate

Für das Verfahren wurde eine Anzahl an spezialisierten Peptidsubstraten, einschließlich Analogen und Kombinationen dieser Peptidsubstrate entwickelt, die in der nachstehenden Tabelle beschrieben sind. Tabelle 1

Legende:

Abkürzung	Aminosäure
Ala	Alanin
Cys	Cystein
Asp	Asparginsäure
Glu	Glutaminsäure
Phe	Phenylalanin
Gly	Glycin
His	Histidin
Ile	Isoleucin
Lys	Lysin
Leu	Leucin
Met	Methionin
Asn	Asparagin
Pro	Prolin
Gln	Glutamin
Arg	Arginin
Ser	Serin
Thr	Threonin
Val	Valin
Trp	Tryptophan
Tyr	Tyrosin

Promegapeptide A-C enthalten eine vorteilhafte Sequenz, die für Serin-Threoninkinasen spezifisch ist. Promegapeptid G ist ein vorteilhaftes Substrat für die Tyrosinkinase.
Zwar wird für das hier vorgestellte Material von Peptiden Gebrauch gemacht, die chemisch in vitro synthetisiert worden sind und von denen einige kommerziell erhältlich sind, dennoch wird angemerkt, dass sich die Erfindung auch durchführen lässt, indem ein Peptid aus einer natürlichen Quelle wie der Verdauung eines größeren Vorläuferproteins oder -peptids isoliert wird und Isolierung des geeigneten erhaltenen Fragments mit bekannten Methoden und anschließender Bindung mit einem hier-definierten Detektorsegment.
Für den Assay wird ein biotinyliertes markiertes Peptid eingesetzt, das für die interessierende Proteinkinase erforderlich ist. In Gegensatz zu Proteinsubstraten, die häufig für Proteinkinaseassays eingesetzt werden, können Peptide so designed werden, dass sie ein selektives Substrat für eine bestimmte Kinase darstellen, indem ein Peptid synthetisiert wird, das die Konsensussequenz wiedergibt, die das interessierende Enzym erkennt. Das biotinylierte Peptid kann durch die jeweilige Proteinkinase unter für dieses Enzym optimalen Phosphotransferasebedingungen in Gegenwart von y-³²P-ATP phosphoryliert werden. Da sowohl die phosphorylierten als auch die nicht-phosphorylierten Peptide biotinyliert sind, können sie an eine Biotin bindende Matrix angebunden werden und das überschüssige freie y-³²P-ATP kann mittels mehrmaliger Waschvorgänge entfernt werden.
Die Biotin bindende Matrix kann eine beliebige Matrix sein, die kovalent mit Avidin- oder Streptavidinmolekülen verbunden ist, wie Filterscheiben, Beads oder eine lösliche Matrix. FMC-Corporation (Pine Brook, New Jersey) ist ein Beispiel für einen Hersteller von Avidin und Streptavidin in Matrizes wie Streptavidin verknüpftes Polyvinylcarbonat-(PVC)-Silica, mikroporöse Kunststofffolien oder 12,5 mm Scheiben. Die gebundenen Peptide können zur Bestimmung des ³²P, das in das Peptid inkorporiert worden ist, und damit der Proteinkinaseaktivität des zu untersuchenden Enzyms in einen Flüssigzintillationsspektrometer gegeben werden.
Das zugrunde liegende Prinzip der biotinylierten Peptidmethode ist die Konjugation der Peptidsubstrate für eine spezifische Proteinkinase mit Biotin, wobei das biotinylierte Peptid als Substrat für den Nachweis des interessierenden Enzyms verwendet werden kann. Nach Beendigung der Reaktion werden die phosphorylierten und nicht phosphorylierten Peptide auf Streptavidin oder Avidin beschichtete Filtermembranen, Platten für ELISA oder Avidin beschichtete magnetische Teilchen gegeben, an die die Peptide binden. Freies ATP kann durch Waschen entfernt werden und die ATP-freien Peptide, die an die Filter, Teilchen oder Platten gebunden sind, können mit einem Flüssigzintillationsspektrometer gemessen werden und die Enzymaktivität kann anhand des inkorporierten ³²P bestimmt werden. Eine Biotingruppe kann erfolgreich an ein als Substrat für die Proteinkinaseaktivitätsmessung bestimmtes Peptid gebunden werden, wenn die folgenden Kriterien beachtet werden:

1. Die Biotingruppe muss kovalent an die N-terminate Aminogruppe gebunden sein und nicht an irgendeine andere Aminogruppe, die intern oder C-terminal in dem Peptidsubstrat vorliegt. Dies ist essentiell, da die kovalente Bindung eines Biotinmoleküls an eine ε-Aminogruppe eines internen Lysins eine Änderung der Gesamtladung des Peptids bewirkt. Als Folge kann die Effizienz des Peptids als Substrat für einige Proteinkinasen wie PKA, PKC und CAM Kinasen verändert sein.
2. Die Einführung des Biotinteils in das Peptid sollte keine sterische Hinderung der Zugänglichkeit des Peptidsubstrats für das zu untersuchende Enzym verursachen. Vorzugsweise wird Biotin über 6 Kohlenstoffatome mit dem Substrat verbunden, um die sterische Hinderung zu minimieren.
3. Es muss eine Matrix bereitgestellt werden, die das biotinylierte phosphorylierte Peptid binden kann, sodass die Aktivität der betreffenden Proteinkinase durch Messung der Menge an radiomarkiertem Peptidprodukt bestimmt werden kann. Die Bindung sollte für das modifizierte Phosphopeptid spezifisch sein und andere phosphorylierte Proteine oder andere Peptide, die in der Probe vorliegen, sollten nicht an die Matrix gebunden werden. Folglich ist die Aktivität proportional zu der Menge an gebundenem phosphorylierten biotinylierten Peptid.
4. Der Überschuss an y³²P-ATP, das für die Reaktion nicht verbraucht wurde, sollte vollständig entfernt werden. Das Ziel dabei ist einen möglichst geringen Hintergrundgeräuschpegel zu begünstigen und zudem ein schnelles Verfahren zum Nachweis des betreffenden Enzyms zu schaffen.
5. Die Bindungskapazität der Matrix für das biotinylierte Peptid sollte groß genug sein, so dass eine Konzentration eingesetzt wird, die das mehrfache des Km-Wertes des Peptidsubstrats beträgt. Durch dieses Erfordernis wird sichergestellt, dass die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion innerhalb einer vernünftigen Zeit linear wird. Weiter sollte die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion proportional zu der Enzymmenge in der Reaktion sein.

Für Experimente im kleinen Maßstab kann eine Avidin beschichtete Membranscheibe mit 25 mm Durchmesser mit einem Stift nummeriert werden. Alternativ kann ein bekanntes Volumen an Avidin beschichteten Magnetteilchen in einem Eppendorfröhrchen verwendet werden.
Kinaseassay
Der Kinaseassay wird wie beschrieben durchgeführt, wobei gereinigte Enzyme oder Gewebeextrakte als Enzymquelle und das biotinylierte Peptid als Substrat in Gegenwart weiterer Reagenzien, die für die Reaktion erforderlich sind, wie Puffer, zweiwertige Kationen wie Mn²⁺, Ca²⁺ und Mg²⁺ und y-³²-P-ATP verwendet werden. Für manche Proteinkinasen können andere Kofaktoren wie Phospholipide und Calmodulin erforderlich sein. Nach Beendigung der Reaktion wird ein Aliquot entnommen und direkt auf die Avidin beschichteten Scheiben aufgezogen. Die Scheiben werden in ein Becherglas mit 2 M NaCl gegeben, um freies y-³²-P-ATP abzuwaschen. Alternativ werden die Aliquots in ein Röhrchen mit den Teilchen pipettiert und gut vermischt.
NaCl in dem Becherglas kann 5 mal jeweils nach einer Minute ausgetauscht werden, so dass der Vorgang in 5 Minuten beendet ist. Werden Teilchen verwendet, können sie mit herkömmlichen Mitteln zur Entfernung von freien löslichen Reaktionsbestandteilen wie ATP und endogenen Proteinen gewaschen werden.
Der Assay kann durch geringfügige Modifikation der Matrix zu einem high through-put Assay abgeändert werden. Es können Streptavidin beschichtete 24 oder 96-Well Mikrotiterplatten eingesetzt werden.
Aliquots, die nach Beendigung der Assayreaktion entnommen wurden, werden direkt in die einzelnen Mulden und nicht auf einzelne Scheiben pipettiert. Anschließend wird die gesamte Platte gewaschen, indem die Mulden mit 2 M NaCl gespült werden. Es ist anzumerken, dass es bekannte Vorrichtungen gibt, mit denen die vollständige Reaktionsmischung den einzelnen Mulden zugesetzt werden kann. Das Waschen der Mulden kann mit einem automatisierten System durchgeführt werden. Die Platten können dann mit einem Flüssigzintillationsspektrometer wie einem Top Count Microplate Scintillation und Luminescence counter von Packard Corporation in Merydan, Connetticut und Wallac, Inc. in Gaithersburg, Maryland, vermessen werden. Es folgen nicht einschränkende Beispiele von Assays unter Einsatz der vorliegenden Erfindung.
cAMP abhängige Proteinkinase (PKA)
Wird cAMP abhängige Proteinkinase (PKA) untersucht, wird ein Peptidsubstrat von dem es heißt, dass es für dieses Enzym spezifisch ist, an dessen N-terminaler Gruppe biotinyliert. Es wird ein modifiziertes Peptid *-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Promegapeptid A; SEQ.ID.1) mit einem Peptidsynthesizer synthetisiert. Das Peptid wird in verschiedenen Konzentrationen, nämlich 0, 10, 20, 50 und 100 μM mit bekannten Tests daraufhin getestet, ob es ein Substrat für PKA ist, wobei gereinigte PKA in verschiedenen Verdünnungen verwendet wird. Das Enzym, das für die Untersuchungen verwendet wird, ist die katalytische Untereinheit von PKA (#V5161, Promega Corporation, Madison, Wl.) mit einer spezifischen Aktivität von 50 pmol ³²P, das auf Casein pro μg Enzym in einer Minute bei 37°C übertragen wird, oder 10000 pmol ³²P, das auf das Kemptidsubstrat Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Promega Peptid A, SEQ.ID.1) pro μg Enzym pro Minute bei 37 °C übertragen wird.
Phosphotransferaseaktivität von Proteinkinasen
Mit diesem Assay wird die Phosphotransferaseaktivität von anderen Proteinkinasen bestimmt, wobei entsprechende biotinylierte Peptidsubstrate eingesetzt werden. Beispielsweise wird für den Nachweis der Kinaseaktivität von Ca²⁺- und Phospholipid abhängiger Proteinkinase (PKC) biotinyliertes von Neurogranin abgeleitetes Peptid *-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys (Promegapeptid B; SEQ.ID.2) als Substrat unter optimalen Bedingungen für die PKC-Proteinkinaseaktivität eingesetzt.
Weitere Assays
Weitere Proteinkinasen können wie vorstehend für PKA und PKC beschrieben untersucht werden, wobei die geeigneten Peptidsubstrate verwendet werden und der Nachweis bei den entsprechenden optimalen Nachweisbedingungen durchgeführt wird. Beispielsweise wird das Peptidsubstrat *-Asp-Asp-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Arg (Promegapeptid E; SEQ.ID.5) für den Nachweis von Caseinkinase I (CK-1) eingesetzt.
Das Peptid *-Arg-Arg-Arg-Glu-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Glu (CK-2) (Promegapeptid C; SEQ.ID.3) wird für den Nachweis von Caseinkinase II (CK-2) eingesetzt. Das Peptid *Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Promegapeptid G; SEQ.ID.7) wird für den Nachweis der Tyrosinkinaseaktivität von aktivierten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) eingesetzt.
In jedem Fall wird die Enzymaktivität der zu untersuchenden Proteinkinase nach dem entwickelten Verfahren bestimmt, wobei das biotinylierte Derivat des geeigneten Peptidsubstrats und die Streptavidin verknüpfte Matrix eingesetzt werden, und dann nach dem Phosphocellulosescheibenverfahren mit einem nicht modifizierten Peptidsubstrat.
Proteinkinasen werden bei den für sie optimalen Bedingungen wie sie vorstehend beschrieben worden sind, nachgewiesen, wobei jedoch für die Reaktion die unmodifizierten Peptidsubstrate und die empfohlene Vorgehensweise nach Kasnelli, J. E. 1991 eingesetzt werden. Kurz gesagt, die Reaktion wird durch Entnahme von 40 μL Aliquots gestoppt und diese auf P81-Papier (Watman, Clifton N.J.) aufgebracht. Die Filter werden unverzüglich in ein Becherglas mit 0,5 % Phosphorsäure gegeben und dort 5 min unter gelegentlichem Schütteln des Becherglases belassen. Die Phosphorsäurelösung wird dekantiert und frische Lösung zugesetzt. Dieser Vorgang wird insgesamt 4 mal für jeweils 5 min wiederholt. Die Filter werden getrocknet, in Scintillationsfläschchen gegeben und es wurden 5 ml Scintillationsflüssigkeit zugesetzt. Die Enzymaktivität wird wie vorstehend für das Assaysystem beschrieben, bestimmt.
Zur Bestimmung der Proteinkinaseaktivität von verschiedenen Kinasen müssen bestimmte Kriterien eingehalten werden:

1. Das biotinylierte Derivat des Peptids sollte wie das unmodifizierte Peptidsubstrat ein spezifisches und gutes Substrat für das in Frage stehende Enzym sein.
2. Die Phosphorylierung des biotinylierten Peptids sollte dessen Bindung mit der Avidin verknüpften Matrix oder der Streptavidin verknüpften Matrix nicht beeinträchtigen.
3. Die Phosphorylierung des biotinylierten Peptids sollte proportional zu der Menge an zugesetztem Enzym und zu bestimmten Zeitabschnitten des Nachweises sein.
4. Die phosphorylierten Proteine sollten nicht an die Matrix binden, es sei denn, sie sind biotinyliert, das heißt, nur das phosphorylierte und biotinylierte Peptid sollte an die Matrix gebunden werden.
5. Die Avidin vernüpfte oder Streptavidin verknüpfte Matrix sollte eine ausreichende Bindungskapazität für das, der Matrix zugesetzte biotinylierte Peptid haben.
6. Es sollten Mittel vorgesehen werden, um freies überschüssiges y-³²P-ATP nach Beendigung der Reaktion zu entfernen.

Um diese Kriterien zu erfüllen, werden Peptide synthetisiert, die spezifische Substrate für verschiedene Proteinkinasen sind (Kemp, B.E. und Pearson, R.B., 1991).
Jedes dieser Peptide enthält die Konsensussequenz, die für die Phosphorylierung durch das entsprechende Enzym erforderlich ist. Im Allgemeinen ist es erforderlich, dass diese Peptide mit basischen Aminosäuren verbunden sind, so dass das Peptid positive Ladung(en) aufweist, damit es an das negativ geladene Phosphocellulosepapier binden kann.
Erfindungsgemäß sind die Peptide derart modifiziert, dass sie fest an die Matrix binden können. Der biotinylierte Teil ist an den NH₂-Terminus des Peptidsubstrats über einen Linker mit 6 Kohlenstoffatomen gebunden.
Die biotinmodifizierten Peptide werden mit einem Peptidsynthesizer synthetisiert, wobei etablierte Vorgehensweisen für die Festphasen Peptidsynthese eingesetzt werden (Nova Biochem/Calbiochem, San Diego, Californien). Die Biotingruppe wird zugefügt bevor das Peptid von dem Harz abgespalten wird. Die Identität und Reinheit der biotinylierten Peptide werden mit quantitativer Aminosäureanalyse, 2 Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Lösungsmittelsystemen und FAB (Fast atom bombardment) Massenspektrometrie überprüft.
Es wurden verschiedene Parameter untersucht, die die Ergebnisse dieses Nachweises beeinflussen oder beeinträchtigen könnten. Diese sind der Durchmesser der Scheiben, die Dichte von Streptavidin pro Scheibe, der Trocknungsgrad der Scheiben, die Konzentration an modifizierten Peptidsubstrats und die Menge Enzym, die eingesetzt werden kann.
Der Nachweis wird bei 37°C 5 min lang durchgeführt.
Es wird eine Zunahme der Kinaseaktivität beobachtet, die proportional zur Zunahme der Menge an vorliegenden Enzymen ist.
Es werden Filterscheiben auf Silicabasis hergestellt, an die Avidin oder Streptavidin gebunden wird. Es werden zwei verschiedene Größen hergestellt. Eine mit 25 mm (i.d.) und die andere mit 12,5 mm (i.d.). An die Filter werden 0,5, 1,0 oder 2,0 mg Streptavidin oder Avidin gebunden. Die Scheiben mit 12,5 mm Durchmesser mit 0,5 mg Streptavidin pro Scheibe ergeben die besten Ergebnisse. Zusätzlich wurden verschiedene Trocknungsgrade auf deren Eignung für diesen Nachweis getestet, nämlich nass, 1 Stunde getrocknete Scheiben, 2 Stunden getrocknete Scheiben und 2 Wochen getrocknete Scheiben. Die Untersuchung erfolgte, um sicherzustellen, dass der Nachweis benutzerfreundlich ist.
Die Ergebnisse zeigen, dass seminasse als auch trockene Scheiben erfolgreich für diesen Nachweis eingesetzt werden können.
Die Spezifität dieses Nachweises wird zudem untersucht, indem Gewebeextrakt als PKA-Quelle verwendet wird. Die Linearität der ³²P-Inkorporation in das biotinylierte Peptid wird auch durch die Erhöhung der Substratkonzentration überprüft.
Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Biotinylierung des Peptidsubstrats die Eignung des Peptids als Substrat nicht beeinträchtigt. 1 mg Avidin (oder Streptavidin) pro Scheibe mit 25 mm (i.d.) (0,5 mg/Scheibe mit 12,5 mm (i.d.) reicht für die Bindung von bis zu 5 nmol biotinyliertem Peptid aus, was eine Endkonzentration von 200 μM ergibt (Reaktion Vol. 25 μl). Diese Peptidkonzentration reicht für die meisten gewünschten Zwecke aus. Sowohl Avidin als auch Streptavidin können für diesen Nachweis eingesetzt werden, wobei aufgrund der geringeren Kosten von Streptavidin die meisten Untersuchungen mit Streptavidin durchgeführt werden.
Schließlich werden alle Waschlösungen auf die Entfernung von freiem ATP getestet und der beste Hintergrund wird mit 2 M NaCl erhalten. Daher wurde diese Lösung als Waschlösung eingesetzt.
Die Datengenerierung erfolgte unter folgenden Bedingungen:

1. Die Reaktionen wurden mit der Terminierungslösung (2 M Harnstoff, 125 mM EDTA und 1 % SDS) gestoppt, und jeweils 25 μL Aliquots wurden auf Streptavidin verknüpfte Scheiben mit 12,5 mm aufgebracht (0,5 mg Streptavidin) oder in die Mulden der 24-well Platte.
2. Die Scheiben oder Mulden wurden fünf mal jeweils für 1 Minute mit 2 M NaCl gespült oder gewaschen.
3. Die Scheiben oder Platten wurden getrocknet und im Flüssig-Scintillationszähler gemessen.

Kits
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Kits für das vorstehend beschriebene Verfahren. Ein Basiskit für die Quantifizierung der Aktivität eines Enzyms umfasst einen Behälter mit einem Bioreagenz, das ein modifiziertes Peptidsubstrat mit spezifischer Reaktivität für das Enzym ist, das durch chemische Reaktion zur Ermöglichung der Quantifizierung modifiziert ist, und Gebrauchsanweisungen.
Das modifizierte Peptidsubstrat, das in dem Kit vorliegt, enthält als bindende Verbindung Biotin. Das Kit enthält ebenfalls wenigstens einen Puffer, der mit dem ausgewählten Enzym kompatibel ist.
Das Kit ist dafür bestimmt, spezifisch die Aktivität von Enzymen zu bestimmen, die aus der Gruppe unter Serin-Threonin-Kinasen und Tyrosinkinasen ausgewählt sind. Das Kit umfasst einen Behälter, der ein modifiziertes Peptidsubstrat mit der bindenden Verbindung Biotin enthält. Das Substrat, das modifizierte Peptid, ist spezifisch für das ausgewählte Enzym.
Ein Kit ist für die Quantifizierung der Aktivität eines Enzyms bestimmt, das aus der Gruppe bestehend aus Kinasen ausgewählt ist. Das Basiskit enthält wenigstens einen Behälter mit einem modifizierten Peptidsubstrat, das die bindende Verbindung Biotin enthält. Das Substrat, das modifizierte Peptid, ist für das ausgewählte Enzym spezifisch.
Das modifizierte Peptidsubstrat in dem Kit kann eines der folgenden Peptide sein, abhängig vom Typ des Enzyms, das wie beschrieben bestimmt werden soll: Promegapeptid A (SEQ.ID.1), Promegapeptid B (SEQ.ID.2), Promegapeptid C (SEQ.ID.3), Promegapeptid D (SEQ.ID.4), Promegapeptid E (SEQ.ID.5), Promegapeptid F (SEQ.ID.6), Promegapeptid G (SEQ.ID.7) und Promegapeptid N (SEQ.ID.8). Es wird auf Tabelle 1 verwiesen, in der die modifizierten Peptidsubstrate, die für ausgewählte Enzyme spezifisch sind, angegeben sind.
Gebrauchsanweisungen sind ebenfalls enthalten.
„Gebrauchsanweisung" ist ein konkreter Ausdruck, der die Reagenzkonzentration oder zumindest einen Nachweisparameter wie die relative Menge an Reagenz und Probe, die zugesetzt werden soll, Haltezeitdauer für die Reagenz/Probenmischungen, Temperatur, Pufferbedingungen usw. beschreibt.
Das Kit kann auch eine biotinbindende Matrix enthalten, die mit Avidin- oder Streptavidinmolekülen verknüpft ist, wie Filterscheiben, Beads, lösliche Matrix oder Platten. Die biotinbindende Matrix kann eingesetzt werden, um das modifizierte Peptidsubstrat und das modifizierte Peptidprodukt mit Biotin zu binden.
Die Menge der verschiedenen Reagenzien in den Kits kann in Abhängigkeit einer Anzahl von Faktoren wie der optimalen Empfindlichkeit des Nachweises variieren. Die Gebrauchsanweisungen eignen sich dazu, einem Analysten die Durchführung des gewünschten Nachweises zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Bereitstellung von manuellen Testkits und Testkits für automatisierte Analysatoren.
Die folgenden Beispiele dienen zur Illustrierung der Vorteile der vorliegenden Erfindung und zur Unterstützung von Fachleuten bei der Durchführung und dem Einsatz derselben.
Die Beispiele beschränken den Offenbarungsgehalt oder den Schutzumfang, der durch das Patent gewährt wird, in keinster Weise. Obwohl präzise Beschreibungen für Nachweise von Proteinkinasen gegeben werden, sollte es Fachleuten klar sein, dass die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung gleichermaßen für den Nachweis einer großen Vielzahl von ausgewählten Enzymen eingesetzt werden kann.
Obwohl sich das vorgestellte Material Peptide zunutze macht, die chemisch in vitro synthetisiert werden und von denen einige kommerziell erhältlich sind, ist anzumerken, dass die Erfindung durch Isolierung eines Peptids aus einer natürlichen Quelle durchgeführt werden kann.
BEISPIELE
Die Assays gemäß diesen Beispielen beruhen auf dem Einsatz von biotinylierten Peptidsubstraten, die für bestimmte Enzyme spezifisch sind.
Beispiel 1
Kinaseaktivität von cAMP abhängiger Proteinkinase
Die Kinaseaktivität von cAMP abhängiger Proteinkinase (PKA) wurde für jede der verschiedenen Peptidsubstratkonzentrationen 2-fach bestimmt, in einem Reaktionsvolumen (50 μL) mit 40 mM Tris HCl, pH 7,4, 20 mM MgCl₂, 100 μM y-³²P-ATP (spezifische Aktivität 100-200 cpm/pmol), 100 μg/ml Rinderserum Albumin (BSA) und dem geeigneten biotinyliertem Peptidsubstrat: *-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly (Promegapeptid A, SEQ.ID.1, MG. 998,4).
Die Reaktion wurde durch Zugabe der geeigneten Menge an Enzym (Promega #V5221), sodass 2 Kemptide units erhalten wurden, gestartet und 0,5 und 10 min bei 37°C inkubiert (eine Kemptide unit ist definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um die Inkorporierung von 1 pmol Phosphat in Kemptidsubstrat in einer Minute zu katalysieren). Nach festgelegten Zeitspannen bei geeigneter Temperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 μL Terminierungslösung wie vorstehend beschrieben, gestoppt.
Es wurden 25 μl Aliquots entnommen und auf eine 12,5 mm (i.d.) Streptavidin verknüpfte Scheibe (0,5 mg Streptavidin/Scheibe) aufgebracht und in ein Becherglas mit 2 M NaCl gegeben. Nach einer Minute unter sachtem Schütteln des Becherglases bei Raumtemperatur wurde frisches NaCl zugegeben. Dieser Waschvorgang wurde weitere 5 mal für jeweils 1 Minute wiederholt.
Die Scheiben wurden dann noch einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet und in Scintillationsfläschchen gegeben. Es wurden 5 ml Scintillationsflüssigkeit zugesetzt.
Die Enzymaktivität wurde durch Bestimmung der Radioaktivität mittels Flüssigscintillationsspektrometrie berechnet. Zur Bestätigung, dass die Phosphoryllierung spezifisch durch PKA katalysiert wurde, wurde der Reaktion ein spezifischer und wirksamer Inhibitor für PKA (#V5681, Promega Corporation, Madison, Wl.) zugesetzt. Jegliche PKA Phosphotransferaseaktivität sollte durch die Zugabe des Inhibitors inhibiert sein.
Ergebnisse mit der gemessenen PKA
Die Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeit (Anfangsgeschwindigkeit der PKA) wie sie mit dem Protokoll und unter der vorstehend beschriebenen Bedingung bestimmt wurde und der Menge Enzym in der Reaktion zeigt 1. Mit 100 μM modifizierten Peptidsubstrat in der Reaktion wurde eine lineare Antwort der PKA-Aktivität mit zunehmender Menge Enzym für die Reaktion erhalten. Ebenfalls wurde die Aktivität des Enzyms im Hinblick auf die Konzentration an biotinyliertem Peptidsubstrat untersucht.
Wie in 2 gezeigt, zeigt der kinetische Plot das typische Michaelis-Menten-Sättigungsverhalten (hyperbolische Kurve). Die Auswertung der Daten ergab einen Km-Wert für das Substrat von 33 μM und einen Vmax-Wert von 1,45 pmol/min wie in 3 dargestellt. Ähnliche Werte wurden für den Phosphocellulosepapierassay mit Kemptide als Substrat erhalten. Der Km-Wert des unmodifizierten Substrats wurde durch die Biotinylierung nicht beeinträchtigt wie in 4 dargestellt. Kemp, B.E. und Pearson, R.B. 1991.
Die Proteinkinaseaktivität war für PKA spezifisch, da der Zusatz von 50 μM PKA-Inhibitor (PKI) die Enzymaktivität drastisch verringerte.
Beispiel 2
Kinaseaktivität von PKA in Gewebe von Ratten
Es wurde auch die Kinaseaktivität von PKA in verschiedenen Geweben von Ratten untersucht, wobei das modifizierte Peptidsubstrat und Assayprotokoll wie sie vorstehend beschrieben worden sind, verwendet wurden.
Wie in 5 dargestellt, betrug die Proteinkinaseaktivität von PKA 2,2, 1,75, 3,2 und 1,9 nmol ³²P/min/mg für Rattenleber, Eierstock, Herz beziehungsweise Hirn und war vergleichbar mit denjenigen, die mit unmodifiziertem Peptid und dem Phosphocellulosepapierverfahren erhalten wurden. Die Phosphatinkoporierung in das modifizierte Substrat wurde vollständig unterdrückt bei Zugabe von 100 μM PKA-Inhibitor (PKI) zu der Reaktion. Folglich wurde die Phosphorylierung des modifizierten Peptidsubstrats unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen und wie sie mit dem Protokoll nachgewiesen wurde, durch PKA katalysiert und nicht durch andere in dem Gewebeextrakt vorliegende Proteinkinasen.
Protein(e), die während der Reaktion phosphoryliert wurden und eine basische Ladung haben, binden nicht an die Matrix. Ausschließlich das phosphorylierte modifzierte Peptidsubstrat bindet mit der Matrix. Folglich spiegelt die Phosphatinkoporation nach dem Assayprotokoll die wahre ³²P-Inkorporation in das Peptidsubstrat wieder. Dies ist beim Nachweisverfahren mit Phosphocellulasepapier nicht der Fall, bei dem jedes basische Protein in dem Extrakt, das phosphoryliert ist, an das Papier bindet und eine Überschätzung der Kinaseaktivität des Enzyms zur Folge hat.
Beispiel 3
Proteinkinaseaktivität von Ca²⁺ und Phospholipid abhängiger Proteinkinase
Die Proteinkinaseaktivität von Ca²⁺ und Phospholipid abhängiger Proteininkinaseaktivität (PKC) wurde auf die gleiche Art wie vorstehend für PKA beschrieben, bestimmt, jedoch wurde als biotinyliertes Peptidsubstrat ein Derivat von Neurogranin verwendet, nämlich biotinyliertes Neurogranin _(28-43) Chen, S-J, et al., 1993.
Das Peptid wurde modifiziert, indem Biotin enthaltendes: *-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys (Promegapeptid B SEQ.ID.2, Mol.Gew. 2139,6) zugesetzt wurde und wurde in einer Konzentration von 100 uM eingesetzt. Das Enzym (#V5261, Promega Corporation) wurde 5 × in 100 μg/ml BSA verdünnt.
Die Kinaseaktivität von PKA wurde mit einem Reaktionsvolumen von 50 μL bestimmt mit 40 mM Tris. HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, BSA mit 100 μg/ml und 100 μM y-³²P-ATP (Sp.akt. 100 cpm/pmol). Die Aktivität wurde jeweils mit und ohne 100 μg/ml Phosphatidylserin, 10 μg/ml Diacylglycerin und 0,4 mM Kalziumchlorid bestimmt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 5 μL Enzym gestartet und es wurde bei 25 °C inkubiert. Nach festgelegten Zeitspannen wurden die Reaktionen durch Zugabe von 10 μL Terminierungslösung (siehe oben) gestoppt.
25 μL Aliquots wurden auf Scheiben gegeben und die Scheiben wurden wie vorstehend für PKA beschrieben, verarbeitet.
Ergebnisse mit gemessener PKC
Die für PKC erhaltene Aktivität wurde ebenfalls mit derjenigen verglichen, die für das unmodifizierte Peptidsubstrat erhalten wurde und mit dem Phosphocellulosepapierverfahren bestimmt wurde. Die in 6 gezeigten Ergebnisse, die bei einer modifizierten Peptidsubstratkonzentration von 100 μM erhalten wurden, zeigen, dass die PKC-Aktivität linear zur Zunahme der Menge an Enzymprotein in der Reaktion war. Ebenso wie bei der für PKA vorgestellten Arbeit wurde der Einfluss der Substratkonzentration auf die Kinaseaktivität von PKC untersucht.
Es wurde Michaelis-Menten-Kinetik erhalten, das heißt eine hyperbolische Kurve wie in 7 dargestellt, und die Aktivität des Enzyms erreichte ein Maximum bei etwa 100 μM modifiziertes Substrat. Jedoch war die Aktivität von PKC etwa 6 bis 7 mal höher als die nach dem Phosphocellulosepapierverfahren erhaltene Aktivität. Der Grund für die Zunahme der Aktivität von PKC in dem Assaysystem kann die erhöhte und spezifische Bindung des phosphorylierten Peptids und ebenso ein geringer Verlust an phosphorylierten Produkt aus der Matrix während des Waschvorgangs sein. Dies zeigt, dass die Kinaseaktivität des Enzyms mit dem Assaysystem mit biotinyliertem Neurogranin _(28-43) genau bestimmt werden kann.
Die Aktivität wurde vollständig durch den spezifischen myristoylierten PKC Peptidinhibitor unterdrückt wie in 8 dargestellt. Danach waren 10 bis 20 μM Inhibitor ausreichend, um die Kinaseaktivität von PKC zu inhibieren, was darauf hindeutet, dass das gesamte ³²P, das in das Peptidsubstrat inkoporiert war, von PKC katalysiert war.
Beispiel 4
Kinaseaktivität von PKC in Rattengewebe
Die Kinaseaktivität von PKC in Ratten wurde untersucht, wobei die Materialien und Verfahren nach Beispiel 3 eingesetzt wurden.
9 zeigt, dass die Aktivität von PKC in einer angereicherten Fraktion eines high spin Überstandes von Rattenhirnextrakt etwa 500 pmol ³²p/mg/min und die von teilweise gereinigter PKC 2200 pmol ³²P/mg/min betrug.
Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf den speziellen Aufbau und Anordnungen wie sie hier dargestellt und beschrieben worden sind, beschränkt, sondern umfasst auch modifizierte Formen davon und fallen unter die Ansprüche, die auf die Bibliographie folgen.
Bibliographie der zitierten Literatur

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Casnellie, J.E., 1991. "Assay of Protein Kinases Using Peptides with Basic Residues for Phosphocellulose Binding." Meth. Enzymol., 200:115-120.
Chakravarthy, Balu R., Alexandra Bussey, James F. Whitfield, Marianna Sikorska, Ross E. Williams and Jon P. Durkin, 1991, "The Direct Measurement of Protein Kinase C (PKC) Activity in Isolated Membranes Using a Selective Peptide Substrate." Anal. Biochem., 196, 144-150.
Chen, S-J, Klann, E., Gower, M.C., Powell, C.M., Sessoms, J.S., and Sweatt, J.D., 1993. "Studies with Synthetic Peptide Substrates Derived from the Neuronal Protein Neurogranin Reveal Structural Determinants of Potency and Selectivity for Protein Kinase." C. Biochem., 32:1032-1039.
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Claims

Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens oder der Aktivität einer ausgewählten Proteinkinase, umfassend: a. Bereitstellung eines Peptidsubstrats, an das ein Bindungsteil konjugiert ist; b. Zugabe einer ausreichenden Menge des Peptidsubstrats gemäß Schritt (a) zu einer Lösung, die die ausgewählte Proteinkinase enthält; c. Inkubieren der Proteinkinase mit dem Peptidsubstrat und der Bedingungen, bei denen die ausgewählte Proteinkinase ausreichend lang aktiv ist, um ein phosphoryliertes Peptidprodukt zu bilden; d. Bindung des Peptidsubstrats und des Peptidprodukts an eine Bindungsmatrix, die eine spezifische Reaktivität für den Bindungsteil aufweist, wobei die Matrix eine Bindungskapazität und Spezifität für den Bindungsteil hat, die ausreichen, um im Wesentlichen das gesamte Peptidsubstrat und Peptidprodukt aus der Lösung zu binden; und e. Messen der Menge an Peptidprodukt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bindungsteil gemäß Schritt (a) Biotin ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Biotinteil so mit dem Peptidsubstrat konjugiert ist, dass der Biotinteil keine sterische Hinderung zwischen dem Peptidsubstrat und der Proteinkinase ergibt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Biotinteil mit dem Peptidsubstrat über dessen N-terminate Aminogruppe mittels eines Linkers konjugiert ist, der eine Länge von wenigstens sechs Kohlenstoffatomen hat.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zudem nach Schritt (d) und vor Schritt (e) enthaltend das Waschen der Matrix.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsmatrix gemäß Schritt (d) ein Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Protein Avidin oder Streptavidin oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsmatrix Proteinbeschichtete Membranen, Filter, Kügelchen, Scheibchen, lösliche Matrizes oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (c) die ausgewählte Proteinkinase in Gegenwart eines biotinylierten Peptidsubstrats und eines Markers inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Macker ein radioaktiver Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der radioaktive Marker ³²P ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Peptidprodukt mit einem Szintillationspektrometer gemessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidsubstrat eines ausgewählt unter SEQ. ID. NRN: 1 bis 8 ist, die mit einem Biotinteil konjugiert sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteinkinase eine Serin-Threonin-Kinase oder eine Tyrosin-Kinase ist.
Ein Kit zur Bestimmung des Vorliegens oder der Aktivität einer ausgewählten Proteinkinase enthaltend: einen Behälter, der ein Peptidsubstrat, das mit einem Bindungsteil konjugiert ist enthält, wobei das Peptidsubstrat die Fähigkeit hat, spezifisch mit der ausgewählten Proteinkinase zu reagieren.
Kit nach Anspruch 15, weiter enthaltend eine Bindungsmatrix, wobei die Bindungsmatrix spezifisch reaktiv für die Anbindung an den Bindungsteil ist.
Ein Kit nach Anspruch 15 oder 16, zusätzlich enthaltend einen Behälter mit einem Puffer, der mit der ausgewählten Proteinkinase kompatibel ist.
Ein Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Bindungsteil Biotin ist.
Ein Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Bindungsmatrix Avidin oder Streptavidin oder eine Kombination davon enthält.
Ein Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei das Peptidsubstrat ein beliebiges Peptidsubstrat gemäß SEQ. ID. NRN. 1 bis 8 ist.