WO1997011372A1 - Immunoassay mit einem eine detektorsubstanz bildenden detektormolekülgemisch - Google Patents

Immunoassay mit einem eine detektorsubstanz bildenden detektormolekülgemisch Download PDF

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WO1997011372A1
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Wolf-Georg Forssmann
Knut Adermann
Andreas Kist
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Haemopep Pharma Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay with a detector substance which interacts with a substrate to be detected according to claim 1, a detector substance according to claim 6, uses of the detector substance according to claim 9 and a diagnostic agent containing the detector substance according to claim 12.
  • Immunometric assays also called sandwich assays or two-site assays, work according to the double antibody principle with two antibodies that bind different epitopes of the antigen.
  • the wall antibody is immobilized in excess on a support, for example on the wall of the incubation vessel. This antibody selectively captures the antigen to be measured from the offered sample.
  • a second, labeled antibody (labeling, for example, radioactive, chemiluminometric, enzymatic, or fluorometric) then attaches itself to another epitope of the bound antigen.
  • labeling for example, radioactive, chemiluminometric, enzymatic, or fluorometric
  • the two antibodies must not interfere with one another sterically for the purpose of optimal binding to the antigen.
  • Unbound second antibody is also separated and removed from the sample.
  • a measurement signal eg radioactivity, chemiluminescence, enzymatic color reaction, or fluorescence
  • a measurement signal is only generated by the complex wall-antibody-antigen-second antibody marker.
  • a measurement signal eg radioactivity, chemiluminescence, enzymatic color reaction, or fluorescence
  • antigen and antibody can depend very much on the way in which the antigen is presented. This is especially true for antibodies that are directed against epitopes that change significantly as the milieu changes. In addition to pH and ionic strength, such changes in the environment can also be the binding to a solid phase. Epitopes that are defined in the tertiary and quaternary structure of the antigen are primarily affected.
  • the wall antibody is adsorbed directly onto the polystyrene surface of microtiter plates.
  • the binding to the plastic surface is based on non-specific, hydrophobic interactions and is accordingly weak.
  • the antigen can also be bound directly to the surface of the microtiter plates based on non-specific, hydrophobic interactions.
  • the disadvantages of such a relatively weak binding are the fact that the binding site on the wall surface cannot be predetermined and the high proportion of desorption during the assay procedure.
  • the technical problem on which the invention is based is to provide an immunoassay which is basically a ensures higher sensitivity and higher specificity.
  • the techniques for detection that are common in immunoassay technology should remain applicable.
  • the technical problem is solved by the present invention.
  • the general idea of the invention here is that the principle described does not use a single detector substance with an affinity grouping that is nonspecifically distributed on the detector substance, but rather uses mixtures of at least two detector molecules that position the affinity grouping at different but specific positions of the respective detector molecule. This advantageously significantly reduces the risk of a negative interaction of the detector molecule provided with the affinity group with the substrate to be detected and the sensitivity of such an immunoassay functioning in this way is significantly increased.
  • Patent claim 6 relates to the detector substance to be used according to the invention, which comprises a mixture of at least two detector molecules
  • patent claim 9 relates to the use of the detector substance
  • claim 12 relates to a diagnostic agent containing the detector substance according to the invention.
  • the immunoassay according to the invention is carried out with a detector substance which interacts with a substrate to be detected.
  • the detector substance is a mixture of at least two different detector molecules.
  • the detector molecules each have a chemical grouping A at different positions, which is suitable for entering into an affinity bond.
  • the detector substance according to the invention therefore contains at least two classes of detector molecules, one class being the chemical grouping A at a specific position which is different from the specific position of the second class of detector molecules.
  • the detector molecules are preferably present in approximately the same concentration in the mixture forming the detector substance.
  • the detector substance comprising at least two detector molecules is brought into contact with a sample which contains the substrates to be detected. After complexes have been formed from the substrate to be detected and the two different detector molecules in each case, these are immobilized and / or detected by complexes which are formed by an affinity substance which forms an affinity bond with the chemical group A.
  • the detector molecule is preferably a polypeptide, in particular an antibody, which can specifically interact with an antigen, glycosylated peptides which, due to their polysaccharide-containing grouping, can specifically interact, for example lectins, oligosaccharides, nucleic acids and haptens.
  • Chemical group A preferably comprises biotin, streptavidin, antigen, antibody, protein A, F c fragments, F ab fragments, hormones, receptors, enzymes, enzyme substrates.
  • the affinity substance which is able to form a complex with chemical group A, is complementary to chemical group A.
  • chemical group A can be, for example, protein A
  • the affinity substance is then an antibody from the IgG class. If the chemical group A is a hapten, for example, then the affinity substance is an antibody which was obtained against the hapten, for example by immunization with hapten conjugates.
  • the remaining Combinations and variations of the respective assignments are readily apparent to the person skilled in the art. It goes without saying that the specific list is not exhaustive.
  • affinity substances which, if they do not have their own measurable characteristics, in turn have groups which, for example, contain radioactive isotopes or chromophores and / or fluorophores or bound enzymes that can cause color reactions.
  • the detector molecule (a polypeptide) carries biotin as chemical group A.
  • the high affinity binding of the antigen with a predetermined binding site to the microtiter plates results in a defined alignment of the antigen and ensures the defined accessibility of all epitopes of the antigen.
  • binding is achieved via a streptavidin-biotin system.
  • antigens are selectively synthesized with a biotin molecule at the N-terminal or at the C-terminal end, or at another point on the molecule.
  • the microtiter plates coated with streptavidin ensure high affinity binding (affinity constant IO "15 mol / 1) of the biotin-peptide complex (Chaiet, L., Wolf, FJ (1964), Arch. Biochem. Biophys. 106, 1-5).
  • the present invention also relates to a detector substance which can be used, inter alia, in the immunoassay according to the invention, but opens up further possible uses.
  • the affinity substance according to the invention contains a mixture of at least two different detector molecules, the at least two detector molecules each having a chemical group A at different positions, which is suitable for entering into an affinity bond, the chemical group A at a different but specific position in each case Detector molecules is bound.
  • the decisive factor here is the respective biotinylation for the at least two different detector molecules but to be introduced specifically so that two groups of detector molecules are present.
  • One group has, for example, the biotinylation at the N-terminus, whereas the second group of detector molecules has the biotin label specifically at another location, preferably the C-terminus.
  • the detector substances according to the invention can be used in different areas.
  • the detector substances in immunoassays can also be used for the detection and quantification of antibodies, autoantibodies and endogenous substances, in particular regulatory peptides. They can also be used for receptor labeling as a diagnostic in fluorescence microscopy and flow cytometric diagnosis of diseases which are associated with the expression or change in the expression of receptors. such as carcinoid diagnostics at the level of somatostatin receptors.
  • the detector substances according to the invention can be used in the characterization of unknown receptors of known peptides and in the search for receptor analogs by means of fluorescence microscopy and flow cytometry.
  • the detector substances are also suitable for the purification of peptides by means of affinity chromatography.
  • Antibodies can be purified, for example, if the detector substances according to the invention are bound to a solid phase matrix via their affinity group A. It is also possible to use the detector substances according to the invention in medical diagnostic tests, in particular using biosensors.
  • Another area of application of the detector substance according to the invention is flow-cytometric analytical and preparative tive separation of complex cell mixtures, the cells being characterized by surface or intracellular labeling.
  • Antibodies can be specifically characterized with the help of immobilized biotinylated peptides, the binding site and the epitope presentation of which can be predetermined based on the biotinylation.
  • the titers of the corresponding antibodies or autoimmune antibodies in the blood can be determined according to the principle of the immunization immunoassay.
  • the high affinity of streptavidin for biotin leads to the binding of the fluorescence-labeled streptavidin to the biotinylated active substance bound by the receptor. In this way, the complex of receptor-active substance-biotin-streptavidin fluorescence can be localized for the observer.
  • biotinylated peptides are used for receptor labeling, for example in carcinoid diagnostics at the level of somatostatine receptors.
  • Antibodies generated by immunization are by no means uniform, but always consist of a mixture of different antibody species, which also differ in their regioselectivity towards the different epitopes or molecular areas of the antigen.
  • the high affinity binding of biotin to streptavidin can be used for the purification and differentiation of antibodies - based on the selective incorporation of the biotin by chemical methods at the C-terminus, at the N-terminus, or also in the central position of the antigen.
  • Antigens selectively labeled with biotin - or derivatives derived from the structure of the antigen - can be attached to a matrix, e.g.
  • a hydrophilic chromatography material to which streptavidin is bound, can be immobilized with a defined spatial orientation. This method ensures that affinity chromatographic purifications are carried out with improved monitoring of the interaction between antibody and antigen.
  • the defined loading of the chromatography column with a biotinylated antigen permits a higher loading of the affinity matrix. In addition to increasing the selectivity of an antigen-antibody interaction, this can also lead to a quantitative increase in the regioselective antibodies obtained.
  • a basis of the method according to the invention is the synthesis of peptidyl resins and peptides blocked with protective groups, which can optionally be selectively linked to biotin or its derivatives at certain amino acid positions of the peptide chain. It is possible that both after peptide synthesis using Fmoc chemistry and Boc chemistry in the totally blocked peptidyl resin, the N-terminal amino group below Preservation of the remaining protective groups can be selectively split off. This regenerated amino group can then be converted by known coupling methods in peptide chemistry, but preferably with uronium or phosphonium compounds of the TBTU or BOP type, with biotin or its derivatives to give the N-terminal biotin-labeled peptidyl resin.
  • the corresponding N-biotinyl peptides can be obtained in high purity by subsequent cleavage from the support and the other protective groups and subsequent preparative chromatographic purification.
  • biotinylation at the C-terminus of peptides is preferably achieved by using the lysine derivative N- (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -N- [1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl] -L-lysine [Fmoc-Lys (Dde) - OH]. If the peptides in question do not contain lysine as the C-terminal amino acid in their sequence, the solid phase synthesis is carried out starting with Fmoc-Lys (Dde) -OH as the C-terminal building block.
  • the Dde group can be split off in the fully protected peptidyl resin or peptide by repeated treatment with dilute hydrazine hydrate, all other protective groups of the peptide being retained.
  • biotin or its derivatives by known activation methods of peptide chemistry and subsequent unblocking and cleavage from the carrier, selectively biotinylated peptides can be obtained in highly pure form at the C-terminus.
  • biotinyl residues can be carried out in high yield after the entire peptide chain has been synthesized. This applies in particular to the display of C-terminal biotin-labeled peptides.
  • the biotin residue can be introduced in high yield at the sterically unfavorable resin-bound amino acid position.
  • the (+) biotin can be selectively introduced into the protected peptidyl resin in the form of the natural compound or its carboxyl-activated active esters and surprisingly also as a 6-aminocaproic acid or lysine-spaced derivative using the methods described.
  • the synthetic biotinyl-labeled peptides can be identified by various analytical methods. These include methods of chromatography, capillary electrophoresis, mass spectrometry, peptide sequencing and amino acid analysis.
  • the display of urodilatin which is selectively labeled at the N- and C-terminus as well as correspondingly labeled fragments of the human parathyroid hormone.
  • Urodiline has special clinical applications.
  • ELISA test enzyme-linked immunosorbent assay
  • its biotinylated derivatives are of great importance for the analysis of the formation of human autoantibodies against the peptide.
  • the assay according to the invention is preferably implemented by binding the C- and N-terminal biotin-labeled synthetic peptides to microtiter plates loaded with streptavidin. After this binding, it is possible to bind peptide-specific polyclonal or monoclonal antibodies to the immobilized peptide. It is thus advantageously possible to measure both antibodies which are directed against C-terminal regions of the respective peptide and antibodies which are directed against N-terminal regions of the peptide in a single assay, by using both synthetic biotinyl peptides can be used in a test. The corresponding test can also be carried out separately. This makes it possible to detect antibodies against the C- and N-terminus of peptides in separate analyzes.
  • the bound peptide-specific antibodies are characterized by protein A, protein G or a secondary antibody, e.g. B. an anti-human IgG antibody, is bound to the species-specific Fc fragment of the human antibody.
  • protein A or protein G can be labeled, for example radioactive, to quantify the peptide-antibody binding.
  • the secondary antibody can be conjugated to an enzyme or to radioactively labeled substances.
  • the enzymes are able to convert certain substrates in a photometrically traceable reaction.
  • peroxidases or phosphatases for example, can be bound to the secondary antibody.
  • ABTS 2,2 '-azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid
  • 4-methylumbilliferyl phosphate, p-nitrophenyl phosphate and bromochloroindolyl phosphate-nitro-blue-tetrazolium for example, tetramethylbenzidine and 2,2 '-azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) for peroxidases or 4-methylumbilliferyl phosphate, p-nitrophenyl phosphate and bromochloroindolyl phosphate
  • the fluorescence or The photometrically measurable fluorescence or staining or the radioactivity corresponds quantitatively via the secondary antibody to the amount of the peptide-specific antibody which is bound to the specifically N- or C-terminally biotinylated peptide of on the selective synthesis of Measurement methods based on N- or C-terminal biotinylated peptides are shown in FIG.
  • peptides eg urodilatin
  • the work also shows that the antigenic properties of the peptides biotinylated selectively at the N- or C-terminus are still present even after drying and reactivation with various assay buffers.
  • the antigenic activity of the N-biotinyl peptides does not decrease by storing the dried microtiter plate over a period of several weeks.
  • the peptide syntheses are carried out according to methods known per se. Fully protected peptidyl resins prepared with Fmoc chemistry are then treated for 10 minutes with a solution of 20% piperidine in N, N-dimethylformamide (DMF) and then washed carefully with DMF. Peptides synthesized according to Boc chemistry are treated after the last amino acid coupling for 30 minutes with a solution of 50% trifluoroacetic acid in dichloromethane and washed carefully with dichloromethane. Alternatively, in the case of peptide synthesis by Boc chemistry, the last amino acid can also be introduced as an Fmoc derivative.
  • Fully protected peptidyl resins prepared with Fmoc chemistry are then treated for 10 minutes with a solution of 20% piperidine in N, N-dimethylformamide (DMF) and then washed carefully with DMF.
  • Peptides synthesized according to Boc chemistry are treated after the last amino acid coupling for 30 minutes with a solution of 50% trifluoroacetic acid
  • the peptidyl resins obtainable in this way have a free amino function at the N-terminus and can thus be selectively linked to biotin or its suitable derivatives to form the biotinyl-labeled peptide.
  • biotin itself and its carboxyl-activated derivatives such as, for example, the N-hydroxysuccinimide ester, the 4-nitrophenyl ester and the hydrazide, and preferably N-biotinyl-6-aminocaproic acid and its carboxyl-activated derivatives, such as the hydrazide, can be used and the N-hydroxysuccinimide ester can be used.
  • the biotin or its derivative Before being linked to the N-terminal amino group of the protected peptidyl resin, the biotin or its derivative is dissolved, preferably in N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide or 1,3-dimethyl-3,4, 5, 6-tetrahydro-2 (1H) pyrimidinone (DMPU), and treated with 1.1 equivalents of activator.
  • N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide or 1,3-dimethyl-3,4, 5, 6-tetrahydro-2 (1H) pyrimidinone (DMPU) and treated with 1.1 equivalents of activator.
  • Suitable activators are 2 (IH) -benzotriazol-l-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) and compounds derived therefrom, benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethyamino) -phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and compounds derived therefrom as well as N, N-dialkylcarbodiimides such as diisopropylcarbodiimide (DIC) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) with the addition of other auxiliaries such as N-hydroxysuccinimide, 1-hydroxybenzotriazole or diisopropylethylamine.
  • TBTU 2- (IH) -benzotriazol-l-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • BOP benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (d
  • the biotin or its derivative is preactivated for 10 minutes at room temperature and then combined in a two to ten-fold excess based on the peptidyl resin with the latter for 10 to 20 hours with shaking.
  • the biotinylated peptidyl resin is then carefully washed with the solvent, 2-propanol and dichloromethane used to remove excess reagents and dried under high vacuum.
  • the peptide labeled in this way is cleaved from the carrier resin within 90 minutes by adding preferably trifluoroacetic acid / ethanedithiol / water (94: 2: 2, volume), freed from the protective groups, precipitated with cold tert-butyl methyl ether and lyophilized .
  • the isolated crude product is purified by preparative high-performance liquid chromatography and then characterized. Compared to the non-biotinylated peptide, the biotin-labeled peptide always has a significantly higher retentivity when C18 reversed-phase chromatography is carried out. tion time.
  • the N-terminally bound biotin can be detected by mass spectrometry by means of a molecular weight which is 226.3 daltons larger. When using N-biotinyl-6-aminocaproic acid, the molecular weight increases by 339.5 daltons.
  • Selective biotin labeling can be achieved with special lysine derivatives both in the context of the Fmoc and the Boc synthesis strategy. If no lysine is present at the C-terminus of the peptide sequences to be biotinylated, the peptide synthesis is started with an additional lysine, which is followed by the actual peptide chain of the desired substrate.
  • the derivative N- (tert-butyloxycarbonyl) -N- (9-fluorenyloxycarbony) -lysine [Boc-Lys (Fmoc) -OH] is used.
  • the amino group of the C-terminal lysine can be released for 5 to 15 minutes by adding 20% piperidine in N, N-dimethylforinamide. After selective deblocking of the C-terminal lysine, both resins are carefully washed with N, N-dimethylformamide.
  • the method can in principle be used for all carrier-bound synthetic peptides which are selectively labeled with biotin or its derivatives at the N- or C-terminus by the method of the protective group technique according to the invention.
  • the method particularly includes the chemical synthesis of selectively biotinylated peptides derived from urodilatin (CDD / ANP-95-126) and other natriuretic peptides as well as from human parathyroid hormone and its fragments.
  • the method also includes peptidyl resins and peptides which are selectively labeled at the N- and the C-terminus by biotin.
  • the synthetic, selectively (+) -biotin labeled peptides are immobilized by coupling to a streptavidin-coated microtiter plate via a biotin-streptavidin bond.
  • the microtiter plate is washed with a wash solution (e.g. phosphate buffer; phosphate buffer: 136 mM sodium chloride; 2.68 mM potassium chloride; 10 mM sodium dihydrogen phosphate; 1.76 mM potassium dihydrogen phosphate) between each work step.
  • a wash solution e.g. phosphate buffer; phosphate buffer: 136 mM sodium chloride; 2.68 mM potassium chloride; 10 mM sodium dihydrogen phosphate; 1.76 mM potassium dihydrogen phosphate
  • the microtiter plate is incubated with a streptavidin solution (eg 20 ⁇ g / ml) for two hours.
  • the free binding sites are then saturated with a blocking buffer (eg 3% bovine albumin in phosphate buffer or 2.5% casein, 0.2% Tween 20 in phosphate buffer) for at least 2 hours.
  • the biotinylated peptides e.g. N- and C-terminal biotinylated Urodilatin
  • 1 M acetic acid eg 30 ⁇ g / ml
  • the serum to be examined is either neat or diluted with a physiological buffer (eg 3% bovine albumin in phosphate buffer; 1: 250; urodilatin antibody serum: physiological buffer) pipetted onto the microtiter plate and incubated for 2 hours.
  • a physiological buffer eg 3% bovine albumin in phosphate buffer; 1: 250; urodilatin antibody serum: physiological buffer
  • the secondary reagent for example conjugated or iodinated anti-human IgG antibody or iodinated protein A or iodinated protein G or conjugated with peroxidase or alkaline phosphatase
  • the radioactivity can be measured directly in the gamma counter.
  • a solution of a chromogenic substance for example 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic acid (ABTS), 4-methylumbilliferyl phosphate
  • ABTS 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic acid (ABTS), 4-methylumbilliferyl phosphate
  • ABTS 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic acid
  • 4-methylumbilliferyl phosphate 4-methylumbilliferyl phosphate
  • the amount of radioactivity or the resulting fluorescent or colored substance is directly proportional to the amount of the antibody that has bound to the biotinylated peptide.

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Abstract

Immunoassay mit einer Detektorsubstanz, die mit einem zu detektierenden Substrat in Wechselwirkung tritt, wobei: die Detektorsubstanz ein Gemisch von mindestens zwei verschiedenen Detektormolekülen ist, die mindestens zwei Detektormoleküle jeweils an verschiedenen Positionen eine chemische Gruppierung A tragen, die zum Eingehen einer Affinitätsbindung geeignet ist, die Detektorsubstanz aus mindestens zwei Detektormolekülen mit einer Probe, die das zu detektierende Substrat enthält, in Kontakt gebracht wird, nach Bildung von Komplexen aus zu detektierendem Substrat und den jeweils zwei verschiedenen Detektormolekülen, die Komplexe durch eine Affinitätssubstanz, die mit der chemischen Gruppierung A eine Affinitätsbindung eingeht, immobilisiert und/oder nachgewiesen werden.

Description

Immunoassay mit einem eine DetektorSubstanz bildenden Detektormolβkülσemisch
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Immunoassay mit einer Detektorsubstanz, die mit einem zu detektierenden Substrat in Wechselwirkung tritt gemäß Patentanspruch 1, eine Detektor¬ substanz gemäß Anspruch 6, Verwendungen der Detektorsubstanz nach Anspruch 9 und ein Diagnostikum enthaltend die Detektor¬ substanz nach Anspruch 12.
Immunometrische Assays, auch Sandwich Assays oder Two-site Assays genannt, arbeiten nach dem Doppelantikörperprinzip mit zwei Antikörpern, die unterschiedliche Epitope des Antigens binden. Hierbei wird der Wandantikörper im Überschuß an einem Träger, z.B. an der Wand des Inkubationsgefäßes, immobilisiert. Dieser Antikörper fängt das zu messende Antigen aus der angebo¬ tenen Probe selektiv heraus. In einem Trennungsschritt werden alle Substanzen aus der Probe entfernt, die nicht vom Wandan¬ tikörper gebunden wurden. Ein zweiter, markierter Antikörper (Markierung z.B. radioaktiv, chemiluminometrisch, enzymatisch, oder fluorometrisch) heftet sich anschließend an ein weiteres Epitop deε gebundenen Antigens. Hierbei dürfen sich die beiden Antikörper zwecks optimaler Bindung an das Antigen nicht gegen¬ seitig sterisch behindern. Nichtgebundener zweiter Antikörper wird ebenfalls abgetrennt und aus der Probe entfernt. Ein Meßsignal (z.B. Radioaktivität, Chemiluminiszens, enzymatische Farbreaktion, oder Fluoreszenz) wird nur von dem Komplex Wandan- tikörper-Antigen-zweiter Antikörper-Marker erzeugt. Für die Entwicklung, eines immunometrisehen Assays ist es erforderlich, über Antikörper zu verfügen, die an unterschied¬ liche Epitope des Antigens binden. Diese Epitope müssen in ausreichender Entfernung, voneinander liegen, um die gleich¬ zeitige Bindung beider Antikörper ohne sterische Hinderung, zu ermöglichen. An der Bindung mit dem Antikörper sind etwa 12 bis 16 Aminosäuren des Antigens beteiligt (Amit et al . , 1986, Science 233, 747 - 753; Fischmann et al. , 1991, J. Biol. Chem. 266, 12915 - 12920) . Um gegenseitige sterische Hinderung der beiden Antikörper zu vermeiden, ist es somit erforderlich, regiospezifische Antikörper zu generieren, die möglichst exakt an vorher definierte Bereiche des Antigens binden. Dies gilt um so mehr, je kleiner das Antigen ist.
Die Bindung zwischen Antigen und Antikörper kann sehr stark von der Art abhängen, in der das Antigen präsentiert wird. Dies gilt vor allem für Antikörper, die gegen Epitope gerichtet sind, die sich bei Milieuveränderungen stark ändern. Solche Milieuverände¬ rungen können neben pH und Ionenstärke auch die Bindung an eine feste Phase sein. In erster Linie sind hiervon Epitope betrof¬ fen, die in der Tertiär- und Quartärstruktur des Antigens definiert sind.
Im klassischen Immobilisierungsassay wird der Wandantikörper direkt an die Polystyroloberflache von Mikrotiterplatten adsor¬ biert. Die Bindung an die Kunststoffoberflache beruht, wie allgemein bei Peptiden und Proteinen, auf unspezifischen, hydrophoben Wechselwirkungen und ist entsprechend schwach. Auch das Antigen kann auf der Basis unspezifischer, hydrophober Wechselwirkungen direkt an die Oberfläche der Mikrotiterplatten gebunden werden. Die Nachteile einer solchen, relativ schwachen Bindung sind jedoch die nicht Vorherbestimmbarkeit der Bindungs- stelle an die Wandoberfläche und der hohe Anteil an Desorptionen während der Assaydurchführung.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, einen Immunoassay anzugeben, der grundsätzlich eine höhere Empfindlichkeit und höhere Spezifität gewährleistet. Dabei sollen die in der Immunoassaytechnik üblichen Techniken zur Detektion einsetzbar bleiben.
Das technische Problem wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Der allgemeine Erfindungsgedanke ist hierbei, daß das beschriebene Prinzip nicht eine einzige Detektorsubstanz mit einer Affinitätsgruppierung, die unspezifisch auf der Detektor¬ substanz verteilt ist, einzusetzen, sondern Gemische aus minde¬ stens zwei Detektormolekülen einzusetzen, die die Affinitäts¬ gruppierung an verschiedenen aber spezifischen Positionen des jeweiligen Detektormoleküls tragen. Damit wird vorteilhafter¬ weise die Gefahr einer negativen Wechselwirkung des mit der Affinitätsgruppe versehenen Detektormoleküls mit dem zu detek- tierenden Substrat deutlich herabgesetzt und die Nachweisemp¬ findlichkeit eines solcher Art funktionierenden Immunoassays signifikant gesteigert.
Daε der Erfindung zugrundeliegende technische Problem wird insbesondere gelöst durch einen Immunoassay mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteran¬ sprüche 2 bis 5 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Immunoassays. Der Patentanspruch 6 betrifft die erfindungsgemäß einzusetzende Detektorsubstanz, die ein Gemisch aus mindestens zwei Detektortnolekülen umfaßt, Patentanspruch 9 betrifft die Verwendung der Detektorsubstanz und Anspruch 12 betrifft ein Diagnostikum enthaltend die erfindungsgemäße Detektorsubstanz.
Der erfindungsgemäße Immunoassay wird mit einer Detektorsubstanz ausgeführt, die mit einem zu detektierenden Substrat in Wechsel¬ wirkung tritt. Dabei ist die Detektorsubstanz erfindungsgemäß ein Gemisch von mindestens zwei verschiedenen Detektormolekülen. Die Detektormoleküle weisen jeweils an verschiedenen Positionen eine chemische Gruppierung A auf, die zum Eingehen einer Af¬ finitätsbindung geeignet ist. Die erfindungsgemäße Detektor¬ substanz enthält mithin mindestens zwei Klassen von Detektor¬ molekülen, wobei die eine Klasse die chemische Gruppierung A an einer spezifischen Position trägt, die verschieden ist von der spezifischen Position der zweiten Klasse von Detektormolekü¬ len. Vorzugsweise sind die Detektormoleküle in näherungsweise gleicher Konzentration in dem die Detektorsubstanz bildenden Gemisch vorhanden. Erfindungsgemäß werden die Detektorsubstanz aus mindestens zwei Detektormolekülen mit einer Probe die zu detektierende Substrate enthält, in Kontakt gebracht. Nach Bildung von Komplexen aus zu detektierendem Substrat und den jeweils zwei verschiedenen Detektormolekülen werden diese durch Komplexe, die durch eine Affinitätssubstanz, die mit der chemi¬ schen Gruppierung A eine Affinitätsbindung eingeht, gebildet werden, immobilisiert und/oder nachgewiesen.
Das Detektormolekül ist vorzugsweise ein Polypeptid, insbesonde¬ re Antikörper, der mit einem Antigen spezifisch in Wechsel¬ wirkung treten kann, glycosilierte Peptide, die aufgrund ihrer Polysaccharid enthaltenden Gruppierung spezifisch in Wechsel¬ wirkung treten kann, beispielsweise Lektine, Oligosaccharide, Nukleinsäuren sowie Haptene.
Die chemische Gruppierung A umfaßt vorzugsweise Biotin, Strepta- vidin, Antigen, Antikörper, Protein A, Fc-Fragmente, Fab-Frag- mente, Hormone, Rezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate.
Die Affinitätssubstanz, die einen Komplex mit der chemischen Gruppierung A einzugehen vermag, ist jeweils komplementär zu den chemischen Gruppierungen A. So wird beispielsweise beim Einsatz eines Detektormoleküls, welches als chemische Grup¬ pierung A das Biotin trägt, die Affinitätssubstanz mit der gebildete Komplex aus detektierendem Substrat und Detektor¬ molekül immobilisiert oder nachgewiesen wird, daß Streptavidin sein. In ähnlicher Weise kann die chemische Gruppierung A, bei¬ spielsweise Protein A sein, wohingegen dann die Affinitätssub¬ stanz ein Antikörper aus der IgG-Klasse ist. Ist die chemische Gruppierung A beispielsweise ein Hapten dann ist die Affinitäts¬ subtanz ein Antikörper, der gegen das Hapten z.B. mittels Immunisierung mit Haptenkonjugaten gewonnen wurde. Die übrigen Kombinationen und Variationen der jeweiligen Zuordnungen sind für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Es versteht sich von selbst, daß die spezifische Aufzählung nicht abschließend ist.
Für die Detektion der zu detektierenden Substanz mittels des erfindungsgemäßen Immunoassay bieten sich markierte Affinitäts¬ substanzen an, die, sofern sie nicht über eigene meßbare Charak¬ teristika verfügen, ihrerseits Gruppen aufweisen, die beispiels¬ weise radioaktive Isotope oder Chromo- und/oder Fluorophore oder daran gebundene Enzyme, die Farbreaktionen hervorrufen können, sind.
Im folgenden wird das Prinzip der Erfindung an einem spezifi¬ schen Ausführungsbeispiel näher erläutert. Dabei trägt das Detektormolekül (ein Polypetid) Biotin als chemische Gruppe A.
Die hochaffine Bindung des Antigens mit einer vorherbestimmten Bindungsstelle an die Mikrotiterplatten ergibt eine definierte Ausrichtung des Antigens und gewährleistet die definierte Zugänglichkeit aller Epitope des Antigens. Eine solche Bindung gelingt über ein Streptavidin-Biotin-System. Hierzu werden Antigene mit einem Biotinmolekül am N-terminalen oder am C- terminalen Ende, oder an einer anderen Stelle des Moleküls selektiv synthetisiert. Die mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten gewährleisten eine hochaffine Bindung (Af¬ finitätskonstante IO"15 mol/1) des Biotin-Peptidkomplexes (Chaiet, L., Wolf, F.J. (1964), Arch. Biochem. Biophys. 106, 1 - 5) . Folglich ergibt sich eine starke und vollständige Bindung des Antigens an die Mikrotiterwand (Figur) . Desorption während der Durchführung des Assays, wie sie im klassischen Assaysystem ohne Biotin aufgrund unspezifischer hydrophober Wechselwirkungen vorkommt, tritt nicht auf. Die Konzentration des zu immobilisierenden, biotinylierten Antigens kann deshalb niedriger, als bei einer direkten Immobilisierung gewählt werden. Bindungsvergleiche zwischen dem klassischen Immobilisierungsas- say, in welchem das Antigen mit nicht vorherbestimmbarer Bin¬ dungsstelle aber unspezifische hydrophobe Wechselwirkungen an die Mikrotiterwand gebunden wurde, und dem Streptavidin-Biotin- Immobilisierungsassay, bei welchem das N- oder das C-terminale Ende des Antigens biotinyliert und das Biotinepitop anschließend über Streptavidin hochaffin an die Mikrotiterwand gebunden wurde, ergaben eine deutlich höhere Empfindlichkeit des Strep- tavidin-Biotin-Assays gegenüber dem klassischen Assay. Die Verdrängung durch Zugabe von ungebundenem Antigen erfolgte im Streptavidin-Biotin-Assay als Ausgestaltung des erfindungsgemä¬ ßen Immunoassays überraschenderweise bereits bei deutlich niedrigeren Konzentrationen, als beim klassischen Immobilisie- rungsassay.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Detektor¬ substanz, die unter anderem im erfindungsgemäßen Immunoassay einsetzbar ist, jedoch weitere Anwendungsmöglichkeiten er¬ schließt.
Die erfindungsgemäße Affinitätssubstanz enthält ein Gemisch aus mindestens zwei verschiedenen Detektormolekülen, die mindestens zwei Detektormoleküle weisen jeweils an verschiedenen Positionen eine chemische Gruppierung A auf, die zum Eingehen einer Af¬ finitätsbindung geeignet ist, wobei die chemische Gruppierung A an einer jeweils verschiedenen aber spezifischen Position der Detektormoleküle gebunden ist.
Bevorzugt wird die Verwendung einer Detektorsubstanz, die ein Polypeptid enthält, welches jeweils spezifische an verschiedenen Positionen markiert ist. Dabei kommen grundsätzlich die weiter oben genannten chemischen Gruppierungen A in Frage. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Biotin, welches an in der Aminosäuresequenz des Polypeptids vorkommende Aminogruppen (beispielsweise durch Lysin) gebunden wird. Hierbei kommt es erfindungsgemäß entscheidend darauf an, die jeweilige Biotiny- lierung für die mindestens zwei verschiedenen Detektormoleküle aber spezifisch einzubringen, so daß zwei Gruppen von Detektor¬ moleküle präsent sind. Die eine Gruppe weist beispielsweise die Biotinylierung am N-Terminus auf, wohingegen die zweite Gruppe von Detektormoleküle die Biotinmarkierung spezifisch an einer anderen Stelle, vorzugsweise dem C-Terminus aufweist. Es ist ersichtlich, daß diese Beschreibung nur beispielhaft ist. Es kommt grundsätzlich jede mögliche Position in Frage. Wenn allerdings eine Position gewählt worden ist, sollte diese Position für die Klasse der Detektormoleküle beibehalten werden, so daß die erfindungsgemäßen Vorteile, die durch die Verwendung der mindestens zwei verschiedenen Detektormoleküle erzielt werden, voll zur Geltung kommen. Die erfindungsgemäßen Detektor¬ substanzen lassen sich in unterschiedlichen Bereichen einsetzen. So können die Detektorsubstanzen in Immunoassays beispielsweise auch zur Detektion und Quantifizierung von Antikörpern, Autoan- tikörpern und körpereigenen Substanzen, insbesondere von regula¬ torischen Peptiden eingesetzt werden. Sie lassen sich ebenfalls verwenden für Rezeptormarkierung als Diagnostikum in der fluo¬ reszenzmikroskopischen und durchflußzytometrischen Diagnostik von Erkrankungen, die mit der Expression oder der Veränderung der Expression von Rezeptoren einhergehen, . wie beispielsweise Carcinoiddiagnostik auf der Ebene von Somatostatinrezeptoren.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Detektorsubstanzen bei der Charakterisierung unbekannter Rezeptoren jeweils bekann¬ ter Peptide und bei der Suche von Rezeptoranaloga durch Fluores¬ zenzmikroskopie und Durchflußzytometrie einsetzen. Aber auch zur Reinigung von Peptiden mittels Affinitätschromatographie sind die Detektorsubstanzen geeignet. Dabei können beispielswei¬ se Antikörper gereinigt werden, wenn die erfindungsgemäßen Detektorsubstanzen über ihre Affinitätsgruppierung A an eine Festphasenmatrix gebunden werden. Auch der Einsatz der erfin¬ dungsgemäßen Detektorsubstanzen in medizinischen Diagnosetests, insbesondere unter Einsatz von Biosensoren, ist möglich.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Detektor¬ substanz ist die durchflußzytometrische analytische und präpara- tive Trennung komplexer Zellgemische, wobei die Zellen durch Oberflächen- oder Intracellulärmarkierung charakterisierbar sind.
Für die erfolgreiche Entwicklung eines Immunoassay-Kits ist die Gewinnung eines effektiven antigenspezifischen Antikörpers von Bedeutung. Mit Hilfe immobilisierter biotinylierter Peptide, deren Bindungsstelle und deren Epitoppräsentation aufgrund der Biotinylierung vorherbestimmbar sind, lassen sich Antikörper gezielt charakterisieren.
Durch Bindung biotinylierter Peptide an Mikrotiterpatten lassen sich nach dem Prinzip des Immσbilisierungs-Immunoassays die Titer der entsprechenden Antikörper bzw. Autoimmunantikörper im Blut bestimmen.
Auf der Suche nach den Bindungsstellen von Wirkstoffen im Organismus war es bislang erforderlich, die Wirkstoffe mit detektierbaren Markern zu versetzen, z.B. mit Radioaktivität oder mit Fluoreszenz. Diese Marker können aber die Epitope des Wirkstoffs für die Rezeptorbindungsstellen verdecken und ver¬ ringern hierdurch die Affinität des Rezeptors für den Wirkstoff. Der Einbau von Biotin in das Wirkstoffmolekül läßt sich hingegen sehr genau steuern, wodurch die Epitope des Wirkstoffs für die Rezeptorbindungsstellen zugängig bleiben. Die Wirkstoffrezep- toren im Organismus binden zunächst die freien Epitope des biotinylierten Wirkstoffs. Zur Sichtbarmachung der Bindung wird dem in-vitro, bzw. dem in-vivo-System z.B. Fluoreszenz-markier¬ tes Streptavidin zugesetzt. Die hohe Affinität von Streptavidin für Biotin führt zur Bindung des Fluoreszenz-markierten Strep- tavidins an den vom Rezeptor gebundenen biotinylierten Wirk¬ stoff. Auf diese Weise wird der Komplex Rezeptor-Wirkstoff-Bio- tin-Streptavidin-Fluoreszenz für den Beobachter lokalisierbar.
In der fluoreszenzmikroskopischen und durchflußzytometrischen Diagnostik von Erkrankungen, die mit der Expression oder der Veränderung der Expression von Rezeptoren einhergehen, lassen sich biotinylierte Peptide zur Rezeptormarkierung verwenden, z.B. bei der Carcinoiddiagnostik auf der Ebene von Somatosta- tinrezeptoren.
Durch Immunisierung erzeugter Antikörper sind keinesfalls einheitlich, sondern sie bestehen stets aus einem Gemisch unterschiedlicher Antikörperspezies, die sich auch in ihrer Regioselektivität gegenüber den verschiedenen Epitopen oder Molekülbereichen des Antigens unterscheiden. Die hochaffine Bindung von Biotin an Streptavidin läßt sich - basierend auf dem selektiven Einbau des Biotins durch chemische Methoden am C-Terminus, am N-Terminus, oder auch in zentraler Position des Antigens - zur Reinigung und Differenzierung von Antikörpern nutzen. Selektiv mit Biotin markierte Antigene - oder von der Struktur des Antigens abgeleitete Derivate - können an einer Matrix, z.B. einem hydrophilen Chromatographiematerial, an welches Streptavidin gebunden ist, mit definierter räumlicher Orientierung immobilisiert werden. Dieses Verfahren gewährleis¬ tet die Durchführung von affinitätschromatographischen Reinigun¬ gen mit verbesserter Überwachung der Wechselwirkung zwischen Antikörper und Antigen. Außerdem läßt die definierte Beladung der Chromatographiesäule mit einem biotinylierten Antigen eine höhere Beladung der Affinitätsmatrix zu. Dies kann zusätzlich zur Erhöhung der Selektivität einer Antigen-Antikörper-Wechsel¬ wirkung auch zu einer quantitativen Steigerung der gewonnenen regioselektiven Antikörper führen.
Die Erfindung wird durch die folgende spezifische Ausführungs- form näher erläutert.
Eine Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Synthese von mit Schutzgruppen blockierten Peptidylharzen und Peptiden, die sich an bestimmten Aminosäurepositionen der Peptidkette wahlweise selektiv mit Biotin oder dessen Derivaten verknüpfen lassen. Es ist möglich, daß sowohl nach Peptidsynthesen unter Verwendung, der Fmoc-Chemie als auch der Boc-Chemie in dem total blockierten Peptidylharz die N-terminale Aminogruppe unter Erhalt der übrigen vorhandenen Schutzgruppen selektiv abgespal¬ ten werden kann. Diese regenerierte Aminogruppe kann anschlie¬ ßend durch an sich bekannte Kopplungsverfahren der Peptidchemie, vorzugsweise aber mit Uronium- oder Phosphoniumverbindungen des Typs TBTU oder BOP, mit Biotin oder dessen Derivaten zum N-ter¬ minal Biotin-markierten Peptidylharz umgesetzt werden. Durch nachfolgende Abspaltung vom Träger und der übrigen Schutzgruppen und folgende präparative chromatographische Reinigung sind die entsprechenden N-Biotinylpeptide in hoher Reinheit zu erhalten.
Überraschenderweise gelingt eine selektive Biotinylierung am C-Terminus von Peptiden vorzugsweise durch Verwendung des Lysin-Derivates N- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -N- [1- (4,4-dime¬ thyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl] -L-lysin[Fmoc-Lys (Dde) - OH] . Falls die betreffenden Peptide in ihrer Sequenz kein Lysin als C-terminale Aminosäure enthalten, wird die Festphasensyn- theβe beginnend mit Fmoc-Lys(Dde) -OH als C-terminalem Baustein durchgeführt. Nach ausgeführter Peptidsynthese ist in dem voll geschützten Peptidylharz oder Peptid die Dde-Gruppe durch mehrmalige Behandlung mit verdünntem Hydrazinhydrat abspaltbar, wobei alle übrigen Schutzgruppen des Peptides erhalten bleiben. Nach Kopplung mit Biotin oder dessen Derivaten durch bekannte Aktivierungsmethoden der Peptidchemie und folgende Entblockie- rung und Abspaltung vom Träger können am C-Terminus selektiv biotinylierte Peptide in hochreiner Form erhalten werden.
Vorteilhaft an diesem Verfahren ist die Tatsache, daß die Ein¬ führung der Biotinyl-Reste nach erfolgter Synthese der gesamten Peptidkette in hoher Ausbeute durchgeführt werden kann. Dies gilt insbesondere für die Darstellung von C-terminal Biotin-mar¬ kierten Peptiden. Überraschenderweise läßt sich der Biotin-Rest an der sterisch ungünstigen harzgebundenen Aminosäureposition in hoher Ausbeute einführen.
Im Unterschied zu Verfahren gemäß Stand der Technik der Peptid¬ synthese ist zur Verknüpfung von Biotin oder dessen Derivaten mit der selektiv entblockierten Aminogruppe am N- oder C-Termi- nus das Lösungsmittel 1,3-Dimethyl-3,4, 5,6-tetrahydro-2 (IH) -py- rimidinon (DMPU) besonders bevorzugt. Dieses erlaubt ein ein¬ faches Lösen von Biotin oder dessen Derivaten in hoher Kon¬ zentration und deren Verknüpfung mit der peptidständigen ter¬ minalen Aminogruppe in hohen Ausbeuten schon in Überschüssen von drei Äquivalenten.
Das (+) -Biotin kann in Form der natürlichen Verbindung oder seiner Carboxyl-aktivierten Aktivester und überraschenderweise auch als 6-Aminocapronsäure- oder Lysin-gespacertes Derivat unter Anwendung der beschriebenen Methoden selektiv ins ge¬ schützte Peptidylharz eingeführt werden.
Die synthetischen biotinyl-markierten Peptide können durch verschiedene analytische Methoden identifiziert werden. Hierzu gehören Methoden der Chromatographie, der Kapillarelektrophore¬ se, der Massenspektrometrie, der Peptidsequenzierung und der Aminosäurenanalyse.
Bezüglich der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise sowohl die Darstellung von selektiv am N- und C-Terminus Biotinyl- markierten Urodilatin als auch von entsprechend markierten Fragmenten des humanen Parathormons erwähnenswert. Das Urodila¬ tin besitzt besondere klinische Applikationen. Seine biotiny¬ lierten Derivate sind in einem ELISA-Test (Enzymelinked im- muno-sorbent assay) von großer Bedeutung zur Analyse einer Bildung von humanen Autoantikörpern gegen das Peptid.
Der erfindungsgemäße Assay wird vorzugsweise durch Bindung der C- und N-terminal Biotin-markierten synthetischen Peptide an mit Streptavidin beladenen Mikrotiterplatten realisiert. Nach dieser Bindung ist es möglich, peptidspezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper an das immobilisierte Peptid zu binden. In vorteilhafter Weise ist es so möglich, sowohl An¬ tikörper, die gegen C-terminale Bereiche des jeweiligen Peptides als auch Antikörper, die gegen N-terminale Bereiche des Peptides gerichtet sind, in einem einzigen Assay zu messen, indem beide synthetischen Biotinyl-Peptide in einem Test verwendet werden. Der entsprechende Test kann auch getrennt durchgeführt werden. Hierdurch ist es möglich, Antikörper gegen C- und N-Terminus von Peptiden in getrennten Analysen zu erfassen.
In beiden Fällen werden die gebundenen peptidspezifischen Antikörper charakterisiert, indem Protein A, Protein G oder ein Sekundärantikörper, z. B. ein Anti-Human-IgG-Antikörper, an das speziesspezifische Fc-Fragment des humanen Antikörpers gebunden wird.
Erfindungsgemäß können zur Quantifizierung der Peptid-Antikör- per-Bindung das Protein A oder Protein G markiert, z.B. radioak¬ tiv, sein. Der Sekundärantikörper kann mit einem Enzym oder mit radioaktiv markierten Substanzen konjugiert sein. Die Enzyme sind in der Lage, bestimmte Substrate in einer photometrisch verfolgbaren Reaktion umzusetzen. Erfindungsgemäß können an den Sekundärantikörper z.B. Peroxidasen oder Phosphatasen gebunden sein. Als Substrat dieser Enzyme können z.B. Tetramethylbenzidin und 2,2' -Azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) für Peroxidasen oder 4-Methylumbilliferylphosphat, p-Nitrophe- nylphosphat undBromochloroindolylphosphat-Nitro-Blau-Tetrazo- lium für Phosphatasen eingesetzt werden. Die Reaktionsprodukte dieser Substrate sind durch verschiedene Methoden meßbar, vor allem aber durch Messung der Fluoreszenz oder der Farbintensität der Reaktionsprodukte. Die an daε Protein A, Protein G oder den Sekundärantikδrper konjugierte Radioaktivität wird im Gamma- Counter bestimmt. Die Fluoreszenz oder Farbintensität wird im Spektralphotometer bestimmt. Die photometrisch meßbare Fluores¬ zenz oder Färbung oder die Radioaktivität entspricht über den Sekundärenantikörper quantitativ der Menge des peptidspezifi- schen Antikörpers, der an das spezifisch N- oder C-terminal biotinylierte Peptid gebunden ist. Die einzelnen Phasen der Durchführung des auf der selektiven Synthese von N- oder C-ter¬ minal biotinylierten Peptiden beruhenden Meßverfahrens sind in Figur 1 dargestellt. Erfindungsgemäß wird ermöglicht, daß Peptide (z.B. Urodilatin) , die in dieser Weise immobilisiert sind, ihre antigenen Eigen¬ schaften nicht verlieren. Die Arbeit zeigt weiterhin, daß die antigenen Eigenschaften der selektiv am N- oder C-Terminus biotinylierten Peptide auch nach Trocknung und Reaktivierung mit verschiedenen Assaypuffern weiterhin vorhanden sind. Die antigene Aktivität der N-Biotinyl-Peptide verringert sich durch Lagerung der getrockneten Mikrotiterplatte über einen Zeitraum von mehreren Wochen nicht.
Die Synthese von selektiv markierten Biotinyl-Peptiden erfolgt beispielsweise durch Herstellung von partiell entblockierten Peptidylharzen nach der Merrifield' sehen Festphasenmethode, wobei sowohl Synthesen unter Verwendung der Fluorenylmetho- xycarbonyl- (Fmoc) als auch der tert-Butyloxycarbonyl (Boc) -Grup¬ pe als temporärer Aminoschutzgruppe geeignet sind (E. Atherton und R.C. Sheppard, Solid Phase Synthesis, IRL Press, Oxford 1989; J. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford 1991) .
Beispiel 1: Herstellung von Peptiden mit selektiver N- oder
C-terminaler (+) -Biotinyl-Markierung
Zur Herstellung N-terminal biotinylierter Peptide werden die Peptidsynthesen nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt. Mit der Fmoc-Chemie dargestellte vollständig geschützte Pep- tidylharze werden anschließend für 10 Minuten mit einer Lösung von 20 % Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) behandelt und danach sorgfältig mit DMF gewaschen. Nach der Boc-Chemie syn¬ thetisierte Peptide werden im Anschluß an die letzte Amino¬ säurekopplung für 30 Minuten mit einer Lösung von 50 % Trifluor¬ essigsäure in Dichlormethan behandelt und sorgfältig mit Di¬ chlormethan gewaschen. Alternativ kann bei Peptidsynthesen durch Boc-Chemie die letzte Aminosäure auch als Fmoc-Derivat ein¬ geführt werden. Dessen Aminogruppe läßt sich ebenfalls durch 20 % Piperidin in DMF selektiv freisetzen. Die so erhältlichen Peptidylharze besitzen eine freie Aminofunktion am N-Terminus und können so selektiv mit Biotin oder dessen geeigneten Deriva¬ ten zum biotinylmarkierten Peptid verknüpft werden. Für diese Verknüpfung können Biotin selbst und dessen Carboxyl-aktivierte Derivate wie z.B. der N-Hydroxysuccinimidester, der 4-Nitrophe- nylester und das Hydrazid, sowie vorzugsweise N-Biotinyl-6-ami- nocapronsäure und dessen Carboxyl-aktivierte Derivate wie z.B. das Hydrazid und der N-Hydroxysuccinimidester eingesetzt werden. Vor der Verknüpfung mit der N-terminalen Aminogruppe des ge¬ schützten Peptidylharzes wird das Biotin oder dessen Derivat gelöst, vorzugsweise in N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrroli¬ don, Trifluorethanol, Dimethylsulfoxid oder 1,3-Dimethyl-3,4, 5, 6-tetrahydro-2 (lH)pyrimidinon (DMPU) , und mit 1,1 Äquivalenten Aktivator versetzt. Als Aktivator eignen sich 2 (IH) -Benzotria- zol-l-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU) und davon abgeleitete Verbindungen, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethyamino) -phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und davon abgeleitete Verbindungen sowie N,N-Dialkylcarbodiimide wie Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) unter Zusatz weiterer Hilfsstoffe wie N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol oder Diisopropylethylamin. Zur Biotiny- lierung der Aminogruppe wird das Biotin oder dessen Derivat für 10 Minuten bei Raumtemperatur voraktiviert und anschließend in zwei- bis zehnfachem Überschuß bezogen auf das Peptidylharz mit diesem für 10 bis 20 Stunden unter Schütteln zusammengegeben. Anschließend wird das biotinylierte Peptidylharz sorgfältig zur Entfernung überschüssiger Reagenzien mit dem eingesetzten Lösungsmittel, 2-Propanol und Dichlormethan gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Das auf diese Weise Biotin-markierte Peptid wird vom Trägerharz durch Zugabe vorzugsweise von Tri- fluoressigsäure/Ethandithiol/Wasser (94:2:2, Volumen) innerhalb von 90 Minuten abgespalten, von den Schutzgruppen befreit, mit kaltem tert-Butylmethylether gefällt und lyophilisiert. Daε isolierte Rohprodukt wird durch präparative Hochleistungsflüs- sigchromatographie gereinigt und anschließend charakterisiert. Im Vergleich mit dem nichtbiotinylierten Peptid besitzt das Biotin-markierte Peptid in jedem Fall bei Durchführung einer C18-Reversed-Phase-Chromatographie eine deutlich höhere Reten- tionszeit. Massenspektrometrisch läßt sich das N-terminal gebundene Biotin durch ein um 226.3 Dalton größeres Molekular¬ gewicht nachweisen. Bei Verwendung von N-Biotinyl-6-aminocapron- säure steigt das Molekulargewicht um 339.5 Dalton.
Eine selektive Biotin-Markierung läßt sich sowohl im Rahmen der Fmoc- als auch bei der Boc-Synthesestrategie mit speziellen Lysinderivaten erzielen. Ist am C-Terminus der zu biotinylieren- den Peptidsequenzen kein Lysin vorhanden, so wird die Peptidsyn¬ these mit einem zusätzlichen Lysin, dem die eigentliche Peptid- kette des gewünschten Substrates folgt, begonnen. Im Rahmen der Fmoc-Chemie wird als geschütztes Lysinderivat N- (9-Fluorenylme- thoxycarbonyl) -N-l- (4,4-Dimethyl-2-6,dioxocyclohex-l-yliden) - ethyl-L-lysin [Fmoc-Lys(Dde) -OH] verwendet (B.W. Bycroft, W.C. Chan, S.R.Chhadra, N.D. Hone (1993) J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1993, 778; H.F. Brugghe, H.A.M. Timmermans, L.M.A. van Unen, G.J. ten Hove, G. van de Werken, J.T. Poolman, P. Hoogerhout (1994) Int. J. Pept. Protein Res. 43, 166) . Nach beendeter Peptidsynthese wird dessen Dde-Schutzgruppe abgespalten, wodurch die Aminogruppe des C-terminalen Lysins freigesetzt wird. Hierzu wird das vollständig blockierte Peptid, das als N-terminale Aminoschutzgruppe vorzugsweise eine Boc-Gruppe trägt, dreimal für zwei bis 15 Minuten mit einer Lösung von 2 bis 10 % Hydra- zinhydrat in N,N,Dimethylformamid unter Schütteln umgesetzt. Bei Durchführung einer Peptidsynthese nach der Boc-Strategie wird das Derivat N- (tert-Butyloxycarbonyl) -N- (9-fluorenyloxycar- bony) -lysin [Boc-Lys(Fmoc) -OH] verwendet. Nach beendeter Peptid¬ synthese läßt sich die Aminogruppe des C-terminalen Lysins durch Zugabe von 20 % Piperidin in N,N-Dimethylforinamid für 5 bis 15 Minuten freisetzen. Beide Harze werden nach der selektiven Entblockierung des C-terminalen Lysins sorgfältig mit N,N-Dime- thylformamid gewaschen.
Die Durchführung der selektiven C-terminalen Kopplung mit Biotin oder dessen Derivaten, die Abspaltung vom Trägerharz und Ent¬ blockierung, die präparative Reinigung des Biotinyl-Peptides und dessen Charakterisierung erfolgt mit den gleichen Methoden wie für die N-terminal biotinylierten Peptide oben beschrieben.
Die Methode kann grundsätzlich für alle trägergebundenen, synthetischen Peptide, die durch die erfindungsgemäße Methode der Schutzgruppentechnik am N- oder C-Terminus selektiv mit Biotin oder dessen Derivaten markiert sind, angewendet werden. Die Methode umfaßt besonders die chemische Synthese von selektiv biotinylierten Peptiden, die sich vom Urodilatin (CDD/ANP-95- 126) und anderen natriuretischen Peptiden sowie vom humanen Parathormon und dessen Fragmenten ableiten.
Durch Kombination der beiden Schutzgruppentechniken zur selek¬ tiven Markierung des N- und des C-Terminus von beliebigen Peptiden umfaßt die Methode darüberhinaus Peptidylharze und Peptide, die sowohl am N- als auch am C-Terminus durch Biotin selektiv markiert sind.
Beispiel 2 : Verwendungen der synthetischen, selektiv (+} -
Biotin markierten Peptide
Die synthetischen, selektiv (+) -Biotin markierten Peptide werden durch Kopplung an eine mit Streptavidin gecoatete Miktrotiter- platte über eine Biotin-Streptavidin-Bindung immobilisiert.
Bei der Durchführung des Assays wird zwischen jedem Arbeits- schritt die Mikrotiterplatte mit einer Waschlösung (z.B. Phos¬ phatpuffer; Phosphatpuffer: 136 mM Natriumchlorid; 2,68 mM Kaliumchlorid; 10 mM Natriumdihydrogenphosphat; 1,76 mM Kalium- dihydrogenhposphat) gewaschen.
Die Mikrotiterplatte wird mit einer Streptavidin-Lösung (z.B. 20 μg/ml) für zwei Stunden inkubiert. Anschließend werden die freien Bindungsstellen mit einem Blockungspuffer (z.B. 3 % Rinderalbumin in Phosphatpuffer oder 2,5 % Casein, 0,2 % Tween 20 in Phosphatpuffer) für mindestens 2 Stunden abgesättigt. Die biotinylierten Peptide (z.B. N- und C-terminal biotinyliertes Urodilatin) werden in 1 M Essigsäure (z.B. 30 μg/ml) gelöst und in die mit Streptavidin gecoateten Wells der Mikrotiterplatte eingebracht. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde werden die überschüssigen biotinylierten Peptide ausgewaschen. Das zu untersuchende Serum wird entweder pur oder mit einem physiologi¬ schen Puffer verdünnt (z.B. 3 % Rinderalbumin in Phosphatpuffer; 1 : 250; Urodilatin-Antikörper-Serum : physiologischer Puffer) auf die Mikrotiterplatte pipettiert und für 2 Stunden inkubiert. Anschließend wird das sekundäre Reagenz (z.B. mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase konjugierter oder iodierter Anti¬ human-IgG-Antikörper oder iodiertes Protein A oder iodiertes Protein G) auf die Mikrotiterplatte gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Auswaschen des überschüs¬ sigen sekundären Reagenzes kann die Radioaktivität direkt im Gamma-Counter gemessen werden. Bei der Verwendung von enzym¬ markierten sekundären Reagenzien wird eine Lösung einer chromo- genen Substanz (z.B.2,2' -Azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sul¬ fonsäure (ABTS), 4-Methylumbilliferylphosphat) pipettiert. Diese wird in einer enzymabhängigen Reaktion zu einer quantitativ meßbaren, fluoreszierenden oder farbigen Substanz umgesetzt. Die Fluoreszenz oder die Farbintenεität wird im Spektrophotome- ter bestimmt.
Die Menge der Radioaktivität oder der entstehenden fluores¬ zierenden oder farbigen Substanz ist direkt proportional zur Menge des Antikörpers, der an das biotinylierte Peptid gebunden hat.

Claims

Patentansprüche
1. Immunoassay mit einer Detektorsubstanz, die mit einem zu detektierenden Substrat in Wechselwirkung tritt, wobei
die Detektorsubstanz ein Gemisch von mindestens zwei verschiedenen Detektormolekülen ist, die mindestens zwei Detektormoleküle jeweils an verschiedenen Positionen eine chemische Gruppierung A tragen, die zum Eingehen einer Affinitätsbindung geeignet ist,
die Detektorsubstanz aus mindestens zwei Detektor¬ molekülen mit einer Probe, die das zu detektierende Substrat enthält, in Kontakt gebracht wird, nach Bildung von Komplexen aus zu detektierendem Substrat und den jeweils zwei verschiedenen Detektor¬ molekülen, die Komplexe durch eine Affinitätssubstanz, die mit der chemischen Gruppierung A eine Affinitätsbindung eingeht, immobilisiert und/oder nachgewiesen werden.
2. Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das jeweilige Detektormolekül ein Polypeptid, wie Antikör¬ per, ein glycosiliertes Peptid, wie Lektine, ein Oligosac- charid oder Polysaccharid, Nukleinsäuren und/oder Haptene sind.
3. Immunoassay nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die chemische Gruppierung A, die zum Eingehen einer Affinitätsbindung geeignet ist, Biotin, Streptavidin, ein Antigen, ein Antikörper, Protein A, Protein G, Fc-Frag- mente, Fab-Fragmente, Hormone, Hormonrezeptoren, Enzyme, Enzymsubstrate und/oder Nucleinsäuren sind.
1. Immunoassay nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Affinitätssubstanz jeweils komplementär zu den in Anspruch 3 genannten chemischen Gruppierungen A ist.
5. Immunoassay nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätssubstanz markiert ist, wie beispielsweise mit radioaktiven Isotopen oder mit Chromo- und/oder Fluorophoren.
>. Detektorsubstanz enthaltend ein Gemisch aus mindestens zwei verschiedenen Detektormolekülen, die mindestens zwei Detektormoleküle an verschiedenen Positionen eine chemische Gruppierung A tragen, die zum Eingehen einer Affinitätsbin¬ dung geeignet ist und wobei die Position der chemischen Gruppierung A für jedes der verschiedenen Detektormoleküle jeweils spezifisch ist.
Detektorsubstanz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektorsubstanz aus mindestens zwei Polypeptiden bestehen, deren Aminosäuresequenz gleich ist und an ver¬ schiedener Position eine chemische Gruppierung A tragen.
Detektorsubstanz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Gruppierung A Biotin ist und spezifisch an dem N-terminalen Ende des einen Detektormoleküls und am C-terminalen Ende des anderen Detektormoleküls befind¬ lich ist, so daß die zwei unterschiedlichen Detektormolekü¬ le zum einen N-terminal die chemische Gruppierung tragen und die andere Gruppe des Detektormoleküls die chemische Gruppierung A am C-terminalen Ende tragen.
9. Verwendung einer Detektorsubstanz nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8 in einem Immunoassay
zur Detektion und Quantifizierung von Antikörpern, Autoantikörpern und körpereigenen Substanzen, insbe¬ sondere regulatorischer Peptide, für Rezeptormarkierung als Diagnostikum in fluores¬ zenzmikroskopischer und durchflußzytometrischer Diag¬ nostik von Erkrankungen, die mit der Expression oder der Veränderung der Expression von Rezeptoren einher¬ gehend, z.B. Carcinoiddiagnostik auf der Ebene von Somatostatinrezeptoren, zur Charakterisierung unbekannter Rezeptoren an sich bekannter Peptide und bei der Erforschung von Rezep¬ toranaloga mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durch- flußzytometrie.
10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Reinigung von Antikörpern durch Affinitätschromatographie, wobei die Detektorsubstanz über die chemische Gruppierung A an einer Festphasenmatrix gebunden wird.
11. Verwendung nach Anspruch 9 für die durchflußzytometrische analytische und präparative Trennung komplexer Zellgemische durch Oberflächen- oder Intracellulärmarkierung von Protei¬ nen.
12. Diagnostikum enthaltend eine Detektorsubstanz gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8.
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