JPS58176550A - 均一系免疫試験法、それに用いる試薬調製物及び試薬系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫試験法の発展は、極めて低濃度で液体媒質中に現わ
れる、診断上、医学上、環境上、工業上重要な種々の有
機物質の測定の丸めの極めて有用な分析法をもたらした
。免疫試験は、ここで分析対象物と呼ばれる、測定され
る物質、例えば、抗原、ハプテン又は抗体と、その結合
相手、例えば、対応する抗体又は抗原との間の特異的な
免疫学的結合相互反応に基づく。　　　　。

従来の免疫試験法においては、試験されるべき試験試料
は、反応混合液中で、種々の組成物の試薬系と合わ象れ
る。かかる系は、通常、（＋）分析対象物の複合体であ
る標識化複合体、又はその特異的結合類縁体、及び標識
物質、並びＫ　（１）一定量の、分析対象物に対する抗
体（抗分析対象物）からなる。反応混合液中では、試料
中の分析対象物及び標識化複合体が競争して抗分析対象
物と結合し、その結果、標識化複合体の抗体結合種及び
標識化複合体の遊離種とを生成する。結合種となるＳ＋
ｍ化横化体合体離種に対する相対量すなわち割合は、試
験試料中の分析対象物の存在（すなわち量）の関数であ
る。かくして、遊離種中の又は結合種中の標識物質を測
定し、かつその測定量を試料中の分析対象物の存在すな
わち量と相関させることができる。

開発されるべき最初の免疫試験は、標識として放射性同
位元素を用いる放射性免疫試験であった。

放射性物質を取り扱う゛不便さ及び困峻さの故に、例え
ば、酵素の補助因子（コファクター）類、靜素基質類、
活性化剤及び阻害剤のような酵素活性調節剤類、環化反
応剤類、スピンラジカル類、酵素類、バクテリオファー
ジ類、金属類及び有機金属錯体類、有機及び無機触媒類
、補欠分子族類、化学発光性反応剤類、及び螢光性分子
類をはじめとする、放射性同位元素以外の材料を標識成
分として用いる試験系が案出されている。

放射性免疫試験の場合のように、結合種中の標識化複合
体が、標識を監視するのに用いられる方法により、遊離
種中の標識化複合体の存在下で、実質的に識別不可能な
場合には、試験を完遂するために、結合種及び遊離種を
物理的に分離しなければならない。この型式の輯験は、
従来、“不均一系”　と呼ばれている。標識化複合体の
結合種と遊１ｍ！種が、互いの存在下で識別可能な場合
には、“均−系″の方法によることができ、かつ分離工
程を省略することができる。：′：。

本発明は、標識化抗体を用いる、試験試料中の分析対象
物の定量又は定性分析のための免疫試験法及び試薬系に
関する。

標識化抗体は、不均一系免疫試験において用いられてお
り、それには、広汎な標識物質が用いられている。その
中には、螢光性標識〔クーンズ等（Ｃ＊＊ｎａ　ａｔ　
ａｌ　’）＋　　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４５巻工１
５９頁（１９４２））、放射性標識〔マイルス及びヘイ
ルズ（Ｍｉｌｅｓ　ａｎｔ　Ｈａｉｅｓ　）、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　　２１９巻：　１８６頁（１９６８））、酵素
標識〔米国特許第３　、６５４　、０９０号〕等がある
。一般的な参考として、競争的蛋白質結合試験の原理、
オーデル及びドーアデー編、ジエー・ビー・リビンコッ
ト、フィラデルフィア（Ｐｒ１ｎｅｉｐｌｅｓ　　ｏｆ
　　Ｃｏｍｐ＠ｔｉＬｌｖ＊　　Ｐｒｏｔ−ｉｎ−Ｂｌ
ｎｄｉｎｇｋｍｔａｙａ、　ｓｄ、Ｏｄ＊ｌｌ　ａｎｄ
　Ｄａｕｇｈａｄａｙ、　Ｊ、Ｂ、　Ｌｌｐｐ−ｉｎｅ
ｏｔｔ、　Ｐｈ目ａ、）（１９７２）、２６０頁以下を
参照され丸い。標識化分析対象物豪合体を用いる競争法
に比較して、直接免疫試験法における標識化抗体の使用
は、有意の特有な有利性があるにも拘らず、均一系免疫
試験の分野では、標識化抗体は、限られた使用にのみ供
されている。

米国特許第４，２３３，４０２号及びリットマン等（Ｌ
ｉ＆ｍａｎ　＠Ｌ　ａｌ　）　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ
ｅｈｅｍ、　ｌ　Ｑ　１巻重２２３貞（１９８０）は、
均一系免疫試験に酵素チャンネリング法（ｅｎｚｙｍｅ
　ｅｈａｎｎ＠ｌｉｎｇ　ａｐｐｒｅａｅｈ　）につい
て述べている。この方法では、分析対象−に対する抗体
の２つの母集団を、一方の酵素の生成物がもう一方の酵
素の基質であるような２つの累々つ九酵素を用いて、そ
れぞれ標識する。２つの標識化抗体母集団の要員が分析
対象物と結合すると、２つの酵素は接近し、最終検出信
号の生成速度が増加する結果となる。この方法では、２
つの［識化抗体試薬を俸るために２組の異なった抗体を
２つの異なった酵素を用いて標識する必要がある。

幾分似通った原理は、米国特許第３，９９６，３４５号
及びウルｆｆ　７等（Ｕｌｌｍａｎ　ｅ＊　ａｌ　）　
Ｊ、　Ｂｉｅｔ。

Ｃｈ＠ｍ、　２５１巻：４１７２頁（１９７６）に１載
されているエネルギー移動均一系免疫試験法に見出され
る。この方法では、抗分析対ｉ物を螢光体−減衰体対の
一方で機織し、＃Ｉ／ＩＪ２の試薬を、分析対象物と複
合体を形成しているかかる対のもう一方で生成する。標
識化抗体が標識化分析対象物複合体と結合すると、エネ
ルギー移動減衰のために螢光に変化をも九らす結果とな
る。試験試料中に分析対象物が存在するとこの結合に対
する競争がおこりかつ螢光減衰が相当量だけ減少する。

この方法は２つの標識化試薬の調製をも必要とし、かつ
、クルマン等（Ｕｌｌｍｍｎ　＠ｔ　ａｌ　）　　によ
り報告されているように、望ましくない二相性応答（ｂ
ｉｐｈａｓｉ。

ｒｅａｐｏｎ嘗ｅ）をもたらす。

標識化抗体を用いる、文献に報告された別の均−系法と
しては、酵素ホスフォリパーゼＣ・で標識するもの〔ウ
ェイ及びルーペ（Ｗｅｉ　ａｎｄ　Ｒｕｂｅ。

Ｃｌ１ｎ、Ｃｈ＠ｍ、　　２３巻：１３８６貞（１９７
７）〕が挙げられる。嶌分子量分析対象物（ＩｒＧ）の
酵素標識化抗体との結合は、基質すなわち正常な赤血球
へのホスフォリパーゼＣの触媒作用に対し立体障害を引
きおこす。かかる方法の感度及び４ｉ）異性は、一様な
、結合力及び％異性の抗体を調製すること並びに抗体＃
Ｊ４製物・から非特異的蛋白質を除去することの困難さ
により、著しく狭ばめられる。従来法は抗血清を産生す
るために用いられていたので、免疫試薬として、かなり
の量の精製抗体が必要とされた。これらの方法により産
生された抗血清は、分析対象物に対して異なる特異性及
び結合力をもった抗体の異種収集体からなるであろう。

分析対象物特異的抗体の単離には、分析対象物が共有結
合で付着するマトリックスを用いたアフィニティ（親和
性）精製を必要とする。免疫原及び効果的表アフイニテ
イ　（親和性）吸着体を調製するのに十分な量又は純度
で得ることのできない分析対象物にとっては、かかる方
法も又、最終的には不適当なものとなるであろう。史Ｋ
、標識のために遊離の抗体を得るため、アフィニティー
カラム上に得られた抗原−抗体複合体を切断する際、よ
り強力な結合すなわちより結合の強い抗体、試験に用い
るために最も望ましい抗体は、脱離させるには最も困難
なものとなるであろう。従って溶出された抗体は、主と
して低い結合力、のもの又は恐らく変性抗体の場合さえ
あると予想されるであろう。

更に、アフィニティー精製に先立ち、抗血清から補体成
分を除去しないならば、アフイニテイーカ抗体と共Ｋｌ
ｌ出し、潜在的非特異的標識化蛋白質となって、パック
グラウンド信号を増加させる。

標識化抗体を用いることを試みた、従来の均一系免疫試
験の不都合を克服するために、その分野の研究者等は、
追加の、更に複雑な試薬を位置する更に複雑な試薬系に
頼った。かかる系は、ギボンス等（Ｇｉｂｂｏｎｓ　ａ
ｔ　ｍｌ　）　、　　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２７巻
：　１６０２（１９８１）により提案された酵素増強（
ｓｎｓｙｍｓ　＊ｎｈａｍｅ＊ｍ＠ｎｔ　）免疫試験法
により明示される。米国特許第４　、２８７　、３００
号も参照されたい。

この方法において本文、抗体の２つの母集団が標識され
、１組は負の電荷をもつように化学的に修正され、もう
一方は酵素で標識される。分析対象物を含有する試験試
料は、負に電荷された抗体、酵素標識抗体及び巨大分子
の正に帯電した基質複合体からなる試薬系と組合わされ
る。２つの異種標識化抗体が分析対象物と結合すると、
荷電した試薬が局部的に吸引しあうために、反応速度を
高める結果となる。均一系免疫試験において標識化抗体
を用いるために提案された、他の同様に複雑な方法が米
国特許第４．、．２０８，４７９号及び纂４，２５６．
８３４号に記載されている。　これらの方法においては
、分析対象物の関数として、標識応答を質化させるため
Ｋは、信号発生系の他に、標識によって修飾された巨大
分子を必要とする。

本発明の目的は、従来法の不都合を克服する、標識化抗
体を用いる均一系免疫試験法を提供することである。か
かる方法は、非特異的標識化蛋白質つ存在による感度の
損失を克服し、かつ単一の結合試薬、標識化抗体を含む
、大幅に簡略化された試験法を提供すると同時に、標識
化分析対象物複合体を用いるのに比較して標識化抗体を
用いる、主要な有利性を保持するであろう。

臨床免疫学における単一クローン性抗体の応用について
の最近の概説は、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈ＠ｍ、　２７巻；１
７９７頁（１９８１）にある。概説は、免疫試験に標識
化抗体を用いることについて、いくつか有利性を列挙し
、かつｐ−鍼化抗体対の近接結合（ｐｒｏｘｉｍａｌ　
ｂｉｎｄｉｎｐ　）に基づく試験系への、標識化単一ク
ローン性抗体の、２，３の将来可能な応用について推測
している。その示唆によれば、例えば、酵素チャンネリ
ング系及びエネルギー移動系勢、上に列挙したような、
標識化抗体の２つの異なつ九母集団を用いる、それら公
知の試験系において、従来の多価抗体の代わりに、標識
化単一クローン性抗体を用いることである。

本発明は、単一の標識化抗体試薬を用いる均一系免疫試
験を提供する。重要な分析対象物を含有すると予想され
る試験試料を、分析対象物に対する抗体が、実質的に唯
一の標識化成分である標識化単−クローン分析体−製物
と組み合わせる。試験試料は又、標識化単−クローン性
抗分析対象物と結合しうるエピトープからなる巨大分子
複合体とも、任意Ｋ、組み合わせる。標識化抗分析対象
物が分析対象物と結合した場合、結合しない場合と比較
して、検出可能な応答が、定性的又は定量的意味におい
て、測定可能に異なシ、又は、巨大分子複合体も存在す
る場合、標識化抗分析対象物が複合体と結合し九場合に
、結合しない場合又は分析対象物と結合した場合と比較
して、検出可能な応答が測定可能に異なるように、用い
られる標識を選択する。従って、結果として得られる検
出可能な応答は、試験試料中の分析対象物の関数である
。糊合体が存在しない場合、分析対象物の濃度が増加す
ると、標識°化抗分析対象物との結合が増加し、従って
標識の検出可能な応答の変化が増加する。複合体が存在
する場合、標識化抗分析対象物が複合体と結合すると、
標識の検出可能な応答が変化する。分析対象物の濃度が
増加すると、標識化抗分析対象物の複合体との結合が減
少し、従って、標識の検出可能な応答の変化が減少する
。

抗分析対象物は、免役′学的に銹導された特異的結合物
質、例えば抗体又はそのフラグメントである。

好ましい実施態様においては、標識化抗分析対象物の結
合の際の、標識応答の変化は、立体効果により引き起こ
される。試薬検出系メンバーとの相互反応の際、分析対
象物が、又はある場合には複合体が、１１！ｉｋｍｔ化
抗分析対象物と結合すると、該メンバーの標識への接近
が立体上妨害されて検出可能な応答をもたらすよう標識
が選択されるであろう。好ましい標識としては、基質類
、補酵素類、補欠分子族類、阻害剤類及び酵素類自身の
ような岬素触媒厘；応の関与物が挙げられる。

本方法の基本的な特徴は、抗分析対象物が実質的に唯一
の標識化成分である標識化抗分析対象物の製造である。

実質的に純粋な標識化抗分析対象物を有することにより
、非特異的材料と結合した標識によるパックグラウンド
応答が事実上なくなる。抗分析対象物を得るために、単
一クローン（ｍｏｎｏｅｌ＠ｎａｌ　）法を応用すれば
、かかる純粋な標識化抗分析対象物調製物の製造のため
の新規なかつ極めて有利な方法を提供することになる。

本発明の製造方法は、体細胞融合（ｓ＠ｍａｔｉａｓｅ
ｌｌ　ｈｙｂｒｌｄ１ｍｍＮ＠ｍ　）により単一クロー
ン性（モノクロナールｍ・ｎ・ａｌａｎａｌ　）抗分析
対象物調製物を得る巖初の工程′からなる。単一クロー
ン性調製物を、免疫グロブリンＩＩＩＫ選択的な分離法
にかけることによシ、非特異的蛋白質は簡単に効率よく
除去される。調製物中の、実質的にすべての免疫グロブ
＋）７Ｍは単一クローン性、即ち、化学的に同一である
から、分離され九免疫グロブリン画分は、実質的に非特
異的成分を含まない。次に、選げれた標識物質を、化学
的Ｋ、例えば、共有結合を形成することにより、精製さ
れた調製物中の抗分析対象物と、従来の蛋白質修飾法で
結合させる。

いくつかの有意義な分析上の及び製造上の有利性が、本
免疫試験法及び試薬系を特徴づける。その中の主なもの
は、単一の標識化抗体試薬のみを必要とすることである
。分析対象物を測定するために、試薬系は単に、標識化
抗分析対象物及び標識と相互反応をおこして検出可能な
試験応答を発生させるために必要な試薬検出系の成分の
みからなることが必要である。標識化抗分析対象物を用
いることにより、測定したい、異なる分析対象物のそれ
ぞれに対して特有の分析対象物−標識複合体を製造する
必要性が排除される。通常、本発明に従って、一群の異
なつ九分析対象物についての一連の試験をｈなう際、個
々の試験のすべてに用いられる、特定のタイプの抗分析
対象物、例えばＩ、０群の抗体が選択される。種々の異
なる分析対象物に対する抗体は、所望の標識化抗分析対
象物試薬を製造するために単純な標−法を用いることが
できる、則−の基本的なＩ、Ｇ構造を有するであろう。

このことは、一連の試験を行なう際、重要な合成上の利
点である。

本発明の更にもう１つの重要な利点は、標識化複合体を
製造するために、分析対象物を広範Ｈに精製する必要性
が排除されることである。分析対象物複合体を用いる従
来法においては、有意の非特異的標識を回避せんとする
ならば、純粋な分析対象物を必要とする。本発明におい
ては、抗分析対象物の産生を促すための、動物への注射
に、比較的不純な分析対象物調製物が用いられる場合で
さえも、体細胞融合により、申し分なく特異的な抗分析
対象物が、本来得られる。更に１関連した利点としては
、分析対象物は、試験試薬を製造する際、初期の抗体産
生を促す九めにのみ必要とされるので、標識及び試験試
薬としての用途のための大量の抗体を得るために、比較
的少量の分析対象物が必要とされることである。抗分析
対象物の産生を続行させることは、公知の単一クローン
性抗体増殖法により、それ以上の分析対象物を必要とせ
ずに可能である。

分析対象物が、特に乏しく、得るのが困難な物質である
場合には、本発明は、標識化抗分析対象物を製造するた
めの、更に著しく有利な方法を提供する。実質的に純粋
な標識化抗分析対象物調製物は、アフイニティ結合剤と
して、分析対象物を必要としないクロマトグラフィーの
手法により得られる。単一クローン性抗体法を用いて、
均一な免疫グロブリンを含有する抗分析対象物ｗＡ製物
が得られる。非特異的物質は、免疫グロブリン群に選択
的な結合剤を用いるクロマトグラフィーにより、簡単に
除去することができる。標識された従来の抗体を用いる
爽際的かつ鋭敏な試験での従来“−□′、 法の試みと対称的に、引１ｉ抗体のすべては等しい結合
力を有するであろう。従来法においては、すべての抗分
析対象物が、その結合力又は特異性に関係なく標識され
、このことがパックグラウンドをさらに増加させること
になる。

この開示において、次の用飴は別に断らないかぎり、次
のように定義される。

分析対象物−試験試料中の存在の有無又は量が測定され
るべき化合物又は一群の関連化合物。

抗分析対象物−通常、完全分子型抗体又は抗体７ラグメ
ントよりなる、分析対象物に対し特異的な、免疫学的に
得られた結合性物質。

均−系免疫試験一標識応答が、遊離−標識種からの結合
−標識種の物理的分離なしに御ｊ定される、分析対象物
及び抗分析対象物間の特異的結合に基づく試験。

試薬系一本試験を行うのに用いるための組成物、賦験具
又Ｆｉ装置、試験キット、他の物理的装置Ｊ手段又は試
薬の組合わせ。

五菫立見星 好ましい実施態様において、本試験は、抗分析対象物に
複合体形成された標識の応答が、かかる標識化抗分析対
象物と分析対象物が結合した際、変化することに基づい
ている。菖１図について見ると、競争結合に基づく分析
対象物（Ａ　！１）の−］定のための均一系免疫試験は
、分析対象物−標識化複合体（Ａ西及び抗分析対象物（
ムｍ亀ｉ−ム鳳）を用いる。Ａｎ及びＡｎ　は限られた
量のム１ｓ４ｉ　−Ａｍとの結合に対し競争せしめられ
る。Ａｎａｌ−Ａｉｌ　　とそれぞれ結合し九、Ａｎ及
びＡｎ　　の複合体が形成され、いくらかの過制の非結
合Ａｎを残す。非結合Ａ−はある信号を発するが、この
信号は（ム一：　Ａｎｔｉ−Ａｎ）複合体においては変
化もしくは変調される。これと対照的に、本試験は標識
化抗分析対象物（Ａｎｔｉ−ムｎ）を単に添加すること
により行うことができ、結果として変化又は変調した信
号を発するＡｎ及びＡｎＬｉ−Ａｌｌ　の複合体すなわ
ち（Ａｎ　：　Ａｎｔ＆−Ａｎ　）を形成する。　標識
応答の変化又は変調は、分析対象物の標識化抗分析対象
物との結合によって起こり得る様々な効果の結果であり
得る。例えば、＠識応答は信号の発生、例えば電磁波信
号であり、これは、生成する複合体中の標識に対し分析
対象物又は分析対象物上の特異基が接近することにより
、ある測定可能な程度に変化する本のである。かかる例
は、発光性標識例えば螢光体又は化学発光体を用いる蛋
白質分析対象物の試験に適切である。標識を適切に選択
すると、例えば標識発現を吸収する基又は疎水基のよう
な、一般の蛋白質に共通であるか、試験中の特異蛋白質
に特有の、蛋白質分析対象物中の化学基との接近のため
に、標識信号の減衰又は増大がおこる結果となる。

標識応答の変化の特に好ましい機構は、立体障害である
。標識化抗分析対象物と分析対象物が結合すると、常に
、標識のＪｌｄ囲で、いくらかの立体上の変化がおこる
であろう。条件を適当に選択すると、正常な応答を提供
する標識の能力を、測定可能に変化させるに十分な程強
力に、かかる立体効果をおこすことができるであろう。

好ましくは、標識と相互反応して測定信号を発する１つ
又はそれ以上の物質からなる試薬検出糸メンバーとの相
互反応、例えば化学反応で、検出可能な試験応答を提供
するよう標識が選択される。かかる試験系においては、
標識化抗分析対象物複合体の嵩（大きさ）が、分析対象
物との結合で、有意に増加するよう選択される。分析対
象物の嵩（大きさ）が相対的に大きくなると、標識の周
囲の立体効果が更に顕著になる。

立体障害が関与する場合、標識それ自体は小さいことが
好ましく、例えば分子量が５０，０００未満一般に、１
０，０００未満、更に通常は４，０００未満であり、好
ましくは２　、０００未満であり、かつ標識が相互反応
する検出系メンバーは、ある程度大きいことが好ましく
、例えば標識より３倍大きく更に通常にＦｉｌＯ倍大き
く、好ましくは２０〜Ｚｏｏ倍以上大きい。従って、１
００〜２０００ドルトン程度の大きさを有する標識を用
いる最も好ましい系においては、検出可能な信号を提供
するためにＩ！Ｉ識が相互反応する検出系の少なくとも
１つのメンバーが、１０．０００〜２００．０００ドル
トン以上程度である。ｍ識と検出系メンバー間のかかる
大暑さの関係は、分析対象物の標識化抗分析対象物との
結合の際、有意の立体効果の可能性を増大する。従って
、好着しい標識は、酵素基質、補酵素、＃嵩補欠分子族
及び酵素阻害剤のような、酵素−触媒：、反応における
関与物であり、そこから広汎な酵素反応を利用して試験
成分を選ぶことができる故である。標識及びその相互反
応検出系メンバー間に、好ましい大きさの関係を保つに
十分な程大きい分子量の酵素に対して、多くの小さな基
質、補酵素及び阻害剤が知られている。これは、同様Ｋ
、補欠分子族とそれらに対応するアポ酵素に対しても適
用される。同様に、かなり大きな基質を有する酵素又は
、水溶性ポリマーのような高分子量バックボーン材に小
さい基質、補酵素及び阻害剤を結合することにより、人
工的に大きい基質、補酵素、阻害剤をそれに対１〜て製
造することができる酵素が多数知ら５れている。分析対
象物／抗分析対象物結合の立体効果は、分析対象物との
複合体形成により有意に増加する嵩（大きさ）を有する
抗分析対象物を選択することによっても高められる。一
般に、抗分析対象物は分析対象物の嵩の１０倍以上とは
ならないことが好ましく、より一般的には、分析対象物
の絶対的な大きさよね、より小さく、史に分析対象物の
嵩の０．２Ｓ倍より小さいことが好ましい。低分子量の
免疫グロブリンクラス（群）の抗体を選択することＫよ
り、抗分析対象物の嵩を減少させることができる。例え
ば、１９Ｍクラスの抗体が約９００　、０００の分子量
を有するのに対し、ＩｐＧ抗体は約１５０，０００の分
子量を有する。又、選択的に抗体を開裂して、分析対象
物に対する千れらの特異的結合親和力を保持している低
分子量の７ラグメントを生成することができ、例えば、
Ｆａｂ　　（５０，０００ドルトン）、Ｆ　（ａｂ’　
）　（５３，０００ドルトン）及びＦ　（ａｂ’）！（
１０６゜０００ドルトン）のよりなＩｐＧ抗体の　種々
の７ラグメントを製造することができる。

従って、標識化抗分析対象物の結合の際の標識の立体障
害に基づく分析対象物の検出には、大きい分析対象物、
例えば約１０，０００より大きい、艶に一般的には約５
０，０００より大きい、好ましくは約１００，０００よ
り大きい分子量の分析対象物を用いかつ、比較的小さい
タイプの抗分析対象物、例えば、完全分子型Ｉ、Ｇ抗体
又はそれらの７ラグメントを選択することが好ましい。

同様に１かかる系では、比較的小さい標識、及び標識が
相互反応する比較的大きい検出系メンバーを選択するこ
とが好オしい。

分析対象物が十分に大きくなく、結合の際、標識化分析
対象物が、標識の検出可能な応答に有意な測定可能な変
化を与えるに十分な根強力な立体障害をおこさせること
ができかい場合は、分析上の有用性を付与する丸めに、
系に付加成分を添加することができる。かかる付加成分
は、標識化単一クローン性抗分析対象物と結合可能なエ
ピトープ類（すなわち、抗原決定因子もしくは抗体に対
する結合部位）であり、それによシ標識化抗分析対象物
とかかる複合体が結合すると、標識応答において、標識
化抗分析対象物の非結合体と比較し、及び分析対象物と
競争的に結合した標識化抗分析対象物と比較し、測定可
能な変化を惹起する。この別法は、標識化単一クローン
性抗分析対象物との結合に対する分析対象物と分析対象
物類縁体高分子複合体間の競争に基づくものである。抗
分析対象物、標識及び相互反応検出系メンバーの大きさ
の選択に関しては、同様のパラメータが、好ましい直接
結合法におけると同様に、ここで用いられる。更に、高
分子分析対象物複合体は、立体効果を増大するために、
抗分析対象物に対して大きくすることが好ましい。高分
子複合体の分子量は選げれた抗分析対象物の分子量の０
．１倍、更に一般的には選ばれた抗分析対象物の分子量
より大きく、かつ最屯好ましくは４倍大きい。相対的に
いえば、分析対象物は、抗分析対象物より大−に小さく
、通常は、その分子量の１０倍より小さく、一般的には
、約５０００ドルトン以下、好ましくは約１０００ドル
トンより小さい。

この別法においては、高分・テ複合体は、種々の方法で
構成され、標識化抗分析対象物により認識される結合部
位を有する高分子を供する。例えば、分析対象物それ自
体、又は特異的結合類縁体（すなわち、構造的に分析対
象物と類似しており、かつ抗分析対象物で認識されかつ
結合する化合物）は重合化され又は架橋化されて、高分
子単位を形成してもよい。更に通常的には、複合体は高
分子量材料、例えば、分析対象物又は分析対象物の結合
類縁体のいずれかである数多くの残基が、通常共有結合
により付加されている水溶性ポリマーから成る。基体材
料は通常的１０，０００以上の分子量を有するが、試験
実施の丸めに望まれるように変ってもよい。分析対象物
又は分析対象物類縁体の、かかる高分子マドＩＪツクス
への結合は、普通の技能者が利用できる技術によって達
成される。支持体材料は、天然製品、天然製品の修正品
又は合成材料であってもよい。有用な基体もしくは支持
体ポリマーとしては、蛋白質類、ポリペプチド−１多糖
ｌＩＩ等が挙げられ、アルブミン、デキストラン、澱粉
及びアｓ−＝ロー、スをはじめとする具体例が挙げられ
る。支持体Ｆｉ架橋していてもよく又は別の方法で化学
的に改質されていてもよい。

分析対象物 本発明は、その抗分析対象物が入手可能又は製造可能な
いかなる〜分析対象物の試験に対し適用できる。はとん
どの場合、分析対象物は、それに対する抗分析対象物が
製造可能な、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、炭化水
素、糖蛋白質、ステロイド、又は他の有機分子である。

分析対象物は、機能的意味において、通常抗原及びそれ
に対する抗体、すなわちハプテンとそれに対する抗体；
ホルモン類、ビタミン類、代紺産物及び薬理学上の試薬
及びそれらの結合相手からなる群よシ選択される。通常
、分析対象物は、抗体又は抗原性ポリペプチド又は蛋白
質のような約１，０００と約１０゜ｏｏｏ、ｏｏｏ間の
分子量を通常有する免疫学的に活性なポリペプチド又は
蛋白質、又は少なくとも約１００かつ通常は約１，５０
０未満の分子量を有するハブ−テンである。分析対象物
が標識化抗分析対象物と結合すると標識応答の変化をも
たら′す本発明の好ましい直接結合法は、ポリペプチド
類、蛋白質類、多糖類、ポリ核酸Ｉ１１等のような比較
的高分子量物質の測定に適用される場合、特に有利であ
る。分析対象物が、分析上重要な試験試料、例えば血清
、プラズマ、全血、尿及び唾液のような生物学的試料、
の数多くの高分子量の成分のように、特に微量物質であ
る場合には特に利点が得られる。本試験は絶対的な最少
量の精製分析対象物物質を用いて構成することができる
。

代表的なポリペプチド分析対象物は、アンギオテンシン
！及び蓋、Ｃ−ペプチド、オキシトシン、バソプレッシ
ン、ノイロフィシン、ガストリン、セクレチン、ブラジ
キニン及びグルカゴンである。

代表的な蛋白質分析対象物としては、プロタミン類、粘
性蛋白質類、糖蛋白質類、グロブリン類、アルブミン類
、硬蛋白質類、燐蛋白質類、ヒストン＃Ａ（細胞核蛋白
質類）、脂肪蛋白質類、色素蛋白質類及び核蛋白質類が
挙げられる。特異蛋白質類の例としては、プレアルブミ
ン、α１−脂肪蛋白質、ヒトの血清アルブミン、α、−
［１１１蛋白質、α１−Ｍ、）！Ｊブシｙ、αｌ−１１
１１１質、トランスコルチン、チロキシン結合グロブリ
ン、ハプトグロビン為ヘモグロビン、ミオグロビン、セ
ルロプラズはン、α、−脂肪蛋白質、α１マクログロブ
リン、β−脂肪蛋白質、赤血球蛋白質、トランスフェリ
ン、凝血酵素、フイプリノゲン、ＩｆＧ、　　１ｆＭ、
　　Ｉｆム。

ＩｐＤ及び工ｔＥのような免疫グロブリン類、及びそれ
らのフラグメント、例えは、ＦｅとＦａｂ　、　　補体
成分類、プロラクチン、フイブリノゲン、トロンビン等
のような血液凝固因子類、インシュリン、メラノトロピ
ン、ソマトトロピン、向甲状腺性ホルモン、卵胞刺激ホ
ルモン、　黄体形成ホルモｙ　（１ｗＤｉｎ１ｇｉｎｇ
　ｈｏｒｍｏｎｅ　）　、絨毛膜ゴナドトロピン、甲状
腺刺激ホルモン、胎盤ラクトジエン、固有因子、トラン
スコバラミン、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素
酵素、アｉラーぞ、リパーゼ、ホスファターゼ類、コリ
ン・エステラーゼ、グルタミン酸修酸トランスアミナ−
（、グルタミン酸熱性葡彎酸アミノ基転移酵素及びウロ
ペプシンのような血清酵素類、エンドルフィン類、工ン
ケフプリン類、プロタミン、組繊抗原類、バクテリア抗
原類、及び肝炎関連抗原ＩＩＩ（例えば、困−ムｙ、　
　ＨＢｅｋｙ及びＨＢ・ムｔ）のようなヴイールス抗体
類のクラスを挙げることができる。

ハプテン分析対象物は、同様に、高分子分析対象物複合
体を用いる上に教示された別の競争法を特に用いて棚定
することができる。代表的なノ・ブテン分析対象物とし
ては、薬剤類、代謝産物類、ホルモン類、ビタミン類及
び同様の有機化合物類の一般のクラスが挙げられる。ハ
ブテン性ホルモン類としてはチロキシン及びトリョード
チロニンのようなヨードチロニン拳が挙げられる。ビタ
きン類は、ビタミンＡ、Ｂ、例えばＢ４、Ｃ，Ｄ、　Ｅ
及びに、＠酸及びチアミンを含む。薬剤類は、アミノグ
リコシド類、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン
、アミカシン、シソマイシン、カナマイシン及ヒネチル
マイシン、ペニシリン、テトラサイクリン、テラマイシ
ン、クロロ１イセチン及びアクナノマイセチン；ヌクレ
オシド類及びアデノシンジホス７エート（ムＤＰ）、ア
ゾンクントリホスフェート　（ＡＴＰ）、フラビンモノ
ヌクレオチド（ＦＭＮ）　、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）　、ニコチン酸アミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ）及びその燐酸誘導体（ＮＡ
ＤＰ）　、チミジン、グアノシン及。

びアデノシンのようなヌクレオチド類；プロスタグラン
ジン類；エストロゲン類（例えば、エストＩＪ　２ｉ　
−ル、！：エストラジオール）、ステロイド類、アンド
ロゲン類、ジゴキシン、ジギトキシン、則腎皮質ステロ
イド類のようなステロイド類；フエノパルビタール、フ
ェニトイン、プリ電トン、エトサクシミド、カルバマゼ
ピン、パルプロエート、テオフィリン、カフェイン、プ
ロプラノロール、キニジン、アミトリブチリン、コルチ
ゾール、デシプラミン、シソピラミド、ドキセビン、ド
キソルビシン、ノルトリブチリン、メトトレキセート、
イはプラミン、リドカイン、プロカインアミド、Ｎ−ア
セチルプロカインアミド、アンフェタミン類、カテコー
ルアミン類及び抗ヒスタきン剤類を含む。

ｌ」［仁刈１組 本発明のこの成分は、分析対象物と特異的に又は選択的
に結合する、免疫学的に誘導される単一クローン性結合
物質ならばいかなるものでもよい。

完全分子型単一クローン性抗体の形態の場合は、抗分析
対象物は、例えば　ＩｐＧ、　　ＩｆＭ、　　１９Ｎ　
勢の全知の、免疫グロブリンクラス中のサブクラスのい
ずれかに所属してもよい。分析対象物に対する特異的結
合親和力を保持している、いかなるこのような抗体・の
、いかなるフラグメント、例えば、Ｆａｂ　、　ｊ’　
（ａｂ’）及びＦ　（、ａｂ’）１として従来知られて
いる１９Ｇのフラグメント本又用いることができる。

更に、凝集体、ポリマー及び免疫グロブリン又はフラグ
メントの複合体は、適切な場合は、抗分析対象物として
用いることができる。かかるポリ　（抗分析対象物）は
、利用しつる方法で、分析対象物に対する特異的結合親
和力を保持するように製造することができる。選択され
九又は製造され友材料が単一クローン性起源を有し、か
つ分析対象物に対する特異的結合親和力を有している限
り、他の形態の抗分析対象物を用いることができる。

本発明の抗分析対象物のための免疫グロブリン原料は、
体細胞融合法（ｓｏｍａ４ｉａ　６＠目ｈｙｄｒｌｄｌ
−ｚａ＊ｉｏｎ　Ｌａｅｈｎｉｑｕ＠ｓ　）、更に一般
には単一クローン性抗原体（＋ａｏｎｏｅｌｏｎｍｌ　
ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔ＊ａｈｎｉｑｕ＠ｍ）。

と吐ばれる方法により得られる。かかる方法は、化学的
に均一な抗体を製造するための一般的手段として、今や
周知である〔櫃説、　　Ｌｙｍｐｈａｅｙ＊・Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａｉ　、　　メルチャーズ等編、スプリンゲル
ーフエルラーク（＠ｄ、　Ｍ＠ｌｅｈ＊ｒｉ　＠ｔ　Ｉ
Ｌｌ、　Ｓｐｒｉｍｇ＠ｒ−’Ｖ＠ｒ１ｍｇ　）　　（
＝　ニー　ヨーク１９７ｇ）及びＭ＊＄ｈ＠ｄａｉｎ　
ＥｎｍｙｍＯｌｏｇｙ　７３　（パー）Ｂ）：　　３巻
４６頁（１９８Ｄを参照されたい〕。

一般的にいえば、単一クローン性抗分析対象物免疫グロ
ブリンは、かかる抗体を産生ずるリンパ球細胞を骨髄嘘
細胞と融合して、ハイブリドーマ（融合細胞、　　ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｉ）を生成し、問題の分析対象物に対す
る所望の抗体を分ｔするハイブリドーマクローンを単献
し、かつ分節された単一クローン性抗体を収穫すること
により産生ずる。１Ｎ８１８融合に用いられるリンパ球
細胞は、通常、分析対象物に対して免疫化されているマ
ウス又はラットのような動物から取り出された膵臓細胞
である。

ものであることが好ましい。

融合細胞ハイブリドーマに対して選択的な培養媒質上で
クローニング（分校系形成、　　ｃｌａｗｉｎｇ　）を
行い、所望の抗体を分泌する単離され九ハイブリドーマ
を適切な方法で測定することにより、所望の抗体を分節
する、形成されたハイプリドーマを単離する。従って、
ハイブリドーマ細胞培養物の均一性は、それらの所望の
抗体分泌について、選択されたハイプリドーマをサブク
ローニング（５ｕｂｏｌｏｎｌｎ（）することにより、
確認することが好ましい。分泌された単一クローン性抗
体の収穫は従来法により行われる。抗体の増殖社、生体
外又は生体内でのハイプリドーマの培養、例えば、ハイ
プリドーマをマウスのような動物に導入することにより
、かつ抗体の豊富な腹水液を取り出すことにより完遂さ
れる。

Ｌ 本試験においては、様々なタイプの＃識が有用であり、
要求されることは只、標識抗分析対象物の、分析対象物
との結合が、その検出可能な応答を変化させることであ
る。上述のように、螢光体及び化学発光体のような種々
の光源性標識が使用でき、標識抗分析対象物が結合する
と、それらの光発散に乱れが生じる。好ましくは、標識
応答変化の原因要素は立体障害である。次は、本方法に
用いることができる種々のタイプの標識の具体例である
が、これらに限定されるものではない。

１、　酵素基質標識 この系では、標識化抗分析対象物複合体が酵素の基質で
あり、かつ、分析対象物との標識化複合体の結合によ沙
、正又は負のいずれかの意味で、しかし通常は妨害する
形で、基質−標識化複合体への酵素の作用力が影響され
るように標識が選択される。基質−標識化複合体への酵
素の作用は、ある面において、通常は、指示反応におけ
る化学反応性のような又は例えば螢光又は光吸収（色）
等の光度特性のような化学的又は物理的面において、区
別できうる生成物を生成する。このタイプの標識は、一
般的に云えば、１９７８年４月１０日出願の係属出願第
８９４　、８３ｅ１号（英国特許明細書第１，５５２，
６０７号に相当する）；並びにムｎａｌ。

Ｃｈ＠臘、４８巻！　１９３３頁（１９７６）　、　Ａ
ｎａｌ、旧ｏｅｈ＠ｍ。

ｙｙ＠：ｔｓ頁（１９７’！　）及びＣ１ｌ！１．　Ｃ
ｈｅｗ、　２３＠　２１４０２頁（１９７７）に記載さ
れている。かかる酵素基質−標識化法においては、例え
ば、基質−抗分析対象物複合体勢の標識化複合体は、酵
素により、開裂又は変化により、影養される性質を有し
、複合体からそれ自身を判別するところの検出可能な性
質を有する生成物を生成するであろう。例えば、複合体
は試験状態下では非螢光性であるが、酵素と反応すると
螢光性生成物が生成される。

様々な螢光原性基質−標識化複合体は明らかに、かかる
技法に使用される。例えば、標識化複合体は、式： ％式％ のものであって本よい。

式中、Ｇは燐酸エステル、カルボン酸エステル、硫酸エ
ステルのような開裂可能な基又はグリコーンであり、Ｄ
は、Ｇが脱離した際、螢光性生成物を生じる螢光原性色
素部分で、例えば、Ｄはウンベリフェロン、フルオレセ
イン、ローブオン及ヒそれらの訪導体であり、Ｒは結合
基、Ａｂは、抗分析対象物であり、ｎは、抗分析対象物
の１分子当りの、例えば、ｌと５０の間の、標識の平均
数である。酵素による標識化複合体の開裂（例えば、ホ
スファターゼ、カルボキシラーゼ、サルファターゼ、グ
リコシダーゼ等による）は、複合体の抗分析対象物Ａｂ
部分への分析対象物の結合により影響される。米国特許
第４，２７９，９９２号を参照されたい。特に好ましい
基質−標識化試験法は、タイプ： の標識化複合体を用いる。　　　： 式中、Ｒ，Ａｂ及びｎは上に定義し九通りであ択それに
より、そ′の螢光により区別されうる生成物を生成する
複合体を開裂する酵素β−ガラクトシダーゼの能力は、
分析対象物との複合体の結合により妨害される。

他の有用な基質−標識化複合体は、式：％式％） の複合体であり、式中、Ｒ′は酵素により開裂されうる
結合基で、例えば、燐酸エステル、カルボン酸エステル
勢であり、　ムｂ及びｎは上の定義のとおりであり、Ｄ
は、Ｒ′の開裂の際、螢光指示薬を放出する、上記の螢
光原色翼部分である。特に打型しい方法ではタイプ： の標識化複合体を用いる。

式中、ＥＬｌは標識化成分Ａｂｔ開裂しうる燐酸エステ
ル基へ結合する一１重結合又は鎖で１）、Ｒ”は、水素
又は低級アルキル基のような置換基、例えば、メチル基
及びエチル基、Ｎ−アルキルアミド又ハＮ−（水酸基置
換低級アルキル）アミド基、例えば、ｕｌ−２〜６であ
る　−〇〇ＮＨ−（ＣＨ，）ＩＥ、−ｏｎ　　（米国特
許第４，２７３，７１５号参照）である。ウンベリフェ
ロン残基は他の、又は追加の置換基を有してもよい（Ａ
ｎａｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　　４０巻；８０３頁（ｘｅｓ８
））。

ホスホジェステラーゼによる開裂は、複合体の抗分析対
象物Ａｂ部分への分析対象物の結合により影響される。

２、補酵素標識 と・の系の柿識化複合体は、その１１１１１部分が補酵
素活性化官能基から成り、かつ、かかる補＃素の酵素反
応に関与する能力が、標識化抗分析対゛象物が分析対象
物と結合することにより影響される。

結果としておこる酵素反応の速度は、最終的に検出しう
る信号を生じる、従来の検出系により調定できる。この
タイプの標識は、１９７ｇ＄１４月１０日出鵬の係楓出
顧第８９４，８３６号（英国特許明細書第１，５５２，
６０７号に相当する）；並びに、Ａｎａｌ、旧ｏｏｈｅ
＋ｕ、　７２巻：２７１頁（１９７６）、ムｎａｌ。

Ｂｌｏｏｈ・１．７２巻：２８３真　（１９７６）及び
五１＆ｌ。

１１ｅｓｈＩ曹、　７６ＩＩｋ！Ｇ１５頁（１９７６）
　　に記載されている。

３、補欠分子族標識 この系においては、ｌＩｉ繊は、酵素の補欠分子族であ
り、かつ触媒的に不活性なアポ酵素が補欠分子族標識と
結合して活性な酵素（ホロ酵素）を生成する能力が、ｉ
ａ織化抗分析対象物複合体の分析対象物との結合によシ
影響される。結果として生じるホロ酵素の活性は、最終
的に検出可能な信号を生じる、従来の検出系により測定
できる。このタイプの標識は米国特許第４，２３８，５
６５号に記載されている。特に好ましい補欠分子族標識
化試験法では、標識としてフラビンアデニンジヌクレオ
チド（ＦＡＤ）を、かつアポ酵素としてアポグルコース
酸化酵素を用いる。結果として生じるグルコ−ス酸化Ｉ
Ｉ素の活性は、グルコース、ペルオキシダーゼ及び過酸
化水素に対して応答して色変化を生じる指示系からなる
比色検出系により測定できゐ。通切な螢光像基質を用い
て、過酸化水素の螢光検出も又可能である。

４、　酵素活性調節官能基 この系の標識化複合体は、その標識部分に、酵素阻害剤
又は酵素促進剤のような酵素活性調節官能基を有し、か
つかかる調節基標識の、酵素活性を調節する能力は、標
識化抗分析対象物と分析対象物との結合によシ影響され
る。結果として生じる酵素反応の速度は、最終的に検出
しうる信号を生じる従来の検出系により測定できる。こ
のタイプの試験系については、米国特許第４，１３４，
７９２号及び第４，２７３，８６６号に記載されている
。調節される＃累としてジヒドロ葉酸エステルリダクダ
ーゼを有するメトトレキセートを、標識として用いるこ
とが特に好ましい。標識が酵素阻害剤である場合は、酵
素と共有結合として又は非共有結合として相互反応して
本よく、かつ、例えばメ））レキセードのような小さな
分子であって屯よく、又は例えば、酵素に対する抗体の
ような大きな分子であってもよい（米国特許第４，２７
３，８６６号及１び１９８１年、７月２１日出願の係属
出願＠２８５，６０５号を参照されたい）。

この系においては、標識が酵素であり、かつ、酵素標識
の活性は標識化抗分析対象物と分析対象物との結合によ
り影響される。結果として生じる酵素活性は、最終的に
検出しうる信号、例えば、吸収又は螢光を生じる従来の
検出系によりＩｌｌ定できる。このタイプの試験系につ
いては、米国特許第３，８１７，８３７号及び第４．０
４３，８７２号に記載されている。

６、　化学的励起螢光標識 この系においては、標識は再び、螢光体である。

しかしながら、螢光体標識が螢光を発するエネルギー状
ａｔで、化学的に励起される螢光体＊＊の能力は、標識
化抗分析対象物と分析対象物との結合により影響をうけ
る。標識の化学的励起は、通常、その場で生成され丸高
エネルギー化合物に螢光標識がさらされることによシ完
遂する。このタイプの試験系については米国特許第４，
２３８，１９５号に記載されている。

７、　エピトープａｌｌ１Ｍ！ この系においては、標識は、第２の抗体即ち抗標識又は
それらのフラグメントに対するエビ）　−プ即ち抗体結
合位からなる。標識化抗分析対象物資金体中の標識に対
する抗標識の結合能力が、分析対象物とのかかる標識化
抗分析対象物の結合により影響される。いくつかの監視
法又は検出法が可能である。１つの例としてエピトープ
標識も又、抗螢光゛体との結合の際、その光発散が変化
、例えば減少する螢光体である。分析対象物に結合した
標識化抗分析対象物は、減衰する抗螢光体への螢光体標
識の接近を制限する（米国特許第３，９９８゜“９４３
号参照）。他の方法では、酵素に結合しｆ５エピトープ
標識からなる遣加の検出分子が用いられる。このエピト
ープ−酵素複合体への抗榔鐵の結合は酵素活性の阻害を
伴う。分析対象物との結合により、エピトープ標識化抗
分析対象物上の結合標識から、より多くの抗＊ｍが除外
されればされる程、゛より多くの抗標識が結合に利用さ
れかつエピトープ酵素試薬の酵素活性を阻害する（米国
特許第３，９３５，０７４号参照）。

抗分析対象物の精製及び標識 一旦、単一クローン性抗分析対象物調製物（腹水液又は
組織培養液）が得られると、実質的に免疫グロブリンの
みを含有する画分を、存在するかもしれない他の蛋白質
から分離する。かかる分離は、利用されうるいかなる方
法によって達成されてよい。打着しくは、アフィニティ
ークロマトグラフィーの手法がこの作業に適用される。

クロマトグラフィーのカラム上の親和結合相手として、
通常、所望の抗分析対象物が所属する免疫グロプリンタ
ラスに対する抗体、即ち、技工ｆＧ又はそのフラグメン
トである抗−（抗分析対象物）を用いることができる。

好ましい方法ではないが、親和結合相手として分析対象
物を用いることもできる。

好ましいアフィニティークロマトグラフィーの手法は、
蛋白質ムと通常呼ばれる物質、ＩｆＧ免疫グロブリン類
と特異的に結合する特有の性質を有する黄色ブドウ球菌
（８ｔａｐｈｙｌｓａｏｏｅｕｓ　ａｕｒｓｕｓ　）に
９７巻二８２２頁（１９６６）及びＩｍｍｕｍｏｌ　、
　１０　ｓ＠；８２８頁（１９６９））。蛋白質ムは、
アフィニティークロマトグラフィーのカラムマトリック
スとして用いるのに適切な、単離された蛋白質又はゲル
粒子に付着した蛋白質として市販されている〔蛋白質入
−セファロース、フルマシア・ファイン・ケξカルズ、
ピスカタウエイ、ニューシャーシー、アメリカ合衆国（
Ｐｒ＠ｔｏｉｎ入−８＠ｐｈａｒｏｍ＊　。

Ｐｈａｒｍａｅｉａ　　Ｆｉｎｅ　　’（’ｈａｍｉｏ
ａｌｓ　、　　　Ｐｌｓａａ口ｗａｙ　、　　Ｎ＠１１
Ｊ＠ｒｓｅｙ　、　　ＵＳＡ）　］。単一クローン調製
物から抗分析対象物を分離するために、蛋白質入を用い
ることは、本発明に有意の有益性を４たらす。分析対象
物は、それ自Ｊｌｎ製される必要もなく、抗分析対象物
全精製するために、カラムマトリックス材に付着する必
要もない。単一クローン調製物中に存在する唯一の免疫
グロブリンは、抗分析対象物なので、免疫グロブリン類
を分離する手法を適用しさえすればよく、かつ抗分析対
象物のみが分離されることが保証される。

精製された抗分析対象物調製物は、次に、所望の特定の
検出系に従って標識される。上述のように、ＩＩ識は、
利用されうるいかなる方法によっても、抗分析対象物に
結合される。精製抗分析対象物調製物中に実質的に存在
する唯一の蛋白質は抗分析対象物であるので、標識物質
と一般の蛋白質問に共有結合を形成する条件下の反応に
より、Ｓ＊物質は効率よくかつ特異的にその中の抗分析
対象物に付着させることができる。蛋白質類を非特異的
に標識する懸念なしに、抗分析対象物を標識する丸めに
標準蛋白質修飾反応を使用できることが、本発明の更に
もう１つの重要な利点である。

従来の標識複合体のように１標繊は標識されるべき成分
、ここでは分析対象物に、化学的結合、例えば−重結合
により；又は、主に炭素並びに窒素、酸素、燐、硫黄か
ら選択されたベテロ原子からなる１〜５０＠（１）原子
、更に通常には１〜３０個の！子、普通には１〜２０個
の原子からなる鎖によｐ共有結合で結ばれる。従来の連
結基（’ｌｉｎｋｌｎｇｇｒｏｕｐｓ　）　ｔｉｔ文献
に絆細に記載されている。例えば、米国籍杵第４，２３
０，７９７号；第４，２７９，９９２号；第３，８１７
，８３７号；第３，９３５．０７４号及び第３．９９６
，３４５号を参照されたい。蛋白質への結合用のｍ識；
及び／又は標識又は標識誘導体を蛋白質性抗分析対象物
へ連結するのに用い九二官能性結合試薬の残基；に空間
を与え及び／又は機能性を与える目的のために連結基は
、標識上に載置される側腕基からなることもできる。

本［１ｍｍ化分析対象物複合体は、通常、アミノ基又は
カルボキシル基含有の＊＊又は標識誘導体と抗分析対象
物蛋白質中の相当するカルボキシル基又はアミノ基との
間にペプチド又はア５ド結合を形成することにより製造
される。かかる縮合反応は、カルボジイミド反応［５１
１１１＠ＩＩ・・　１４４巻；１３４４頁（１９７４）
］、混合無水物反応〔エルランガー等、免疫学及び免疫
化学における方法、ウィリアムス及びチェイス―、アカ
デミツクプレス（Ｅｒｌａｎｇｅｒ　　ａｔ　　ａｌ　
　、　　Ｍ＠亀ｈ＠ｄｓ　　１！ｌ　　Ｉｍｍｕｍｓｌ
ｏｇｙ　　ｍｉｌｄＩｍ＋ｕｕｎｏｅｈｓｍｉａｔｒｙ
　、　　ａｄ、Ｗｉｌｌｉａｍａ　ａｎｄ　Ｃｈａａ＊
　。

Ａｅａｄｓｍｉａ　Ｐｒｅｓｓ　）　　にニーヨーク　
１９６７）　１４９負〕、並びに酸アジド及び活性エス
テル反応〔コツプル、ペプチド及びアンノ酸、ダブリュ
ー・ニー・ベンジャミン、インフーポレーテツト（Ｋ＠
ｐｐｌｓ　、　　Ｐ＠ｐｔｉｄ＊ｓ　　ａｎｄ　　Ａｗ
ｉｎＯＡａｌｄｓ　、　　Ｗ、　　Ａ。

Ｂ壷ｎｊａｍ１ｍ　、　　■ＩＩｓ、）　（＝　ｚ−ヨ
ーク１９６６））のような従来のペプチド結合形成反応
により遂行することができる。概論としては、Ｃｌ１ｎ
、　Ｃｈ＠ｗ、　２　ｇ巻エフ２６頁（１９７ａ）　　
も参照されたい。

他の周知の方法も又、抗分析対象物への標識又はそれら
の誘導体の結合に利用することができる。

特に１カルボン酸基又はアミノ基を含有する標識又はそ
の誘導体を、抗分析対象物中のアミノ基へ結合するため
に、従来の二官能性結合剤を用いることができる。例え
ば、ビスイソシアネート類、ビスイミドエステル類及び
グルタルアルデヒドのようなアミン−アミン結合剤、Ｃ
Ｉｍｍｕｎ＊＠ｈ＊ｍ。

６巻；５３頁（１９６９））を用いることができる。

又、アミンをカルボン酸に結合する際、架橋基（ｂｒｉ
ｄｇｅ　ｇｒｏｕｐ　）を挿入するＫは、適切な結合反
応が周知である。このタイプの結合反応は、文献、例え
ば上述のコツプル（Ｋ＠ＰＰＩりの研究論文及びロー及
びディーン、アフィニティークロマトグラフィ、ジョン
・ワイリー及びサンズ（Ｌｏｗ・。

＆　Ｄ＠ａｍ　、　　Ａｆ目ｎ１ｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、　　ＪｅｈｍＷｉｌｓｙ＆５ｏｎｓ）
　　にニーＢ−り１９７４）において十分に検討されて
いる。本発明を限定するものではないが、上述の引用例
、ミーンズ及びフィーニー、蛋白質の化学変性、ホール
デンーディ（Ｍ・ａｓｓ　ａｎｄＦｅ＠ｎ＠ｙ　、　　
Ｃｈ＊ｍ１ａａｌ　Ｍｏｄｉｆｉ４ａｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ｐｒ５ｔ＊Ｓ＋ａｍ。

）ｔｏｌｄ・ｏ−Ｄａｙ）（サンフランシスコ１９７１
）：及びグレーザー等、蛋白質の化学費性、エル七ビア
（Ｇｌａｍｏｒ　ｏ＆ｍｌ、　Ｃｈ＠ｍ１ｏａｌ　Ｍ＠
ｄ１ｆｌｅａＬｉ＠ｍ　＠ｔＰｒａｔｅｉｎＩ、　Ｅｌ
ｓａｖｌ＊ｒ　）　（＝　ニー　ｗ−り１９７５）をは
じめとする蛋白質変性に関する文献に記載されているよ
うな抗分析対象物蛋白質構造中の種々の他の官能基へ、
標識又は標識銹導体を結合させるためには、勿論、多く
の他の方法が利用できる。

パックグラウンド信号をおこす槍臓化不活性抗分析対象
物を生成することがないように１分析対象物を変性させ
ない操作法を選択するよう適切な注意を払うべきである
。

１以上の棒鐵を、個々の分析対象物分子に付着すること
ができるし、標識の性質が許すならば、逆も又同じであ
る。普通、抗分析対象物は、抗分析対象物１分子当り１
と３０の間の、更に通常には１と２０の間の数の標識を
有する。感度を高めるために、抗分析対象物当り複数個
の標識を有することが望ましいが、標識濃度が高すぎる
と、抗分析対象物の分析対象物への効果的な結合能力に
影響を与える。標識が、酵素のように比較的大きくかつ
多価である場合は、複数個の抗分析対象物が単一の機織
に付着してもよい。単−標識化抗分析対象物複合体が、
複数個の分析対象物分子と結合し、その各々が順に標識
化抗分析対象物と結合することができるために、格子形
成を導くことになり、標識で、又はその近傍で、相互作
用、例えば立体障害を増す結果となる。

反応混合液及び条件 試験されるべき試験試料は、分析対象物を含有すると思
われる自然に存在する液体又は人工的に生成した液体で
もよく、かつ通常は、生物学的液体又はその希釈液であ
る。試験可能な生物学的液体としては、血清、プラズマ
、尿、唾液、乳汁、並びに羊腺液及び脳背髄液を挙げｂ
ことができる。

結合反応は、はとんどすべての場合、穏やかな条件下で
進行させる。反応混合液は、一般に、少量存在する所望
の有機性共存溶媒を含む水性媒質であろう。反応温度は
、装置期間及び測定段階を通して、正常墳境中で一定値
を保持する。温度は、通常、５と５０℃の間であり、更
に普通ＫＨ１２０と４０℃の間である。好ましくは、反
応社室温で進行する。反応混合液のｐＨは、５と１０の
間で変動し、更に普通には、６と９の間である。種々の
試薬の濃度は、試験媒質中の予想される分析対象物濃度
によって左右され、かかる濃度は、通常、１０　と１０
　　Ｍの間である。先に述べ九反応パラメーターの場合
のように選択は主に、鮭験的に引き出された、好適例に
対してバランスのとれた最適条件及び日常的な（ルーチ
ンの）試験を最終的に行う技能者の要求に基づいて行わ
れる。従って、パラメーターのいずれも、本発明に対し
決定的な性質ではなく、むしろそれらはすべて従来の普
通の技法内のものである。

試薬系 本発明の試薬系、即ち試薬配合は、本発明により包含さ
れる所望の試験方法を行うのに必要とされるすべての必
須の化学的な要素からなる。試薬は、箱詰め状の市販品
の形で、試薬間での両立ができる範囲で組成物もしくは
混合物として；試験具の形で；又は、試験キット、即ち
、必要な試薬を保管する１個以上の容器の箱詰め組合わ
せとして提供される。試薬系には、所望の結合反応系に
適切な試薬が含まれるが、常に、先に定義した標識化抗
分析対象物複合体を必要とする。かかる結合反応試薬は
、標識化複合体に加えて、包含される特異的試験法を遂
行するのに必要な又は任意に選ばれる、他のいかなる試
薬を含有してもよい。

勿論、この試薬系は、当業者に公知の、かつ、緩衝液、
柿釈剤、榛早液婢のような商業上及びユーザーの立場か
ら望ましい他の物質を含有してもよい。試薬系及びそれ
らを包含せしめた固体状の担体柱からなる試験具も又好
ましい。かかる試験具の種々の形態は、１９８０年１０
月３０日出願の米国特許出願第２０２，３７８号に記載
されている。

次に、本発明を次の実施例により説明するが、本発明は
これによって制限されるものではない。

実九例１ ヒトのＩ、Ｇの測定 Ａ、ヒトのＩ、Ｇに対する単一クローｙ％抗体の精製ヒ
トのＩｆＧに対する単一クローン性抗体を含有するネズ
ミの腹水（Ｆｅ特異性；ペセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ、ロックヴイレ、マリ−ランド、アメリカ合衆国
（Ｂｓｔｈ＊ｓｄａ　Ｒｅａｅａｅｈ　Ｌａｂｏｒａ−
１ｏｒｊｅａ　、　　Ｒｏｏｋｖｉｌｌｅ　、　　Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ　ＵＳＡ）を、ヒトＩｆＧ−セファロース
又は黄色ブドウ球菌蛋白質ムーセフ了ｏ　−ｙ、　（８
ｔａｐｈｙｌｏｅｏｅ＠ａｌ　Ｐｒ＠＄＊ｉｍ　Ａ　−
８＊ｐｈａｒｏｓ・）のいずれかを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーによりｎｍ□した。

（リ　　ヒト１９Ｇ−セファロースの製゛造ヒトのＩｔ
Ｇ−セファロースを次のように製造した。セファロース
４Ｂ〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ビスカタ
ウエイ、ニューシャーシー、アメリカ合衆国（Ｐｈａｒ
ｍａｅｉａ　Ｆｌｕｓ　Ｃｈ＊ｍ１ｅａｌａ。

ＰｔｓｓａＬａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊ＠ｒｓｅｙ、　Ｕ
８Ａ）　］を、蒸溜水を洗浄し、１晩４℃で保管した。

セファロースを粗ガラスフリット−Ｅに収集しかつゲル
中にひび割れが現われる壕で徐々に渇水する。この渇水
されたセファロース４Ｂを計量し、その２０ｆを、２０
ミリリツトル（−）の冷水及び磁気撹拌棒を有するプラ
スチック製ビーカーに入れる。このビー“カーを、磁気
攪拌器上の氷の入つ九ガラス製結晶化皿中に載置する。

−電極及び温度針を挿入し、１ＯＮ水酸化ナトリウム（
ＮａＯＨ）の１滴で、−を−１１，５に調整し、次に、
粉砕したばかりの臭化シアン（ＣＮＢｒ）　８　Ｆを添
加した。１　ＯＮ　ＮａＯＨｔ−滴加して−をｐｔｌ　
１１．０−１１．５に保持し、かつ氷砕片を加えて温度
を５〜１０℃に保持した。１７分後、ゲルを粗ガラスフ
リット主に傾瀉して反応を終了した。

いくらかの未反応ＣＮＢ　ｒがビーカーに残溜し友。

ゲルを、１０容量（２００ｓ＋ｊ）の冷然溜水で、次い
で０．１　Ｍ炭酸ナトリウム（ｍ　９．０　＞で洗浄し
九。ゲルを、ひび割れが現われるまで徐々に渇水し、次
に１２５１ｎｔの三角フラスコに移した。ヒト。

のＩｙＧ　（１５０Ｗ、リサーチ・プロダクツ・デイヴ
イジョン、マイルス・ラボラトリーズ、インコーホレー
テッド、エルクハート、インヂアナ、アメリカ合衆国（
Ｒｓｓ＠ａｅｈ　Ｐｒｏｄｕｅｔｉ　Ｄｉｖｉｓｉｅ＋
ａ。

Ｍｌｌｅａ　ＬａＬ＋ｏｒａＬｏｒｉｓｓ、　Ｉ！ｌ。

、、　Ｉｌｋｈｍｙｔ、　ＩｍｄｉｓｍａＵＳＡ）を、
更に５−の炭酸塩緩衝液を用いてすすぎながら添加した
。混合液をシーソーミキサー（ｓｅｅ−ａａｗ　ｍ１ｘ
ｅｒ　）上の冷所に載置した。９６時間後、ゲルを粗ガ
ラスフリット上に傾瀉し、かつ１０−の冷然溜水ですす
いだ。Ｆ液は、差異により１１％の程度を測定する、後
の分析のために貯蔵した。ゲルを５０−の０．２Ｍエタ
ノールアミン−ｈ＋ｃｔ　（−８，０）中に再び懸濁し
、シーソーミキサー上で４℃３０分温置し装。最後にゲ
ルを粗ガラスフリット上に傾瀉し、１ｔの水、次いで、
２０ｍＭ　ハイシン［Ｎ、Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン］　（ｐＨ８，２）　、Ｑ、１Ｍグリ
シン−ＨＣｔ　（…３０）及び２０ｍＭバイシン（４１
１，２）を用いて洗浄した。

（２）ヒトＩｆＧ−セファロースを用いる精製ヒ）Ｉｆ
ＧＫ対する単一クローン性抗体を含有するネズｉの腹水
を、使用に先立って、−２０℃で凍結貯蔵した。腹水液
を、２０ｍＭバイシン（−８，２）で平衡化し九３＋ｄ
（ＩＩｙＲＸ３．８画）のヒトＩＦＧ−セファロースカ
ラムに直接に施した。カラムを１５−の２０　ｍＭパイ
シン（ｇ１８．２）で洗浄した。カラムを２０ｍＭバイ
シン（ｐｔｌ８．２）１５−で、次いで、０１Ｍ塩化ナ
トリウム（ＮａＣ１）を含有する２　０　ｍＭバイシン
（ｐＨ８，２）Ｉｓ−で、最後に２０ｍＭバイシン（…
８．２）１５−で洗浄した。抗体を、０．１　Ｍグリシ
７−１（ＣｔＩ　５ｍｇ　（ｐＨ２，５）、続いて０．
１　Ｍグリシ７−　ＥＩＣｌ　１５ｍｇ　（ｐＨ２，５
）、２Ｏ−ｐ−ジオキサンでカラムより溶出した。低−
溶出液を受容した試験管に１Ｍパイシン（−８，５）１
００マイクロリツトル（ｓＬ）を加えて、友だちに、−
を高めた。溶出液の、２８０ナノメートル（１１ｍ）に
おける吸光度（Ａ、。）を監視し、抗体を含有する画分
をひとまとめにし、かつＭｉｌｌ＋−ｐｅｒ・（ミリボ
ア）ＣＸ−ＩＱ浸浸漬超超過装置（Ｉｍｍｅｒｉｉｂｌ
ｅ　ｕＨｒａｆｉｌＬｒａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｓｅ　）
　　（分子量削除　ｉｏ、ｏｏｏドルトン以下；ミリボ
ア・コーポレーション、ベッドフォード、マサチュセツ
ツ、アメリカ合衆国（Ｍｉｌｌｌｐｏｒ＠Ｃｏｒｐ、、
　　Ｂ＠ｄｆ＠ｒｄ。

ＭａｇｓａｏｈｕｉｅＬＬｓ、　ＵＳＡ　）を用いて、
〜１ｗＩｔマで濃縮した。

濃縮された抗体溶液を、セファデックスＧ−２５〔ファ
イン；シアＡ／　−ｑ　シア（ｆｉｎ＠：　Ｐｈａｒｍ
ａｏｉａ））の８０ｍ　（１，５ｏ＋＋Ｘ　４５１？Ｉ
ＩＩ）カラムに施し、グリシンを除去した。抗体を含有
する画分をＭｉｌｌｉｐｏｒ・ＣＸ−１０装置を用いて
濃縮し九。

（３）ｆｆｉ白質入−セファロースを用いる精製使用に
先立ち一２０℃で貯蔵された腹水液（ｌ−）を、室温で
、０．０４％アジ化ナトリウムを含有する２０ｍＭバイ
シン（＄８．２）で平衡化した蛋白質入−セファロース
−４〒、〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈ
ａｒｍａａｉａ　Ｆｌａ＠Ｃｈ＠ｍｉｅａ１ｍ）〕　の
４　ｗＬｔ、　（１α×５１）カラムに施した。カラム
をこのバイシン緩衝液１５−を用いて、次いで０、１　
Ｍ　ＮａＣ１を含有する同様のパイシン緩衝液１５−を
用いて、次にＮａＣＬを含まないパイシン緩衝液１５−
を用いて洗浄した。抗体は、０．１　Ｍグリシン−ＨＣ
１緩衝液（−３，０）でカラムを洗浄することにより溶
出した。この酸性溶出液を受容した試験管に１Ｍバイシ
ン（ｐ！（８，５）１００＃ｔを加えて、友だちに−を
高めた。最後に、カラムをバイシン緩衝液１３−で洗浄
し、カラム管再び−８，２に戻し九。１０〇−滴画分の
Ａ１．。を監視し、かつ抗体を含有する画分をひとまと
めにし、Ｍｉｌｌｉｐ＠ｒ・（ミリボア）ＣＸ−１０浸
漬型超ろ過装置を用いて、〜１ｓＪｔで濃縮した。

濃縮され九抗体溶液をセファデックスＧ２５（微ＩＩＩ
）のクロマトグラフィーにかけてグリシンを除去した。

抗体溶液（〜１−）を室温で、０，０４−アジ化ナトリ
ウムを含有する２　０　ｒｍＭパイシン（ｐＨ８，２）
で平衡化、し九〇〇−（１，５備Ｘ４Ｓ国）セファデッ
クスＧ−２５（微細）カラムに施した。

１０〇−滴画分のＡ□０を監視しかつ抗体を含有する画
分をひとまとめＫＬ、前と同様に、２−１で濃縮した。

Ｂ、ｌｊｌ製単−クローン性抗体の標識化精製巣−クロ
ーン性抗体調製物（Ｌ　８　＊／ｄ）を、同一官能基の
二官能性（ｈ＠ｍｏｂｉｆｍｎ＠ｔｌｅ＊ｓａｌ　）架
橋剤ジメチルアジピミデー）　（ＤＭＡ）を用いて、β
−ガラクトシル−ウンベリフェロンでＩＩＩＩした。

Ｎ−６（６−−アミノヘキシル）−７−β−ガラクトシ
ルクマリン−３−カルボキサミド（ＡＭ−ＧＵ）（米国
特許第４，２５９，２３３号）１０マイクロモル（μｍ
ｏｌ　）　（５ｍｇ）を水２００−に溶解し、１Ｍトリ
エチルアンモニウム炭酸水素塩（ｍ９．６）（Ｔｌｉ：
ｘＢ）に溶解した、当モル量のＤＭＡ（１０ａｓ＠１２
．５〜）と混合した。黄色溶液を、室温で５分間ｍａｌ
、、次いで、１ｍ（２，８１１９）の抗体２０ｍＭパイ
シン（ｐＨ８，２）溶液を添加し、かつ反応混合物を室
温で６０分開基装し九。１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐ）
１９．６）２００μｔを添加して反応を終了させた。溶
液を蛋白質入−セファロースカラ五に施こし、本実施例
のＡ（３）で先に述べたと同様に、標識抗体を琳離した
。

３４３　ａｒｔｓにおける吸光度（Ａ１４Ｂ）を試験し
て、存在するＡ　Ｈ−ＧＵ基を定量しく　ｇ：：：＝２
１）　：過剰のβ−ガラクトシダーゼでの処理を採用し
て、ｊ００１１１１！ｌにおける吸光度（Ａ、。。）を
試験して、酵素に接近しゃすいＡ）ｉ−ＧＵ基を測定し
；かつ加水分解されたＧＵ−抗体複合体の螢光を試験し
て、減衰の１ｉ度を測定することにより、標識抗体の特
性を確認した。

Ｃ０試験方法 （１）試験反応へ及ぼすポリエチレングリコールの影響 一定量（５０μ／−，０，０１３ム８１．単位）のＧＵ
−抗Ｉ、Ｇを、６ｑｂポリエチレングリコール６０００
［シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ｉ
ズリ−、アメリカ合衆国（８ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｌａａ
ｌ　Ｃｏ、、　　Ｓｔ。

Ｌ＠ｍｉｓ、　Ｍｌｓｓ＊ｕｒｉ、　ＵＳＡ）〕　を含
有するものと含有しないもののいずれかの２ＱｍＭバイ
シン（ｐＨ８，２）１．２５−及びｓｋの量（Ｏ〜２０
０μｔ）の正常なヒ）　Ｉ、Ｇ　（２ｑ／＋＋＋／）を
含有するキュベツトに取った。仔ウシの血清アルブミン
（ＢＳム）で補償することにより、蛋白質濃度を保持し
た。反応混合液を室温で１５分間温湿し、次いで０，６
１単位／−のβ−ガラクトシダーゼ１０μｔを添加した
。

更に１０分及び２０分室温で混合後、螢光（励起４００
ｎｍ、発光−４５０ｎｍ）を読み取った。空試験は、β
−ガラクトシダーゼを受容していないが、他はすべて同
じである。

（２）　　Ｉ、Ａ及びＩ、Ｍの存在下でのＩ、Ｇ試験６
％ポリエチレングリコール６０００を含有する２ＱｍＭ
パイシン（ｍ８．２）１．４５−及び種々の量のヒトＩ
、Ｇ　（又はＩ、Ａ又はＩ、Ｍ）　　（蛋白質濃度社、
ＢＳＡを用いて減少したＩｆ濃度を補償することにより
保持した）に、一定量（５０μＡ、０．０１３ム１．。

単位）のＩ、Ｇに対する標識抗体を添加した。反応混合
液を室温で１５分間温湿し、次いで！−ガラクトシダー
ゼ（０，６１／Ｉｌ）　１０μｔを添加した。混合後、
反応混合液を２０分間２度目の湿量を行い、次に、上述
のように螢光を読み取った。

Ｄ、結果 榛＊巣−クローン性抗体調製物は、抗体１分子した。標
識を過剰のβ−ガラクトシダーゼと共に湿量すると、抗
体１モル当ｆｉ　０．６１の置換基（４５ｓ）が加水分
解され、かつ抗体１モル当ｊｉ）０．０６の置換基（加
水分解された基の９８−）が螢光によシ検出された。ヒ
）　Ｉ、Ｇの濃度増加による、標識抗体の加水分解阻害
に及ぼすポリエチレングリコール６０００の影響をｔｓ
２図に示す。　ポリエチレングリコール酸１０〜２０−
だけ阻害を増進する。Ｉ、Ｇ、　　Ｉ、Ｍ及びＩ、Ａ　
にょるＧＵ−抗Ｉ、Ｇの加水分解の阻害については、第
２図及び絡３図に示す。’Ｉ、Ｇ　（０，０６Ｉ、Ｇ／
抗体）３．８μｔにより、ＧＵ−抗Ｉ、Ｇの阻害は５０
チに達した。■−による交叉反応性（ａｒｏｓｅ−ｒ＠
ａｅ４ｉｖｌｔｙ　）　　（２０９１阻害における）は
１５チであｆｉ、Ｉ、Ａによるものは１６．４−であっ
た。

このデータにより、Ｉ、Ｇ試験が本発明方法により遂行
できることが確証され九。実質的に１非特異性標識蛋白
質を含まない標識単一クローン分析Ｉ、Ｇ調製物より発
生する検出可能な信号は、分析対象物（Ｉ、Ｇ）と結合
すると測定可能に変化する。

実施例２ ゲンタマイシンの測定 Ａ、ゲンタマイシンに対する単一クローン性抗体の精製 ゲンタマイシンに対する単一クローン性抗体を含有する
ネズミの腹水〔スクリップスーマイルス。

インコーホレーテッド、ラジｌう、カリフォルニア、ア
メリカ合衆国（Ｓａｒｌｐｐｍ　−Ｍｉｌｅｓ、　Ｉｎ
ｎ、。

ＬａＪｏｌｌｍ、　（：ｍ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ
）　：Ｉを、実施例ＩＫ述べた方法で、蛋白質−Ａ−セ
ファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。

Ｂ、梢裂単−クローン性抗体の標識化 ＡＨ−ＧＵ、上述、（５ｑ、　　１０４ｍ＠ｌ）を水２
００μｔに溶解した。　ジメチルアジピミデート（５ｑ
。

２０μｍｏ１．）を、１Ｍトリエチルアンモニウム炭酸
水素塩（ＴｇＡＢ）　（ｐＨ９，６）に溶解し、この溶
液１００μｔをＡ）ｌ−ＧＵ溶液１００μｔ　と共に室
温で約５分間湿量し丸。抗体溶液〔２−、ローリ−法（
ｔｈ＠Ｌ＠ｗｒｙ　ｍ＠ｔｈ＠ｄ　）、　　Ｊ、　　Ｂ
ｉｏｌ、　　Ｃｈ＠ｍ、　　１９３巻；２６５頁（１９
５１）により測定したものとして２．４キ蛋白質〕を次
に添加し、かつ反応混合液を室温て約１時間湿量した。

この際、１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９，６）　１０
０＃ｔを添加して、反応を停止し友。黄色溶液を蛋白質
入−セファロースカラムに施こし、ゲンタマイシンに対
するＧＵ−標識抗体を上述のように単離した。Ａ、４．
を測定して、存在するＧＵ［ｌｌ換基濃度を決定しくｌ
　　＝２１）：β−ガ０ ラクトシダーゼを用いて加水分解を行ってム。。

をｍ定して、いくつのＧＵ置換基が加水分解されるかを
決定しくｇ　　＝ｘ３５）；螢光を測定して、加００ 水分解されたＧＵ置換基のいくつが減衰されるかを決定
して、ＧＵ−抗体の特性を確認した。

Ｃ，ゲンタマイシン−巨大分子複合体の製造仔ウシの血
清アルブミン（ＢＳＡ、３００ｑ）を水１．１５−にＳ
解し九。一定量（１，０＋ｄ）を、必要に応じて２Ｎ塩
酸（ＨＣｌ　）又は２Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）
の添加により、約４．５に調整された−を有するゲンタ
マイシン硫酸塩〔シュアリング・、コーポレーション、
フルームフィールト、ニューシャーシー、アメリカ合衆
国（Ｓ＠ｈ＠ｒ　ｌｎｇ　Ｃｏｒｐｔ。

Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌへ　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　ＵＳ
Ａ）〕の水溶液２−に添加し九。混合液の−は同様に４
．５に調整した水を添加して、最終容量を約８−とじ、
−を再び４．５に調整した。氷浴槽中で１５分間冷却後
、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩〔ピアス・ケミｆｙ　ル・−ｂ７パ
ニー、ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国（Ｐ
ｉ＠ｒａ＊　Ｃｈｓｍｉｏｍｌ　Ｃｏ、、　　Ｒｏａｋ
ｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉｎ＠１４、ＵＳＡ）３６００■を
この溶液に添加し、氷浴槽中で２時間攪拌した。４℃で
一晩湿量後、溶液を室温になるまで放置し、次に、５０
ｍＭパイシン−０、１チアジド（ｐＨ８，５）で平衡化
し九〇−２５（微細）セファデックス〔ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｏｉａ　Ｆｉｎｅ
　Ｃｂ＠ｍｉａａ１ｍ　）　）のカラム（２，５Ｘ５５
ｃＭ）に施こした。７ミリリツトルの画分を収集し、ニ
ンヒ゛、ドリン反応に対する正応答及び２８０　ａｍに
おける吸光度により　Ｂ８ムーゲンタマインン複合体の
存在について試験した。

ｌｌ５Ａ−ゲンタマイシンを含有する画分をひとまとめ
にした。

０、試験方法 標識単一クローン性抗体（１０μｔ、　Ｏ，０Ｏ１４Ａ
、、。

単位）を、θ〜８０μｆのゲンタマイシン−ＢＡＡ又は
θ〜８０μＶのゲンタマイシン−Ｂ８ム及び０．６μｆ
の遊−ゲンタマイシンを含有する２０ｍＭノ；イシン（
−８４）１．４８−に添加した。反応混合液を室温で１
５分間温湿し、次に、０．６１　Ｕ／／ｌβ−ガラクト
シダーゼ１０μｔを添加しく空試験以外）、反応混合液
を更に２０分間温湿した後、螢光を読み礒つ九。

Ｅ、結果 標識化単一クローン性抗体調製物は、抗体１分子蟲り０
９７のＡＨ−ＧＵ置換基を有することが判明した。標識
を過剰の！−ガラクトシダーゼと共に湿量すると、抗体
１分子轟り僅か０．２２の置換基（２３１６）が加水分
解され、抗体１分子幽り０．０２３の置換基（加水分解
された基の１０チ）が螢光により検出された。ゲンタマ
イシン−ＢＡＡによるＧＵ−抗ゲンタマイシンの加水分
解に対する阻害及び遊離のゲンタマイシンによる阻害の
緩和について、第５図に示す。

このデータにより、ゲンタマイシン試験が本発明の方法
により遂行できることが確証された。実質的に、非特異
性標識化蛋白質を含まないｓｌＩ化単−クローン分析ゲ
ンタマイシン抗体調製物により発生する検出可能な信号
は、ゲンタｉイシンー巨大分子複合体と結合すると測定
可能に変化する。

かかる各・号変化は、ゲンタマイシンの存在により緩和
される。

実施例３ ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定 Ａ、標識化単一クローン性抗体の製造 ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対する単一クロ
ーン性抗体を含有するネズｉの腹水液をメロイ・ラボラ
トリーズ、インコーホレーテッド。

スプリングフィールド、ヴアージニア（Ｍ＠１ａｙＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｓａ、　Ｉｎｅ、、　　Ｓｐｒｉｎｇ
ｆｉ＠ｌｄ、　Ｖム、）より購買した。蛋白質入−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂ　［ファルマシア・ファイン・ケ之
カルズ（ＰｈａｒｍａａｌａＦｌｌｌ＠Ｃｈ＠ｍ！ｏａ
１ｍ　）　）を用いるクロマトグラフィにより、続いて
セファデックスＧ−２５を用いるクロマトグラフィによ
り、抗体を精製した。

精製された単一クローン性抗体を、前述の実施例１にお
けるように、ＤＭムを用いてムＨ−ＧＵ　で標識し友。

標識化抗体は、吸光度β−ガラクトシダーゼによる加水
分解及び螢光に関して特性を確認し九。これらの分析は
、標識化抗′体が抗体１分子当り０．７９のムＨ−ＧＵ
標識を有し；抗体１分子轟りかかる標識の０．３２が！
−ガラクトシダーゼにより加水分解され；かつ抗体１分
子当り０．１４の加水分解された残基が螢光により検出
されることを示唆し友。

Ｂ、試験方法 一定量（２０ｆｉｔ、　　０．００２０Ｄ、、ｓ単位）
の標識化単一クローン分析ｈＣＧ抗体を、０．１％Ｂ８
Ａを含む２０ｍＭパイシン緩衝液（ｐＨ８，２）１．４
２−及び種々の濃度のｈＣＧ　［ルーセル・コーホレー
テッド　＝　ｚ　−５３−り、ニューヨーク（Ｒｅｕｓ
ｉ＊Ｉ　Ｃａｒｐ。

、Ｎ・ｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）より入手〕に添加した。

溶液を室温で１５分間温湿し、次に、２０−バイシン（
−８２）に溶解し九β−ガラクトシダーゼ（０，６１Ｕ
／ｓｇ）１０μｔをそれぞれに添加した。空試験は酵素
以外のすべての成分を含有した。室温で更に２０分間湛
置後、螢光を読み取った。

Ｃ０結果 結果を下記のＡ表に示す。

Ａ表 ０　　　　　　　　　　　３．１ ３１３　　２．８ ６２６　　２．５ ９３９　　２．１ １５６５　　１．５ データは、ｈＣＧ試験が、本方法により遂行できること
を示している。ｈＣＧ濃度□め、増加が、＃嵩β−ガラ
クトシダーゼによる標識化抗ｈＣＧ抗体の開鋏からの螢
光の発生を減少させる。

ヒトエ、ム１の測定 Ａ、　＄ｌ識化単−クローン性抗体の製造精製された、
と）　Ｉ、Ａ、に対するネズミの単一クローン性抗体を
、ペクチン・ディキンソン、サニーヴエール、シーニー
（Ｂｅｅｔｌｅ　Ｄｉｓｋｌｍｓｏｎ。

ｓｕｌ＋！１ｙマａｌｅ、　Ｃム）より購買し九。抗体
を安定化するために用いられ九ゼラチンを蛋白質入−セ
ファロースＣＬ−４Ｂを用いたアフィニテ゛イークロマ
トグラフィーによシ、続いてセファデックスＧ−２５を
用い九クロマトグラフィーにより除去した。

精製され九単−クローン性抗体を、上述の実施例１のよ
うにＤＭムを用いてムＨ−ＧＵでｍ識し九標識化抗体を
実施例３のように分析し、抗体１分子尚り２．１５のＡ
Ｈ−ＧＵＩＩＩＩＩを有することが！１１明し、かつ、
抗体１分子尚り０．０９５の加水分解残基が螢光により
検出された。

Ｂ、試験方法 一定量（５０ｔｔＬ、　　０．００１５０Ｄｊ４．単位
）の標識化ｊｌＬ−クローン分析ヒ）　Ｉ、Ａ、抗体を
、６−ポリエチレングリコール５ｏｏｏ及び種々の濃度
の、正常なヒトのプラズマのコーエ７　画分（Ｃ＠ｈ＠
ｎ　Ｆｒａ　−ａｔｉｏｎ）ｌの精製から得られたヒト
夏、ム１を含有する２０ｍＭバイシン緩衝液（ｐＨ８，
２）　１．２２ｉｓｄｋ添加した（＊白質濃度は、減少
したＩ、Ａ、濃度をＢＳＡで補償することにより保持し
た）。溶液を室温で１５分間温湿量、次に、２０ｍＭ０
ｍＭパイシン（ｐＨ８，２）に溶解し九〇、６１Ｕ／−
β−ガラクトシダーゼ１０μｔをそれぞれに添加した。

空試験は酵素以外のすべての成分を含有し九。室温で１
Ｋ２０分間潟置後、螢光を読み取った。

Ｃ９結果 結果を下記のＢ表に示す。

Ｂ表 ０　　１３．９ １００　　１２．１ ２００　　１１．９ ４００　　　　　　　　　　１０．９ データは、Ｉｆム１試験が、本方法により遂行できるこ
とを示した。Ｉ、Ａ、１１度の増加が、酵素β−ガラク
トシダーゼによる標識化抗Ｉ、Ａ、抗体の開裂からの螢
光の発生を減少させる。

【図面の簡単な説明】

第１図（り及び（璽）は、それぞれ、競争的結合に基づ
く、分析対象物標識複合体を要する従来の蒙争的結合均
−系免疫試験及び標識化抗分析対象物を用いる、本発明
の均一系免疫試験を表わし、各々の原理を比較し九図で
ある。 第２〜４図は、本発明により、ヒ）Ｉ、Ｇの測定につい
ての、実施例１において報告した結果をグラフに表わし
たものである。尚、第２図においてム（−一）はポリエ
チレングリコールを用い九もの、Ｂ　（−ｅ−）はポリ
エチレングリコールを用いないものを表わす。 第５図は、本発明による、ゲンタマイシンの測定につい
ての、実施例２において報告した結果をグラフに表わし
たものである。尚、Ａ　（−・−）Ｆｉゲンタマイシン
０．６μＶを用いた場合であり、Ｂ（−〇−）はゲンタ
マイシンを用いない場合であゐ。 Ａｎ　＋　Ａｎ’　Ｊｐ　ＡｎＴｉ−Ａｎ（Ａｎ”：　
Ａｎｔｉ−Ａｎ）＋（Ａｎ：ＡｎＴｉ−Ａｎ）◆Ａ♂【
変調信号〕　　　　　　〔信号〕 ■。 Ａｎ÷Ａｎ會１−Ａｎ” （Ａｎ：ＡｎＴｉ−Ａｎ’）◆Ａｎｔｉ−Ａｎ”〔変調
４を号〕　　　　　〔イ！欄シ　〕ＦＩＧ、　ｊ ＦＩＧ、２ ０　　　　　　５　　　　　　１０　　　　　　１５　
　　　　　２０１試験当シのＩｇＧ量又はＩｔｉＭ量（
吐）ＦＩＧ、３ １試験当シのＩｇＧ量又はＩｇＡ量（μｔ）ゲンメマイ
シンーＢＳＡ複合体量（４１）手続補正書 昭和５８年５月１８日５ 特許庁長富　若　参　和　夫　　殿 １、事件の表示 昭和８８年　特許願第　４ＳｉｌｌＨ号２、発−の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　　称　マイルス・ラボラトリーズ・インコーホレー
テッド（氏　名） ５、補正命令の日付　自発 ６６補正により増加する発明の数　ｔＬ■、明細書の特
許請求の範囲の欄を別紙の通勤補正する。 腫、明細書の発明の詳細な説明の欄において、明細書第
４２頁２０行目〜第４３頁１行目のｒ　ｈｙｄｒｌｄｉ
ｘａｔｉｏｎ　Ｊを［ｈｙｂｒムｄ１ｇａｔムｏｎ　Ｊ
と補正する。 特許請求の範囲 １．　（ａ）（１）　　単一クローン性抗分析対象物が
実質的に唯一の標識化成分である標識化単一クローン性
抗分析対象物調製物、 但し、該標識化単一クローン性抗分析 対象物に含まれる標識は、該標識化抗 分析対象物が分析対象物と結合すると、結合しない場合
と比較して測定可能に異なる検出可能な応答を提供する
もので ある、 又は、 （２）調製−において、単一クローン性抗分析対象物が
実質的に唯一の標識化成分である標識化単一クローン性
、抗分析対象物調製物；及び該標識化単−夛ロ゛−ン性
抗分析対象物と結合しうるエピトープからなる高分子複
合体 但し、該標識化抗分析対象物に含まれる標識は、該標識
化抗分析対象物が該高分子複合体と結合すると、結合し
ない場合又は分析対象物と結合した場合と比較して、測
定可能に異なる検出可能な応答を提供するものである、 と試験試料を組み合わせ、かつ （ｂ）　　試験試料中の該分析対象物の関数として、該
検出可能な応答を測定する 工程からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
を測定するだめの均一系免疫試験法。 ２、該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子型
抗体からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　該単−クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
グメントからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。　
　　　゛ ４、　該標識が試薬検出系メンバーと相互反応して、該
検出可能な応答を提供し；かつ該標識への該検出系メン
バーの接近が立体的に妨害されるために、結合する場合
、該検出可能な応答が測定可能に異なる特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ５、　該標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反応
の関与物である特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、酵
素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第５項記載の方
法。 ７、　（ａ）　（１）　　該単一クローン性抗分析対象
物が実質的に唯一の標識化成分である標識化単一クロー
ン性抗分析対象物調製物、及び （２）該標識化単一クローン性抗分析対象物に含まれる
、分析対象物についての試薬検出系、 但し、該標識は、該検出系メンバーと相互反応して、該
標識への該検出系メンバーの接近が立体的に妨害される
ために、該標識化抗分析対象物が該分析対象物と結合し
た場合、結合しない場合と比較して、測定可能に異なる
検出可能な応答を提供するものである、 と試験試料を組み合わせ、かつ （ｂ）　　試験試料中の該分析対象物の関数として、該
検出可能な応答を測定する 工程からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
を測定するだめの均一系免疫試験法。 ８　該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子型
抗体からなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、　該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
グメントからなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０　　該標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反
応の関与物である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第１０項記載
の方法。 １２　該分析対象物が、約１０，０００より大きい分子
量を有する特許請求の範囲第７項記載の方法。 １３、該分析対象物が、約１００　、０００より大きい
分子量を有する特許請求の範囲第７項記載の方法。 １４　　該分析対象物が、蛋白質である特許請求の範囲
第７項記載の方法。 １５、　（ａ）　（１）単一クローン性抗分析対象物が
実質的に唯一の標識化成分である標識化単一クローン性
抗分析対象物調製物、 （２）該標識化単一クローン性抗分析対象物と結合しう
るエピトープからなる高分子複合体、及び （３）該標識化単一クローン性抗分析対象物に含まれる
分析対象物についての試薬検出系、但し、該標識は、該
検出系メンバーと相互反応して、該標識への該検出系メ
ンバーの接近が立体的に妨害されるために、該標識化抗
分析対象物が該分析対象物と結合した場合、結合リフい
場合と比較して、測定可能に異なる績出可能な応答を提
供するものである、 と試験試料を組み合わせ、かつ （ｂ）該試験試料中の該分析対象物の関数として、該検
出可能な応答を測定する 工程からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
を測定するための均一系免疫試験法。 １６、該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子
型抗体からなる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
グメントからなる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １８、該標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反応
の関与物である特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １９、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第１８項記載
の方法。 ２０、該高分子複合体が、少なくとも１つの分析対象物
残基又はその結合類縁体を化学的に結合した水溶性高分
子からなる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２１、該高分子が、約１０，０００より大きい分子量を
有する特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、該分析対象物が、約５０００より小さい分子量を
何する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２３　　該分析対象物が、約１０００より小さい分子量
を有する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２４、標識化抗分析対象物に含まれる標識が、該標識化
抗分析対象物が分析対象物と結合した場合、結合しない
場合と比較して、測定可能に異なる検出可能な応答を提
供し、かつ、単一クローン性抗分析対象物が実質的に調
製物中の唯一の標識化成分である漂識化単−クローン性
抗分析対象物からなることを特徴とする、試験試料中の
分析対象物の均一系免疫試験測定に用いるための試薬調
製物。 ２５、該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子
型抗体からなる特許請求の範囲第２４項記載の調製物。 ２６　　該喝−クローン性抗分析対象物調製物が抗体′
フラグメントからなる特許請求の範囲第２４項記載の調
製物。 ２７、該検出系メンバーと相互反応して、該標識への該
検出系メンバーの接近が立体的に妨害されるために、該
標識化抗分析対象物が該分析対象物と結合する場合、結
合しない場合と比較して、測定可能に異なる検出可能な
応答を提供する標識についての試薬検出系を、更に加え
てなる特許請求の範囲第２４項記載の調製物。 ２８　　該標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反
応の関与物である特許請求の範囲第２７項記載の調製物
。 ２９、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第２８項記載
の調製物。 ３０　　該分析対象物が、約１０，０００より大きい分
子量を有する特許請求の範囲第２４項記載の調製物。 ３１　　該分析対象物が、約１００，０００　より大き
い分子量を有する特許請求の範囲第２４項記載のｍ物。 ３２　　被分析対象物が、蛋白質である特許請求の範囲
第２４項記載の調製物。 ３３、（１）単一クローン性抗分析対象物が実質的に唯
−の標識化成分である標識化単一クローン性抗分析対象
物調製物、及び （２）該標識化単一クローン性抗分析対象物と結合しつ
るエピトープからなる高分子複合体、但しζ該標識化抗
分析対象物に含まれる標識は、該標識化抗分析対象物が
該高分子複合体と結合する場合、結合しない場合、又は
該分析対象物と結合した場合と比較して、測定可能に異
なる検出可能な応答を提供するものである、 からなることを特徴とする、試験試料中の分析対象物の
均一系免疫試験測定のだめの試薬系。 ３４　　該単−−クローン分析分析対象物調裂物が完全
分子型抗体からなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬
系。 ３５、該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
グメントからなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系
。 ３６、該標識が該試薬検出系メンバーと相互反応して、
該標識への該検出系メンバーの接近が立体的に妨害され
るために該標識化抗分析対象物が該高分子複合体と結合
する場合、結合しない場合又は該分析対象物と結合する
場合と比較して、測定可能に異なる該検出可能な応答を
提供する、標識についての試薬検出系を、更に加えてな
ぁ、特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ３ｚ　　該標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反
応の関与物である特許請求の範囲第３６項記載の試薬系
。 ３８　　該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子挨
、酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第３７項記
載の試薬系。 ３９　　該高分子複合体が、少６くとも１つの分析対象
物残基又はその結合類縁体が化学的に結合している水溶
性高分子からなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系
。 ４０　　該高分子が、＃１１０，０００よシ大きい分子
量を有する特許請求の範囲第３９項記載の試薬系。 ４１、該分析対象物が、約５０００より小さい分子量を
有する特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ４２該分析対象物が、約１０００より小さい分子量を有
する特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　（ａ）　（１）　　単一クローン性抗分析対象物
   が実質的に唯一の標識化成分である標識化単一クローン
   性抗分析対象物調製物、 但し、該標識化単一クローンｍ分析対象物に含まれる標
   識は、該標識化抗分析対象物が分析対象物と結合すると
   、結合しない場合と比較して測定可能に異なる検出可能
   な応答を提供するものである、 又は、 （２）　　１ｉｌｉ製物において、単一クローン性抗分
   析対象物が実質的に唯一の標識化成分である標識化単一
   クローン性抗分析対象物調製物；及び骸標繊化単−クロ
   ーン性抗分析対象物と結合しうるエピトープからなる高
   分子複合体 但し、諌榔識化抗分析対象物に含まれる標識は、骸樟鐵
   化抗分析対象物が蚊高分子複合体と結合すると、結合し
   ない場合又は分析対象物と結合した場合と比較して、測
   定可能に異なる検出可能な応答を提供するものである、 と試験試料を組み合わせ、かつ （ｂ）　　試験試料中の諌分析対象物の関数として、皺
   検出可能な応答を測定する １租からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
   を測定するための均一系免疫試験法。 ２Ｌ　　咳単−クローン性抗分析対象物調製物が完全分
   子量抗体からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、咳単−クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラグ
   メントからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、　腋標鐵が試薬検出系メンバーと相互反応して、該
   検出可能な応答を提供し；かつ骸標識への該検出系メン
   バーの接近が立体的に妨害される丸めに、結合する場合
   、該検出可能な応答が測定可能に異なる特許請求の範Ｆ
   Ｍ第１項紀載の方法。 ５、　該１１ｉ緻が１、該検出系に含まれている酵素触
   媒反応の関与物である特許請求の範囲第４項記載の方法
   。 ６、該ｌｌ識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   ＃素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第５項記載の
   方法。 ７、　（ａ）　（１）　　該単一クローン性抗分析対象
   物が実質的に唯一のｍｅ化成分である標識化単一クロー
   ン分析分析対象物ｖ４製物、及び （２）該橡繊化単−クローン性抗分析対象物に含まれる
   、分析対象物についての試薬検出糸、 但し、該標識は、該検出系メンバーと相互反応して、該
   標識への該検出系メンバーの接近が立体的Ｋｔ妨害され
   る丸めＫ１、・・　九 該標識化抗分析対麺物が該分析対象物と結合した場合、
   結合しない場合と比較して、測定可能に異なる検出可能
   な応答をと試験試料を組み合わせ、がっ （ｂ）　　試験試料中の該分析対象物の関数として、該
   検出可能な応答を測定する 工程からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
   を測定するための均一系免疫試験法。 Ｓ、＃単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子製
   抗体からなる％軒請求の範囲１ｇ７項記載の方法。 ９、蚊単−クローン分析分析対象物訓製物が抗体フラグ
   メントからなる特許請求の範囲１ｇ７項記載の方法。 １０、＃標識が、該検出系に含まれている酵素触媒反応
   の関与物である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１　　＃１ｌｌＩＩが、酵素基質、補＃素、酵素補欠
   分子族、酵嵩阻害剤又淋簿素である特許請求の範囲第１
   ０項記載の方１０ １２、該分析対象物が、約１０　、０００よシ大きい分
   子量を有する特許請求の範８第７項記載の方法。 １３、該分析対象物が、約１００　、０００より大きい
   分子量を有す暮特許請求の範囲第７項記載の方法。 １４、′該分析対象物が、蛋白質である特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １５、　（ａ）　（１）単一クローン性抗分析対象物が
   実質的に唯一の標識化成分である！１１化単−クローン
   性抗分析対象物調製物、 （２）該標識化−−クローン分析分析対′象物と結合し
   うるエピトープからなる高分子複合°　　体、及び （３）＃標識化単−クローン性抗分析対象物に゛　　含
   まれる分析対象物についての試薬検出系、但し、該標識
   は、該検出系メンバーと相互反応して、該標識への該検
   出系メンバーの接近が立体的に妨害される九ＪｔＪＫ１
   赦ｓｍ化抗分析対象物が該分析対象物と結合した場合、
   結合しない場合と比較して、測定可能に異なる検出可能
   な応答を提供するものである、 と試験試料を組み合わせ、かつ （ｂ）　　蚊試験試料中の該分析対象物の関数として、
   該検出可能な応答を測定する 工程からなることを特徴とする試験試料中の分析対象物
   を測定するための均一系免疫試験法。 １６、骸単−クローン性抗分析対象物調製物が完全分子
   製抗体からなる特許請求の範ｉ！ｌ第１５項記載の方法
   。 １７、皺単−クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
   グメントからなる特許請求の範囲第゛１５項記載の方法
   。 １８’ｌ＄＠織が、骸検出系Ｋｔすれている酵素触媒反
   応の関与物である特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １９、咳標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第１８項記載
   の方法。 ２０、＃高分子複合体が、少なくとも１つの分析対象物
   残基又はその結合類縁体を化学的に結合した水溶性高分
   子からなる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２１、該７ゐ分子が、約１０，０００より大きい分子量
   を有する特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２　眩分析対象物が、約５０００より小さい分子量を有
   する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２３、該分析対象物が、約１０００よシ小さい分子量を
   有する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２４、標識化抗分析対象物に１１れる標識が、該標識化
   抗分析対象物が分析対象物と結合し九場合、結合しない
   場合と比較して、測定可能に異なる検゛州可能な応答を
   提供し、かつ、単一クローン性抗分析対象物が実質的に
   調製物中の唯一の標識化成分である標識化単一クローン
   性抗分析対象物からなることを特徴とする、試験試料中
   の分析対象物の均一系免疫試験測定に用いるための試薬
   調製物。 ２５、該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子
   型抗体からなる％軒請求の範囲第２４項記載の調製物。 　　　　　　　　　　、：。 ２６、該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
   グメントからなる特許請求の範囲第２４項記載の調製物
   。 訂、該検出系メンバーと相互反応して、該標識への諌検
   出系メンバーの接近が立体的に妨害される丸めに、該標
   識化抗分析対象物が該分析対象物と結合する場合、結合
   しない場合と比較して、測定可能ＫＪＩＩなる検出可能
   な応答を提供する標識についての試薬検出系を、更に加
   えてなる特許請求の範囲第２４項記載の調製物。 ２８、骸標識が、腋検出系に１まれている酵素触媒反応
   の関与物である特許請求の範囲第２７項記載の１ｌＩＩ
   Ｉ物。 ２９　　該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族
   、酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第２８項記
   載の調製物。 ３０　　該分析対象物が、約１０，０００より大きい分
   子量を有する％詐請求の範囲第２４項記載のｍ製物。 ３１、　Ｗｊ１分析対象物が、約１００，０００　より
   大きい分子量を有する特許請求の範囲第２４項記載（２
   ２１ｍ１１１１ｉ物。 ３２、＃分析対象物が、蛋白質である特許請求の範囲第
   ２４項記載の調製物。 ３３、（１）単一クローン性抗分析対象物が実質的に唯
   一の標識化成分である標識化単一クローン性抗分析対象
   物調製物、及び （２）該標識化単一クローン性抗分析対象物と結合しう
   るエピトープからなる高分子複合体、但し、該標識化抗
   分析対象物にａすれる標識は、該標識化抗分析対象物が
   該高分子複合体と結合する場合、結合しない場合、又は
   該分析対象物と結合した場合と比較して、測定可能に異
   なる検出可能な応答を提供するものである、 からなることを特徴とする、試験試料中の分析対象物の
   均一系免役試験測定のための試薬系。 ３４＃単一クロ一ン性抗分析対象物調製物が完全分子型
   抗体からなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ３５、該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
   グメントからなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系
   。 ３６　　該標識が該試薬検出系メンバーと相互反応して
   、該標識への該検出系メンバーの接近が立体的に妨害さ
   れる丸めに該標識化抗分析対象物が蚊高分子複合体と結
   合する場合、結合しない場合又は諌分析対象物と結合す
   る場合と比較して、測定可能に異なる該検出可能な応答
   を提供する、標識についての試薬検出系を、更に加えて
   なる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ３？、諌標識が、骸検出系に含まれている酵素触媒反応
   の関与物である特許請求の範囲第３６項記載の試薬系。 ３８、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第３７墳記載
   の試薬系。 ３９、該高分子複合体が、少なくとも１つの分析対象物
   残基又はその結合類縁体が化学的に結合している水溶性
   高分子からなる特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ４０、該高分子が、約１０．０００より大きい分子量を
   有する特許請求の範囲第３９項記載の試薬系。 ４１、該分析対象物が、約５０００より小さい分子量を
   有する特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ４２、該分析対象物が、約１０００より小さい分子量を
   有する特許請求の範囲第３３項記載の試薬系。 ４３、特許請求の範囲第２４項ないし第３２項のいずれ
   かの試薬調製物及びそれらを包含せしめた固体状担体材
   からなることを特徴とする、水性液体試験試料中の分析
   対象物の均一系免疫試験測定のための試験具。 ４４、特許請求の範囲第３３項ないし第４２項のいずれ
   かの試薬調製物及びそれらを包含せしめた固体状担体材
   からなることを特徴とする、水性液体試験試料中の分析
   対象物の均一系免疫試験測定のための試験具。 ４５、（ａ）体細胞融合により、単一クローン性抗分析
   対象物調製物を得て、 （ｂ）免疫グロブリンをさ有するかかる調製物の画分を
   他の蛋白質から分離し、かつ （Ｃ）該分離された免疫グー、テリン画分中の蛋白質を
   、酵素触媒反応に関与する物質で標識する 工程からなることを特徴とする、調製物において分析対
   象物が実質的に唯一の標識化成分である、試験試料中の
   分析対象物を測定するための均一系免疫試験において用
   いられるための標識化抗分析対象物試薬の製造法。 ４６、誼標識化工程が、標識物質及び蛋白質問に共有結
   合を形成する条件下で、骸免疫グロブリン画分を標識物
   質と組み合わせることにより完遂される特許請求の範囲
   第４５項記載の製造法。 ４７、し分離工程が、免疫グロブリンの一般群に対して
   選択的なりロマトグラフイーにより完遂される特許請求
   の範囲第４６項記載の製造法。 ４８、該クロマトグラフィーが、アフィニティー結合相
   手として、蛋白質ムを用いる特許請求の範囲第４７項記
   載の製造法。 ４９、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第４Ｉｓ項記
   載の製造法。 ５０、＃素触媒反応に関与する物質で標識された単一ク
   ローン性抗分析対象物からなり、該標識化単一クローン
   性抗分析対象物が調製物中において実質的に唯一の標識
   化成分であることを特徴とする標識化抗分析対象物調製
   物。 ５１、該単一クローン性抗分析対象物調製物が完全分子
   型抗体からなる特許請求の範囲第５０項記載の調製物。 ５２、該単一クローン性抗分析対象物調製物が抗体フラ
   グメントからなる特許請求の範ｉ！！Ｉ鮪ｓｏ項記載の
   調製物。 ５３、該標識が、酵素基質、補酵素、酵素補欠分子族、
   酵素阻害剤又は酵素である特許請求の範囲第５０項記載
   の講ｌＩ！吻０