JPS58211662A - 試験試料中の被検体を測定するための均一系結合分析方法および該方法に用いる試薬系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異結合分析技術の開発によって、診断、医学。

環境および工業上重要な、液体媒体中に極〈低濃度で存
在する種々の有機物質を測定するのに極めて有用な分析
法が現われた。

特異結合分析とは、試料中の測定対象物質（以下、被検
体と称す）とその結合対手との間の特異反応に基づく分
析である。

被検体またけ結合対手のいずれか一方が抗体であり、他
方がこれに対応する抗原またはハブテンである場合、こ
の特異結合分析を、特に、免疫分析と言う。

その他、被検体と結合対手との反応は、ホルモン、ビタ
ミン、代謝物質および薬剤と、それぞれの受容体および
結合物質との間の結合反応をはじめとし、結合分析の基
礎となっている。

最初に開発された結合分析は、標識として放射性同位元
素を用いる放射免疫分析であった。放射性物質の取扱い
は不便であり、しかも種々の問題が伴うため、その後、
放射性同位元素以外の物質を利用する分析系が考え出さ
れた。このような標識成分としては、例えば、補因子、
酵素基質、酵素調節剤（例えば、活性剤および阻害剤）
、閉環試薬、スピンラジカル、酵素、バクテリオファー
ジ、金属および有機金属錯体、有機および無機触媒、補
欠分子族、化学発光性試薬および螢光分子等がある。

結合分析において、試験試料中の被検体を測定するには
、先ず、試験試料に標識複合体を含んだ試薬系を加える
。その結果、標識複合体は、試験試料中の被検体濃度に
応じて、結合体すなわち結合種と非結合体すなわち遊離
種と成って分かれる。

放射免疫分析の場合のように、結合種となった標識複合
体を遊離種の１１の標識複合体から、標識監視手段によ
って、その性質上、区別することが出来ない場合には、
分析を完遂するために結合種と遊１１＃種とを物理的に
分離する必要がある。この種の分析は、結合分析法にお
いて”不拘−″系と称される。

一方、標識複合体の結合種と遊離種とが共存していても
、相互に区別可能な場合には、”均一系の分析様式を適
用することが出来、上記分離工程を省くことが出来る。

均一結合分析法には、多種多様の分析様式が考えられる
が、一般的には、競合的結合様式の分析が採用されてい
る。この分析様式では、被検体またはそのアナローブ（
類縁体）Ｆｉ標識化された標識複合体が、試験試料中の
被検体と、被検体の結合対手（例えば、抗体）との結合
に関して競合する。

然しなから、ある場合には、標識化された結合対手を用
いる直接結合様式の分析の方が県かに有利となる。この
分析様式では、試験試料中のいずれかの被検体がこの標
識物質と直接結合し、その結果、測定可能な、標識の信
号変化が起る。然し、均一系結合分析においては、標識
結合対手の利用は非常に制限されてきた。このような分
析法を代表するものとしては、米国特許第４，２３３，
４０２号、第３，９９６，３４５号、第４，２８７，３
００号、第４，２０８．４７９号および第４，２５６，
８３４号、リットマン（Ｌｉ　ｔｍａｎ　）らの著Ａｎ
ｓ＋１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１０６　：　２２３（１
９８０）、つ／Ｉ／　−ｒ　ｙ　（Ｕｌ　１ｍｍｎ　）
らの著Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５１　：４１７２（１９７６）、ウェイ（
Ｗｅｉ　）とリューペ（Ｒｕｂｓ　）の著Ｃｌ１ｎ、　
Ｃｈｓｍ、　２３　：１３８６（１９７７）並びにギボ
ンズ（Ｇｉｂｂｏｎｓ　）らの著Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、
　　２７　：　１６０２　（１９８１）がある。

、　標識結合対手を用いる均一系結合分析のうち、米国
特許出願筒３５９，６１０号（１９８２年３月１８日出
願）に記載されたものは、特に、独特であり、しかも、
有用である。その−態様において、この分析系で社、単
一の、標識モノクローナル抗体試薬が用いられている。

分析に当っては、先ず、目的被検体が含まれていると推
定される試験試料に標識モノクローナル抗体調剤を加え
る、ここでは、被検体に対する抗体が実質的に唯一の標
識成分となる。用いる標識としては、標識抗体が被検体
に結合されている場合に、結合されていない場合に比べ
、その検知可能な信号が定性的もしくは定量的意味で異
って測定され得るものが選ばれる。従って、得られる検
知可能な信号は試験試料中の被検体濃度の関数となる。

すなわち、被検体濃度が増大するにつれて、標識抗体と
の結合が増し、その結果、標識の検知可能な信号の変化
が増加する。

米国特許第４，２８１，０６１号には、結合対手に対す
る被検体と標識被検体との間の競合的結合に基づいた均
一系免疫分析が記載されている。この分析では、分析感
度向上のために抗−（結合対手）が使用されている。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２７：　１７９７（１９８１
）は、臨床免疫学におけるモノクローナル抗体の応用に
関する総説を載せている。

西独特許公開公報第３，００６，７０９号および第３゜
００６．７１０号には、結合対手に対する被検体と標識
被検体との間の競合的結合に基づいた均一系免疫分析が
記載されている。標識としては、酵素調節剤（例えば、
阻害剤）が用いられており、結合対手、調節剤である標
識もしくは活性が調節された酵素のうちの１つが、例え
ば抗体と結合することによって立体的に大きくなってい
る。

本発明は、被検体の標識結合対手を用いて試験試料中の
被検体を測定する、改良された均一系結合分析を提供す
る。

本発明において、試験試料に、標識結合対手（例えば、
標識化された抗−被検体）と該標識結合対手中に含まれ
る標識の試薬検知系を加えると、標識結合対手が被検体
と結合した時には、それらが結合していない時に比べて
、該標識と試薬検知系の要素との相互作用によって生ず
る標識の信号が異なる。このような信号の差が生ずるの
は、標識結合対手と被検体とが結合している場合と、こ
れらが結合していない場合とでは、上記試薬検知系が標
識に近寄る際の立体障害の大きさが異なるからである。

このようにして得られるイト号は、試験試料中の被検体
の存在もしくは量の関数と々る。

本発明の分析の改良や、は、上記標識結合対手および試
薬検知系のほかＫ、被検体と選択的な結合を行うが、標
識結合対手とは有意な結合を形成しない高分子結合剤を
試料に加え、以って、上記立体障害を特異的に増大せし
めることから成る。

反応媒体中で、高分子結合剤り被検体−標識結合対手複
合体と結合を形成し、この標識結合対手の結合種の立体
的容積を増大させ、以って、標識と試薬検知系との間の
相互作用をよや著しく立体的に妨害もしく雌減損せしめ
る。

補助結合剤（高分子結合剤）ｈ、被検体と結合するが、
標識結合対手とけ結合しないかなりの大きさを有する物
質であればいかなるものであってもよい。好まＬ　＜は
、補助結合剤は、抗体又は抗体のフラグメントもり、＜
は集合体等のような結合性蛋白とする。また、標識は、
酵素基質、補酵素、＃素の補欠分子族、酵素阻害剤もし
くは酵素自体のような酵素による触媒反応の関与物であ
ることが好ましい。

本発明における改良は、分子量が通常１０，０００ドル
トンより大きく、標識結合対手および補助結合剤と同時
に結合できるような大きな寸法を有する多価被検体の均
一系結合分析に特に適する。

本発明の利点は、被検体の標識結合対手との結合に関す
る標識の信号変化の程度が被検体と結合する補助結合剤
の存在によって増大し、その結果、分析感度が著しく増
す仁とＫある。

また、本発明は、上記結合分析法を実施するだめの改良
された試薬系および試験キットを提供する。

本明細書において、別設のことわりがなければ、次に挙
げる用語は下記の意味を有する。

被検体−試料中に存在する、定性もしくは定置分析の目
的物質また祉目的関連物質類。

被検体の結合対手−被検体に対して特異的な結合親和力
を有する任意の物質または物質類。

均−系結合分析一被検体とその結合対手との間の特異結
合に基づく分析のうち、標識の信号を、標識結合種から
標識遊離種を物理的に分離すること無しに測定するもの
。

試薬系一本発明の分析の実施に使用する組成物、試験具
、試験キットまた社他の物理的配列、手段または試薬の
組み合せ。

被検体 本発明は、被検体に対する結合対手の入手が可能である
場合もしく社これをＸ製することができる場合に、被検
体の分析に適用可能となる。

被検体の多くは、ポリペプチド、蛋白質、炭水化物、糖
蛋白その他の有機分子であって、標識結合対手と補助結
合剤の両者と結合して単一被検体分子を形成することが
十分可能な大きさを有する分子である。被検体は、通常
、例えば抗体または抗原性ポリペプチドまた社蛋白のよ
うな約１　、０００〜約１０，０００，０００　　の分
子量を有する免疫活性ポリペプチドまたは蛋白である。

本発明は、これをポリペプチド、蛋白、多糖類、ポリ核
酸等の類に属する、分子量が比較的高い物質の分析に適
用すると特に有用である。例えば、血清、血漿、全血、
尿および唾液等の生物学的試料をはじめとする、分析上
興味ある試料中の商分子量成分の多くの場合がそうであ
るように、特に、被検体が僅少物質である場合に、格別
有用である。

被検体は多価物質とし、従って、標識結合対手と補助結
合剤の両者と結合する仁とが出来、しかもその分子量は
、通常、約ｉｏ　、　ｏｏｏを超え、しばしば、約ｉｏ
ｏ、ｏｏｏを超えるものとする、代表的ポリペプチド被
検体はアンギオテンシン菖及び１１Ｃ−ペプチド、オキ
シトシン、バソプレッシン、ニューロフィシン、ガスト
リン、セクレチン、プラジキニンおよびグルカゴンであ
る。

代表的蛋白被検体としては、プロタミン、ムコ蛋白、糖
蛋白、グロブリン、アルブミン、ククレロ蛋白、燐蛋白
、ヒストン、リボ蛋白、クロモ蛋白及び核蛋白の類等が
挙げられ、具体的に蛋白を例示するならば、プレアルブ
ミン、α、−リボ蛋白、ヒト血清アルブミン、α、Ｊｊ
ｌ＠白　トランスコルチン、グロキシン結合グロブリン
、ハプトグロビン、ヘモグロビン、ミオグロビン、セル
ロブラスミン、α２−リボ蛋白、α、−マクログロブリ
ン、β−ＩＪホ［＋、エリスロボエヂン、トランスフェ
リン、ヘモヘキシン、フィブリノーゲン、免疫グロブリ
ン（例えば、Ｉ、Ｇ　、　Ｉ、Ｍ　、　Ｉ、Ａ　、　Ｉ
、Ｄ及びＩ、ｇ）およびこれらのフラグメント（例えば
、Ｆｅ及びＦａｂ）、補体因子、プロラクチン、血液凝
固因子（例えば、フィブリノーゲン、トロンビン等）、
インシュリン、メラノトロピン、ソマトトロピン、チロ
トロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛
ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲ
ン、内因子、トランスコバラミン、血清酵素（例えば、
アルカリホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミ
ラーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、コリンエステラー
ゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グ
ルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ及びウロペブ
シン）、エンドルフィン、エンケファリン、プロタミン
、組織抗原、細菌抗、原及び肝炎関連抗原（例えば、Ｈ
ＢｓＡｆＳ）ＩＲｅＡｐ　　及びＨＢｅＡｐ　）　　を
Ｌじめとするウィルス抗原等が挙げられる。

標識結合対手 本構成要素は、被検体に対する結合対手と立体要因に敏
感な標識との複合体である。

このうち、結合対手成分は、被検体に特異的な結合親和
力を有する物質から選ばれる。結合対手は、通常、その
性質上、可逆的な、非共役結合方法で被検体と結合する
高分子である。被検体と結合対手との間のかかる結合と
しては、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワール
ズ力および双極子−双極予相・夏作用等が挙げられる。

また、ある場合にけ共役結合を含め、他の結合が関与し
ていてもよい。被検体と結合対手は、被検体が結合対の
一方となり、結合対手がその他方となって、。

、特異結合対を形成する。このようか結合対としては、
次のようなグループが挙げられる：すなわち、抗原−こ
れに対するノ・ブテンもしくは抗体：レクチンと炭水化
物；補足的ポリ核酸、例えば、ＲＮＡとＤＮＡ　：ホル
モン、ビタミン、代謝物質および薬剤、並びＫそれらと
結合する相手物質もしくけ受容体（通常、結合性生白）
　　：ｆｆｌ！素およびそれらと相互作用を及はし合う
成分（例えば、基質、補酵素及び１；目害剤）等である
。

最も普通には、結合対手は抗−被検体、すなわち、被検
体と特晶的もしくは選択的に結合する、免疫学的に誘導
された結合性物質である。例えば、抗−被検体としては
、被検体に抗して生じた完全形の抗体、又娃該抗体の断
片もしくは集合体から成るものを挙げることが出来る。

完全形の抗体の形態をとる場合には、被検体としては公
知の免疫グロブリン（例えば、Ｉ、Ｇ、　Ｉ、Ｍ、　Ｉ
、Ｅ等）のいずれかのクラスもしくはザブクラスに含ま
れるものを挙けることが出来る。、また、被検体に対す
る特異的な結合親和力を保持した、いずれかの抗体の７
ラクメント、例えば、Ｆａｈ　、　　Ｆ　（ａｂ’）　
　およびＦ（＾ｈ’）ｔ　として一般に知られたＩ、Ｇ
のフラグメントを用いることが出来る。また、適宜、免
疫グロブリンもしくけそれらの７ラグメントの集合体、
重合体および複合体を用いることが出来る。このような
ポリ（抗−被検体）は、被検体に対する結合親和力が維
持されるよう、いずれかの適用可能か方法で調製される
。更には、抗−被検体として選ばれた物質が、目的の被
検体に対して特異的な結合親和力を示す限シ、上記以外
の形態の被検体を採用することが出来る。

抗−被検体を得るだめの免疫グロブリン源は、いずれか
の適用可能な方法で得ることが出来る。

通常、抗−被検体である免疫グロブリンは、慣用的抗血
清技術もしくはモノクローナル技術によって得ることが
出来る。

抗−被検体を含む抗血清は、例えばラビット。

モルモット、もしくはヒツジ等の動物を適当な免疫源に
よって免疫化する方法を昧゛じめとする慣用的な抗血清
技術によって得られる。

従来の技術水準を論評したものに杖、パーカー（Ｐａｒ
ｋｓｒ　）らによるＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｇｌＩ
ｙ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｅａｌｌｙ　Ａｅｔｉｖ＠Ｃｏ
ｍｐｏｕｎｄｓ、　Ｐｒ５ｎｔｉｅｅ−ＩＩｎｌｌ　（
Ｅｎｇｌｅｗｏｏ＋Ｉ　Ｃ目ｒｆｓ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ
ｓｅｙ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

１！１１７６）、パトラ−（ＢｕＬｌｎｒ　）によるＪ
、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　。

Ｍｓｔｈ、７　：１−２４（１９７ｔｌ　）：ワインリ
プとシュロフ（Ｗｅｉｎｒｙｂ　ａｎｄ　５ｈｒｏｆｆ
　）によるＤｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ。

Ｒｅｖ、１０：２７１−２８３（１９７５）：　　プロ
ウトンとストロ７グ（ＢｒｏｕｇｈＬｏｎ　ａｎｄ　Ｓ
ｔｒｏｎｇ　）によるＣｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２２　ニ
ア２６−’１３２（１’９７６　）：およびプレイフェ
ア（Ｐｌａｙｒａｉｒ　）らによるＢｒ０Ｍ＠ｄ。

Ｂｕｌｌ、３０：２４−３１（１９７４）がある。

本発明の標識複合体中の結合対手としては、上記米国特
許出願第３５９，６１０号に記載された理由から、モノ
クローナル抗−被検体を用いることが好ましい。

モノクローナル抗−被検体は化学的に均質であり、これ
は体細胞ノ・イブリダゼーション法によって得られる。

その内容については、Ｌｙｍｐｈ　ｏ　ｏ　ｙ　Ｌ　ｅ
Ｈｙｂｒ　ｉｄｏｍａｓ　、メルヒヤーズ（Ｍｅｌｅｈ
ｅｒｓ　）らの編集。

Ｓｐｒｌｎｇｅｒ−Ｖ＠ｒｌａｇ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
’ｌ　９７８）およびＭｅｔｈｏｄｌＩｉｎ　Ｆ２ｎｗ
ｙｍ０１ｃｉｇ７７３　（Ｐａｒｋ　Ｂ）　；　３−４
６（１９８１）を参照されたい。

一般に、モノクローナル抗−被検体の免疫グロブリンは
、このような抗体を生成するリンパ球をミエローマ細胞
と融合させ、ハイブリドマを形成し、所望の抗体を分泌
するハイブリドマ・クローンを単離し、しかる後に分泌
された該モノクローンの抗体を採取する。ハイブリダイ
ゼーションにおいて用いるリンパ球は、通常、慣用的方
法で、被検体に対して免疫化されたマウスもしくはラッ
ト等の動物から切除した肺細胞である。

結合対手に接合もしくは連結された標識は、他の分子（
複数の分子である場合を含む）（試薬検知系の要素）と
相互作用をなし、検知可能外信号を与えるものであれば
いかなる物質であってもよい。この場合、該相互作用は
立体要因に対して鋭敏であるものとする。すなわち、標
識結合対手と被検体の結合は信号を発生せしめる相互作
用を妨害するものとする。標識複合体の大きさは、被検
体の結合の際、有意に増大するように選ばれる。

一般に、被検体の大きさが相対的に増大すれば増大する
ほど、標識の周囲における立体効果はますます大きくな
る。

標識自体は小さいものであることが好ましく、例えば、
その分子量は５０，０００未満であり、通常は１０，０
００未満、より広く用いられるものれ、４．０００未満
、好ましくは２　、０００未満のものである。

標識と相互作用を及ぼす検知系要素（複数の要素である
場合を含む）はかなり大きいものであることが好虜しく
、例えば、標識よりも３倍大きく、通常は１０倍を超え
、好ましくは２０〜１００倍以上とする。従って、１０
０〜２，０００ドルトンのオーダーの質量を有する標識
に対する最も好ましい検知系においては、標識と相互作
用を及ぼし、その結果、標識が検知可能な信号を力える
こととなる検知系の少なくとも一要素がｔｏ　、ｏｏｏ
〜２００゜０００ドルトンのオーダー以上の質量を有す
るものとする。澤識と検知系要素との間に、上記のよう
な関係があると、被検体と標識結合対手との結合の結果
、有意な立体効果の発生確率が増大する。

種々多様の酵素反応が利用′ｉ５】能てあり、その内か
ら分析成分を選ぶことができる。従って、好適な標識は
、酵素基質、補酵素、酵素の補欠分子族および酵素阻害
剤等のような酵素−Ｍ媒反応の関与物物質である。標識
と、これと相互作用をなす検知系要素との間の好適な寸
法関係を有する十分に大きな分子量の酵素について、冬
〈の小さな基質、補酵素および阻害剤が知られている。

補欠分子族及びこれらに対応するアポ酵素についても同
様なことが言える。同様に、かかり大きな基質と反応す
る多くの酵素並びに小さな基質、補酵素、および阻害剤
を、例えば水溶性高分子のような高分子量背骨材に結合
せしめることによって、。八−■ユ的に太きが基質、補
酵素、もしくは阻害剤が調製され得る酵素が知られてい
る、 特に好適な標識は上述の米国特許出願第３５９゜６１０
号に騨細に記載されているものであり、要約するならば
、米国特許第４，２７９．９９２号および英国特許明細
ＩＩ第１，５５２，６０７号の酵素基ｇＫ標識および補
酵素標識、米国特許第４，２３８，５６５号の酵素の補
欠分子族標識、米国特許第４，１３４，７９２号および
第４，２７３，８６６号の酵素調整剤（例えば、阻害剤
）標識、米国特Ｆｆ第３，８１７，８３７号および第４
．＋１４３．Ｆ１７２号の酵素標識、米国特許第４，２
３Ｆｌ、１９５号の化学的に励起された螢光性標識、米
国特許第３，９３５，０７４号および第３，９９８，９
４３号のエビト・−プ標識等が挙げられる。

選ばれた標識は結合対手と化学的に結合され、本発明の
標識結合対手成分を形成する。この２つの要素を連結す
る手段としては、１・１（々様々な手段を利用すること
が出来、これらの手段は公知である。：、連結には、化
学結合、又は水素を除き、主として炭素並びに窒素、酸
素、リンおよびイオウから選ばれるヘデロノも１子から
成る原子鎖であって、１〜５０原子数、より普通にＶＪ
１〜３０原子数、通常１〜・２０原子数のものを用いる
ことが出来る。

慣用的連結基については、文献に詳説されている。

例えば、米国ｑ！ｉ詐第４　、２３０　、７９７号；第
４，２７９゜９９２号；ｔｒシ３，８１７．Ｆ１３７号
；第３，９３５，０７４号；および第３．９９１５．３
４Ｆｉ号を参照されたい。また、連結基は、標識を離間
させるため、および／もしくは結合対手に対する標識の
結合性を官能化せしめるために標識に付着された側腕基
、並びに／ま　　。

たけ、標識もしくは誘導体化された標識を結合対手と連
結する際に用いられる二官能性カップ１７ング剤の残基
であってもよい。

また、被検体と結合対手との結合の立体的効果は、被検
体との複合体化によって質量が顕著に増大するような結
合対手を選ぶことによって、これを高める仁とが出来る
。普通、結合対手は被検体質量の１０倍未満とし、より
普通に用いられる本のは、被検体の絶対質量より小さく
、よシ好ましくは、被検体ＩＪｑ、ｔの０．２５倍未満
とする。抗−被検体を使用する場合、低分子量の免疫グ
ロブリン・クラスの抗体を選ぶことによって、結合対手
の質量な低減させることが出来る。例えば、Ｉ、Ｇ抗体
は約１５０，０００の分子量を有し、一方、Ｉ、Ｍクラ
スの抗体は約９００，０００の分子量を有している。−
また、適宜、抗体を開裂せしめて、被検体に対する特異
的な結合親和力を保持した低分子量の７ラグメントにす
ることも出来る。例えば、Ｆａｂ（５０，０００ドルト
ン）　、　　Ｆ（ａｈ’）　（５３，０００ドルトン）
およびＦ　（ａ　ｈ’）。

（１０６，０００ドルトン）のよりなＩ、Ｇ　　抗体の
各種フラグメントを調製することができる。

補助結合剤 被検体と選択的に結合する高分子であれば、いかなるも
のでも本発明に係る補助結合剤として使用することが出
来る、高分子とけ、分子量が約５０００以上、通常１０
．１’１００以上、好ましくは４０゜ｏｏｏ以上、また
、しばしば１００．０００以上の、天然もしくは合成槽
の重合分子を言う。選択結合とけ、補助結合剤が有意に
被検体と結合し、場合によっては、反応混合物中に在る
他の物質とも反応してもよいが、標識結合対手と、け反
応しないものを言う。普通、補助結合剤は１．Ｆで定義
したように１被検体に対する非標識結合対手であり、従
って、通常、結合性蛋白（例えば、抗体、レクチン、受
容体蛋白その他類似物）であり、好ましくは、抗−被検
体（例えば、抗体またはそのフラグメントもしくは集合
体）である。補助結合剤として使用する場合にけ、抗−
被検体は（慣用的抗怖清法クローナルのものであっても
よい。

勿論、補助結合剤は、場合によっては適宜、抗−被検体
以外の結合性蛋白であってもよい。例えば、被検体は特
定の炭水化物もしくは炭水化物のクラスであってもよく
、標識結合対手として標識抗体を、補助結合剤としてレ
クチンを使用することが出来る。また、ある場合には、
被検体はＩ、Ｇであってもよ−く、標識結合対手として
は、Ｉ、ＧクラスもしくはＩ、Ｇ断片以外の標識抗体を
、補助結合剤としては、蛋白Ａ（Ｉ、ＧのＦｃ部分と結
合することが文献で知られている蛋白）を用いることが
出来る。補助結合剤として各種単抗体結合性蛋白を使用
す、ることか出来る、その他の場合については当業者に
とって明白であろう。

補助結合剤と標識結合対手とが被検体に対して、最小限
で競合することが好ましい。最も好ま１．い実施の態様
は、分析系内に形成された実質的に全ての被検体−標識
結合対手複合体を補助結合剤上結合させるととＫよつで
標識と相互作用を起す検知系要素の接近を立体的に著し
く妨害せしめるために、被検体は標識結合対手と補助結
合剤の両方と、容易に結合できるものである。このため
、補助結合剤と標識化される結合対手は、同一な本ので
ないことが好ましい。結合対手が好適なモノクローナル
抗−被検体であり、かつ、補助結合剤がポリクローナル
抗−被検体である場合、好ましくけ、先ず、試料を、成
る期間、Ｗ１識モノクローナル抗−被検体に接触させ、
次に１非標靴ポリクローナル抗−被検体を加える。この
方法ＶＣおいて、被検体との結合に対する、標識結合対
手と補助結合剤との間の競。２合は最小となる。結合対
手と補助結合剤との両者がモノクローナル抗−被検体で
ある場合、こわらけ被検体上の相異った限定的位置に結
合されるべく選択されることが好ましく、これらを同時
に加えてもよい。

天然に生ずる結合性蛋白以外の補助結合剤が、標識結合
対手と実質的に結合せず、被検体の存在とは無関係な立
体効果による標識の信号の変化を避することが出来る場
合には、この天然に存在する結合性蛋白以外の補助結合
剤を使用することが出来る。例えば、被検体自身が結合
性蛋白である場合、標識結合対手は結合性蛋白被検体に
対する抗体であり、補助結合剤は結合性蛋白被検体が結
合する、対応する高分子物質（例えば、このような物質
が大きさの点でそのまま高分子である女らば、結合性蛋
白被検体が現実に結合する物質、または、重合体また社
高分子支持体もしくは高分子と結合した物質のような高
分子に変わる形態をした物質）であってもよい。被検体
がチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）である場合Ｌ
、上記態様に該当する。この分析においては、林識抗−
ＴＢＧおよび補助結合剤として、高分子支持体と結合し
たチロキシン（Ｔ−４）もしくはトリョードチロニン（
Ｔ−３）が使用されるであろう。上記の、更なる態様と
して、結合性蛋白アジピンの分析がある。

そこでは、標識抗−アジビンおよｑ補助結合剤として、
ビオチン−高分子複合体が使用されるであろう。また、
更なる例として、酵累ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＦ
Ｒ）の分析があり、そこでは、標識抗−ＤＦＲが補助結
合剤としてのメントレキセートー高分子複合体と併用さ
れる。

また、本発明は、結合性蛋白以外の被検体の分析にも適
用出来、この場合、同様に結合性蛋白でない補助結合剤
が用いられる。例えば、レクチンを被検体とし、標識抗
−レクチンを標識結合対手とし、レクチンに結合する炭
水化物を補助結合剤とすることが出来る。また、ヒスト
ンを被検体とし、標識抗−ヒストンを標識結合対手とし
、ヒストンと結合するポリ核酸（例えば、ＤＮＡ）を補
助結合剤とすることが出来る。更に、標識抗体および補
助結合剤としてデキストランを用いてコンカナバリンＡ
を分析することが出来る。また、慣用的にアンチトロツ
・ピン麗と称される血漿血清蛋白酵素阻害剤の標識体お
よび補助結合剤としてのヘパリン（分子量約１０　、０
００の硫酸化したプロテオグリカン）を用いて、凝血因
子（１，ｆｆ島！　Ｘ’ｌ　Ｘｌ’ｌＸ１１−４たけカ
リクレイン）を分析することが出来る。

補助結合剤は被検体に対して特異的である必要は々い。

即ち、補助結合剤が標識結合対手とけ有意には結合しな
いか、或いは、標識信号を非特異的に変化せしめるもの
であるならば、反応混合物中の他の物質と結合するもの
であってもよい。

反応混合物および条件 分析すべき試料は、被検体を含むと思われる天然産もし
くは人工的に造った液体であってよく、通常、生物学的
液体もしくはその希釈物である。

分析しうる生物学的液体は、血清、血漿、尿、唾液、乳
および羊水および脳を髄液を含む。

結合反応は、はとんど全ての場合、緩和な条件下で進行
する。反応混合物は一般に少量゛の所望の有機補助溶剤
を含む水性媒体である。反応温度は、温置時間および分
析工程の間、普通の環境において一定の水準に保たれる
。温度は一般に、５〜５０℃、更に普通には２０〜４０
℃である。好ましくは、反応を室温で進行させる。反応
混合物の−は５〜１０．更に普通には６〜９の間とする
。

種々の試薬の濃度は、試験媒体中に存在すると推定され
る被検体の濃度によって変わる。このような（被検体の
）濃度は、通常、ｔｏ’〜１０”Ｍである。

−Ｅ述の反応パラメータの場合がそうであるように、パ
ラメータの選択は、根本的には、結局、常法に基づいて
分析することになる技術者の趣好的選択と必要条件とを
考量して求められる実験的最適条件に基づいてなされる
。従って、これらのパラメータは、いずれも本発明にと
って限定的なものでなく、むしろ、全て、当業者が通常
なしうろことにすぎない。

試薬系 本発明の試薬系、即ち、試薬の組み合せは、本発明の範
囲内の所望の分析法を実施するのに必要なすべての必須
化学成分を含む。

試薬系は各試薬が共存していても差しつかえがない場合
に社組成物もしくけ混合物として、試験具の構成で、ま
たは試験キット（即ち、必要な試薬を収納する１個以上
容器の絹合せ包装物）として商業的に包装された形で提
供される。

試薬系は、所望の結合反応系に適合する（複数の）試薬
から成る。これらの試薬は、全て上で定義したような、
標識結合対手、補助結合剤、および標識検知系にとって
必要ないずれかの試薬から成る。このような結合反応試
薬社、本発明に係る特定彦分析方法を実施するため、場
合によって用いる、上記試薬以外のいずれかの試薬を含
むことが出来る。勿論、この試薬系は、公知技術の他の
試薬を含んでいてもよく、これらの試薬は商業的観点お
よび使用者の観点から望ましいもの、例えば、緩衝剤、
希釈剤、標準剤等であってもよい。

特に好ましい試験キットは（１）標識モノクローナル抗
−被検体調剤であって、モノクローナル抗−被検体が実
質上唯一の標識化成分であるもの（２）子連のような、
用いた標識に適合した試薬検出系、および（３）補助結
合剤としての非標識抗−被検体から成る。

また、試験具は、試薬系およびこれを含有する固体担体
材から成ることが好ましい。このような試験具の種々の
形態は１９８０年ｌθ月３０日出願された米国特許第２
０２，３７８号明細書に記載されている。本発明におい
てはこのような試験具を用いることもできる。

以下、本２発明を実施例によって説明するが、本発明は
これＫよって制限されるものではない。

実施例：ヒトのＩ、Ｇの分析 Ａ、　Ｌ＝’、　）の１．Ｇに対するモノクローナル抗
体の精製ヒトのＩ、Ｇに対するＦｒ＋−／ＩＩ異モノク
ローナル抗体を含む腹水〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ社（ｌ１ｅｔｈｎｓｄａ　Ｒｅ＠ｅａｃｈ　Ｌ
ａｈｏｒａｔ、ｏｒｉｓｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｇ＋ａｉＬｈｅｒ８１＞ｔ＋ｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
　ＵＳＡ）＃　〕２．４’ｌ−を５ｍＭリン酸ナトリウ
ム（１（１＝８．１）緩衝液４ｔに対して透析し、透析
された物質の電導率を５ｍＭ＋７７酸塩緩衝液のそれと
ほぼ近い値にせしめた。

透析された腹水を、５ｍＭＩＪン酸塩緩衝液（−＝　８
．１　）中で平衡状態となったブルー・セファローズ（
Ｂｌｕｅ　Ｓ＠ｐｈａｒｏｇｅ　）　［）了−マシア拳
ファイ７−ケミカルズ・ニー・ビー（Ｐｈａｒｍａｅｉ
ａ　Ｆｉｎｅ（ｈｅｍｉｏａｌｓ　ＡＢ、　　Ｕｐｐｓ
ａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）製］のカラム（１儒Ｘ　９　
ｃＭ）に加えた。マウス血清アルブミ／はカラム上に保
持させたが、モノクローナル抗体をけじめとする他の蛋
白ｔ！ｆｉｉ杜カラム全カラムヒた。

これら画分を集めた後、これを、あらかじめ２００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｒＪＩ　＝　Ｒ，１）　　で
洗浄してからｆｉｍＭリン酸ナトリウム）１　％　ｍと
平衡状態にせしめたＤＥＡＥ　（ジエチルアミノ−エタ
ノールサルチル酸エステル）−セルロースのカラムに、
加えた。次Ｋ、このカラムを、５ｍＭ〜１００ｍＭのリ
ン酸ナトリウム（ｐ＋、、、８．１）の溶液で直線的＃
度勾配（全２００−の濃度勾配液）を形成しつつ溶出さ
せた。はとんど不純物を含まないモノクローナル抗体は
約４０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液の所で溶出された。

この両分を集め（回収本釣８５％）、この試料を揮識用
に用いた１、飢Ｎ製モノクローナル抗体の標識化 フラビンＮ＠−（６−アミンヘキシル）−アデニンジヌ
クレオチドの（米国特許第４，２５５．５ｆｉ６号に記
載の方法に従って調製された）２．５ｍＭ７１（性溶液
０．９　ｍｇ　ヲロータリー・エバポレーターで乾燥せ
しめた後、下記の試薬を次の順序で加えた。

０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液０．３−。

トリエチルアミン　　　３９μ４およびジメチルーアジ
ピミデートジヒドロクロリド［ピアス・ケミカル社（Ｐ
ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　　Ｒｏｅｋ
ｆｏｒｄ、　Ｉｌ１％ｎｏｉｓ　ＵＳＡ）製］　３３．
８１１９　（１３８μ町反応混合物を３７℃で５分間温
償した。反応は、反応混合物を、２０ｍＭ炭酸ナトリウ
ム（ｍｌｏ、ｏ）と平衡状態にせしめたセファデックス
Ｇ−１０（７アーマシア・ファイン・ケミカルズＡｎ　
（ＰｈａｒｍａｃｌａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｒｎｉｏａｌｓ
　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　５ｗ５ｄｅｎ　）製〕の
カラム（、１ｃｍ　Ｘ　１０．５　ｃＩｎ）の上に通す
ことによって終了させた。黄色溶出液の最初の１．４−
を集めた後、ロータリー・エバポレータで、蒸発させ、
はぼ乾固せしめた。

残渣に炭酸ナトリウム緩衝液（ｌ　Ｍ、　−＝　１０．
０゜１００μｔ）を加え、次いで上記入で得られた精製
モノクローナル抗体試料（１，５”Ｆ／−、９，４ｎ　
ｍｏｌ　）を１．０−加えた。反応混合物を３７℃で２
０分間温装した後、反応を終了させた。次に、反応混合
物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ−７，０）で平衡
化させ、溶出されたセファデックスＧ−２５（媒体）の
カラム（１，３ｃｒｎＸ　４８　ｃｔｎ）上に通すこと
によって、未反応のＩ−アミンへキシル−ＦＡＤを除去
した。両分（２−）を集め、それらの吸光度を波長２８
０１１ｍおよび４５０１１１ｍ　で監視した。これらの
波長で有意な吸収を伴う溶出物質の最°初のピーク社標
識モノクローナル抗体を含有していた。

標識密度は抗体１モル当りＮ−アくノへキシル−ＦＡＤ
４．６モルであった。

ｑ、−見１」とし免親刀ゴノＱ（二濃」Ｊ１尤折ＦＡＤ
−標識モツクローナル抗−（ヒ）Ｉ、Ｇ）ヲ用いる、ヒ
）　Ｉ、Ｇの測定用ＦＡＤ基アポ酵素活性免疫分析系〔
この分析系は゛アリス”ぐＡＲＩＳ”）と呼ばれる。米
国特許第４，２３８，５６５号を参照されたい。〕に及
はす、非標識ポリクローナル抗−（ヒ）Ｉ、Ｇ）の効果
を以下のようにして調べた。

連設された各キュベツトに、９２ｍＭ　　リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）、１％（／ｖ）　　の仔牛
血清アルブミン、２ｍＭ　３．５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホナート、２１μｆ／−ホースラデ
ツシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼおよび０．１０
５Ｍグルコースを含有する１、９−の試薬を入れた。次
Ｋ、各キュベツトに０．１％仔牛血清アルブミンを含有
する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（−＝７．０）中
の上記Ｂで得られた標識モノクローナル抗体２５μｔを
加えた。次に、各キュベツトにグルコースオキシダーゼ
に対するヤギの抗体１６μｔを加えた。種々の濃度のヒ
）Ｉ、Ｇを含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ＝７．０）と０．１チ仔牛血清アルブミンのアリコ
ート（２５μｔ）を適切なキュベツトに加えた。反応混
合物を２５℃で３０分間温漬した後、ヒ）　Ｉ、ｇに対
する非標識ポリクローナル抗体のアリコート（２またけ
１０μｍ）［アキュレイト・ケミカル・アンド・サイエ
ンティフィック・コーポレーション、ヒツクスビル、ニ
ューコーク、アメリカ合衆国（Ａｃ＋ｅｕｒａｔｓ　　
Ｃｈ＠ｍ１ｅａｌ　　ａｎｄ　　５ｅｉｅｎＬｉｆｉｏ
　　Ｃｏｒｐ、。

Ｈｌｅｋｓｖｉｌｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ＵＳＡ）
製〕　を適切なキュベツトに加えた。反応混合物を２５
℃で更に３０分間温−し、次いで、５０チグリセロール
、８ｍＭアンチピリンおよび０．０２　％　（Ｗ／％’
）アジドナトリウムを含有する０、　１　Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（−＝７．０）中の−ｒボグルコース・オ
キシダーゼ５μｔ（８μＭ　１７ＡＤ結合部位、米国特
許第４，２６８，６３１号を参照されたい）を加えた。

必要成分が全部揃った反応混合物を２′５℃で３０分間
温漬し、しかる後、５２０ｎｍの波長でそれらの吸光度
を記録した。

この結果を、次表に示す。

表 （３０分後の５２９ｎｍでの吸光度） ０　　　　１．１５６（１００％）１．１７２（１００
％）１．１１７（１００チ）１．６７　　　１．１４６
（９９，０チ）１．１１０（９４，７％）　　１．１１
２（９９，６チ）４．０　　　　１．０７９（９３，３
％）１．００８（８６，０チ）１．０７４（９６，１チ
）１６．６　　　　０．９７０（８３，９％３　０．７
３１（６２，８％）　０．７６ｇ（６８，８％）８３　
　　　０．１’１４６（７３，１％）０．５３０（４５
，２％）０．５６９（５０，９チ）８３０　　　　０．
７８７（６８，０％１　０．６８６（５８，５チ）０．
５７８（５１，７チ）上記データによれば、非１ｊＪ　
ｎｋポリクローナル抗−（ヒ）Ｉ、Ｇ）が存在しない場
合、ヒトＩ、Ｇの存在降が増大するにつれて、ＦＡＩ）
−標識モツクローナル抗−（ヒトＩ、Ｇ）中のＦＡＤと
アポグルコース・オキシダーゼとの再結合によって生ず
る着色能が減少することが判る。また、非標識ポリクロ
ーナル抗−（ヒ）Ｉ、Ｇ）が存在する場合においても、
色発生率はヒ）　Ｉ、Ｇの濃度に反比例して変化した。

しかしながら、非標識抗体が存在しない＋３合には、ヒ
）　Ｉ、Ｇが最も高い濃度における色発生率は、被検体
が存在しない時の約７０％の着色に抑えられるにすぎな
いが、非標識抗体が存在する場合には、上記色発生率は
被検体濃度が零の時に比べて５０％も阻害される。

＼ 非標識抗体の存在しない場合（曲線ａ）と、１Ｏｔｓｌ
−のアリコートの非標識抗体が存在する場合（曲線ｂ）
の呈色阻害曲線を比較する図面において、この効果は、
劇的に図示されている。図において、横軸は２μｔアリ
コート中のヒトＩ、Ｇの濃度を、縦軸は色発生率を示す
。補助結合剤を加えて、標識信号を増大すしめると、分
析感度は顕著に増大することになる。

【図面の簡単な説明】

図は補助結合剤（実施例では非棹識抗−被検体を使用）
の添加によって、信号変化が増大することを調べた実施
例中のデータをグラフとして表わした本発明の説明図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　試験試料に、被検体に対する標識結合対手と、該標
   識結合対手中に含まれる該標識に対する試薬検知系を加
   え、その際、該標識結合対手が被検体と結合した時には
   、それらが結合していない時に比べて、標識への該検知
   系の要素の接近が立体的に妨害されるために、該検知系
   の要素と相互作用する標識が測定出来る程度の異なった
   信号を力え；かつ、該信号が試験試料中の被検体の関数
   として測定される、試験試料中の被検体を測定するため
   の均一系結合分析方法において： その改良が、被検体と結合するが、標識結合対手とは有
   意に結合しない高分子結合剤を、該試験試料に、補助的
   に加え、以って、立体障害を大きくすることから成るこ
   とを特徴とする方法。 ２、　高分子結合剤が結合性蛋−白である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、結合性蛋白が抗体またはその集合体感しくけフラグ
   メントである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、　抗体がポリクローナルである特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５、　抗体がモノクローナルである特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ６、　標識結合対手が抗体の標識体またはその集合体も
   しくはフラグメントの標識体である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ７、標識が検出系に含まれる酵累−触媒反応の関与物質
   である特許請求の範囲第１項、第３項および第６項のい
   ずれかに記載の方法。 ８１．標識が酵素基質、補酵素、酵素の補欠分子族、酵
   素阻害剤もしくは酵素である特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９、　被検体がｉｏ、ｏｏｏを超える分子量を有してい
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、被検体が１００　、０００を超える分子量を有し
   ている特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、試験試料に、（１）標識モノクローナル抗−被検
   体調剤であって、該モノクローナル抗−被検体が実質的
   に唯一の標識成分であるものと、（１）該標識モノクロ
   ーナル抗−被検体中に含まれる標識に対する試薬検知系
   を加え、その際、該標識抗−被検体が被検体と結合した
   時には、それらが結合していない時に比べて、標識への
   該検知系の要素の接近が立体的に妨害されるために、試
   薬検知系の要素と相互作用する標識が測定出来る程度の
   異なった信号を与え；かつ、該信号が試験試料中の被検
   体の関数として測定される、試験試料中のｉｏ　、　ｏ
   ｏｏを超える分子量を有する多価被検体を測定するため
   の均一系結合分析法において： その改良が該試験試料に１非標識抗−被検体を補助的に
   加え、以って、立体障害を大きくすることから成ること
   を特徴とする方法。 １２、非標識抗−被検体がポリクローナルである特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １３、最初、一定期間、試験試料とｍｍモノクローナル
   抗−被検体を一緒にし、次いで、非標識ポリクローナル
   抗−被検体を加える特許請求の範囲第１２項記載の方法
   。 １４、非標識抗−被検体もモノクローナルである特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １５、標識モノクローナル抗−被検体と非標識モノクロ
   ーナル抗−被検体が被検体上の異なる限定的部位に結合
   する特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、標識が検出系に含まれる酵素−触媒反応の関与物
   質である特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １７、標識が酵素基質、補酵素、酵素の補欠分子族、酵
   素阻害剤もしくは酵素である特許請求の範囲第１６項記
   載の方法。 １８、試験試料中の被検体を測定する均一系結合分析を
   行うための試薬系であって、 （リ　被検体に対する標識結合対手と；（２）標識結合
   相手中に含、まれる標識の試薬検知系であって、標識結
   合対手が被検体と結合した時には、それらが結合してい
   ない時に比べて、標識への該検知系の要素の接近が立体
   的に妨害されるために１該検知系の要素と相互作用する
   標識が測定出来る程度の異なった信号を与えるものと； （３）被検体と結合するが、標識結合対手とけ有意に結
   合しない高分子結合剤であって、これによって、立体障
   害を大きくするもの とから成ることを特徴とする試薬系。 １９、高分子結合剤が結合性蛋白である特許請求の範囲
   第１８項記載の試薬系。 ２０、結合性蛋白が抗体またはその集合体もしくけフラ
   グメントである特許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２１、抗体がポリクローナルである特許請求の範囲第２
   ０項記載の試薬系。 ２２、抗体がモノクローナルである特許請求の範囲第２
   ０項記載の試薬系。 ２３、標識結合対手が抗体の標識体またはその集合体も
   しくはフラグメントの標識体である特許請求の範囲第２
   ０項記載の試薬系。 ２４、標識が検出系に含まれる酵素−触媒反応の関与物
   質である特許請求の範囲第１８項、第２０項および第２
   ３項のいずれかに記載の試薬系。 ２５、標識が酵素基質、補酵素、酵素の補欠分子族、酵
   素阻害剤もしくは酵素である特許請求の範囲第２４項記
   載の試薬系。 ２６、被検体が１０　、０００を超える分子量を有して
   いる特許請求の範囲第１８項記載の試薬系。 ２７、被検体がｉｏｏ、ｏｏｏを超える分子量を有して
   いる特許請求の範囲１ｓ１８項記載の試薬系。 ２８、標識結合対手が標識モノ身ローナル抗−被検体で
   あシ、かつ、高分子結合剤が非標識抗−被検体である特
   許請求の範囲第１８項記載の試薬系。 ２９、非標識抗−被検体がポリクローナルである特許請
   求の範囲第２８項記載の試薬系。 ３０．非標識抗−被検体本モツクローナルである特許請
   求の範囲第２８項記載の試薬系。 ３１、標識モノクローナル抗−被検体と非標識モノクロ
   ーナル抗−被検体とが被検体上の異なる限定的部位に結
   合する特許請求の範囲第３０項記載の試薬系。 ３２、試薬系が固体担体部材に含有されている特許請求
   の範囲第１８項ないし第３１項のいずれかに記載の試薬
   系。