JP2832083B2 - アシル化タンパク質凝集体および免疫検定における干渉の抑制についてのそれらの使用 - Google Patents
アシル化タンパク質凝集体および免疫検定における干渉の抑制についてのそれらの使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、アシル化タンパク質凝集体、その製造、な
らびに免疫検定のための干渉低下剤および結合剤におけ
るその使用、ならびに免疫検定および関連する免疫学的
検出方法における干渉を低下させるためのその使用に関
する。
らびに免疫検定のための干渉低下剤および結合剤におけ
るその使用、ならびに免疫検定および関連する免疫学的
検出方法における干渉を低下させるためのその使用に関
する。
免疫学的検出方法はここ数年非常に重要性を増してき
ている。これらの方法は、薬品、ホルモン、タンパク質
および特に生物試料中の感染性生物の存在を迅速かつ正
確に検出するのに有用である。すべての免疫学的検出方
法において、第一の特異的結合パートナーである検出す
べき物質（アナライトまたはリガンド）と、このリガン
ドと特異的に反応して結合する第二の特異的結合パート
ナーとの間の特異的結合反応が存在する。リガンドと特
異的リガンド結合パートナーとは特異的結合対を形成
し、これは一般的には抗原と、抗体または抗体断片との
複合体である。それぞれの反応において、１より多いリ
ガンドまたは１つの結合パートナーが互いに反応するこ
とも可能である。これらの特異的反応は各種の方法によ
って検出される。一般的には、特異的結合反応の一方を
標識する。一般的な標識方法は、放射性同位体、色素
源、蛍光原または酵素標識を利用する。不均質免疫検定
においては、結合パートナーの一方を固相に固定する。
ている。これらの方法は、薬品、ホルモン、タンパク質
および特に生物試料中の感染性生物の存在を迅速かつ正
確に検出するのに有用である。すべての免疫学的検出方
法において、第一の特異的結合パートナーである検出す
べき物質（アナライトまたはリガンド）と、このリガン
ドと特異的に反応して結合する第二の特異的結合パート
ナーとの間の特異的結合反応が存在する。リガンドと特
異的リガンド結合パートナーとは特異的結合対を形成
し、これは一般的には抗原と、抗体または抗体断片との
複合体である。それぞれの反応において、１より多いリ
ガンドまたは１つの結合パートナーが互いに反応するこ
とも可能である。これらの特異的反応は各種の方法によ
って検出される。一般的には、特異的結合反応の一方を
標識する。一般的な標識方法は、放射性同位体、色素
源、蛍光原または酵素標識を利用する。不均質免疫検定
においては、結合パートナーの一方を固相に固定する。
免疫検定における困難な問題は、免疫検定の特異的結
合パートナーと、試料、試料中に含まれるその他の成
分、および時には固相との間に好ましくない相互作用や
非特異的反応が生じ得ることである。これらの相互作用
は一般にバックグラウンドシグナルの増加とシグナルの
より大きい分散をもたらし、その結果当該試験の感度と
特異性が低下する。標識結合パートナーとの非特異的相
互作用は偽陽性結果をももたらす。すなわち、アナライ
トが存在しない場合でも、そのアナライトの存在が誤っ
て記録される。
合パートナーと、試料、試料中に含まれるその他の成
分、および時には固相との間に好ましくない相互作用や
非特異的反応が生じ得ることである。これらの相互作用
は一般にバックグラウンドシグナルの増加とシグナルの
より大きい分散をもたらし、その結果当該試験の感度と
特異性が低下する。標識結合パートナーとの非特異的相
互作用は偽陽性結果をももたらす。すなわち、アナライ
トが存在しない場合でも、そのアナライトの存在が誤っ
て記録される。
免疫検定におけるこうした非特異的相互作用を減少さ
せるため、様々な試みがなされてきた。各種炭水化物お
よび各種タンパク質、タンパク質混合物、またはタンパ
ク質断片およびそれらの加水分解物が免疫検定における
試験用成分とアナライトとの間の非特異的相互作用を減
少させることが、ある時期知られていた（例えばRobert
son et al.,Journal of Immun.Meth.26,1985,EP−Ａ−2
60903,US−Ａ−4,931,385）。タンパク質粗断片および
粗加水分解物の使用は、それらの中に含まれる不純物が
試験中の干渉作用をもたらすかも知れないという欠点を
有する。さらに酵素的に製造した加水分解物は、その製
造のために使用したプロテアーゼが混入することもあり
得る。また、その分解操作は制御が非常に難しいので、
それらの品質は一般に均一でない。プロテアーゼ混入物
は試験成分に作用することもあり、微量でも試験の実施
および安定性に負の効果をもたらし得る。
せるため、様々な試みがなされてきた。各種炭水化物お
よび各種タンパク質、タンパク質混合物、またはタンパ
ク質断片およびそれらの加水分解物が免疫検定における
試験用成分とアナライトとの間の非特異的相互作用を減
少させることが、ある時期知られていた（例えばRobert
son et al.,Journal of Immun.Meth.26,1985,EP−Ａ−2
60903,US−Ａ−4,931,385）。タンパク質粗断片および
粗加水分解物の使用は、それらの中に含まれる不純物が
試験中の干渉作用をもたらすかも知れないという欠点を
有する。さらに酵素的に製造した加水分解物は、その製
造のために使用したプロテアーゼが混入することもあり
得る。また、その分解操作は制御が非常に難しいので、
それらの品質は一般に均一でない。プロテアーゼ混入物
は試験成分に作用することもあり、微量でも試験の実施
および安定性に負の効果をもたらし得る。
EP−Ａ−0331068に、特異的干渉因子、例えばリウマ
チ因子を減少させるため、重合させた免疫グロブリン
（IgG）の使用が記載されている。しかし、非特異的相
互作用、特に標識結合パートナーとアナライトまたは固
相との間のものは満足し得る程除去することができな
い。さらに、ヒトおよび動物IgGの製造は複雑で費用が
かかる。
チ因子を減少させるため、重合させた免疫グロブリン
（IgG）の使用が記載されている。しかし、非特異的相
互作用、特に標識結合パートナーとアナライトまたは固
相との間のものは満足し得る程除去することができな
い。さらに、ヒトおよび動物IgGの製造は複雑で費用が
かかる。
免疫検定における非特異的相互作用を減少させるた
め、化学修飾したタンパク質、特にスクシニル化タンパ
ク質の使用もすでに記載されている（US−Ａ−5,051,35
6,EP−A 525916）。しかし、特に高分子アナライト、例
えばウイルス抗原の試験においては、従来技術では干渉
低下物質が非常に高濃度でも、満足し得る干渉の低下が
保証されない。
め、化学修飾したタンパク質、特にスクシニル化タンパ
ク質の使用もすでに記載されている（US−Ａ−5,051,35
6,EP−A 525916）。しかし、特に高分子アナライト、例
えばウイルス抗原の試験においては、従来技術では干渉
低下物質が非常に高濃度でも、満足し得る干渉の低下が
保証されない。
したがって、本発明の１つの目的は、従来技術で知ら
れたものに比較して免疫検定における干渉の除去を改善
する新規干渉低下物質および／または干渉低下剤を提供
することである。詳しくは、本発明は特に高分子アナラ
イトを分析する際に、低ブランク値を与え、シグナルの
分析を減少させ、偽陽性結果を起こさないような干渉低
下物質を提供しようとするものである。
れたものに比較して免疫検定における干渉の除去を改善
する新規干渉低下物質および／または干渉低下剤を提供
することである。詳しくは、本発明は特に高分子アナラ
イトを分析する際に、低ブランク値を与え、シグナルの
分析を減少させ、偽陽性結果を起こさないような干渉低
下物質を提供しようとするものである。
この目的は特定のアシル化タンパク質凝集体によって
達成される。
達成される。
本発明の主題は、免疫検定用干渉低下物質としての、
−CO−Ｒ基（Ｒはカルボキシ、ヒドロキシ、SO3Hまたは
PO3H2基で置換されていてもよい、分枝または非分枝C1
−C4アルキル残基）でアシル化されたタンパク質凝集体
である。
−CO−Ｒ基（Ｒはカルボキシ、ヒドロキシ、SO3Hまたは
PO3H2基で置換されていてもよい、分枝または非分枝C1
−C4アルキル残基）でアシル化されたタンパク質凝集体
である。
本発明の別の主題は、１または数種の本発明のアシル
化タンパク質凝集体を含有することを特徴とする、タン
パク質含有干渉低下物質および緩衝液を含む、免疫検定
のための関連干渉低下剤である。
化タンパク質凝集体を含有することを特徴とする、タン
パク質含有干渉低下物質および緩衝液を含む、免疫検定
のための関連干渉低下剤である。
本発明のさらに別の主題は、１または数種の本発明の
干渉低下物質または干渉低下剤が混合されていることを
特徴とする、特異的結合対の一方を含有する、免疫検定
用特異的結合試薬である。
干渉低下物質または干渉低下剤が混合されていることを
特徴とする、特異的結合対の一方を含有する、免疫検定
用特異的結合試薬である。
さらに別の本発明の主題は、免疫検定において使用さ
れる特異的結合対の特異的結合パートナーに本発明の干
渉低下物質または干渉低下剤を接触させることによる、
免疫検定における非特異的相互作用の低下方法である。
れる特異的結合対の特異的結合パートナーに本発明の干
渉低下物質または干渉低下剤を接触させることによる、
免疫検定における非特異的相互作用の低下方法である。
本発明の特別の主題は、 １）特定のリガンドについて検定しようとする試料を、 ａ）１または数種の干渉低下物質、または干渉低下物
質および適当な緩衝液を含有する１または数種の干渉低
下剤、並びに、 ｂ）少なくとも１つは標識されて検出可能な結合対を
形成し得る、特異的結合対の１または数種の特異的結合
パートナー、に接触させ、 ２）試料中のリガンドの存在または存在量の測定指標と
して、標識結合対または特異的結合対の遊離の標識結合
パートナーの存在または存在量を測定することによって
非特異的相互作用を低下させた試料中の免疫学的リガン
ドを定量する方法であって、干渉低下物質が、−CO−Ｒ
基（Ｒはカルボキシ、ヒドロキシ、SO3HまたはPO3H2基
で置換されていてもよい、分枝または非分枝C1−C4アル
キル残基）でアシル化されたタンパク質凝集体であるこ
とを特徴とする方法である。
質および適当な緩衝液を含有する１または数種の干渉低
下剤、並びに、 ｂ）少なくとも１つは標識されて検出可能な結合対を
形成し得る、特異的結合対の１または数種の特異的結合
パートナー、に接触させ、 ２）試料中のリガンドの存在または存在量の測定指標と
して、標識結合対または特異的結合対の遊離の標識結合
パートナーの存在または存在量を測定することによって
非特異的相互作用を低下させた試料中の免疫学的リガン
ドを定量する方法であって、干渉低下物質が、−CO−Ｒ
基（Ｒはカルボキシ、ヒドロキシ、SO3HまたはPO3H2基
で置換されていてもよい、分枝または非分枝C1−C4アル
キル残基）でアシル化されたタンパク質凝集体であるこ
とを特徴とする方法である。
リガンドとは、１または数種の対応する特異的結合パ
ートナーと特異的に反応して複合体を形成する化学的ま
たは生物学的物質である。その例には、タンパク質、ペ
プチド、炭化水素、毒素、ハプテン、薬剤、ウイルス、
菌類、および細菌、抗体またはそれらの成分が含まれ
る。本発明は特にウイルスやウイルスマーカーなどの高
分子リガンドの分析に好適であるが、ホルモンにも好適
であり、特にHIVウイルス、前立腺特異的抗原（PSA）、
甲状腺刺激ホルモン（TSH）、ガン胎児性抗原（CEA）、
Ｂ型肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎表面抗原、HBs）、α−フ
ェトプロテイン（AFP）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（HCG）、黄体形成ホルモン（LH）、濾胞刺激ホルモン
（FSH）、プロラクチン、フェリチン、インスリンなど
の多価タンパク質に好適である。
ートナーと特異的に反応して複合体を形成する化学的ま
たは生物学的物質である。その例には、タンパク質、ペ
プチド、炭化水素、毒素、ハプテン、薬剤、ウイルス、
菌類、および細菌、抗体またはそれらの成分が含まれ
る。本発明は特にウイルスやウイルスマーカーなどの高
分子リガンドの分析に好適であるが、ホルモンにも好適
であり、特にHIVウイルス、前立腺特異的抗原（PSA）、
甲状腺刺激ホルモン（TSH）、ガン胎児性抗原（CEA）、
Ｂ型肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎表面抗原、HBs）、α−フ
ェトプロテイン（AFP）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（HCG）、黄体形成ホルモン（LH）、濾胞刺激ホルモン
（FSH）、プロラクチン、フェリチン、インスリンなど
の多価タンパク質に好適である。
試料は一般に血液、血清または血漿、唾液、尿その他
の体液である。
の体液である。
特異的結合パートナーは、他の生物学的物質と特異的
に反応して特異的結合対を形成するものであれば、いず
れの生物学的または化学的結合パートナーでもよい。こ
れらには、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、ホルモ
ン、アビジン、ビオチン、またはそれらの誘導体が含ま
れる。本発明においては、特異的結合対の好ましいパー
トナーは、抗原と特異的の結合する抗体または抗体断片
である。
に反応して特異的結合対を形成するものであれば、いず
れの生物学的または化学的結合パートナーでもよい。こ
れらには、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、ホルモ
ン、アビジン、ビオチン、またはそれらの誘導体が含ま
れる。本発明においては、特異的結合対の好ましいパー
トナーは、抗原と特異的の結合する抗体または抗体断片
である。
免疫検定においては特異的結合パートナーの少なくと
も１つは標識される。標識により、直接または間接的
に、例えば放射能、化学発光、リン光、蛍光、または電
気化学発光、または可視呈色などの測定シグナルが提供
される。特異的結合パートナーは、検出可能な物質を産
生するための１またはそれ以上の反応に関与する、例え
ば酵素標識、ビオチンまたはアジビン標識などによって
間接的に検出されることもできる。酵素標識、特にペル
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、またはアルカリホスファターゼが好ましい。
別の好ましい標識は化学発光、特に電気化学八景分子に
よるものである。
も１つは標識される。標識により、直接または間接的
に、例えば放射能、化学発光、リン光、蛍光、または電
気化学発光、または可視呈色などの測定シグナルが提供
される。特異的結合パートナーは、検出可能な物質を産
生するための１またはそれ以上の反応に関与する、例え
ば酵素標識、ビオチンまたはアジビン標識などによって
間接的に検出されることもできる。酵素標識、特にペル
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、またはアルカリホスファターゼが好ましい。
別の好ましい標識は化学発光、特に電気化学八景分子に
よるものである。
本発明は干渉低下物質CO−Ｒ基でアシル化されたタン
パク質凝集体であることを特徴としている。タンパク質
凝集体とは、同一のまたは異なった一定のタンパク質単
量体が重合して１つの高分子粒子を形成した凝集体と理
解される。限界的に、タンパク質凝集体は特に、少なく
とも２、好ましくは３〜40000、特に好ましくは30〜600
のタンパク質単量体からなる人工的粒子と理解される。
それらは水性溶液中で個々の分子に分解することがない
ほどきっちりと互いに結合している。好ましい態様にお
いては、タンパク質凝集体は水溶性である。
パク質凝集体であることを特徴としている。タンパク質
凝集体とは、同一のまたは異なった一定のタンパク質単
量体が重合して１つの高分子粒子を形成した凝集体と理
解される。限界的に、タンパク質凝集体は特に、少なく
とも２、好ましくは３〜40000、特に好ましくは30〜600
のタンパク質単量体からなる人工的粒子と理解される。
それらは水性溶液中で個々の分子に分解することがない
ほどきっちりと互いに結合している。好ましい態様にお
いては、タンパク質凝集体は水溶性である。
タンパク質の重合および凝集は熱または化学的処理に
よって実施することができる。
よって実施することができる。
熱重合処理においては、タンパク質単量体は加熱され
ることによって結合して凝集体となる。タンパク質の熱
重合は、アルブミンを例に使用して、EP−Ａ−269092に
記載されている。
ることによって結合して凝集体となる。タンパク質の熱
重合は、アルブミンを例に使用して、EP−Ａ−269092に
記載されている。
タンパク質単量体の化学的重合は、タンパク質を含有
しないホモまたはヘテロ２官能性リンカー分子を使用し
て実施される。タンパク質を結合するためのこうした処
理は当業者には知られており、そして、例えばGB−Ａ−
1505400、EP−Ａ−0122209、またはEP−A269092に記載
されている。タンパク質単量体のヘテロ２官能性リンカ
ーへの結合の例は、ビス（マレイミド）−メチルエステ
ル、ジメチルスベリミデート、ジスクシンイミジル−ス
ベレート、グルタルジアルデヒド、Ｎ−スクシンイミジ
ル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピロネート、Ｎ−
５−アジド−２−ニトロベンゾイルスクシンイミド、Ｎ
−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベ
ンゾエート、またはマレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（MHS）若しくはマレ
イミド−ベンゾイル−NHS（MBS）とＮ−スクシンイミジ
ル−３−アセチル−チオプロピオネート（SATP）の組合
せを使用した反応である。ホモ２官能性リンカーの例に
はジアミオンヘキサン、カルボジイミド、その他が含ま
れる。
しないホモまたはヘテロ２官能性リンカー分子を使用し
て実施される。タンパク質を結合するためのこうした処
理は当業者には知られており、そして、例えばGB−Ａ−
1505400、EP−Ａ−0122209、またはEP−A269092に記載
されている。タンパク質単量体のヘテロ２官能性リンカ
ーへの結合の例は、ビス（マレイミド）−メチルエステ
ル、ジメチルスベリミデート、ジスクシンイミジル−ス
ベレート、グルタルジアルデヒド、Ｎ−スクシンイミジ
ル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピロネート、Ｎ−
５−アジド−２−ニトロベンゾイルスクシンイミド、Ｎ
−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベ
ンゾエート、またはマレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（MHS）若しくはマレ
イミド−ベンゾイル−NHS（MBS）とＮ−スクシンイミジ
ル−３−アセチル−チオプロピオネート（SATP）の組合
せを使用した反応である。ホモ２官能性リンカーの例に
はジアミオンヘキサン、カルボジイミド、その他が含ま
れる。
好ましいタンパク質は、分子量2000以上、特に10000
以上のタンパク質である。アルブミンまたはオボアルブ
ミンが特に好ましく、殊に血清アルブミンが好ましく、
さらにより好ましいのはウシ血清アルブミンである。
以上のタンパク質である。アルブミンまたはオボアルブ
ミンが特に好ましく、殊に血清アルブミンが好ましく、
さらにより好ましいのはウシ血清アルブミンである。
好ましい態様において、本発明の方法は熱処理によっ
て結合して凝集体となったタンパク質重合体を使用す
る。熱重合され、その後アシル化、特にアセチル化また
はスクシニル化されたアルブミン、好ましくは血清アル
ブミン、殊にウシ血清アルブミン（熱処理−RSA）が特
に好ましい。アシル化されていない熱処理−ウシ血清ア
ルブミンはEP−A269092に記載されている。
て結合して凝集体となったタンパク質重合体を使用す
る。熱重合され、その後アシル化、特にアセチル化また
はスクシニル化されたアルブミン、好ましくは血清アル
ブミン、殊にウシ血清アルブミン（熱処理−RSA）が特
に好ましい。アシル化されていない熱処理−ウシ血清ア
ルブミンはEP−A269092に記載されている。
一定の十分均一な大きさの重合タンパク質凝集体粒子
が産生されるように重合を実施し制御するのが効果的で
ある。10〜200nm、特に効果的には20〜50nmの粒子サイ
ズが好ましい。これは分子量240,000Da〜2.2×109Da、
特に好ましくは2.2×106〜35×106Daに相当する。粒子
サイズはPSC（光子相関分光分析）などの通常知られた
方法によって測定することができる。必要ならば、粒子
サイズを本発明に特に好適な範囲にし、特に均一な粒子
サイズを得るために、粗重合混合物からゲル濾過によっ
て分離する。
が産生されるように重合を実施し制御するのが効果的で
ある。10〜200nm、特に効果的には20〜50nmの粒子サイ
ズが好ましい。これは分子量240,000Da〜2.2×109Da、
特に好ましくは2.2×106〜35×106Daに相当する。粒子
サイズはPSC（光子相関分光分析）などの通常知られた
方法によって測定することができる。必要ならば、粒子
サイズを本発明に特に好適な範囲にし、特に均一な粒子
サイズを得るために、粗重合混合物からゲル濾過によっ
て分離する。
重合のために使用するタンパク質単量体は、同一でも
異なっていてもよい。単一のタンパク質単量体を重合さ
せるのが好ましい。タンパク質単量体として、アルブミ
ン単量体が好ましい。すべての動物またはヒトアルブミ
ン、特に血清アルブミンが可能である。ウシ血清アルブ
ミン（BSA）が本発明には特に好適である。
異なっていてもよい。単一のタンパク質単量体を重合さ
せるのが好ましい。タンパク質単量体として、アルブミ
ン単量体が好ましい。すべての動物またはヒトアルブミ
ン、特に血清アルブミンが可能である。ウシ血清アルブ
ミン（BSA）が本発明には特に好適である。
本発明においては、タンパク質凝集体は−CO−Ｒ基
（Ｒはカルボキシヒドロキシ、PO3H2またはSO3Hで置換
されていてもよい、分枝または非分枝C1−C4アルキル残
基）でアシル化される。特に好ましい置換基はアルボキ
シ基である。
（Ｒはカルボキシヒドロキシ、PO3H2またはSO3Hで置換
されていてもよい、分枝または非分枝C1−C4アルキル残
基）でアシル化される。特に好ましい置換基はアルボキ
シ基である。
アシル基は、タンパク質単量体に導入してもよいし、
タンパク質単量体の重合後のタンパク質凝集体に導入し
てもよい。タンパク質のアシル化は既知の方法、好まし
くはアシル無水物またはアシル−Ｏ−スクシンイミドを
使用して実施される。アセチル化またはスクシニル化タ
ンパク質凝集体は、殊にアルブミン凝集体に特に効果的
なことが証明された（Ｒ＝メチルおよび／またはCH2−C
H2−COOH）。アセチル化には酢酸−Ｏ−スクシンイミド
が好ましい。スクシニル化にはスクシン酸無水物が好ま
しい。
タンパク質単量体の重合後のタンパク質凝集体に導入し
てもよい。タンパク質のアシル化は既知の方法、好まし
くはアシル無水物またはアシル−Ｏ−スクシンイミドを
使用して実施される。アセチル化またはスクシニル化タ
ンパク質凝集体は、殊にアルブミン凝集体に特に効果的
なことが証明された（Ｒ＝メチルおよび／またはCH2−C
H2−COOH）。アセチル化には酢酸−Ｏ−スクシンイミド
が好ましい。スクシニル化にはスクシン酸無水物が好ま
しい。
アシル化過程においては、基本的にタンパク質凝集体
の遊離アミノ基（例えばリシン残基）がアシル化され
る。アシル化タンパク質凝集体という用語は、存在する
遊離アミノ基の少なくとも１つがアシル化されているこ
とを意味する。しかし、すべての遊離アミノ基のほぼ完
全なアシル化が好ましい。
の遊離アミノ基（例えばリシン残基）がアシル化され
る。アシル化タンパク質凝集体という用語は、存在する
遊離アミノ基の少なくとも１つがアシル化されているこ
とを意味する。しかし、すべての遊離アミノ基のほぼ完
全なアシル化が好ましい。
本発明の別の主題は、免疫試験用緩衝液と干渉低下用
の本発明の物質とを含有する、免疫試験における干渉を
低下させるための薬剤である。可能な緩衝液は免疫検定
において通常使用されるすべての水性緩衝液であり、リ
ン酸塩、グリシン−HCl若しくはグリシン−NaOH、酢酸
塩、炭酸塩、クエン酸塩、またはイミダゾール/HCl;ト
リエタノールアミン;MES＝（４−モルホリノエタンスル
ホン酸）、TRIS＝（TRIS（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン、HEPES＝（４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジンエタンスルホン酸）、MOPS（３−Ｎ−モル
ホリノ−プロパン−スルホン酸）およびその他の同様な
緩衝液などの有機緩衝液を含む。pH値および緩衝液塩の
濃度は、関与する免疫検定によって決められ、また例え
ば酵素標識のために使用される酵素によっても左右され
る。通常、pH値は４〜９の範囲である。一般的な緩衝液
濃度は1mM〜1Mである。
の本発明の物質とを含有する、免疫試験における干渉を
低下させるための薬剤である。可能な緩衝液は免疫検定
において通常使用されるすべての水性緩衝液であり、リ
ン酸塩、グリシン−HCl若しくはグリシン−NaOH、酢酸
塩、炭酸塩、クエン酸塩、またはイミダゾール/HCl;ト
リエタノールアミン;MES＝（４−モルホリノエタンスル
ホン酸）、TRIS＝（TRIS（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン、HEPES＝（４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジンエタンスルホン酸）、MOPS（３−Ｎ−モル
ホリノ−プロパン−スルホン酸）およびその他の同様な
緩衝液などの有機緩衝液を含む。pH値および緩衝液塩の
濃度は、関与する免疫検定によって決められ、また例え
ば酵素標識のために使用される酵素によっても左右され
る。通常、pH値は４〜９の範囲である。一般的な緩衝液
濃度は1mM〜1Mである。
干渉を低下させるための物質の濃度は、免疫試験成分
の量と、その中に含まれた、干渉を低下させるための薬
剤と接触させようとする干渉成分の量によって決まる。
一般的な免疫検定においては、干渉低下剤中の干渉低下
物質の濃度は、免疫試験成分との接触後の濃度が1mg/ml
〜50mg/ml、好ましくは5mg/ml〜20mg/mlとなるようにす
べきである。場合によっては、200mg/mlの濃度まで必要
なこともある。
の量と、その中に含まれた、干渉を低下させるための薬
剤と接触させようとする干渉成分の量によって決まる。
一般的な免疫検定においては、干渉低下剤中の干渉低下
物質の濃度は、免疫試験成分との接触後の濃度が1mg/ml
〜50mg/ml、好ましくは5mg/ml〜20mg/mlとなるようにす
べきである。場合によっては、200mg/mlの濃度まで必要
なこともある。
さらに、本発明の干渉低下剤は保存剤やその類似の添
加剤を含むことも可能である。免疫検定における使用の
ためには、干渉低下剤は水性緩衝溶液中に存在するのが
効果的である。さらに、これを多孔性の担体材料（フリ
ース（fleese））、例えば試験片上にしみ込ませて使用
すること、および、例えば凍結乾燥品などの固体形状で
の保存も可能である。
加剤を含むことも可能である。免疫検定における使用の
ためには、干渉低下剤は水性緩衝溶液中に存在するのが
効果的である。さらに、これを多孔性の担体材料（フリ
ース（fleese））、例えば試験片上にしみ込ませて使用
すること、および、例えば凍結乾燥品などの固体形状で
の保存も可能である。
本発明の別の主題は、特異的結合対の一方と、本発明
の干渉低下物質または干渉低下剤とを含む特異的免疫結
合試薬である。
の干渉低下物質または干渉低下剤とを含む特異的免疫結
合試薬である。
本発明によれば、この結合試薬は、免疫検定の１また
は数種の特異的結合パートナーと、少なくとも１つの本
発明の干渉低下物質または干渉低下剤とを混合すること
によって得られる。任意に、保存剤または安定剤などの
添加剤を添加してもよい。特異的結合パートナーの量
は、使用する免疫検定、結合すべきパートナーの量、利
用する標識の種類およびその他の因子によって決まる。
一般的に、濃度の範囲は１〜20μg/mlである。
は数種の特異的結合パートナーと、少なくとも１つの本
発明の干渉低下物質または干渉低下剤とを混合すること
によって得られる。任意に、保存剤または安定剤などの
添加剤を添加してもよい。特異的結合パートナーの量
は、使用する免疫検定、結合すべきパートナーの量、利
用する標識の種類およびその他の因子によって決まる。
一般的に、濃度の範囲は１〜20μg/mlである。
干渉低下物質の量は、結合試薬が接触する免疫検定の
試験成分の量および結合試薬中の干渉成分の量によって
決まる。効果的には、結合試薬中の干渉低下物質の濃度
は、免疫試験成分と接触させた後の総濃度が1mg/ml〜50
mg/ml、好ましくは5mg/ml〜20mg/mlとなるように十分高
くすべきである。場合によっては、有効な干渉低下を得
るため、200mg/mlの濃度まで必要なこともある。
試験成分の量および結合試薬中の干渉成分の量によって
決まる。効果的には、結合試薬中の干渉低下物質の濃度
は、免疫試験成分と接触させた後の総濃度が1mg/ml〜50
mg/ml、好ましくは5mg/ml〜20mg/mlとなるように十分高
くすべきである。場合によっては、有効な干渉低下を得
るため、200mg/mlの濃度まで必要なこともある。
この特異的結合試薬は、特異的に結合するリガンドの
存在または不在の検出のために特異的結合パートナーが
有効な場合であれば、いずれの均質または不均質免疫検
定においても利用することができる。その例にはサンド
イッチ検定、競合免疫検定および当業者に知られたその
他の免疫検定が含まれる。試験は溶液中または固体担体
上で実施することができる。
存在または不在の検出のために特異的結合パートナーが
有効な場合であれば、いずれの均質または不均質免疫検
定においても利用することができる。その例にはサンド
イッチ検定、競合免疫検定および当業者に知られたその
他の免疫検定が含まれる。試験は溶液中または固体担体
上で実施することができる。
一般に、本発明の免疫検定は、リガンドを含有する試
料を本発明の溶液中の特異的結合試薬と接触させる形で
実施される。そして、リガンドと特異的結合パートナー
との間で直接または間接的に特異的結合複合体が形成さ
れる。しかし、このリガンド自体が本発明の結合試薬と
して存在し、これが特異的結合パートナーまたは別の本
発明の結合試薬と接触することも可能である。このリガ
ンドと結合パートナーは直接複合体を形成することがで
きる。その場合はこの結合パートナーはリガンドに対し
て特異的である。しかし、結合パートナーが１または数
種の特異的結合分子を介して間接的にリガンドと複合体
を形成し、そしてこれらの結合分子がリガンドと結合す
ることも可能である。
料を本発明の溶液中の特異的結合試薬と接触させる形で
実施される。そして、リガンドと特異的結合パートナー
との間で直接または間接的に特異的結合複合体が形成さ
れる。しかし、このリガンド自体が本発明の結合試薬と
して存在し、これが特異的結合パートナーまたは別の本
発明の結合試薬と接触することも可能である。このリガ
ンドと結合パートナーは直接複合体を形成することがで
きる。その場合はこの結合パートナーはリガンドに対し
て特異的である。しかし、結合パートナーが１または数
種の特異的結合分子を介して間接的にリガンドと複合体
を形成し、そしてこれらの結合分子がリガンドと結合す
ることも可能である。
この手法が固体担体、例えばチューブ、マイクロタイ
タープレート、または試験担体上での不均質免疫検定と
して実施される場合は、リガンドに対する特異的結合パ
ートナーを直接担体上に固定化することができる。しか
し、リガンド結合パートナーに対する特異的結合パート
ナーを担体上に固定化する方が好ましい。好ましい例
は、ビオチニル化結合パートナーに対する特異的結合試
薬としての固定化されたストレプトアビジンである。こ
うした不均質免疫検定の各種変法は当業者に知られてい
る。
タープレート、または試験担体上での不均質免疫検定と
して実施される場合は、リガンドに対する特異的結合パ
ートナーを直接担体上に固定化することができる。しか
し、リガンド結合パートナーに対する特異的結合パート
ナーを担体上に固定化する方が好ましい。好ましい例
は、ビオチニル化結合パートナーに対する特異的結合試
薬としての固定化されたストレプトアビジンである。こ
うした不均質免疫検定の各種変法は当業者に知られてい
る。
競合免疫検定においては、非標識リガンド結合パート
ナーに対してリガンドと標識リガンド類似体とが競合す
る。不均質免疫検定の場合ならば、この結合パートナー
は第２の結合部位、好ましくはビオチンなどの特異的結
合部位を介して固相に結合することもあり得る。遊離の
および結合したリガンド類似体の標識が、測定すべきリ
ガンドの存在または量の測定指標として使用される。
ナーに対してリガンドと標識リガンド類似体とが競合す
る。不均質免疫検定の場合ならば、この結合パートナー
は第２の結合部位、好ましくはビオチンなどの特異的結
合部位を介して固相に結合することもあり得る。遊離の
および結合したリガンド類似体の標識が、測定すべきリ
ガンドの存在または量の測定指標として使用される。
サンドイッチ免疫検定においては、リガンドは第１の
特異的結合部位によって標識リガンド結合パートナーと
結合し、そして第２の結合部位によって非標識リガンド
パートナー（これは不均質免疫検定の場合は固相との別
の特異的結合部位を有する）と結合する。そしてリガン
ド、標識および非標識結合パートナーとの間で複合体が
形成される。不均質試験においては、複合体は非標識結
合パートナーを介して固相に結合し、例えば洗浄によっ
て、遊離の標識結合パートナーから分離することができ
る。遊離のまたは結合した標識リガンド結合パートナー
を、測定すべきリガンドの存在または量の測定指標とし
て、既知の方法で測定する。酵素標識を使用する場合
は、呈色性酵素基質を標識系に添加し、その結果生じる
呈色を測定する。
特異的結合部位によって標識リガンド結合パートナーと
結合し、そして第２の結合部位によって非標識リガンド
パートナー（これは不均質免疫検定の場合は固相との別
の特異的結合部位を有する）と結合する。そしてリガン
ド、標識および非標識結合パートナーとの間で複合体が
形成される。不均質試験においては、複合体は非標識結
合パートナーを介して固相に結合し、例えば洗浄によっ
て、遊離の標識結合パートナーから分離することができ
る。遊離のまたは結合した標識リガンド結合パートナー
を、測定すべきリガンドの存在または量の測定指標とし
て、既知の方法で測定する。酵素標識を使用する場合
は、呈色性酵素基質を標識系に添加し、その結果生じる
呈色を測定する。
免疫測定における使用のためには、本発明の干渉低下
物質と共に本発明の結合試薬として、特異的免疫結合対
の少なくとも１つのパートナー（リガンド、標識リガン
ド類似体、またはリガンド結合パートナー）が存在す
る。効果的なのは、一般的にリガンド結合パートナー、
特に標識リガンド結合パートナーである。
物質と共に本発明の結合試薬として、特異的免疫結合対
の少なくとも１つのパートナー（リガンド、標識リガン
ド類似体、またはリガンド結合パートナー）が存在す
る。効果的なのは、一般的にリガンド結合パートナー、
特に標識リガンド結合パートナーである。
別の本発明の主題は、免疫検定における本発明の干渉
低下物質の使用である。
低下物質の使用である。
特定の本発明の主題は、免疫検定における非特異的相
互作用を低下させるための本発明の干渉低下物質の使用
である。
互作用を低下させるための本発明の干渉低下物質の使用
である。
実験によって、本発明の干渉低下物質は陰性試料の偽
陽性シグナルを有意に低下し、したがって、陽性試料の
ブランク値シグナルを有意に低下することが示された。
さらに、陽性試料のブランク値の分散が減少し、これに
伴って測定値の標準偏差も低下する。これにより動的測
定範囲が広がり、測定自体も感度、正確度共に良くな
る。
陽性シグナルを有意に低下し、したがって、陽性試料の
ブランク値シグナルを有意に低下することが示された。
さらに、陽性試料のブランク値の分散が減少し、これに
伴って測定値の標準偏差も低下する。これにより動的測
定範囲が広がり、測定自体も感度、正確度共に良くな
る。
さらに別の本発明の主題は、本発明の干渉低下物質の
製造方法である。これは、第１段階として、タンパク
質、好ましくはアルブミン、特にウシ血清アルブミンを
２官能性リンカーを使用した化学的凝集反応によつて凝
集させることを特徴としている；化学的凝集反応は好ま
しくは熱凝集反応である。好ましい粒子サイズは10〜20
0nm、特に好ましくは20〜50nmの範囲である。熱凝集は
好ましくは50〜100℃、より特定すると60〜80℃の温度
で実施される。それから第２段階として、適当なアシル
化剤を使用することによって、−CO−Ｒ基によるアシル
化を実施する。アシル化は好ましくは完全に行なわれる
べきで、例えばHPLC操作によってアシル化剤の消費を介
してモニターし得る。
製造方法である。これは、第１段階として、タンパク
質、好ましくはアルブミン、特にウシ血清アルブミンを
２官能性リンカーを使用した化学的凝集反応によつて凝
集させることを特徴としている；化学的凝集反応は好ま
しくは熱凝集反応である。好ましい粒子サイズは10〜20
0nm、特に好ましくは20〜50nmの範囲である。熱凝集は
好ましくは50〜100℃、より特定すると60〜80℃の温度
で実施される。それから第２段階として、適当なアシル
化剤を使用することによって、−CO−Ｒ基によるアシル
化を実施する。アシル化は好ましくは完全に行なわれる
べきで、例えばHPLC操作によってアシル化剤の消費を介
してモニターし得る。
しかし、この方法を逆にUS−Ａ−5,051,356によるタ
ンパク質のアシル化から実施し、つぎにそのアシル化ア
ンパク質の熱および化学的重合を行なうことも可能であ
る。
ンパク質のアシル化から実施し、つぎにそのアシル化ア
ンパク質の熱および化学的重合を行なうことも可能であ
る。
実施例１ アシル化熱処理−BSAのブランク値および干渉の低下効
果 Boehringer Mannheim製のHBsAg Enzymutest を使用
してHBsAg（Ｂ型肝炎表面抗原）サンドイッチ免疫決定
を実施する。
果 Boehringer Mannheim製のHBsAg Enzymutest を使用
してHBsAg（Ｂ型肝炎表面抗原）サンドイッチ免疫決定
を実施する。
ａ）アシル化熱処理−BSAを含まない試験 抱合体（conjugate）を含むインキュベート緩衝液： 40mmolリン酸緩衝液 pH7.0、抗HBsAgビオチン （モノクローナル、マウス）＞240ng/ml ペプトン（ラクトアルブミンの加水分解物）:40mg/ml 抗HBsAg−POD（モノクローナル、マウス）、 POD（ペルオキシダーゼ）:0.04U/ml 基質／色素原緩衝液： リン酸／クエン酸緩衝液100mmol/l、pH4.4; H2O3:3.2mmol/l; 2,2′アジノージ［（３−エチル−ベンズチアゾリン−
スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩（ABTS）:1.9mm
ol/l Boehringer Mannheim製ES600装置を使用して試験を実
施する。
スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩（ABTS）:1.9mm
ol/l Boehringer Mannheim製ES600装置を使用して試験を実
施する。
試料100μｌと、抱合体を含むインキュベート溶液500
μｌとをストレプトアビジン被覆チューブ（Boehringer
Mannheim製Enzymutest ）に注ぎ入れ、インキュベー
トする（37℃、180分）。洗浄液200μｌで洗浄すること
により、固相に結合していない標識抗体をチューブから
除去する。
μｌとをストレプトアビジン被覆チューブ（Boehringer
Mannheim製Enzymutest ）に注ぎ入れ、インキュベー
トする（37℃、180分）。洗浄液200μｌで洗浄すること
により、固相に結合していない標識抗体をチューブから
除去する。
基質／色素原緩衝液500μｌを添加し、60分後、分光
光度計によって422nmにおいて呈色を測定する。
光度計によって422nmにおいて呈色を測定する。
ｂ）各種実験においてインキュベート緩衝液に“干渉低
下剤”を添加する。
下剤”を添加する。
1.本発明のアシル化熱処理−BSA（熱凝集ウシ血清ア
ルブミン）（2mg/ml、粒子サイズ30nm） 2.本発明のスクシニル化熱処理−BSA（2mg/ml、粒子
サイズ30nm） 3.従来技術のアシル化BSA単量体（2mg/ml） 4.従来技術のスクシニル化BSA単量体（2mg/ml） 表１は各種インキュベート緩衝液添加剤１−４を含ま
ない（実施例1a）および含む（実施例1b）各種試料の測
定値を示す。干渉低下剤（実施例1b、1.および2.）を使
用した場合は、従来技術の他の添加剤に比較して、陰性
血清における試験結果のブランク値の有意な低下、そし
てまた標準偏差の低下がある。
ルブミン）（2mg/ml、粒子サイズ30nm） 2.本発明のスクシニル化熱処理−BSA（2mg/ml、粒子
サイズ30nm） 3.従来技術のアシル化BSA単量体（2mg/ml） 4.従来技術のスクシニル化BSA単量体（2mg/ml） 表１は各種インキュベート緩衝液添加剤１−４を含ま
ない（実施例1a）および含む（実施例1b）各種試料の測
定値を示す。干渉低下剤（実施例1b、1.および2.）を使
用した場合は、従来技術の他の添加剤に比較して、陰性
血清における試験結果のブランク値の有意な低下、そし
てまた標準偏差の低下がある。
1b、1,および2.および従来技術の他の添加剤に比較した
陰性血清（NS）の標準偏差の低下 実施例２ 抗HIV−P24試験におけるブランク値の低下 Boehringer Mannheim製のEnzymun−Testまるあーるを
使用してサンドイッチ免疫検定を実施する。
陰性血清（NS）の標準偏差の低下 実施例２ 抗HIV−P24試験におけるブランク値の低下 Boehringer Mannheim製のEnzymun−Testまるあーるを
使用してサンドイッチ免疫検定を実施する。
抱合体を含むインキュベート緩衝液： リン酸緩衝液 40mmol/l;pH7.0 ビオチニル化ウシ血清成分HIV−P24抗体（300ng/ml） POD標識ポリクローナル抗HIV抗体（100mU/ml） アシル化熱処理−BSA、粒子サイズ30nm、2mg/ml（表
２中第２欄） 基質緩衝液： リン酸／クエン酸 50mmol/l;pH4.4 H2O2:1.6mmol/l ABTS:0.9mmol/l 試料200μｌをインキュベート緩衝液500μｌと共にス
トレプトアビジンチューブ内で４時間インキュベートす
る。試料血清はHIV−P24抗原を含んではいけない。続い
て洗浄段階を実施し、溶液を基質緩衝液700μｌと共に
１時間再びインキュベートする。その後、442nmにおい
て測定する。結果を表２に示す。
２中第２欄） 基質緩衝液： リン酸／クエン酸 50mmol/l;pH4.4 H2O2:1.6mmol/l ABTS:0.9mmol/l 試料200μｌをインキュベート緩衝液500μｌと共にス
トレプトアビジンチューブ内で４時間インキュベートす
る。試料血清はHIV−P24抗原を含んではいけない。続い
て洗浄段階を実施し、溶液を基質緩衝液700μｌと共に
１時間再びインキュベートする。その後、442nmにおい
て測定する。結果を表２に示す。
第１欄はインキュベート緩衝液中にアセチル化熱処理
−BSAを添加しないで測定した偽陽性値（μg/ml）を示
す；第２欄はインキュベート緩衝液中にアセチル化熱処
理−BSAを添加した測定値を示す。第２欄は本発明の物
質が偽陽性シグナルを64％まで低下させることを示して
いる。
−BSAを添加しないで測定した偽陽性値（μg/ml）を示
す；第２欄はインキュベート緩衝液中にアセチル化熱処
理−BSAを添加した測定値を示す。第２欄は本発明の物
質が偽陽性シグナルを64％まで低下させることを示して
いる。
実施例３ PSA（前立腺特異的抗原）免疫検定における、タンパ
ク質加水分解物（ペプトン）および従来技術の特異的干
渉低下タンパク質による干渉の低下と比較した、アセチ
ル化熱処理−BSAによる干渉の低下。
ク質加水分解物（ペプトン）および従来技術の特異的干
渉低下タンパク質による干渉の低下と比較した、アセチ
ル化熱処理−BSAによる干渉の低下。
Boehringer Mannheim GmbH製のEnzymun−Test PSA I
Iを使用して免疫検定を実施する。
Iを使用して免疫検定を実施する。
1.抱合体を含むインキュベート緩衝液： リン酸塩緩衝液 40mmol/l;pH7.3 MAB＜PSA＞マウス−PR12−Fab−POD 70mU/ml MAB＜PSA＞マウス−PR1−IgG−ビオチン 1ng/ml 各種干渉低下タンパク質をインキュベート緩衝液に添
加する（表３中の添加剤１、2a−ｃ）。
加する（表３中の添加剤１、2a−ｃ）。
2.基質緩衝液： リン酸／クエン酸緩衝液 100mmol/l;pH4.4 H2O2:3.2mmol/l 色素原ABTS:1.9mmol/l 試料50μｍ、抱合体を含むインキュベート緩衝液700m
l（インキュベート時間90分）、洗浄溶液200ml、基質緩
衝液700μｌ（インキュベート時間30分）として、実施
例１にしたがって試験を実施する。
l（インキュベート時間90分）、洗浄溶液200ml、基質緩
衝液700μｌ（インキュベート時間30分）として、実施
例１にしたがって試験を実施する。
添加剤１は、干渉低下物質として、シグナルを発生す
る免疫成分（抗体または抗体断片抱合体）に対して干渉
作用を及ぼす成分と結合する、PE−Ａ−331062のサブク
ラス（subclass）特異的IgG重合体（抗PSA抗体多重抱合
体）である。この例においては、効果は見られない（右
欄“添加剤１を含まない”参照）。
る免疫成分（抗体または抗体断片抱合体）に対して干渉
作用を及ぼす成分と結合する、PE−Ａ−331062のサブク
ラス（subclass）特異的IgG重合体（抗PSA抗体多重抱合
体）である。この例においては、効果は見られない（右
欄“添加剤１を含まない”参照）。
添加剤2aは各種濃度の本発明の干渉低下物質である
（アセチル化熱処理−BSA重合体、粒子サイズ30nm）。
実験によると、添加剤2aを添加しない場合に偽陽性が測
定される女性血清（NS）における干渉に対し、濃度0.1m
g/mlのとき特に効果的であることが示される。動的測定
範囲も、シグナルに陰性影響を及ぼすことなくブランク
値（スタンダードＡ）を低下させることでかなり改善さ
れる。（検量線：スタンダードＡ〜Ｅ）。
（アセチル化熱処理−BSA重合体、粒子サイズ30nm）。
実験によると、添加剤2aを添加しない場合に偽陽性が測
定される女性血清（NS）における干渉に対し、濃度0.1m
g/mlのとき特に効果的であることが示される。動的測定
範囲も、シグナルに陰性影響を及ぼすことなくブランク
値（スタンダードＡ）を低下させることでかなり改善さ
れる。（検量線：スタンダードＡ〜Ｅ）。
添加剤2bは固相のために使用される溶解状態の干渉低
下タンパク質重合体である（熱処理−BSA）。このイン
キュベート緩衝液添加剤は、表中の例（0.1mg/ml）ばか
りでなく0.2〜1.6mg/mlという、より高濃度範囲におい
ても、干渉シグナルに何も影響を示さない。アナライト
濃度を増加させると（スタンダードＡ〜Ｅ）、検量線が
水平になってしまう。
下タンパク質重合体である（熱処理−BSA）。このイン
キュベート緩衝液添加剤は、表中の例（0.1mg/ml）ばか
りでなく0.2〜1.6mg/mlという、より高濃度範囲におい
ても、干渉シグナルに何も影響を示さない。アナライト
濃度を増加させると（スタンダードＡ〜Ｅ）、検量線が
水平になってしまう。
添加剤2cは従来技術のタンパク質加水分解物である
（アルブミン加水分解物）。認識し得る干渉低下のため
には高濃度が必要である（5mg/ml）。
（アルブミン加水分解物）。認識し得る干渉低下のため
には高濃度が必要である（5mg/ml）。
実施例４ この実施例は実施例３と同様に実施される；ただし、
インキュベート緩衝液は添加剤を含まない（表４中の対
照１）か、または8nm〜74nmの範囲の各種粒子サイズの
スクシニル化熱処理−BSAを0.35mg/mlの濃度で含む。
インキュベート緩衝液は添加剤を含まない（表４中の対
照１）か、または8nm〜74nmの範囲の各種粒子サイズの
スクシニル化熱処理−BSAを0.35mg/mlの濃度で含む。
実施例５ アセチル化熱凝集ウシ血清アルブミン（アセチル化熱処
理BSA）の調製 1.熱凝集BSAの調製 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100ml中でBSA1g
を70℃に加熱し、４時間この温度のまま保つ。その後こ
の溶液を冷却し、濾過し、超遠心（排除限界:30,000D
a）によって50mg/mlに濃縮する。その後30倍容量の再蒸
留水に対して透析を実施し、次に凍結乾燥する。生成物
は分子量約700,000、粒子サイズ30±8nm（光子相関分光
分析法（PCS）によって測定）である。
理BSA）の調製 1.熱凝集BSAの調製 50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）100ml中でBSA1g
を70℃に加熱し、４時間この温度のまま保つ。その後こ
の溶液を冷却し、濾過し、超遠心（排除限界:30,000D
a）によって50mg/mlに濃縮する。その後30倍容量の再蒸
留水に対して透析を実施し、次に凍結乾燥する。生成物
は分子量約700,000、粒子サイズ30±8nm（光子相関分光
分析法（PCS）によって測定）である。
2.熱処理−BSAのアセチル化 100mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中の熱凝集BSA4
000gを25℃に加熱する。OD280nmでタンパク質濃度を測
定し、タンパク質濃度10mg/mlに調整する。必要なら
ば、正しい値に調整するために10mMリン酸カリウム緩衝
液（pH8.0）を使用することができる。この熱処理−BSA
溶液を撹拌容器に注ぎ入れ、25℃に加熱する。室温で、
ヒドロキシスクシンイミドエステル中、濃度100mg/mlの
酢酸を無水DMSOに溶解する。アセチル化熱処理−BSAlL
あたりスクシンイミドエステル溶液11.5mlを添加する。
こうして得られたDMSO中の最終濃度はおよそ１％とな
る。pH値をチェック（目標値6.5〜９）した後、アセチ
ル化混合物を25℃において120分撹拌する。TSK3000/HPL
Cによって酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
の低下をモニターする（260nmで検出）。インキュベー
ト後、リシン塩酸溶液を最終濃度5mMとなるように添加
することによって、アセチル化処理を停止させる。
000gを25℃に加熱する。OD280nmでタンパク質濃度を測
定し、タンパク質濃度10mg/mlに調整する。必要なら
ば、正しい値に調整するために10mMリン酸カリウム緩衝
液（pH8.0）を使用することができる。この熱処理−BSA
溶液を撹拌容器に注ぎ入れ、25℃に加熱する。室温で、
ヒドロキシスクシンイミドエステル中、濃度100mg/mlの
酢酸を無水DMSOに溶解する。アセチル化熱処理−BSAlL
あたりスクシンイミドエステル溶液11.5mlを添加する。
こうして得られたDMSO中の最終濃度はおよそ１％とな
る。pH値をチェック（目標値6.5〜９）した後、アセチ
ル化混合物を25℃において120分撹拌する。TSK3000/HPL
Cによって酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
の低下をモニターする（260nmで検出）。インキュベー
ト後、リシン塩酸溶液を最終濃度5mMとなるように添加
することによって、アセチル化処理を停止させる。
反応を停止させたアセチル化物をフィルタープレスに
よって濾過する。続いてプレスを水で洗浄する。濾液と
洗浄液を混合する。
よって濾過する。続いてプレスを水で洗浄する。濾液と
洗浄液を混合する。
混合濾液をポリスルホン膜10KDによって50Lに濃縮す
る。濃縮溶液を10倍容量の20mMリン酸カリウム溶液（pH
7.0）に対してダイアフィルトレートする。その後ダイ
アフィルトレート緩衝液を使用して濃縮物を２倍容量に
希釈し、それから再び最初の容量に濃縮する。TSK3000H
PLC分析によって、ダイアフィルトレートの結果を検定
する。溶液を80±10mg/mlに濃縮し、続いて0.1％クロロ
アセトアミドおよび0.01％MIT（メチルイソチアゾロ
ン）で安定化する。
る。濃縮溶液を10倍容量の20mMリン酸カリウム溶液（pH
7.0）に対してダイアフィルトレートする。その後ダイ
アフィルトレート緩衝液を使用して濃縮物を２倍容量に
希釈し、それから再び最初の容量に濃縮する。TSK3000H
PLC分析によって、ダイアフィルトレートの結果を検定
する。溶液を80±10mg/mlに濃縮し、続いて0.1％クロロ
アセトアミドおよび0.01％MIT（メチルイソチアゾロ
ン）で安定化する。
PSC測定によると、粒子サイスは30nm±15であった。
実施例６ 化学的に重合したアセチル化ウシ血清アルブミン（Ｐ
−BSA−Succ）の調製。
−BSA−Succ）の調製。
1.ウシ血清アルブミン（BSA）の重合 ａ）マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（MHS）によるBSAの活性化 BSA3gを30mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.1）30ml中に
溶解し、MHS180mg/ジメチルスルホキシド（DMSO）1ml溶
液0.6mlを加える。25℃で１時間インキュベート後、溶
液を10mMリシン濃度となるようにし、150倍容量の透析
緩衝液（15mMリン酸カリウム緩衝液/50mM NaCl/1mMエチ
レンジアミンテトラアセテート（EDTA）/pH6.2）に対し
て透析する。
ンイミド（MHS）によるBSAの活性化 BSA3gを30mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.1）30ml中に
溶解し、MHS180mg/ジメチルスルホキシド（DMSO）1ml溶
液0.6mlを加える。25℃で１時間インキュベート後、溶
液を10mMリシン濃度となるようにし、150倍容量の透析
緩衝液（15mMリン酸カリウム緩衝液/50mM NaCl/1mMエチ
レンジアミンテトラアセテート（EDTA）/pH6.2）に対し
て透析する。
ｂ）Ｓ−アセチルチオプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（SATP）によるBSAの活性化 BSA3gを30mMリン酸カリウム緩衝液30ml中に溶解し、S
ATP140mg/DMSO1ml溶液0.6mlを加える。25℃で１時間イ
ンキュベート後、溶液を10mMリシン濃度となるように
し、150倍容量の透析緩衝液（15mMリン酸カリウム緩衝
液/50mM NaCl/1mM EDTA/pH6.2）に対して透析する。
スクシンイミド（SATP）によるBSAの活性化 BSA3gを30mMリン酸カリウム緩衝液30ml中に溶解し、S
ATP140mg/DMSO1ml溶液0.6mlを加える。25℃で１時間イ
ンキュベート後、溶液を10mMリシン濃度となるように
し、150倍容量の透析緩衝液（15mMリン酸カリウム緩衝
液/50mM NaCl/1mM EDTA/pH6.2）に対して透析する。
ｃ）活性化BSA成分の重合 （ｂ）のSATP活性化BSA含有溶液を25mMヒドロキシル
アミン濃度とし、pHを7.5に調整し、25℃で１時間イン
キュベートする。続いて、（ａ）のMHS活性化BSA含有溶
液を加え、25℃でさらに45分インキュベートを続ける。
10mMシステインを添加することによって、重合を停止さ
せる。さらに30分後、溶液を25mM N−メチルマレイミド
濃度とし、150倍容量の50mMリン酸カリウム緩衝液/0.15
M NaCl/pH7.2に対して透析する。
アミン濃度とし、pHを7.5に調整し、25℃で１時間イン
キュベートする。続いて、（ａ）のMHS活性化BSA含有溶
液を加え、25℃でさらに45分インキュベートを続ける。
10mMシステインを添加することによって、重合を停止さ
せる。さらに30分後、溶液を25mM N−メチルマレイミド
濃度とし、150倍容量の50mMリン酸カリウム緩衝液/0.15
M NaCl/pH7.2に対して透析する。
2.スクシニル化 スクシン酸無水物0.1g/DMSO1ml溶液2.6mlを（1c）の
透析した重合BSAに添加する。25℃で60分インキュベー
ト後、溶液を50mMリシン濃度とし、150倍容量の20mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH6.8）に対して透析し、凍結乾
燥する。
透析した重合BSAに添加する。25℃で60分インキュベー
ト後、溶液を50mMリシン濃度とし、150倍容量の20mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH6.8）に対して透析し、凍結乾
燥する。
実施例７ トロポニン−Ｔサンドイッチ免疫検定における、重合ス
クシニル化BSA（Ｐ−BSA−Succ）による、干渉の低下 Boehringer Mannheim GmbH製のEnzymun−Test Tropo
nin Tを使用して試験を実施する。
クシニル化BSA（Ｐ−BSA−Succ）による、干渉の低下 Boehringer Mannheim GmbH製のEnzymun−Test Tropo
nin Tを使用して試験を実施する。
1.抱合体を含むインキュベート緩衝液： 40mMリン酸塩緩衝液 pH7.0 MAB＜トロポニン−Ｔ＞Ｍ−７−Fab−POD 150mU/ml MAB＜トロポニン−Ｔ＞Ｍ−11−７−IgG−ビチオン
2.5μg/ml Ｐ−BSA−Succ0.5mg/ml;比較試験においてはインキュ
ーベート緩衝液はＰ−BSA−Succを含まない。
2.5μg/ml Ｐ−BSA−Succ0.5mg/ml;比較試験においてはインキュ
ーベート緩衝液はＰ−BSA−Succを含まない。
2.基質緩衝液： リン酸／クエン酸緩衝液 100mM、pH4.4 H2O2:3.2mM 色素原ABTS:1.9mM 試料140μｌ、抱合体を含むインキュベート緩衝液700
μｌ（インキュベート時間30分）、洗浄溶液200μｌ、
基質緩衝液700μｌ（インキュベート時間15分）とし
て、実施例１にしたがって試験を実施した。
μｌ（インキュベート時間30分）、洗浄溶液200μｌ、
基質緩衝液700μｌ（インキュベート時間15分）とし
て、実施例１にしたがって試験を実施した。
インキュベート緩衝液にＰ−BSA−Succを添加しない
場合は、表Ａに掲げた血清への干渉は、明らかにトロポ
ニンT0.2ng/mlのカットオフ（cut−off）値以上とな
る。Ｐ−BSA−Succを0.5mg/ml添加した場合は、すべて
の血清の非特異的シグナルをカットオフ値以下とし、お
よび／または場合によっては干渉を完全に解消する。干
渉低下タンパク質を添加した場合は、検量線の傾斜に何
ら有意な効果をもたらさない。すなわち、陽性血清の検
出率は影響されない。重合体スクシニル化BSA（Ｐ−BSA
−Succ）とおよそ同程度の干渉低下を得るためには、従
来技術のスクシニル化BSA（BSA−Succ）単量体50倍高濃
度で使用しなければならない（表Ｂ）。その場合は、検
量線が強く水平化し、逆に陽性ヒト血清の高すぎる検出
率をもたらす（表Ｂ）。従って、BSA−Succ単量体はト
ロポニン−Ｔ試験には使用することができない。
場合は、表Ａに掲げた血清への干渉は、明らかにトロポ
ニンT0.2ng/mlのカットオフ（cut−off）値以上とな
る。Ｐ−BSA−Succを0.5mg/ml添加した場合は、すべて
の血清の非特異的シグナルをカットオフ値以下とし、お
よび／または場合によっては干渉を完全に解消する。干
渉低下タンパク質を添加した場合は、検量線の傾斜に何
ら有意な効果をもたらさない。すなわち、陽性血清の検
出率は影響されない。重合体スクシニル化BSA（Ｐ−BSA
−Succ）とおよそ同程度の干渉低下を得るためには、従
来技術のスクシニル化BSA（BSA−Succ）単量体50倍高濃
度で使用しなければならない（表Ｂ）。その場合は、検
量線が強く水平化し、逆に陽性ヒト血清の高すぎる検出
率をもたらす（表Ｂ）。従って、BSA−Succ単量体はト
ロポニン−Ｔ試験には使用することができない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カウフマン，マーティン ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，フィッシェリード 29番 地 (56)参考文献 特開 平１−305357（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−322895（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−254869（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−49258（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−165055（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/531
Claims (15)
- 【請求項１】免疫検定における非特異的相互作用を低下
させるためのタンパク質含有物質であって、干渉低下物
質が、−CO−Ｒ基（Ｒはカルボキシ、ヒドロキシ、SO3H
またはPO3H2基で置換されていてもよい、分枝または非
分枝C1−C4アルキル残基）でアシル化された粒径20−50
nmのタンパク質凝集体のみから実質的になることを特徴
とする物質。 - 【請求項２】タンパク質がアルブミンであることを特徴
とする、請求の範囲１記載の干渉低下物質。 - 【請求項３】アルブミンがウシ血清アルブミンであるこ
とを特徴とする、請求の範囲２記載の干渉低下物質。 - 【請求項４】Ｒがメチル基または−CH2CH2−COOH基であ
ることを特徴とする、請求の範囲１〜３記載の干渉低下
物質。 - 【請求項５】タンパク質凝集体がホモまたはヘテロ２官
能性リンカーによって化学的に凝集したものであること
を特徴とする、請求の範囲１〜４のいずれか１つに記載
の干渉低下物質。 - 【請求項６】タンパク質凝集体が熱凝集したものである
ことを特徴とする、請求の範囲１〜４のいずれか１つに
記載の干渉低下物質。 - 【請求項７】緩衝液およびタンパク質含有干渉低下物質
を含む、免疫検定における非特異的相互作用を低下させ
るための干渉低下剤であって、請求の範囲１〜６のいず
れか１つに記載の干渉低下物質を含有することを特徴と
する干渉低下剤。 - 【請求項８】特異的結合対の特異的結合パートナーと、
タンパク質含有干渉低下物質または干渉低下剤とを含
む、免疫検定用特異的結合試薬であって、請求の範囲１
〜６のいずれか１つに記載の干渉低下物質、または請求
の範囲７記載の干渉低下剤を含有することを特徴とする
試薬。 - 【請求項９】結合パートナーが標識またはビオチニル化
結合パートナーであることを特徴とする、請求の範囲８
記載の特異的結合試薬。 - 【請求項１０】1.リガンドについて試験しようとする試
料を、 ａ）１または数種のタンパク質含有干渉低下物質、また
はタンパク質含有干渉低下物質および適当な緩衝液を含
有する１または数種のタンパク質含有干渉低下剤、並び
に ｂ）少なくとも１つは標識されて検出可能な結合対を形
成し得る、特異的結合対の１または数種の特異的結合パ
ートナー、に接触させ、 2.試料中のリガンドの存在または存在量の測定指標とし
て、標識結合対または特異的結合対の遊離の標識結合パ
ートナーの存在または存在量を定量することによって、
非特異的相互作用の低下の下で試料中の免疫リガンドを
定量する方法であって、干渉低下物質が請求の範囲１〜
６のいずれか１つに記載のアシル化されたタンパク質凝
集体のみから実質的になることを特徴する方法。 - 【請求項１１】請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載
の干渉低下物質、または請求の範囲７記載の干渉低下剤
を使用することを特徴とする免疫学的検定法。 - 【請求項１２】請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載
の干渉低下物質、または請求の範囲７記載の干渉低下剤
を使用して非特異的相互作用を低下させることを特徴と
する免疫学的検定法。 - 【請求項１３】ａ）タンパク質を重合させて凝集体を形
成させ、ｂ）このタンパク質凝集体を対応するアシル化
剤によってアシル化することを特徴とする、請求の範囲
１記載の干渉低下物質の製造方法。 - 【請求項１４】タンパク質を加熱によって重合させるこ
とを特徴とする、請求の範囲13記載の方法。 - 【請求項１５】タンパク質凝集体をアセチル−Ｏ−スク
シンイミドまたはスクシン酸無水物によってアセチル化
することを特徴とする、請求の範囲13記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4343479A DE4343479A1 (de) | 1993-12-21 | 1993-12-21 | Acylierte Proteinaggregate und deren Verwendung zur Entstörung von Immunoassays |
| DE4343479.7 | 1993-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08506907A JPH08506907A (ja) | 1996-07-23 |
| JP2832083B2 true JP2832083B2 (ja) | 1998-12-02 |
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ID=6505533
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN (1) | CN1115563C (ja) |
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| DE (2) | DE4343479A1 (ja) |
| ES (1) | ES2206490T3 (ja) |
| PT (1) | PT685070E (ja) |
| WO (1) | WO1995017668A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2009210506A (ja) * | 2008-03-06 | 2009-09-17 | Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk | 免疫クロマトグラフィー用展開溶媒 |
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| WO2000011208A1 (en) * | 1998-08-25 | 2000-03-02 | University Of Washington | Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures |
| US6629040B1 (en) | 1999-03-19 | 2003-09-30 | University Of Washington | Isotope distribution encoded tags for protein identification |
| WO2001096869A1 (en) | 2000-06-12 | 2001-12-20 | University Of Washington | Selective labeling and isolation of phosphopeptides and applications to proteome analysis |
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| WO2006031216A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Metrika, Inc. | Quantitative immunoassays using tag/anti-tag chemistry |
| EP2095107B1 (en) | 2006-11-14 | 2014-07-02 | Alere San Diego, Inc. | Methods for risk assignment |
| EP2728354B1 (en) * | 2011-06-29 | 2018-06-13 | LSI Medience Corporation | Non-specific reaction inhibitor, method for inhibiting non-specific reaction, and kit |
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| WO2019130560A1 (ja) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | 株式会社ニチレイバイオサイエンス | ブロッキング試薬 |
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1993
- 1993-12-21 DE DE4343479A patent/DE4343479A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-12-21 PT PT95905571T patent/PT685070E/pt unknown
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