ES2206490T3 - Agregados proteinicos acilados y su utilizacion para la eliminacion de perturbaciones en ensayos inmunologicos. - Google Patents
Agregados proteinicos acilados y su utilizacion para la eliminacion de perturbaciones en ensayos inmunologicos.Info
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Abstract
EL OBJETIVO DE LA INVENCION SON MEDIOS DE ELIMINACION DE PERTURBACIONES QUE CONTIENEN PROTEINA DE INMUNOASAIS A BASE DE AGREGADOS DE PROTEINA, QUE ESTAN ACILADOS CON GRUPOS - O - R, DONDE R REPRESENTA UN RESTO C{SUB.1} - C{SUB.4} ALQUIL DE CADENA RAMIFICADA O NO RAMIFICADA, QUE PUEDE SER SUSTITUIDO CON HIDROXI, CARBOXI, SO{SUB.3}H O PO{SUB.3}HO}{SUB.2}. ESTAS SUSTANCIAS DE ELIMINACION DE PERTURBACIONES PUEDEN SER UTILIZADAS CONJUNTAMENTE CON UN AMORTIGUADOR COMO MEDIO DE ELIMINACION DE PERTURBACIONES O CONJUNTAMENTE CON UN PARTNER DE ENLACE INMUNOLOGICO COMO REACTIVO DE ENLACE PARA EVITAR EFECTOS DE CAMBIO NO ESPECIFICOS EN INMUNOASAIS. UN OTRO OBJETIVO DE LA INVENCION ES UN PROCESO DE PRUEBA INMUNOLOGICO BAJO UTILIZACION DE ESTAS SUSTANCIAS DE ELIMINACION DE PERTURBACIONES.
Description
Agregados proteínicos acilados y su utilización
para la eliminación de perturbaciones en ensayos inmunológicos.
El invento se refiere a agregados proteínicos
acilados, a su preparación y a su empleo en un agente para la
eliminación de perturbaciones y en un reactivo de fijación para
ensayos inmunológicos, así como a su utilización para la eliminación
de perturbaciones en ensayos inmunológicos, al igual que a un
correspondiente procedimiento inmunológico de detección.
Los métodos inmunológicos de detección han
alcanzado una gran importancia en los últimos años. Con ellos se
puede detectar con rapidez y exactitud la presencia de
medicamentos, hormonas, proteínas, y en particular de organismos
infecciosos, en muestras biológicas. En todos los métodos
inmunológicos de detección se llega a una reacción de fijación
específica entre un primer partícipe específico en la fijación, a
saber la sustancia que se debe detectar ("analito" o
"ligando"), y un segundo partícipe específico en la fijación,
que reacciona específicamente con el ligando, o que lo fija. El
ligando y los partícipes específicos en la fijación al ligando, a
saber los denominados partícipes de un par de fijación específica,
forman en tal caso un par de fijación específica, por lo general un
complejo entre un antígeno y un anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo. En este caso pueden reaccionar uno con otro en cada
reacción más de un ligando o más de un partícipe en la fijación.
Estas reacciones específicas de fijación se detectan de diferentes
maneras. Por lo general, un partícipe en la reacción específica de
fijación está marcado. Métodos usuales de marcación son los que usan
radioisótopos, cromógenos, fluorógenos o una marcación enzimática.
En el caso de ensayos inmunológicos heterogéneos, uno de los
partícipes en la fijación está inmovilizado junto a una fase
sólida.
Un muy grave problema en el caso de ensayos
inmunológicos consiste en que entre partícipes específicos en la
fijación del ensayo inmunológico y la muestra, los constituyentes
adicionales contenidos en la muestra y eventualmente la fase sólida
pueden efectuarse indeseadas interacciones y reacciones
inespecíficas de fijación. Tales interacciones producen por lo
general un aumento de la señal de fondo y también una dispersión
más fuerte de las señales y por consiguiente una sensibilidad y una
especificidad disminuidas del correspondiente sistema de ensayo.
Mediante una interacción inespecífica con el partícipe en la
fijación que está marcado, pueden resultar también mediciones
falsamente positivas, es decir puede ocurrir que se mida falsamente
la presencia de un analito, también en el caso de su ausencia.
Se emprendieron diferentes intentos de reducir
estas interacciones inespecíficas en ensayos inmunológicos. Desde
hace mucho tiempo es conocido que diferentes componentes del tipo de
hidratos de carbono y diferentes proteínas, mezclas de proteínas o
fracciones de proteínas, así como sus materiales hidrolizados,
pueden reducir las interacciones inespecíficas entre los
componentes del sistema de ensayo y el analito en ensayos
inmunológicos (por ejemplo Robertson y colaboradores, Journal of
Immun. Meth. 26, 1985, 195, documento de solicitud de patente
europea EP-A-260.903, documento de
patente de los EE.UU.
US-A-4.931.385). El empleo de
fracciones brutas de proteínas y materiales hidrolizados brutos
tiene la desventaja de que mediante las impurezas contenidas en
ellos pueden provocarse de nuevo por su parte otras perturbaciones
del sistema de ensayo. Los materiales hidrolizados producidos por
vía enzimática pueden además estar contaminados con las proteasas
utilizadas en la preparación, y por regla general no presentan
ninguna calidad uniforme, puesto que la disociación se puede
controlar solamente con dificultades. Las contaminaciones de
proteasas pueden atacar a los componentes del sistema de ensayo y
ya en pequeñas cantidades conducen al perjuicio de las funciones del
sistema de ensayo y de la estabilidad en almacenamiento.
El documento
EP-A-0.331.068 describe el empleo de
inmunoglobulinas (IgG) polimerizadas para la reducción de factores
perturbadores específicos, tales como p.ej. factores de reuma. Sin
embargo, con ello no se pueden excluir de una manera satisfactoria
interacciones inespecíficas, en particular las de los partícipes en
la fijación, que están marcados, con analitos o con la fase sólida.
Además de ello, la obtención de una IgG humana o animal es
complicada y cara.
Para la disminución de interacciones
inespecíficas en ensayos inmunológicos se describió también el
empleo de proteínas modificadas químicamente, en particular
proteínas succiniladas (documentos
US-A-5.051.356, EP-A
525.916, y 7. Immunol Meth. 85:409-419 (1985)). Sin
embargo, en particular en el caso de análisis en cuanto a analitos
de alto peso molecular, por ejemplo antígenos de virus, de acuerdo
con el estado de la técnica no se garantiza ninguna eliminación
satisfactoria de perturbaciones del sistema de ensayo, a pesar de
usarse concentraciones muy altas de sustancias eliminadoras de
perturbaciones causadas por proteínas.
Por lo tanto, fue misión del invento poner a
disposición nuevas sustancias eliminadoras de perturbaciones, o
nuevos agentes eliminadores de perturbaciones, que produzcan una
mejor eliminación de perturbaciones en el caso de ensayos
inmunológicos que las sustancias y los agentes del estado de la
técnica. En particular, las sustancias eliminadoras de
perturbaciones deberían producir un valor en vacío más bajo, una
disminución de la dispersión de señales y la evitación de resultados
falsamente positivos de los análisis, en particular en el caso del
análisis de analitos de alto peso molecular.
El problema planteado por esta misión se resuelve
mediante agregados proteínicos específicamente acilados.
Son objeto del invento agregados proteínicos como
sustancias eliminadoras de perturbaciones para ensayos
inmunológicos, que están acilados con grupos -CO-R,
representando R un radical alquilo C1-C4 ramificado
o sin ramificar, que puede estar sustituido con carboxi, hidroxi,
SO_{3}H o PO_{3}H_{2}.
Un objeto adicional del invento es un
correspondiente agente eliminador de perturbaciones para ensayos
inmunológicos, que contiene una sustancia eliminadora de
perturbaciones con un contenido en proteínas y un tampón,
caracterizado porque contiene uno o varios de los agregados
proteínicos acilados conformes al invento.
Un objeto adicional del invento es un reactivo
específico de fijación para ensayos inmunológicos, que contiene un
partícipe de un par de fijación específica, caracterizado porque
contiene adicionalmente una o varias de las sustancias eliminadoras
de perturbaciones, o uno o varios de los agentes eliminadores de
perturbaciones, que son conformes al invento.
Un objeto adicional del invento es un
procedimiento para disminuir interacciones inespecíficas en ensayos
inmunológicos por puesta en contacto de la sustancia eliminadora de
perturbaciones conforme al invento, o del agente eliminador de
perturbaciones conforme al invento, con los partícipes específicos
en la fijación de un par de fijación específica, que se utilizan en
un ensayo inmunológico.
En particular, es objeto del invento un
procedimiento para la determinación de ligandos inmunológicos en
una muestra, mediando reducción de interacciones inespecíficas,
por
1) puesta en contacto de la muestra que se ha de
investigar en cuanto al ligando con
- a) una o varias sustancias eliminadoras de perturbaciones, o con uno o varios agentes eliminadores de perturbaciones, que contienen una sustancia eliminadora de perturbaciones y un tampón apropiado, y
- b) uno o varios partícipes específicos en la fijación de pares de fijación específica, realizándose que por lo menos uno de los partícipes en la fijación está marcado y forma un par de fijación detectable; y por
2) medición de la presencia o de la cantidad del
par de fijación que está marcado o del partícipe libre marcado de
un par de fijación específica, como medida de la presencia o la
cantidad del ligando en la muestra,
caracterizado porque
la sustancia eliminadora de perturbaciones es un
agregado proteínico, que está acilado con grupos
-CO-R, significando R un radical alquilo
C1-C4 ramificado o sin ramificar, que puede estar
sustituido con carboxi, hidroxi, SO_{3}H o PO_{3}H_{2}.
Como ligando sirve la sustancia química o
biológica, que reacciona específicamente con uno o varios
correspondientes partícipes específicos en la fijación, para formar
un complejo, tales como por ejemplo proteínas, péptidos, hidratos de
carbono, toxinas, haptenos, medicamentos, virus, hongos y
bacterias, anticuerpos o constituyentes de ellos, entre otros. El
invento es especialmente apropiado para el análisis de ligandos de
alto peso molecular, tales como por ejemplo virus, marcadores de
virus pero también hormonas, en particular proteínas polivalentes
tales como virus HIV (de la inmunodeficiencia humana), un antígeno
específico para la próstata (PSA), tireotropina (TSH), un antígeno
carcino embrional (CEA), virus de la hepatitis B (antígeno
superficial de la hepatitis B, HBs), A-fetoproteína
(AFP), gonadotropina coriónica humana (HCG), hormona luteinizante
(LH), hormona estimuladora de folículos (FSH), prolactina,
ferritina e insulina.
Como muestras sirven por lo general líquidos
corporales, tales como sangre, suero o plasma, saliva, orina u
otros líquidos corporales.
Como partícipe específico en la fijación puede
servir cualquier partícipe biológico o químico en una fijación, que
reaccione específicamente con otra sustancia biológica para formar
un par de fijación específica. Entre ellos se cuentan anticuerpos,
fragmentos de anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, avidina,
biotina o sus derivados. De modo preferido, se emplean en el
presente invento, como partícipes de un par de fijación específica,
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, que se fijan
específicamente con antígenos.
Por lo menos uno de los partícipes específicos en
la fijación en un ensayo inmunológico está marcado. La marcación
puede proporcionar directa o indirectamente una señal medible, por
ejemplo por radiactividad, quimioluminiscencia, fosforescencia,
fluorescencia o electroquimioluminiscencia, o un color visible. El
partícipe específico en la fijación puede también ser detectable
indirectamente, por ejemplo con una marcación enzimática, una
marcación con biotina o avidina, que participan en una o varias
reacciones, con el fin de producir una sustancia detectable. De modo
preferido, se emplea una marcación enzimática, en particular con
una peroxidasa, glucosa-oxidasa,
\beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina. Una
marcación preferida adicional es la marcación con una molécula
quimioluminiscente, en particular electroquimioluminiscente.
El invento está caracterizado porque las
sustancias eliminadoras de perturbaciones conformes al invento son
agregados proteínicos acilados con grupos -CO-R.
Por un agregado proteínico se entiende un agregado, que se había
polimerizado a partir de monómeros proteínicos definidos, iguales o
diferentes, para formar una partícula de elevado peso molecular. De
acuerdo con la definición, se entiende en este contexto por un
agregado proteínico una partícula artificial a base de por lo menos
2, preferiblemente de 3 - 40.000, de modo especialmente preferido
de 30 - 600 monómeros proteínicos, que están unidos unos con otros
tan firmemente que en una solución acuosa no se descomponen en las
moléculas individuales de proteínas. De modo preferido, los
agregados proteínicos son solubles en agua.
Las proteínas se pueden polimerizar o agregar por
vía térmica o química.
En el caso de la polimerización térmica, los
monómeros proteínicos se reúnen para formar agregados mediante
aplicación de temperaturas más altas. La polimerización térmica de
proteínas se describe en el documento
EP-A-269.092 en el ejemplo de
albúminas.
La polimerización química de monómeros
proteínicos se efectúa con moléculas engarzadoras homo- o
hetero-bifuncionales que no contienen proteínas.
Estos procedimientos para la reticulación de proteínas son conocidos
por un experto en la especialidad y se describen por ejemplo en los
documentos de solicitud de patente británica GB-A
1.505.400, o de solicitudes de patentes europeas
EP-A-0 122.209 o
EP-A-0.269.092. Ejemplos de la
reticulación de monómeros proteínicos con engarzadores
hetero-bifuncionales son la reacción con
bis(maleinimido)-éster metílico, suberimidato de dimetilo,
suberato de disuccinimidilo, glutarodialdehído,
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato,
N-5-azido-2-nitro-benzoíl-succinimida,
N-succinimidil-(4-yodoacetil)-amino-benzoato,
o la combinación del maleinimido-hexanoíl-éster de
N-hidroxi-succinimida (MHS) o
maleinimido-benzoÍl-NHS (MBS) y del
N-succinimidil-3-acetil-tiopropionato
(SATP). Ejemplos de engarzadores homo-bifuncionales
son por ejemplo diaminohexano, carbodiimida y otros.
Las proteínas preferidas son proteínas que tienen
un peso molecular mayor que 2.000, en particular mayor que 10.000.
Se prefieren especialmente albúminas o la ovoalbúmina, en particular
albúminas de suero, de modo muy especialmente preferido la albúmina
de suero bovino.
En el procedimiento conforme al invento se
utilizan preferiblemente polímeros de proteínas, que se habían
agregado por vía térmica. Es muy especialmente preferida una
albúmina polimerizada térmicamente, de modo preferido una albúmina
de suero, en particular una albúmina de suero bovino
("termo-RSA") que luego, a continuación, se
acila, en particular se acetila o succinila. La preparación de la
termo-albúmina de suero bovino no acilada se
describe en el documento EP-A 269.092.
Ventajosamente, en este caso la polimerización se
llevará a cabo y controlará de tal manera que resulten partículas
de agregados poliproteínicos con un determinado tamaño, lo más
uniforme que sea posible. Se prefiere en este contexto un tamaño de
partículas de 10 - 200 nm, de modo muy especialmente ventajoso entre
20 y 50 nm. Esto corresponde a un peso molecular de 240.000 Da a
2,2 x 10^{9} Da, preferiblemente de 2,2 x 10^{6} a 35 x
10^{6} Da. El tamaño de partículas se puede determinar por medio
de procedimientos conocidos, tales como p.ej. PCS (de Photon
Correlation Spectroscopy = espectroscopia por correlación de
fotones). Cuando es necesario, también el intervalo de tamaños de
partículas especialmente apropiado para el invento se puede separar
mediante filtración a través de gel de una mezcla en bruto de
polímeros, con el fin de obtener un tamaño especialmente uniforme
de partículas.
Los monómeros proteínicos, que se emplean para la
polimerización, pueden ser en tal caso iguales o diferentes. De
modo preferido, se polimerizan monómeros proteínicos uniformes. De
modo preferido, como monómeros proteínicos se emplean monómeros
albumínicos. Como monómeros albumínicos se pueden emplear todas las
albúminas animales o humanas, en particular albúminas de suero. Es
muy especialmente apropiada para el invento una albúmina de suero
bovino (RSA, de Rinder Serum Albumin).
Los agregados proteínicos son acilados conforme
al invento con grupos -CO-R, en los que R
representa un radical alquilo de C1-C4 ramificado o
sin ramificar, que puede estar sustituido con carboxi, hidroxi,
PO_{3}H_{2} o SO_{3}H. Es especialmente preferido como
sustituyente el grupo carboxi.
En este caso, los grupos acilo se pueden
introducir ya en los monómeros proteínicos o tan sólo después de la
polimerización de los monómeros proteínicos en los agregados
proteínicos. La acilación de proteínas se efectúa en este caso de
acuerdo con métodos conocidos, de modo preferido con anhídridos de
acilo o con acil-O-succinimida. Se
han manifestado como especialmente ventajosos los agregados
proteínicos acetilados y succinilados, particularmente los
agregados albumínicos (en los que R = metilo o bien
-CH_{2}-CH_{2}-COOH). En este
caso para la acetilación se utiliza preferiblemente la
O-succinimida de ácido acético. La succinilación se
efectúa de modo preferido con el anhídrido de ácido succínico.
En el caso de la acilación se acilan en lo
esencial grupos amino libres (p.ej. radicales de lisina) del
agregado proteínico. Por el concepto de agregados proteínicos
acilados se entiende que se presenta acilado por lo menos uno de los
grupos amino libres presentes. Se prefiere sin embargo una
acilación lo más completa que sea posible de todos los grupos amino
libres.
Un objeto adicional del invento es un agente
eliminador de perturbaciones para sistemas de ensayos
inmunológicos, que contiene un tampón para ensayos inmunológicos y
la sustancia eliminadora de perturbaciones conforme al invento. En
este caso, como tampones pueden servir todos los tampones acuosos,
que son habituales en ensayos inmunológicos, por ejemplo tampones de
fosfato, glicina-HCl o glicina-NaOH,
acetato, carbonato, citrato, o tampones orgánicos tales como p.ej.
los de imidazol / HCl; trietanol-amina; MES =
(ácido
4-morfolino-etano-sulfónico),
TRIS = tris(hidroximetil)-aminometano),
HEPES = (ácido
4-(2-hidroxi-etil)-1-piperazino-etano-sulfónico),
MOPS (ácido
3-N-morfolino-propano-sulfónico)
y otros tampones similares. El valor del pH y la concentración de
las sales de tampones se ajusta al respectivo ensayo inmunológico,
por ejemplo, entre otras cosas, también a la enzima en el caso de
una marcación con una enzima. Los usuales valores del pH están
situados entre 4 y 9. Las concentraciones usuales de tampones están
situadas entre 1 mM y 1 M.
La concentración de la sustancia eliminadora de
perturbaciones se ajusta a la cantidad de los componentes del
sistema de ensayo inmunológico, y a la cantidad de los componentes
perturbadores contenidos en ellos, con las que se debe reunir el
agente eliminador de perturbaciones. Para ensayos inmunológicos
habituales, en este caso la concentración de la sustancia
eliminadora de perturbaciones en el agente eliminador de
perturbaciones debería ser tan alta que después de la reunión con
los componentes del sistema de ensayo inmunológico resulte una
concentración comprendida entre 1 mg / ml y 50 mg / ml,
preferiblemente entre 5 mg / ml y 20 mg / ml. En casos individuales
se pueden necesitar sin embargo incluso hasta 200 mg / ml.
Adicionalmente, en el agente eliminador de
perturbaciones conforme al invento pueden estar presentes todavía
otras adiciones, tales como las de agentes de estabilización y
similares. Para su empleo en un ensayo inmunológico, el agente
eliminador de perturbaciones se presenta ventajosamente en una
solución tamponadora acuosa. Además, son posibles su utilización
como una impregnación de un material de soporte poroso (velo) p.ej.
sobre una tira de ensayo, y su almacenamiento en una forma sólida,
por ejemplo como un material liofilizado.
Un objeto adicional del invento lo constituyen un
reactivo inmunológico específico de fijación con un partícipe de un
par de fijación específica, y la sustancia eliminadora de
perturbaciones, o el agente eliminador de perturbaciones, conformes
al invento.
El reactivo de fijación de acuerdo con el
presente invento se prepara mediante el recurso de que se mezclan
uno o varios de los partícipes específicos en la fijación de un
ensayo inmunológico y por lo menos una sustancia eliminadora de
perturbaciones o un agente eliminador de perturbaciones, conformes
al invento. Eventualmente, se pueden añadir más adiciones, tales
como las de agentes de estabilización o agentes de conservación y
otros similares. La cantidad del partícipe específico en la
fijación depende del modo de realizar el ensayo inmunológico, de la
cantidad del partícipe en la fijación que se ha de fijar, del tipo
de la marcación y de otros factores. Por lo general, la
concentración es de 1-20 \mug / ml.
La cantidad de la sustancia eliminadora de
perturbaciones se ajusta a la cantidad de los componentes del
sistema de ensayo inmunológico y de los componentes perturbadores,
que están contenidos en el reactivo de fijación y con los que se
pone en contacto el reactivo de fijación. Ventajosamente, la
concentración de una sustancia eliminadora de perturbaciones en el
reactivo de fijación debería ser tan alta que después de la reunión
con los componentes del sistema de ensayo inmunológico resulte una
concentración total comprendida entre 1 y 50 mg / ml,
preferiblemente de 5-20 mg / ml. Sin embargo, en
casos individuales, pueden necesitarse también concentraciones más
altas, hasta de 200 mg / ml, para llegar a una eliminación eficaz de
perturbaciones.
El reactivo específico de fijación se puede
utilizar en cualquier ensayo inmunológico homogéneo o heterogéneo,
en el que un partícipe específico en la fijación sea útil para la
detección o comprobación de la ausencia de un ligando que se fije
específicamente. Ejemplos de esto son ensayos en emparedado, ensayos
inmunológicos competitivos y otros ensayos inmunológicos, conocidos
por un experto en la especialidad. Los ensayos se pueden llevar a
cabo en solución o sobre soportes sólidos.
Por lo general, el procedimiento de ensayo
inmunológico conforme al invento se lleva a cabo poniendo en
contacto en solución una muestra que contiene un ligando con un
reactivo específico de fijación de acuerdo con el presente invento,
de tal manera que se forme directa o indirectamente un complejo de
fijación específica entre el ligando y el partícipe específico en
la fijación. Es posible, sin embargo, también que el propio ligando
se presente como un reactivo de fijación de acuerdo con el invento y
se ponga en contacto con un partícipe específico en la fijación o
con otro reactivo de fijación conforme al invento. El ligando y el
partícipe en la fijación pueden formar directamente un complejo. El
partícipe en la fijación es entonces específico para el ligando. Es
posible, sin embargo, también que el partícipe en la fijación forme
indirectamente un complejo con el ligando a través de una o varias
moléculas específicas de fijación, que se fijan unas con otras y
con el ligando.
Si el procedimiento se emplea como ensayo
inmunológico heterogéneo sobre soportes sólidos, p.ej. tubos, placas
de microtitulación o un soporte de sistema de ensayo, sobre el
soporte puede estar inmovilizado directamente un partícipe en la
fijación que sea específico para el ligando. Se prefiere, sin
embargo, que sobre el soporte esté inmovilizado un partícipe en la
fijación que sea específico para los partícipes en la fijación al
ligando. Un ejemplo preferido de ello es una estreptavidina
inmovilizada como reactivo de fijación que sea específico para
partícipes biotinilados en la fijación. Las diferentes variantes de
tales ensayos inmunológicos heterogéneos son conocidas por un
experto en la especialidad.
En el caso de ensayos inmunológicos competitivos,
el ligando y un compuesto análogo al ligando marcado, compiten en
cuanto al partícipe no marcado en la fijación al ligando, que se
puede fijar a la fase sólida - en el caso de ensayos inmunológicos
heterogéneos - a través de un segundo sitio de fijación,
preferiblemente un sitio específico de fijación (tal como biotina).
Compuestos análogos al ligando, libres o fijados, se miden mediante
su marcación como medida de la presencia o de la cantidad del
ligando que se ha de determinar.
En el caso de ensayos inmunológicos en
emparedado, el ligando se fija con un primer sitio específico de
fijación a un partícipe marcado en la fijación al ligando, y con el
segundo sitio de fijación a un partícipe no marcado en la fijación
al ligando, que está provisto - en el caso de ensayos inmunológicos
heterogéneos - de otro sitio específico de fijación adicional para
la fase sólida. Se forma un complejo entre el ligando, los
partícipes marcados y no marcados en la fijación, realizándose que
el complejo, en el caso de ensayos heterogéneos, se fija a la fase
sólida a través de los partícipes no marcados en la fijación, y
puede ser separado, por ejemplo, por lavado del partícipe marcado
libre en la fijación.
Se determinan los partícipes marcados, libres o
fijados, en la fijación a un ligando como medida de la presencia o
de la cantidad del ligando que se ha de determinar de acuerdo con
métodos conocidos. En el caso de una marcación enzimática, por
ejemplo se añade a la especie marcada un substrato de enzima que
forma un color y se mide el color resultante.
Por lo menos uno de los partícipes de un par
inmunológico específico de fijación (ligando, compuesto análogo al
ligando marcado o partícipe en la fijación a un ligando) se
presenta como un reactivo de fijación conforme al invento juntamente
con la sustancia eliminadora de perturbaciones conforme al invento,
para su empleo en un ensayo inmunológico. Ventajosamente, éste es
por lo general un partícipe en la fijación a un ligando, en
particular un partícipe marcado en la fijación a un ligando.
Un objeto adicional del invento es la utilización
de una sustancia eliminadora de perturbaciones conforme al invento
en ensayos inmunológicos.
En particular, es objeto del invento la
utilización de una sustancia eliminadora de perturbaciones conforme
al invento para la reducción de interacciones inespecíficas en
ensayos inmunológicos.
Se ha puesto de manifiesto que las sustancias
eliminadoras de perturbaciones conformes al invento reducen
considerablemente las señales falsamente positivas de muestras
negativas y por consiguiente también reducen la señal de valor en
vacío de muestras positivas. Además, se reduce la magnitud de la
dispersión del valor en vacío de muestras positivas y por
consiguiente de la desviación típica del valor de medición. Con
ello se amplía también el intervalo dinámico de valores de medición,
y la medición se hace en conjunto más sensible y más exacta.
Un objeto adicional del invento es un
procedimiento para la preparación de las sustancias eliminadoras de
perturbaciones conformes al invento. Este está caracterizado porque
preferiblemente, en una primera etapa, una proteína, de modo
preferido una albúmina, en particular albúmina de suero bovino, se
agrega mediante agregación química con engarzadores bifuncionales,
de modo preferido por agregación térmica, preferiblemente hasta
llegar a un tamaño de partículas comprendido entre 10 y 200 nm, de
modo muy especialmente preferido entre 20 y 50 nm. La agregación
térmica se efectúa de modo preferido a una temperatura comprendida
entre 50 y 100ºC, de modo muy especialmente preferido entre 60 y
80ºC; en una segunda etapa se efectúa luego la acilación con un
grupo -CO-R, con un apropiado agente de acilación.
La acilación debe transcurrir en tal caso preferiblemente de un
modo completo y se puede vigilar al mismo tiempo a través del
consumo de un agente de acilación por ejemplo mediante una HPLC
(cromatografía de líquido a alta presión).
Sin embargo, también es posible llevar a cabo el
procedimiento en el orden de sucesión inverso, por acilación de una
proteína de acuerdo con el documento
US-A-5.051.356 y por una
subsiguiente polimerización térmica o química de la proteína
acilada.
Un ensayo inmunológico en emparedado para
determinar el HBsAg (antígeno de superficie de hepatitis B) se lleva
a cabo con el sistema de ensayo HBsAg Enzymuntest® de la entidad
Boehringer Mannheim.
- 40 mmol de un tampón de fosfato de pH 7,0, anti-HBsAg-biotina (monoclonal de ratón) > 240 ng / ml, peptona (material hidrolizado de lactoalbúmina): 40 mg /ml
- Anti-HBsAg-POD (monoclonal de ratón), POD (peroxidasa): 0,04 U/ml
- Tampón de fosfato y citrato 100 mmol/l, pH 4,4;
- H_{2}O_{2}: 3,2 mmol/l;
- sal de diamonio de ácido 2,2'-azino-di-[ácido 3-etil-benzotiazolina-sulfónico- (6)] (ABTS): 1,9 mmol/l.
El ensayo se lleva a cabo en un aparato ES 600 de
la entidad Boehringer Mannheim.
100 \mul de una muestra y 500 \mul de una
solución de incubación con un conjugado se añaden a un tubito
revestido con estreptavidina (Enzymuntest de la entidad Boehringer
Mannheim) y se incuban (durante 180 min a 37ºC). Los anticuerpos
marcados, no fijados a la fase sólida, se eliminan desde el tubito
con 200 \mul de una solución de lavado.
Se añaden 500 \mul de la solución de substrato
y tampón para cromógeno y el desarrollo de color se mide
espectrofotométricamente a 422 nm después de 60 min.
b) al tampón para incubación se le añaden en
diferentes ensayos "agentes para la eliminación de
perturbaciones":
- 1.
- termo-RSA acetilada (albúmina de suero bovino agregada térmicamente) de acuerdo con el invento (2 mg / ml, tamaño de partículas 30 nm)
- 2.
- termo-RSA succinilada de acuerdo con el invento (2 mg / ml, tamaño de partículas 30 nm)
- 3.
- RSA acetilada monómera de acuerdo con el estado de la técnica (2 mg / ml)
- 4.
- RSA succinilada monómera (2 mg / ml) de acuerdo con el estado de la técnica (2 mg / ml).
La Tabla 1 muestra la medición de diferentes
muestras sin (conforme al Ejemplo 1a) y con diferentes adiciones de
tampones para incubación 1-4 (de acuerdo con el
Ejemplo 1b). Se muestran una manifiesta disminución del valor en
vacío de los resultados del ensayo con los agentes eliminadores de
perturbaciones conformes al invento (de acuerdo con el Ejemplo 1b,
1. y 2.) y una disminución de la desviación típica en el caso de
los sueros negativos (NS, de Negativ Seren), en comparación con las
otras adiciones de acuerdo con el estado de la técnica.
(Tabla pasa a página
siguiente)
- n.d. = no determinado
Un ensayo inmunológico en emparedado se lleva a
cabo con el sistema de ensayo anti-HIV Enzymuntest
de la entidad Boehringer Mannheim.
- Tampón de fosfato 40 mmol/l; pH 7,0
- Constituyentes del suero bovino, anticuerpos HIV-P24 biotinilados (300 ng / ml)
- Anticuerpos policlonales anti-HIV marcados con POD (100 mU/ml)
- Termo-RSA acetilada, tamaño de partículas 30 mm, 2 mg / ml en la columna 2 de la Tabla 2
- Fosfato / citrato 50 mmol/l; pH 4,4
- H_{2}O_{2}: 1,6 mmol/l
- ABTS: 0,9 mmol/l
200 \mul de una muestra se incuban con 500
\mul de un tampón para incubación durante 4 horas en un tubo
revestido con estreptavidina. Los sueros de ensayo no contienen
ningún antígeno HIV-P24. A continuación se lava y se
incuba con 700 \mul de un tampón para substrato por hora. Se mide
a 422 nm. Los resultados los muestra la Tabla
2:
La columna 1 indica los valores falsamente
positivos medidos (en \mug/ml) sin la adición de
termo-RSA acetilada en el tampón para incubación, la
columna 2 indica los valores medidos con termo-RSA
acetilada en el tampón para incubación. La columna 2 muestra que
mediante la sustancia eliminadora de perturbaciones conforme al
invento se efectúa una reducción hasta en 64% de las señales
falsamente positivas.
Eliminación de perturbaciones de un ensayo
inmunológico para determinar el PSA (antígeno específico para
próstata) mediante una termo-RSA acetilada, en
comparación con la eliminación de perturbaciones mediante materiales
hidrolizados proteínicos (peptona) y proteínas eliminadoras de
perturbaciones específicas de acuerdo con el estado de la
técnica.
El ensayo inmunológico se lleva a cabo de acuerdo
con el Enzymuntest® PSA II de la entidad Boehringer Mannheim
GmbH.
- Tampón de fosfato 40 mmol / l, pH 7,3
- MAK <PSA> ratón-PR12-Fab-POD 70 mU / ml
- MAK <PSA> ratón-PR1-IgG-biotina 1 ng / ml
Al tampón para incubación se le añaden diferentes
proteínas eliminadoras de
perturbaciones (adiciones 1, 2a-c en la Tabla
3).
- Tampón de fosfato / citrato 100 mmol / l, pH 4,4
- H_{2}O_{2}: 3,2 mmol / l
- Cromógeno ABTS: 1,9 mmol / l.
La realización del ensayo se efectúa de acuerdo
con el Ejemplo 1 con 50 \mum de una muestra y 700 ml de un tampón
para incubación con un conjugado (incubación durante 90 min), 200
ml de una solución de lavado, 700 \mul de un tampón para
substrato (incubación durante 30 min).
Explicación acerca de la Tabla
3
PS1 hasta 5:
Sueros humanos positivos para PSA (voluntarios
varones)
NS1-10:
Sueros humanos negativos para PSA (sueros de
mujeres)
La adición 1 es la de un polímero de IgG
específico para una subclase como proteína eliminadora de
perturbaciones de acuerdo con el documento
EP-A-331.062 (policonjugado de
anticuerpos anti-PSA) que fija componentes
perturbadores y está dirigida contra el componente inmunológico
emisor de señales (anticuerpo o conjugado con fragmentos de
anticuerpos). En este Ejemplo no se muestra ningún efecto (véase
testigo en la columna derecha "sin adición 1").
La adición 2a es la de una sustancia eliminadora
de perturbaciones conforme al invento en diferentes concentraciones
(polímero de termo-RSA acetilada, tamaño de
partículas 30 nm). La serie de ensayos muestra que especialmente en
el caso de una concentración empleada mayor que 0,1 mg / ml se
inicia una eliminación eficaz de perturbaciones de los sueros de
mujeres, medidos como falsamente positivos (NS) sin añadir la
adición 2a. El intervalo dinámico de mediciones se mejora además de
ello de una manera manifiesta por disminución del valor en vacío
(patrón A) sin perjuicio para la señal (pendiente de la curva de
calibración: patrones A-E).
La adición 2b es la de un polímero de proteína
eliminadora de perturbaciones que se utiliza para fases sólidas en
una forma disuelta (termo-RSA). Ni en el ejemplo de
la tabla (0,1 mg / ml), ni en un intervalo de concentraciones más
altas de 0,2 a 1,6 mg / ml esta adición de un tampón para
incubación muestra ninguna influencia sobre las señales
perturbadoras. Con una concentración creciente de analito (patrones
A-E) se puede observar también en este caso un
aplanamiento de la curva de calibración.
La adición 2c es la de un material hidrolizado
proteínico (material hidrolizado de lactoalbúmina) de acuerdo con
el estado de la técnica. Se necesitan concentraciones altas (5 mg /
ml) para la eliminación apreciable de las perturbaciones.
El Ejemplo se lleva a cabo igual que en el
Ejemplo 3, pero en el tampón para incubación no se añade ninguna
adición (testigo 1 en la Tabla 4) o se añade
termo-RSA succinilada con diferentes tamaños de
partículas entre 8 nm y 74 nm de diámetro en una concentración de
0,35 mg / ml.
(Tabla pasa a página
siguiente)
1 g de RSA se calienta a 70ºC en 100 ml de una
solución 50 mM de un tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) y se
mantiene a esta temperatura durante 4 horas. Luego la solución se
enfría, se filtra y se lleva en una ultracentrífuga (con un límite
de exclusión de 30.000 Da) a una concentración de 50 mg / ml. Luego
se dializa frente al volumen 30 veces mayor de un agua doblemente
destilada y a continuación se liofiliza. El producto tiene un peso
molecular de aproximadamente 700.000 y un tamaño de partículas de
30 \pm 8 nm (medido por medio de una espectroscopia por
correlación de fotones (PCS)).
4.000 g de una RSA agregada térmicamente en 100
mM de un tampón de fosfato de potasio de pH 8,0 se atemperan a 25ºC.
La concentración de proteínas se determina mediante la OD (densidad
óptica) a 280 nm y después de ello se ajusta una concentración de
proteínas de 10 mg / ml. Eventualmente se corrige con 10 mM de un
tampón de fosfato de potasio de pH 8,0. La solución de
termo-RSA en el recipiente con sistema de agitación
se calienta a 25ºC. El éster
N-hidroxi-succinimídico de ácido
acético se disuelve a la temperatura ambiente en una concentración
de 100 mg / ml en DMSO anhidro. Por cada litro de una solución de
termo-RSA que se ha de acetilar, se añaden 11,5 ml
de una solución del éster succinimídico. La concentración final en
DMSO, que se consigue con ello, es de aproximadamente 1%. La tanda
de acetilación se agita luego durante 120 min a 25ºC después de
haber controlado el valor del pH (nominal 6,5 - 9). La disminución
del éster N-hidroxi-succinimídico de
ácido acético se vigila por medio de una HPLC en TSK 3000
(detección a 260 nm). Después de la incubación, la acetilación se
detiene por adición de una solución de hidrocloruro de lisina hasta
una concentración final de 5 mM.
La tanda de acetilación detenida se filtra a
través de una prensa de filtración. La prensa se lava
posteriormente con agua. El material filtrado y el material de
lavado posterior se reúnen.
El material filtrado reunido se concentra hasta
50 l a través de una membrana de polisulfona de 10 KD. La solución
concentrada se diafiltra frente al volumen 10 veces mayor de una
solución de fosfato de potasio 20 mM de pH 7,0. El concentrado se
diluye con el tampón para diafiltración hasta el respectivo volumen
doble y luego se concentra de nuevo hasta el volumen de partida. El
éxito de la diafiltración se determina a través de una analítica
con HPLC en TSK 3000. La solución se concentra hasta una
concentración de 80 \pm 10 mg / ml y a continuación de ello se
estabiliza con cloroacetamida al 0,1% y MIT (metilisotiazolona) al
0,01%.
La medición por PCS proporciona un tamaño de
partículas de 30 \pm 15 nm.
3 g de RSA se disuelven en 30 ml de un tampón de
fosfato de potasio 30 mM, de pH 7,1 y se mezcla con 0,6 ml de una
solución a base de 180 mg de MHS / ml de
dimetil-sulfóxido (DMSO). Después de una incubación
durante 1 hora a 25ºC la tanda se aumenta de concentración hasta 10
mM de lisina y se dializa frente al volumen 150 veces mayor del
tampón para diálisis (15 mM de un tampón de fosfato de potasio / 50
mM de NaCl / 1 mM de
etilen-diamina-tetraacetato (EDTA) /
pH 6,2).
3 g de RSA se disuelven en 30 ml de un tampón con
30 mM de fosfato de potasio, de pH 7,1, y se mezclan con 0,6 ml de
una solución de 140 mg de SATP / ml de DMSO. Después de incubación
durante 1 hora a 25ºC la tanda se aumenta de concentración hasta 10
mM de lisina y se dializa frente al volumen 150 veces mayor de un
tampón para diálisis (15 mM de un tampón de fosfato de potasio /
NaCl 50 mM / 1 mM de EDTA/ pH 6,2).
La solución con la RSA activada por SATP,
procedente de (b), se aumenta de concentración hasta 25 mM de
hidroxilamina, se ajusta un valor del pH de 7,5 y se incuba durante
1 hora a 25ºC. A continuación, se añade la solución con la RSA
activada con MHS, procedente de (a), y se incuba durante 45 min
adicionales a 25ºC. La reticulación se detiene por adición de 10 mM
de cisteína. Después de otros 30 min adicionales, la tanda se
aumenta de concentración hasta 25 mM de N-
metil-maleinimida y se dializa frente al volumen 150
veces mayor de una mezcla de 50 mM de tampón de fosfato de potasio
/ 0,15 M de NaCl / de pH 7,2.
La solución de poli-RSA
dializada, procedente de (1c), se mezcla con 2,6 ml de una solución
de 0,1 g de anhídrido de ácido succínico / ml de DMSO. Después de
una incubación durante 60 min a 25ºC, la tanda se aumenta de
concentración hasta 50 mM de lisina, se dializa frente al volumen
150 veces mayor de un tampón con 20 mM de fosfato de potasio, de pH
6,8, y se liofiliza.
El ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el
Enzymuntest® para determinar troponina-T, de la
entidad Boehringer Mannheim GmbH.
- 40 mM de un tampón de fosfato pH 7,0
- MAK M-7-Fab-POD 150 mU/ml
- MAK M-11-t-IGG-biotina 2,5 \mug/ml
- 0,5 mg / ml de P-RSA-Succ; en el ensayo comparativo el tampón de incubación no contiene nada de P-RSA-Succ.
- Tampón de fosfato / citrato 100 mM, pH 4,4.
- H_{2}O_{2}: 3,2 mM
- Cromógeno: ABTS 1,9 mM.
La realización del ensayo se efectúa, de acuerdo
con el Ejemplo 1, con 140 \mul de una muestra y 700 \mul de un
tampón para incubación con un conjugado (incubación durante 30
min); 200 \mul de una solución de lavado, 700 \mul de un tampón
para substrato (incubación durante 15 min).
Sin la adición de
P-RSA-Succ al tampón para
incubación, los sueros perturbados enumerados en la Tabla A están
manifiestamente por debajo del valor de corte de 0,2 ng / ml de
troponina-T. La adición de 0,5 ng / ml de
P-RSA-Succ reprime las señales
inespecíficas de todos los sueros por debajo del valor de corte, o
elimina la perturbación en parte por completo. La adición de la
proteína eliminadora de perturbaciones no tiene ninguna repercusión
significativa sobre la pendiente de la curva de calibración (Tabla
A). Por lo tanto no se influye sobre el hallazgo de sueros humanos
positivos.
Una RSA succinilada monómera
(RSA-Succ) correspondiente al estado de la técnica,
se debe emplear en una concentración aproximadamente 50 veces más
alta, con el fin de tener aproximadamente el mismo efecto
eliminador de perturbaciones que una RSA succinilada polímera
(P-RSA-Succ) (Tabla B). Esto tiene
como consecuencia una gran disminución de la pendiente de la curva
de calibración, lo cual conduce a hallazgos grandemente aumentados
de sueros humanos positivos (Tabla B). Por lo tanto la
RSA-Succ monómera no se puede emplear en el ensayo
para determinar troponina-T.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (27)
1. Sustancia eliminadora de perturbaciones con un
contenido de proteínas,destinada a disminuir la interacción
inespecífica en ensayos inmunológicos, caracterizada porque
la sustancia eliminadora de perturbaciones representa partículas de
agregados proteínicos con un determinado tamaño, lo más uniforme
que sea posible, que están acilados con grupos
-CO-R, representando R un radical alquilo de
C1-C4 ramificado o sin ramificar, que puede estar
sustituido con carboxi, hidroxi, SO_{3}H o PO_{3}H_{2}.
2. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la
proteína es una albúmina.
3. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque la
albúmina es albúmina de suero bovino.
4. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con las reivindicaciones 1-3,
caracterizada porque
R representa un grupo metilo o un grupo
-CH_{2}CH_{2}-COOH.
5. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4,
caracterizada porque el agregado proteínico está agregado
químicamente con engarzadores homo- o
hetero-bifuncionales.
6. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4,
caracterizada porque el agregado proteínico está agregado
térmicamente,
7. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque la
sustancia eliminadora de perturbaciones representa una albúmina de
suero bovino acetilada o succinilada, agregada térmicamente.
8. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1-7,
caracterizada porque el tamaño de partículas del agregado
proteínico acetilado es de 10-200 nm.
9. Sustancia eliminadora de perturbaciones de
acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque el
tamaño de partículas es de 20-50 nm.
10. Sustancia eliminadora de perturbaciones
destinada a disminuir interacciones inespecíficas en ensayos
inmunológicos, que contiene un tampón y una sustancia eliminadora
de perturbaciones con un contenido de proteínas,
caracterizada porque contiene una sustancia eliminadora de
perturbaciones de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9.
11. Agente eliminador de perturbaciones de
acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el
tampón tiene un valor del pH comprendido entre 4 y 9.
12. Reactivo específico de fijación para ensayos
inmunológicos, que contiene un partícipe específico en la fijación
de un par de fijación específica, y una sustancia eliminadora de
perturbaciones, o un agente eliminador de perturbaciones, con un
contenido de proteínas, caracterizado porque contiene una
sustancia eliminadora de perturbaciones de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9 o un agente eliminador de
perturbaciones de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u
11.
13. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 12, caracterizado porque el partícipe
en la fijación es un partícipe en la fijación, que está marcado o
biotinilado.
14. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el
partícipe en la fijación es un antígeno, un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo.
15. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 14, caracterizado porque el partícipe
en la fijación es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo,
marcado con una enzima o marcado por
electroquimioluminiscencia.
16. Procedimiento para la determinación de un
ligando inmunológico en una muestra mediando reducción de
interacciones inespecíficas, por
1. puesta en contacto de la muestra que se ha de
investigar en cuando al ligando con
- a) una o varias sustancias eliminadoras de perturbaciones con un contenido de proteínas, o uno o varios agentes eliminadores de perturbaciones con un contenido de proteínas que contiene(n) una sustancia eliminadora de perturbaciones con un contenido de proteínas, y un apropiado tampón, y
- b) uno o varios partícipes en la fijación de pares de fijación específica, realizándose que por lo menos uno de los partícipes en la fijación está marcado y forma un par de fijación detectable, y por
2. medición de la presencia o de la cantidad del
par de fijación marcado o del partícipe marcado libre de un par de
fijación específica, como medida de la presencia o la concentración
del ligando en la muestra,
caracterizado porque la sustancia
eliminadora de perturbaciones es un agregado proteínico acilado de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 - 9.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado porque el ligando
representa un virus, un marcador de virus, un marcador de tumor o
una hormona.
18. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque los
partícipes en la fijación de pares de fijación específica se
escogen entre el conjunto formado por los antígenos, anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos.
19. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 16 - 18, caracterizado porque un partícipe
en la fijación está marcado con enzimas o es
electroquimioluminiscente.
20. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 16-19, caracterizado porque
un partícipe específico en la fijación posee un sitio adicional
específico de fijación para un partícipe en la fijación fijado a una
fase sólida.
21. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, caracterizado porque un partícipe en la
fijación está biotinilado y es capaz de fijarse a una superficie de
estreptavidina.
22. Utilización de la sustancia eliminadora de
perturbaciones de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9 o del agente eliminador de perturbaciones de
acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11 para ensayos
inmunológicos.
23. Utilización de la sustancia eliminadora de
perturbaciones de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9 o del agente eliminador de perturbaciones de
acuerdo con una de las reivindicaciones 10 u 11 para la disminución
de interacciones inespecíficas en ensayos inmunológicos.
24. Procedimiento para la preparación de una
sustancia eliminadora de perturbaciones de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque a) se polimeriza la
proteína para formar un agregado, y b) porque el agregado
proteínico se acila con un correspondiente agente de acilación.
25. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado porque la polimerización de
la proteína se efectúa por vía térmica.
26. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado porque el agregado
proteínico está acetilado con
acetil-O-succinimida o con
anhídrido de ácido succínico.
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