ES2203636T3 - Agregados poteinicos acilados y su utilizacion con el fin de aumentar las señales en un ensayo inmunologico para la deteccion de anticuerpos. - Google Patents
Agregados poteinicos acilados y su utilizacion con el fin de aumentar las señales en un ensayo inmunologico para la deteccion de anticuerpos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A AGREGADO DE PROTEINA, QUE SE ACILA CON GRUPOS - CO - R, DONDE R REPRESENTA C{SUB.1} - C{SUB.4} ALQUIL, QUE PUEDE SER SUSTITUIDO POR CARBOXI, HIDROXI, SO{SUB.3}H O PO{SUB.3}H{SUB.2}, PARA EL REFORZAMIENTO DE SEÑAL Y PARA EVITAR RESULTADOS NEGATIVOS FALSOS EN INMUNOASAIS PARA LA DETERMINACION DE ANTICUERPOS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UN REACTIVO CON UN AMORTIGUADOR Y UN REACTIVO DE ENLACE CON UN PARTNER DE ENLACE INMUNOLOGICO, QUE CONTIENE ESTE AGREGADO DE PROTEINA.
Description
Agregados proteínicos acilados y su utilización
con el fin de aumentar las señales en un ensayo inmunológico para
la detección de anticuerpos.
El invento se refiere a agregados proteínicos
acilados, a su preparación y a su empleo en un agente y en un
reactivo para ensayos inmunológicos, así como a su utilización con
el fin de aumentar las señales de ensayos inmunológicos destinados
a la detección de anticuerpos, así como a un correspondiente
procedimiento inmunológico de detección.
Los métodos inmunológicos de detección han
alcanzado en los últimos años una gran importancia. Con ellos se
puede detectar con rapidez y exactitud la presencia de
medicamentos, hormonas, proteínas, y en particular organismos
infecciosos, en muestras biológicas. En todos los métodos
inmunológicos de detección se llega a una reacción específica de
fijación entre un primer partícipe específico en la fijación, la
sustancia que se debe detectar ("analito") y un segundo
partícipe específico en la fijación, que reacciona específicamente
con el ligando, o lo fija. El ligando y el partícipe específico en
la fijación del ligando, los denominados partícipes en un par
específico de fijación, forman en tal caso un par específico de
fijación, en general un complejo entre un antígeno y un anticuerpo
o un fragmento de anticuerpo. En tal caso, pueden reaccionar unos
con otros en cada reacción más de un ligando o más de un partícipe
en la fijación. Estas reacciones específicas de fijación se
detectan de diferentes maneras. Por lo general, uno de los
partícipes de la reacción específica de fijación está marcado.
Métodos usuales de marcación son los que usan radioisótopos,
cromógenos, fluorógenos o una marcación enzimática. En el caso de
análisis inmunológicos heterogéneos, uno de los partícipes en la
fijación está inmovilizado junto a una fase sólida.
La detección de anticuerpos específicos, que
están dirigidos contra un antígeno, se lleva a cabo en un ensayo
inmunológico heterogéneo, en particular en un denominado ensayo
inmunológico en emparedado, se lleva a cabo por consiguiente en
general de tal manera que un antígeno fijado a la fase sólida se
pone en contacto, en una primera etapa de incubación, con la muestra
que se ha de determinar, por regla general un suero o plasma
humano, y los anticuerpos contra el antígeno, que están contenidos
en la muestra, se pueden fijar durante un período de tiempo de
incubación al antígeno que está fijado a las paredes. Después de la
reacción, la tanda de ensayo se lava y, en una segunda etapa de
reacción, los anticuerpos fijados a la fase sólida se detectan
mediante un segundo anticuerpo, que lleva una marcación y está
dirigido contra la clase de anticuerpos que se han de determinar.
Esta detección se realiza de tal manera que un anticuerpo
(monoclonal o policlonal) marcado, dirigido contra una clase de
anticuerpos que se ha de determinar, o un análogo al analito
marcado, se fija en una segunda etapa de incubación a los
anticuerpos, que se han fijado en la primera etapa de incubación al
antígeno situado junto a las paredes. Si se deben de detectar
anticuerpos IgG, se utiliza preferiblemente un
anti-IgG marcado, en el caso de anticuerpos IgM, se
utiliza un anti-IgM, y así sucesivamente. Después
de la segunda incubación, se lava la tanda de ensayo se lava y se
eliminan los anti-anticuerpos o análogos a
analitos, marcados, presentes en exceso, no fijados. En una tercera
etapa, la cantidad de anticuerpos fijados se detecta de tal manera
que, por ejemplo en ensayos enzimáticos inmunológicos, la tanda de
ensayo reacciona con una solución de substrato y el complejo
cromático formado se mide fotométricamente. La extinción o la señal
de esta solución cromática es proporcional a la cantidad de
anticuerpos fijados.
En una segunda forma de realización de estos
ensayos inmunológicos de anticuerpos, el antígeno no se fija
directamente a la fase sólida, sino que se fija a la fase sólida a
través de otro partícipe específico en la fijación, antes o
preferiblemente durante el ensayo. De modo preferido, en tal caso,
un antígeno acoplado covalentemente con biotina se acopla a una
fase sólida cargada con estreptavidina.
Un modo especial de perturbación de ensayos en
cuanto a anticuerpos se observa en particular en el caso de la
detección de anticuerpos IgG contra un antígeno, por ejemplo de
HIV, HCV, toxoplasmosis, anticuerpos, etc. Si se diluyen iguales
cantidades de una muestra de un suero humano, que contiene una alta
concentración de un anticuerpo dirigido contra un antígeno, (por
ejemplo un anticuerpo contra HCV), con diferentes sueros, que no
poseen ningún anticuerpo contra este antígeno, se encuentran
diferencias significativas en el hallazgo encontrado de la cantidad
de anticuerpos en los sueros diluidos de esta manera, aún cuando en
todos los sueros esté contenida la misma cantidad total de
anticuerpos específicos. En el caso de ensayos inmunológicos
enzimáticos, se puede medir, en las muestras diluidas con un suero,
una señal demasiado pequeña en el factor de 2-10.
Una explicación de este fenómeno no se conoce, pero podría consistir
eventualmente en el hecho de que en los sueros humanos están
contenidas sustancias que obstaculizan la fijación de anticuerpos
específicos a un antígeno. Una posibilidad de explicación distinta o
adicional podría ser que estas sustancias contenidas en sueros
humanos obstaculizan la detección de los anticuerpos fijados en la
segunda etapa de incubación. Las reducciones drásticas de las
señales producidas por constituyentes del suero son especialmente
críticas en el caso de sueros débilmente positivos, que en un caso
desfavorable se detectan como negativos, y por consiguiente se
diagnostican falsamente.
Fue misión del presente invento, por lo tanto,
conseguir un aumento suficientemente grande de las señales en un
ensayo inmunológico para la detección de anticuerpos, de tal manera
que se reduzcan o eviten resultados falsamente negativos de los
análisis. El problema planteado por esta misión se resuelve
mediante la utilización en ensayos inmunológicos de agregados
proteínicos acilados específicamente.
Son objeto del invento agregados proteínicos como
sustancias destinadas al aumento de las señales en ensayos
inmunológicos para la determinación de anticuerpos, que están
acilados con grupos -CO-R, representando R un
radical alquilo C1-C4 ramificado o sin ramificar,
que puede estar sustituido con carboxi, hidroxi, SO_{3}H o
PO_{3}H_{2}.
Un objeto adicional del invento es un
correspondiente agente destinado a aumentar las señales en ensayos
inmunológicos, que contiene un tampón y una o varias de las
sustancias conformes al invento destinadas a aumentar las
señales.
Un objeto adicional del invento es un reactivo
específico de fijación para ensayos inmunológicos destinados a la
determinación de anticuerpos, que contiene un partícipe en la
fijación para los anticuerpos que se han de determinar,
caracterizado porque adicionalmente contiene una o varias de las
sustancias, o uno o varios de los agentes, conformes al invento,
que se destinan a aumentar las señales del ensayo inmunológico.
Un objeto adicional del invento es un
procedimiento para el aumento de las señales y para la reducción de
resultados falsamente negativos de los análisis en ensayos
inmunológicos destinados a la determinación de anticuerpos, mediante
puesta en contacto de una sustancia, o del agente conforme al
invento, que se destina a aumentar las señales, con los partícipes
específicos en la fijación, dirigidos contra los anticuerpos, en
particular con el partícipe no marcado en la fijación.
En particular, es objeto del invento un
procedimiento para la determinación de un anticuerpo en una muestra
mediando aumento de las señales y reducción de los resultados
falsamente negativos de los análisis, por
puesta en contacto de la muestra, que se ha de
investigar en cuanto a los anticuerpos, con uno o varios partícipes
específicos en la fijación del anticuerpo, realizándose que por lo
menos un partícipe en la fijación está marcado y forma con el
anticuerpo un par detectable de fijación,
medición de la señal del par marcado de fijación
o del partícipe marcado libre en la fijación como medida para la
presencia o para la concentración del anticuerpo en la muestra,
caracterizado porque a la muestra, o a uno de los
partícipes específicos en la fijación, se le añade un agregado
proteínico, que está acilado con grupos -CO-R,
representando R un radical alquilo C1-C4
ramificado o sin ramificar, que puede estar sustituido con carboxi,
hidroxi, SO_{3}H o PO_{3}H_{2}.
Como muestra sirven por lo general líquidos
corporales, tales como sangre, suero o plasma, saliva, orina u
otros líquidos corporales, en particular suero o plasma.
Son anticuerpos que se han de detectar todos los
anticuerpos que están dirigidos contra un antígeno, en particular
anticuerpos inmunoglobulínicos.
Como partícipe específico en la fijación puede
servir cualquier partícipe biológico o químico en la fijación, que
reaccione específicamente con el anticuerpo que se ha de determinar
para dar un par específico de fijación. Son de este tipo en
particular antígenos, haptenos y
anti-anticuerpos.
Está marcado por lo menos uno de los partícipes
específicos en la fijación en un ensayo inmunológico. La marcación
puede proporcionar directa o indirectamente una señal medible, por
ejemplo por radiactividad, quimioluminiscencia,
electroquimioluminiscencia, fosforescencia, fluorescencia o un
color visible. El partícipe específico en la fijación puede también
ser detectable indirectamente, por ejemplo con una marcación
enzimática, que participa en una o varias reacciones, con el fin de
producir una sustancia detectable. Se prefieren en el presente
invento una marcación enzimática, en particular con una peroxidasa,
glucosa-oxidasa, fosfatasa o
\beta-galactosidasa, o una
electro-quimioluminiscencia. Preferiblemente se
emplea en el presente invento un anti-anticuerpo
marcado, dirigido contra el anticuerpo que se ha de detectar.
Las sustancias para aumentar las señales,
conformes al invento, son agregados proteínicos aciladas. Como un
agregado proteínico se entiende un agregado, que había sido
polimerizado a partir de monómeros proteínicos definidos, iguales o
diferentes, para formar una partícula de mayor peso molecular. De
acuerdo con la definición, se entiende en tal caso como un agregado
proteínico una partícula artificial a base de por lo menos 2,
preferiblemente 3-40.000, de modo especialmente
preferido 30-600, monómeros proteínicos, que están
fijados tan fuertemente unos a otros, que ellos en la solución
acuosa no se descomponen en las moléculas proteínicas individuales.
De modo preferido, los agregados proteínicos son solubles en
agua.
Las proteínas pueden ser polimerizadas o
agregadas por vía térmica o química.
En el caso de la polimerización térmica, los
monómeros proteínicos se reúnen para formar agregados, mediando
aplicación de temperaturas elevadas. La polimerización térmica se
describe con el ejemplo de albúminas en el documento de solicitud
de patente europea EP-A-269.092.
La polimerización química de monómeros
proteínicos se efectúa con moléculas de engarzadores (enlazadores)
homo- o hetero-bifuncionales, que no contienen
proteínas. Estos procedimientos para la reticulación de proteínas
son conocidos por un experto en la especialidad y se describen por
ejemplo en los documentos de solicitud de patente británica
GB-A 1.505.400, o de solicitudes de patentes
europeas EP-A-0.122.209 o
EP-A-269.092. Ejemplos acerca de la
reticulación monómeros de albúminas con engarzadores
hetero-bifuncionales son la reacción con
bis(maleinimido)-éster metílico, suberimidato de dimetilo,
suberato de bis-succinimidilo,
glutaro-dialdehído,
N-succinimidil-3-(piridilditio)propionato,
N-5-azido-2-nitro-benzoíl-succinimida,
N-succinimidil-(4-yodo-acetil)-aminobenzoato
o la combinación de
maleinimido-hexanoíl-N-éster
hidroxi-succinimídico (MHS) o
maleinimido-benzoíl-NHS (MBS) y de
N-succinimidil-3-acetil-tiopropionato
(SATP). Ejemplos de engarzadores homo-bifuncionales
son por ejemplo diamino-hexano, carbodiimida y
otros.
De modo preferido, en los procedimientos
conformes al invento se utilizan polímeros de albúminas, en
particular polímeros de albúminas de sueros, que se habían agregado
por vía térmica. Es muy especialmente preferida una albúmina de
suero bovino polimerizada térmicamente (conocida como
"termo-RSA"), que luego se acila, en
particular se acetila o succinila, a continuación. La preparación de
la termo - albúmina de suero bovino no acilada se describe en el
documento EP-A-269.092.
Ventajosamente, en este caso, la polimerización
se lleva a cabo y se controla de tal manera que resulten partículas
de agregados poliproteínicos con un determinado tamaño, lo más
uniforme que sea posible. Se prefiere en este contexto un tamaño de
partículas de 10-200 nm (nanómetros), de modo muy
especialmente ventajoso comprendido entre 20 y 50 nm. Esto
corresponde aproximadamente a un peso molecular de 240.000 Da - 2,2
x 10^{9} Da, preferiblemente de
2,2 x 10^{6} - 35 x 10^{6} Da (Dalton). El tamaño de partículas se puede determinar por medio de procedimientos conocidos, tales como p.ej. el de PSC (de Photon Correlation Spectroscopy = espectroscopia de correlación de fotones). Cuando sea necesario, también el intervalo de tamaños de partículas, que es especialmente apropiado para el invento, se puede separar mediante filtración a través de un gel con respecto de una mezcla de polímeros brutos, con el fin de obtener un tamaño de partículas especialmente uniforme.
2,2 x 10^{6} - 35 x 10^{6} Da (Dalton). El tamaño de partículas se puede determinar por medio de procedimientos conocidos, tales como p.ej. el de PSC (de Photon Correlation Spectroscopy = espectroscopia de correlación de fotones). Cuando sea necesario, también el intervalo de tamaños de partículas, que es especialmente apropiado para el invento, se puede separar mediante filtración a través de un gel con respecto de una mezcla de polímeros brutos, con el fin de obtener un tamaño de partículas especialmente uniforme.
Los monómeros proteínicos, que se emplean para la
polimerización, pueden ser en tal caso iguales o diferentes. De
modo preferido, se polimerizan monómeros proteínicos uniformes. Son
especialmente apropiadas las albúminas. Como monómeros albumínicos
se pueden emplear todas las albúminas animales o humanas, en
particular albúminas de sueros. Es muy especialmente apropiada para
el invento la albúmina de suero bovino (RSA de Rinder Serum
Albumin).
Los agregados proteínicos son acilados conforme
al invento con grupos -CO-R, en los que R
representa un radical alquilo C1-C4 ramificado o sin
ramificar, que puede estar sustituido con carboxi, hidroxi,
PO_{3}H_{2} o SO_{3}H. Se prefiere como sustituyente en tal
caso el grupo carboxi.
En este caso, los grupos acilo pueden ser
introducidos ya en los monómeros proteínicos o, tan sólo después de
la polimerización de los monómeros proteínicos, en los agregados
proteínicos. La acilación de la proteína se efectúa en tal caso con
métodos conocidos, preferiblemente con anhídridos de acilo o con
acil-O-succinimida. Como
especialmente ventajosos se han manifestado los agregados
proteínicos, en particular los agregados albumínicos, acetilados y
succinilados (R = metilo o
-CH_{2}-CH_{2}-COOH). En tal
contexto, para la acetilación se utiliza de modo preferido la
O-succinimida de ácido acético. La succinilación se
efectúa de modo preferido con anhídrido de ácido succínico.
Al realizar la acilación, se acilan en lo
esencial grupos amino libres (p.ej. radicales de lisina) del
agregado proteínico. Por el término de agregados albumínicos
acilados, se entiende que se presenta en estado acilado por lo menos
uno de los grupos amino libres existentes.
Otro objeto del invento es un agente eliminador
de perturbaciones para ensayos inmunológicos, que contiene un
tampón para ensayos inmunológicos y la sustancia eliminadora de
perturbaciones conforme al invento. En este caso, como tampones
pueden servir todos los tampones acuosos que son habituales en
ensayos inmunológicos, por ejemplo los tampones de fosfato,
glicina-HCl, acetato, carbonato, citrato, o
tampones orgánicos, tales como p.ej. los de imidazol,
trietanol-amina; MES = ácido
(4-morfolino-etano-sulfónico),
TRIS =
(tris(hidroximetil)-amino-metano),
HEPES = ácido
4-(2-hidroxi-etil)-1-piperazino-etano-sulfónico,
MOPS = ácido
(B-N-morfolino-propano-sulfónico)
y otros tampones. El valor del pH y la concentración de las sales
de tampones se ajusta al ensayo inmunológico respectivo, por
ejemplo, entre otras cosas, también a la enzima en el caso de una
marcación enzimática. Los valores usuales del pH están situados
entre 4 y 9. Las concentraciones usuales de los tampones están
situadas entre
1 mM y 1 M.
1 mM y 1 M.
La concentración de una sustancia conforme al
invento destinada a aumentar las señales se ajusta a las cantidades
de líquido de muestra y de componentes del ensayo inmunológico y de
los componentes perturbadores contenidos allí, con las que se debe
de reunir el agente. Para los habituales ensayos inmunológicos, en
tal caso la concentración de agregados proteínicos acilados
conformes al invento en el agente debería ser tan alta que después
de la reunión con los componentes inmunológicos del ensayo, en
particular con los partícipes no marcados en la fijación, resulte
una concentración comprendida entre 1 mg/ml y 50mg/ml, de modo
preferido entre 5 y 20 mg/ml. En casos individuales, pueden ser
necesarios sin embargo también hasta 200 mg/ml.
Adicionalmente, en el agente conforme al invento
pueden estar presentes todavía otros aditivos tales como agentes de
estabilización y similares. Para su empleo en un ensayo
inmunológico, el agente se presenta ventajosamente en una solución
acuosa de tampón, pero para el almacenamiento es posible también la
forma sólida, por ejemplo como un material liofilizado, o como una
impregnación de un material de soporte poroso (velo) p.ej. sobre
una tira de ensayo.
Un objeto adicional del invento es un reactivo
inmunológico específico de fijación para un anticuerpo que se ha de
determinar, que contiene un partícipe específico en la fijación del
anticuerpo y una de las sustancias, o uno de los agentes, conformes
al invento. El reactivo de fijación de acuerdo con el presente
invento se prepara mezclando uno o varios partícipes específicos en
la fijación de un anticuerpo que se ha de determinar y por lo menos
una de las sustancias, o uno de los agentes, conformes al invento.
Eventualmente se pueden añadir otros aditivos tales como agentes de
estabilización o agentes de conservación u otros similares. La
cantidad del partícipe específico en la fijación depende del modo
de realizar el ensayo inmunológico, de la cantidad del anticuerpo
que se ha de determinar, del tipo de la marcación y de otros
factores. Por lo general, la concentración es de
0,1-20 \mug/ml.
La cantidad de agregados proteínicos acilados en
el reactivo de fijación está situada ventajosamente en 1 mg/ml y 50
mg/ml, de modo preferido entre 5 y 20 mg/ml. En casos individuales
pueden ser necesarias también concentraciones más altas, hasta de
200 mg/ml.
El reactivo específico de fijación se puede
utilizar en cualquier ensayo inmunológico homogéneo o heterogéneo,
de modo preferido heterogéneo, en el que un partícipe específico en
la fijación sea útil para la detección o la ausencia de un
anticuerpo que se fija específicamente. Ejemplos de ello son ensayos
en emparedado, ensayos inmunológicos competitivos y otros ensayos
inmunológicos conocidos por un experto en la especialidad. Los
ensayos se pueden llevar a cabo en solución o sobre soportes
sólidos.
Por lo general, el procedimiento de ensayo
inmunológico conforme al invento se lleva a cabo de tal manera que
una muestra que contiene un anticuerpo se pone en contacto con un
reactivo específico de fijación de acuerdo con el presente invento,
en forma de una solución, de manera tal que se forma directa o
indirectamente un complejo específico de fijación entre el
anticuerpo y el partícipe específico en la fijación. El anticuerpo
y el partícipe en la fijación pueden formar un complejo
directamente. El partícipe en la fijación es entonces específico
para el partícipe en la fijación. Sin embargo, también es posible
que el partícipe en la fijación forme un complejo con el ligando a
través de una o varias moléculas específicas de fijación, que se
fijan entre ellas con el anticuerpo.
Si el procedimiento se emplea sobre soportes
sólidos, por ejemplo tubos, placas de microtitulación o un soporte
de ensayo, como un ensayo inmunológico heterogéneo, sobre el
soporte se puede inmovilizar directamente un partícipe específico
en la fijación para los anticuerpos. Se prefiere, sin embargo, que
sobre el soporte esté inmovilizado un partícipe específico en la
fijación para los partícipes en la fijación a anticuerpos. Un
ejemplo preferido de ello es una estreptavidina inmovilizada como
reactivo específico de fijación para partícipes biotinilados en la
fijación. Las diferentes reacciones de tales ensayos inmunológicos
heterogéneos son conocidas por un experto en la especialidad.
En el caso de análisis inmunológicos
competitivos, los anticuerpos y un análogo a anticuerpo marcado, o
un fragmento de anticuerpo marcado, compiten en cuanto al partícipe
no marcado en la fijación al ligando, que se puede fijar - en el
caso de ensayos inmunológicos heterogéneos - a través de un segundo
sitio de fijación (preferiblemente un sitio específico de fijación
tal como biotina) a la fase sólida. Los análogos a anticuerpos,
libres o fijados, se miden mediante su marcación como medida de la
presencia o la cantidad del anticuerpo que se ha de determinar.
En el caso de ensayos inmunológicos en
emparedado, el anticuerpo se fija con un primer sitio específico de
fijación a un partícipe marcado en la fijación y con el segundo
sitio de fijación a un partícipe en la fijación a anticuerpos, no
marcado - en el caso de ensayos inmunológicos heterogéneos -,
inmovilizado o provisto de otro sitio específico adicional de
fijación para la fase sólida. Se forma un complejo entre el
anticuerpo y los partícipes marcados y no marcados en la fijación,
realizándose que el complejo, en el caso de ensayos heterogéneos,
se fija a la fase sólida a través del partícipe no marcado en la
fijación, y puede ser separado por lavado con respecto del
partícipe marcado libre en la fijación. Se determina la señal de
partícipes marcados en la fijación a anticuerpos, libres o fijados,
como medida de la presencia o la cantidad del anticuerpo que se ha
de determinar, de acuerdo con métodos conocidos. En el caso de una
marcación enzimática, por ejemplo, se mide para la especie marcada
un substrato enzimático que forma un color, y el color resultante
se mide como señal.
Las sustancias conformes al invento muestran un
efecto especialmente ventajoso en ensayos inmunológicos en
emparedado, en particular en ensayos inmunológicos heterogéneos en
emparedado.
Se ha manifestado como muy especialmente
ventajoso para el efecto de las sustancias conformes al invento,
cuando la muestra se incuba en solución con el partícipe no marcado
en la fijación juntamente con un agregado albumínico acilado
conforme al invento, y tan sólo entonces se añade a esta solución el
partícipe marcado en la fijación.
Otro objeto del invento es la utilización de las
sustancias conformes al invento en ensayos inmunológicos. En
particular, es objeto del invento la utilización de las sustancias
conformes al invento con el fin de aumentar la intensidad de las
señales y de reducir los resultados falsamente negativos de los
análisis en ensayos inmunológicos. Se ha puesto de manifiesto que en
el caso de un empleo de las sustancias, o de los agentes, conformes
al invento en un ensayo inmunológico en cuanto a anticuerpos, se
amplifican considerablemente señales, que por lo demás son apenas
medibles en el caso de bajas concentraciones de anticuerpos. La
sensibilidad del ensayo inmunológico se aumenta de una manera tan
considerable, que las muestras, que sin las sustancias conformes al
invento se valoraron como negativas, se pueden identificar
claramente como positivas en cuanto a anticuerpos. El aumento de las
señales puede ser hasta 2-5 veces mayor. Un aumento
tan drástico de la señal en el caso de ensayos en cuanto a
anticuerpos mediante empleo de la sustancias poliméricas conformes
al invento era también sorprendente, por cuanto que mediante la
presencia de las sustancias conformes al invento aumenta la
viscosidad en la solución para incubación, con ello se disminuye la
difusión de los anticuerpos y de los complejos de antígenos y
anticuerpos hacia la pared, y por lo tanto se debía esperar más
bien una señal disminuida en el ensayo.
Un objeto adicional del invento es un
procedimiento para la producción de las sustancias eliminadoras de
perturbaciones conformes al invento. Este procedimiento está
caracterizado porque, preferiblemente en una primera etapa, una
proteína, de modo preferido una albúmina, del modo más preferido
albúmina de suero bovino, se agrega mediante agregación química con
engarzadores bifuncionales, preferiblemente por agregación térmica,
de modo preferido hasta un tamaño de partículas comprendido entre
10 y 200 nm, de modo muy especialmente preferido entre 20 y 50 nm.
La agregación térmica se efectúa de modo preferido a una
temperatura comprendida entre 50 y 100ºC, de modo muy especialmente
preferido entre 60 y 80ºC. En una segunda etapa se efectúa entonces
la acilación con un grupo -CO-R mediante un agente
de acilación apropiado. La acilación debe transcurrir en tal caso
preferiblemente de un modo completo y se puede vigilar
conjuntamente a través del consumo del agente de acilación, por
ejemplo por medio de una HPLC (= cromatografía de líquido de alto
rendimiento).
Sin embargo, también es posible llevar a cabo el
procedimiento en un orden de sucesión inverso, por acilación de la
proteína de acuerdo con el documento de patente de los EE.UU.
US-A-5.051.356 y por subsiguiente
polimerización térmica o química de la proteína acilada.
Fosfato de sodio 40 mmol / l de pH 7,4
Cloruro de sodio 7,1 g / l
N-Metil-isotiazolona.
HCl 1 g / l
2-Cloro-acetamida
1 g / l
Plasma basado en diagnóstico 210 ml / l
Péptidos de HCV biotinilados
(5-100 ng / l, dependiendo del antígeno)
Termo-RSA acetilada con
diferentes concentraciones comprendidas entre 0 y 1%
(0,1% = 1 m/ml), tamaño de partículas 30 nm
Tampón de fosfato 50 mmol / l de pH 7,0
Albúmina bovina 1 g / l
IgG bovina 4 g / l
Triton X 100 1 g / l
Anticuerpos (de cordero)
anti-Fc\gamma humana - POD
Fosfato / citrato 10 mmol / l, de pH 4,4
H_{2}O_{2} 3,2 mmol / l,
ABTS 1,2 mmol / l
La realización del ensayo con diferentes muestras
1-4 se efectúa sobre ES 600 de la entidad
Boehringer Mannheim GmbH.
1ª Etapa: Incubación durante 1 hora de 20 \mul
de muestra + 0,5 ml de tampón de incubación en un tubo revestido
con estreptavidina.
\newpage
2ª Etapa: Adición durante 1 hora de 0,5 ml de un
tampón de conjugado, con una etapa de lavado del conjugado.
3ª Etapa: Incubación durante 1 hora con 0,5 ml de
un tampón de substrato con un cromógeno.
Medición de la solución de substrato a 422
nm.
La Tabla 1 indica la influencia de
concentraciones crecientes de termo-RSA acetilada
sobre los valores medidos de las muestras 1-4. Las
señales de los valores medidos se hacen manifiestamente más altas
con una concentración creciente de termo-RSA
acetilada con un valor nulo constante. De ello resulta una
sensibilidad claramente mayor.
Muestra | Adición de una TRSA acetilada en un tampón de incubación | ||||||
0% | 0,10% | 0,20% | 0,30% | 0,50% | 1% | 2% | |
Suero 1 | 0,294 | 0,414 | 0,475 | 0,684 | 0,689 | 0,805 | 1,108 |
Suero 2 | 1,390 | 1,735 | 2,247 | 2,360 | 2,440 | 2,820 | 2,921 |
Suero 3 | 0,369 | 0,562 | 0,608 | 0,709 | 0,859 | 1,026 | 1,032 |
Suero 4 | 0,260 | 0,387 | 0,452 | 0,596 | 0,656 | 0,723 | 0,889 |
Suero 5 | 0,172 | 0,275 | 0,310 | 0,390 | 0,479 | 0,553 | 0,580 |
Suero 6 | 0,596 | 0,894 | 1,038 | 1,092 | 1,350 | 1,287 | 1,563 |
El ensayo se lleva a cabo igual en el Ejemplo 1,
pero en el tampón de incubación se encuentran 5 mg/ml de una
termo-RSA con diferentes tamaños de partículas,
comprendidos entre 25 nm y 85 nm.
La Tabla 2 muestra los resultados.
Mientras que en el caso de los sueros negativos
para HCV no se puede observar ningún aumento de las señales,
mediante el empleo de una termo-RSA acetilada con
diferentes tamaños de partículas se observa un manifiesto aumento de
las señales.
Muestras | Adición de una TRSA acetilada en el tampón de incubación | |||||
sin | 25 nm | 39 nm | 59 nm | 66 nm | 85 nm | |
Suero positivo A | 0,276 | 0,561 | 0,706 | 0,750 | 0,699 | 0,702 |
Suero positivo B | 0,150 | 0,332 | 0,357 | 0,409 | 0,513 | 0,398 |
Suero positivo C | 0,379 | 0,996 | 1,306 | 1,221 | 1,008 | 1,024 |
Suero positivo D | 0,432 | 1,094 | 1,249 | 1,292 | 1,158 | 1,119 |
Suero negativo 1 | 0,043 | 0,045 | 0,046 | 0,047 | 0,049 | 0,046 |
Suero negativo 2 | 0,043 | 0,041 | 0,043 | 0,044 | 0,044 | 0,046 |
Suero negativo 3 | 0,041 | 0,042 | 0,046 | 0,048 | 0,047 | 0,045 |
Suero negativo 4 | 0,042 | 0,043 | 0,045 | 0,046 | 0,044 | 0,043 |
Suero negativo 5 | 0,038 | 0,041 | 0,041 | 0,040 | 0,042 | 0,041 |
Igual que en el Ejemplo 2, pero con una
termo-RSA succinilada con diferentes tamaños de
partículas en el tampón de incubación.
Muestras | Adición de una TRSA succinilada en el tampón de incubación | |||||
sin | 8 nm | 18 nm | 30 nm | 74 nm | 85 nm | |
Suero positivo A | 0,256 | 0,240 | 0,364 | 0,652 | 0,570 | 0,593 |
Suero positivo B | 0,083 | 0,080 | 0,178 | 0,216 | 0,210 | 0,260 |
Suero positivo E | 0,407 | 0,330 | 0,619 | 0,858 | 0,797 | 1,009 |
Suero positivo F | 0,357 | 0,389 | 0,593 | 0,864 | 0,753 | 1,059 |
Suero negativo 6 | 0,010 | 0,013 | 0,013 | 0,022 | 0,022 | 0,021 |
Suero negativo 7 | 0,012 | 0,017 | 0,018 | 0,027 | 0,026 | 0,028 |
Suero negativo 8 | 0,011 | 0,019 | 0,017 | 0,029 | 0,027 | 0,034 |
Suero negativo 9 | 0,010 | 0,015 | 0,015 | 0,021 | 0,024 | 0,026 |
Suero negativo 10 | 0,013 | 0,018 | 0,018 | 0,033 | 0,027 | 0,035 |
1 g de RSA se calienta a 70ºC en 100 ml de una
solución 50 mM de un tampón de fosfato de potasio (de pH 7,0) y se
mantiene a esta temperatura durante 4 horas. Luego la solución se
enfría, se filtra y se lleva en una ultracentrífuga (con un límite
de exclusión de 30.000 Da) hasta una concentración de 50 mg/ml.
Seguidamente, se dializa frente a un volumen 30 veces mayor de agua
doblemente destilada y a continuación se liofiliza. El producto
tiene un peso molecular de aproximadamente 700.000 y un tamaño de
partículas de 30 \pm 8 nm (medido a través de una espectroscopia
de correlación de fotones (PCS)).
4.000 g de una RSA agregada térmicamente en 100
mM de un tampón de fosfato de potasio de pH 8,0 se atemperan a 25ºC.
La concentración de proteína se determina mediante OD (densidad
óptica) a 280 nm y después de ello se ajusta una concentración de
proteína de 10 mg/ml. Eventualmente se corrige con un tampón de
fosfato de potasio 10mM de pH 8,0. La solución de
termo-RSA situada en el recipiente con sistema de
agitación se calienta a 25ºC. El éster
N-hidroxi-succinimídico de ácido
acético se disuelve a la temperatura ambiente en una concentración
de 100 mg/ml en DMSO anhidro. Por cada litro de solución de
termo-RSA que se ha de acetilar, se añaden 11,5 ml
de una solución de éster succinimídico. La concentración final en
DMSO alcanzada con ello es de aproximadamente 1%. La tanda de
acetilación se agita luego durante 120 min a 25ºC después de haber
controlado el valor del pH (valor nominal
6,5 - 9). La disminución de la cantidad del éster N-hidroxi-succinimídico de ácido acético se vigila a través de una HPLC / TSK 3.000 (detección a 260 nm). Después de la ncubación se detiene la acetilación por adición de una solución de hidrocloruro de lisina a una concentración final de 5 nm.
6,5 - 9). La disminución de la cantidad del éster N-hidroxi-succinimídico de ácido acético se vigila a través de una HPLC / TSK 3.000 (detección a 260 nm). Después de la ncubación se detiene la acetilación por adición de una solución de hidrocloruro de lisina a una concentración final de 5 nm.
La tanda de acetilación detenida se filtra a
través de una prensa de filtración. La prensa se lava
posteriormente con agua, y los valores del material filtrado y del
material del lavado posterior se reúnen.
El material filtrado reunido se concentra hasta
50 l a través de una membrana de polisulfona de 10 KD. La solución
concentrada se diafiltra frente a un volumen 10 veces mayor de una
solución 20 mM de fosfato de potasio de pH 7,0. El material
concentrado se diluye hasta el respectivo volumen doble con un
tampón de diafiltración y luego se concentra de nuevo hasta el
volumen inicial. El éxito de la diafiltración se determina a través
de una analítica por HPLC / TSK 3.000. La solución se concentra
hasta una concentración de 80 \pm 10 mg/ml y a continuación de
ello se estabiliza con 0,1% de cloroacetamida y 0,01% de MIT
(metil-isotiazolona).
La medición por PCS proporciona un tamaño de
partículas de 30 \pm 15 mm.
3 g de RSA se disuelven en 30 ml de un tampón de
fosfato de potasio 30 mM de pH 7,1 y se mezclan con 0,6 ml de una
solución a base de 180 mg de MHS /ml de
dimetil-sulfóxido (DMSO). Después de una incubación
durante 1 hora a 25ºC, la tanda se amplía hasta 10 mM de lisina y
se dializa frente a un volumen 150 veces mayor de un tampón para
diálisis (mezcla de un tampón de fosfato de potasio 15 mM / NaCl 50
mM / etilen-diamina-tetraacetato
(EDTA) 1 mM / pH 6,2).
3 g de RSA se disuelven en 30 ml de un tampón de
fosfato de potasio 30 mM de pH 1 y se mezclan con 0,6 ml de una
solución de 140 mg de SATP / ml de DMSO. Después de una incubación
durante 1 hora a 25ºC, la tanda se amplía hasta 10 mM de lisina y se
dializa frente a un volumen 150 veces mayor de un tampón de diálisis
(mezcla de un tampón de fosfato de potasio 15 mM / NaCl 50 mM /
EDTA 1 mM / pH 6,2).
La solución con la RSA activada con SATP
procedente de (b) se amplía hasta 25 mM de hidroxilamina, se ajusta
un pH de 7,5 y se incuba durante 1 hora a 25ºC. A continuación se
añade la solución con la RSA activada con MHS procedente de (a) y
se incuba a 25ºC durante otros 45 min. La reticulación se detiene
por adición de 10 mM de cisteína. Después de otros 30 min la tanda
se amplía hasta 25 mM de
N-metil-malenimida y se dializa
frente a un volumen 150 veces mayor de una mezcla de tampón de
fosfato de potasio 50 mM / NaCl 0,15 M / pH 7,2.
La solución de poli-RSA dializada
procedente de (1c) se mezcla con 2,6 ml con una solución de 0,1 g
de anhídrido de ácido succínico / ml de DMSO. Después de haber
incubado durante 60min a 25ºC, la tanda se amplía hasta 50 mM de
lisina, se dializa frente a un volumen 150 veces mayor de un tampón
de fosfato de potasio 20 mM de pH 6,8 y se liofiliza.
Claims (27)
1. Agregado proteínico con un determinado tamaño
lo más uniforme que sea posible, que está acetilado con grupos
-CO-R, representando R un radical alquilo
C1-C4 ramificado o sin ramificar, que puede estar
sustituido con carboxi, hidroxi, SO_{3}H o PO_{3}H_{2}.
2. Agregado proteínico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es una
albúmina.
3. Agregado proteínico de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque la albúmina es una
albúmina de suero bovino.
4. Agregado proteínico de acuerdo con las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
R representa un grupo metilo o un grupo
-CH_{2}CH_{2}-COOH.
5. Agregado proteínico de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el
agregado proteínico ha sido agregado químicamente con engarzadores
homo- o hetero-bifuncionales.
6. Agregado proteínico de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el
agregado proteínico ha sido agregado térmicamente.
7. Agregado proteínico de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque consiste en una
albúmina de suero bovino acetilada o succinilada, agregada
térmicamente.
8. Agregado proteínico de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el
tamaño de partículas del agregado es de 10-200
nm.
9. Agregado proteínico de acuerdo la
reivindicación 8, caracterizado porque el tamaño de
partículas es de 20-50 nm.
10. Agente para aumentar las señales de ensayos
inmunológicos destinados a la detección de anticuerpos, que contiene
un tampón, caracterizado porque contiene un agregado
proteínico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9.
11. Agente de acuerdo con la reivindicación 10,
caracterizado porque el tampón tiene un valor del pH
comprendido entre 4 y 9.
12. Reactivo específico de fijación para ensayos
inmunológicos destinados a la detección de un anticuerpo, que
contiene uno o varios partícipes específicos en la fijación del
anticuerpo, caracterizado porque además contiene un agregado
proteínico acilado de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9 o un agente de acuerdo con una de las
reivindicaciones 10 u 11.
13. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 12, caracterizado porque el partícipe
en la fijación es un partícipe biotinilado en la fijación.
14. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el
partícipe en la fijación es un antígeno.
15. Reactivo específico de fijación de acuerdo
con la reivindicación 14, caracterizado porque un partícipe
en la fijación es un anti-anticuerpo marcado.
16. Procedimiento para la determinación de un
anticuerpo en una muestra mediando evitación de una determinación
falsamente negativa por aumento de la señal de medición, por
1) puesta en contacto de la muestra que se ha de
ha de investigar en cuanto al anticuerpo con uno o varios
partícipes específicos en la fijación del anticuerpo, realizándose
que por lo menos uno de los partícipes en la fijación está marcado
y forma con el anticuerpo un par de fijación detectable,
2) medición de las señales del par marcado de
fijación o del partícipe marcado libre en la fijación, como medida
de la presencia o de la concentración del anticuerpo en la
muestra,
caracterizado porque la muestra y por lo
menos uno de los partícipes específicos en la fijación se ponen en
contacto con un agregado proteínico acilado de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1-9.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo está
dirigido contra un virus.
\newpage
18. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque un partícipe
no marcado en la fijación es un antígeno o epítopo, que es capaz de
fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar.
19. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 16-18, caracterizado porque
el partícipe marcado en la fijación es un
anti-anticuerpo.
20. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 16-19, caracterizado porque
en primer lugar, la muestra y el partícipe no marcado en la
fijación se ponen en contacto con un agregado proteínico acilado, y
a continuación se añade el partícipe marcado en la fijación.
21. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 16-20, caracterizado porque
el partícipe no marcado en la fijación posee otro sitio específico
adicional de fijación para un partícipe en la fijación que está
fijado a una fase sólida.
22. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 21, caracterizado porque el partícipe no
marcado en la fijación está biotinilado.
23. Utilización de los agregados proteínicos
acilados de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9 para ensayos inmunológicos.
24. Utilización de los agregados proteínicos
acilados de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-9 para aumentar la intensidad de las señales y
evitar resultados falsamente negativos de las mediciones en ensayos
inmunológicos.
25. Procedimiento para la preparación de un
agregado proteínico acilado de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque
a) se polimerizan monómeros proteínicos para
formar un agregado, y porque
b) se acila el agregado proteínico con un
correspondiente agente de acilación.
26. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque la polimerización de
la proteína se efectúa por vía térmica.
27. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado porque el agregado
proteínico se acetila con
acetil-O-succinimida o se succinila
con anhídrido de ácido succínico.
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