ES2239121T3

ES2239121T3 - Metodo de inmovilizacion de reactivo(s) afin(es) sobre una base solida hidrofobica.

Info

Publication number: ES2239121T3
Application number: ES01903931T
Authority: ES
Inventors: Fabienne Babin; Laurence Hamon; Francois Rieunier
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: ATE292283T1; AU3188501A; EP1247096A1; AU777713B2; CA2397500C; FR2803913B1; DE60109733T2; DE60109733D1; US20040052797A1; EP1247096B1; WO2001051927A1; JP2003523503A; US7052887B2; FR2803913A1; JP4746810B2; CA2397500A1

Abstract

Procedimiento de inmovilización de un reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo, que consiste en una etapa de activación de dicha fase sólida y una etapa de copulación del reactivo afín sobre dicha fase sólida, caracterizado por utilizar, en la etapa de activación de dicha fase sólida, una combinación de una carbodiimida y de un tampón fosfato, en presencia de un coactivador y en medio ácido que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, 5, y por realizar la etapa de copulación en medio básico que tiene un pH de aproximadamente 7, 2 a aproximadamente 10, 5.

Description

Método de inmovilización de reactivo(s) afín(es) sobre una base sólida hidrofóbica.

La invención se relaciona con un procedimiento de inmovilización de reactivo(s) afín(es) sobre una fase sólida hidrofóbica utilizable en ensayos biológicos de detección de analitos.

Se conocen desde hace decenas de años ensayos de análisis biológico que utilizan reactivos que tienen una afinidad entre sí. Se designará a partir de ahora a estos últimos por el término "reactivos afines" o "reactivos de par de afinidad". Así, se sabe cómo buscar y detectar un miembro de un par de afinidad por medio del otro. Entre los ensayos biológicos que utilizan una reacción de afinidad entre reactivos afines, o "ensayos de afinidad", se encuentran los análisis enzimáticos que utilizan, por ejemplo, una enzima y su substrato; los inmunoensayos cualitativos o cuantitativos, iniciados por los trabajos pioneros de Berson y Yalow (1959) y que utilizan la reacción de un anticuerpo hacia el antígeno o hapteno correspondiente; más recientemente los ensayos de hibridación de ácido nucleico, que utilizan un blanco oligo- o polinucleotídico con una sonda nucleotídica complementaria, capaz de hibridarse específicamente con él; etc.

Desde los años 1960, se ha intentado utilizar, en los ensayos de afinidad que necesitan una separación de los complejos libres y de los complejos unidos obtenidos, fases sólidas (o soportes sólidos) reactivas, con el fin de simplificar esta etapa de separación.

La inmovilización de los reactivos afines sobre una fase sólida puede ser practicada por copulación covalente, por ejemplo, con ayuda de glutaraldehído. Se sabe también, desde los trabajos de Catt y Tregear en 1967, cómo realizar la inmovilización de un reactivo afín sobre una fase sólida por simple adsorción pasiva.

La inmovilización por adsorción pasiva presenta la ventaja de la simplicidad, pero puede conllevar la liberación al medio líquido del reactivo no inmovilizado convenientemente.

Las copulaciones covalentes sobre fase sólida presentan, en general, la ventaja de conducir a una mayor estabilidad del reactivo final, pero también permiten inmovilizar con antelación reactivo afín sobre un soporte sólido. Son numerosos los modos y agentes de copulación covalente sobre fase sólida de los que se dispone actualmente: se citarán, a modo de ejemplos no limitativos, las copulaciones con glutaraldehído, con bromuro de cianógeno y con carbodiimidas, en presencia o no de coactivador, tal como la DMAP (dimetilaminopiridina), el HOBt (1-hidroxibenzotriazol), la N-hidroxisuccinimida y la s-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida), bien conocidos por el experto en la técnica.

Los diferentes protocolos de inmovilización del reactivo afín sobre una fase sólida por copulación covalente se realizan en una etapa, en dos o incluso en tres etapas. En las copulaciones en una etapa, se ponen todos los ingredientes en contacto entre sí. Las copulaciones en dos etapas hacen intervenir, en general, una primera etapa en la que se activa el soporte sólido por un agente llamado "agente de activación" y se lava luego con el fin de eliminar cualquier exceso de agente de activación que no haya reaccionado, para ponerlo finalmente en presencia del reactivo afín, lo que permite realizar, en una segunda etapa, la copulación propiamente dicha.

Se conocen y utilizan numerosas fases o soportes sólidos: las fases sólidas hidrofílicas (como, por ejemplo, el Sephadex® comercializado por la sociedad Pharmacia) y las fases sólidas hidrofóbicas (como, por ejemplo, el polipropileno, el poliestireno, los látex...). Estas últimas se hacen generalmente reactivas por medio de funciones que les son injertadas previamente, tales como funciones amina, carboxilo, tosilo, aldehído, hidroxilo, tiol, clorometilo, hidrazida, etc.

Se han propuesto diferentes técnicas para copular de forma covalente reactivos afines a fases sólidas hidrofóbicas funcionalizadas por un grupo carboxilo: se utilizan diversas combinaciones de tampón y agente de activación, como la combinación de MES (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico) con una carbodiimida. Se citará, a modo de ejemplo, la copulación covalente de anticuerpos a látex carboxílicos en presencia de MES y de EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida), descrita por D. Bastos-González y col., J. of Colloid and Interface Science, 176, 232-239 (1995), o por C. Bieniarz y col., Bioconjugate Chem., 1996, 7, 88-95.

Sin embargo, se sabe desde hace mucho tiempo que se debe evitar la combinación de tampón fosfato y de carbodiimida -como agente de activación-, puesto que las carbodiimidas tienen el inconveniente de activar también los fosfatos y de perder así una gran parte de su reactividad. Se produce, pues, como resultado a la vez una insuficiente eficacia de la copulación covalente, una gran proporción de adsorción pasiva y, como consecuencia, una inestabilidad de los productos obtenidos (Wong, S., en "Chemistry of protein conjugation and crosslinking", capítulo 6, página 196 (1991), y M.A. Gilles y col., Analytical Biochemistry 184, 244-248 (1990).

Bangs (Bangs Laboratories Inc., Tech. Note # 13c, Covalent coupling protocols, página 3) propuso un protocolo de activación de las fases sólidas hidrofóbicas funcionalizadas por un grupo carboxilo con ayuda de la carbodiimida EDC en solución acuosa, pero los resultados obtenidos están lejos de ser satisfactorios en el plano de la eficacia de copulación. En efecto, la copulación no es cuantitativa y la parte de adsorción pasiva es importante con respecto a la copulación covalente (véase el ejemplo 1 más adelante).

De forma general, con todas las técnicas de la técnica anterior dirigidas a inmovilizar por copulación covalente un reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo, se observa al mismo tiempo que la copulación covalente propiamente dicha entre el reactivo afín y la fase sólida la coexistencia no deseada de una fijación importante por adsorción pasiva de dicho reactivo afín sobre dicha fase sólida. En otras palabras, estas técnicas presentan el inconveniente de no poder permitir la fijación covalente máxima deseada. No pudiendo ser dirigida la adsorción pasiva en beneficio de la copulación covalente, el resultado es que estas técnicas no permiten optimizar de la mejor manera la fijación covalente del reactivo afín ni, por lo tanto, obtener copulaciones covalentes reproducibles. En consecuencia, dan lugar productos inestables en el tiempo.

Existe, pues, una necesidad real de disponer de un método de inmovilización de un reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo que permita dirigir y optimizar de forma reproducible el carácter covalente de la copulación, eliminando a la vez al máximo la posibilidad de adsorción pasiva simultánea.

Se ha visto ahora, de forma sorprendente, que era posible dirigir y optimizar de forma reproducible el carácter covalente de una reacción de inmovilización del reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo con ayuda de una combinación de una carbodiimida y de un tampón fosfato como agente de activación.

La invención tiene, pues, por objeto, un procedimiento de inmovilización de un reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo, cuyo procedimiento consiste en una etapa de activación de dicha fase sólida y una etapa de copulación del reactivo afín sobre la fase sólida y se caracteriza por utilizar, en la etapa de activación de dicha fase sólida, una combinación de una carbodiimida y un tampón fosfato en medio ácido, en presencia de un coactivador, y por realizar la etapa de copulación del reactivo afín en medio básico.

Se puede utilizar para los fines de la invención no importa qué carbodiimida usada en este campo como agente de activación de la función carboxilo, así como en el campo de la síntesis peptídica.

Ejemplos de carbodiimidas están especialmente descritos por Lundblad, R.L. y col., Chemical Reagents for Protein Modification, Vol. 2, Cap. 4, CRC Press, Boca Ratón, F.L., y Marion Mikolajczyk y col., Tetrahedron, Vol. 37, pp. 233-284 (1981).

Entre las carbodiimidas utilizables como activador en el marco de la invención, se puede utilizar especialmente el CMC (metil-p-toluensulfonato de N-ciclohexil-N'-(2-morfolinoetil)carbodiimida) y la EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida), siendo particularmente preferido el CMC.

La carbodiimida debe ser utilizada en exceso con respecto a la función COOH. Ventajosamente, se utiliza una cantidad de 20 a 50 equivalentes molares por función COOH.

Por "tampón fosfato", se entiende, en el marco de la invención, cualquier tampón fosfato clásico (de sodio y/o de potasio) utilizado a una concentración que va generalmente de 30 a 200 mM, siendo más particularmente preferido el tampón fosfato 50 mM.

Se puede utilizar no importa qué coactivador usado en este campo. Ejemplos de coactivadores están especialmente descritos por Staros, J.V., Biochemistry 21, 3950-3955 (1982); O'Sullivan, M.J. y col., Anal. Biochem. 100, 100-108 (1979), y Abdella, P.M. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 87, 734-742 (1979).

Entre los coactivadores utilizables según la invención, se pueden emplear especialmente el s-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida), el HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y la N-hidroxisuccinimida, siendo particularmente preferido la s-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida).

Como la carbodiimida, el coactivador debe ser utilizado en exceso con respecto a la función COOH. Ventajosamente, se utiliza una cantidad de 3 a 10 equivalentes molares por función COOH.

Por "medio ácido" en la etapa de activación del procedimiento de la invención, se entiende cualquier medio que tenga un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, siendo más particularmente preferido el pH 6 y siendo conferido el carácter ácido de dicho medio por el tampón fosfato.

Por "medio básico" en la etapa de copulación del procedimiento de la invención, se entiende un medio que tiene un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 10,5, siendo más particularmente preferido un medio que contenga un 50% de un tampón de pH 8,5.

El carácter básico del medio es obtenido por utilización de tampones clásicos apropiados, por ejemplo un tampón borato o una mezcla de tampón fosfato/tampón borato.

Así, en un modo de realización preferido de la invención, se utiliza, en la etapa de activación de la fase sólida, una combinación de 20 a 50 equivalentes molares por función COOH de CMC en tampón fosfato 30-200 mM, en presencia de 3 a 10 equivalentes molares por función COOH de coactivador sulfo-N-hidroxisuccinimida, en medio ácido que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, y se realiza la copulación en medio básico que tiene un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 10,5.

En un modo de realización particularmente preferido de la invención, se utiliza, en la etapa de activación de la fase sólida, una combinación de 30 equivalentes molares por función COOH de CMC en tampón fosfato KH_{2}PO_{4} 50 mM, en presencia de 5 equivalentes molares por función COOH de coactivador sulfo-N-hidroxisuccinimida, a pH 6, y se realiza la copulación en un medio que contiene un 50% de un tampón borato de pH 8,5.

La combinación juiciosa de los parámetros de activación: carbodiimida, tampón fosfato, coactivador y pH ácido asociada a las condiciones de copulación descritas anteriormente es esencial para la práctica del procedimiento de la invención.

Los reactivos afines que se pueden inmovilizar en el marco de la invención son todos los compuestos que tienen una función amina o que pueden ser artificialmente provistos de ella. Se citarán, a modo de tales reactivos afines, las proteínas, los péptidos, las inmunoglobulinas, los antígenos, los haptenos, los anticuerpos, las enzimas, los substratos enzimáticos, los oligonucleótidos, los polinucleótidos, etc., así como cualquier otro reactivo biológico conocido por el experto en la técnica.

Por "fase sólida hidrofóbica", se entiende en la presente descripción las fases sólidas constituidas por polímeros hidrofóbicos habitualmente utilizados en este campo, por ejemplo los polipropilenos, los polímeros vinilaromáticos, tales como los poliestirenos, y especialmente los látex de estos polímeros. Estas fases sólidas son funcionalizadas por un grupo carboxilo según las técnicas conocidas por el experto en este campo. A este efecto, se podrá hacer referencia, por ejemplo, al artículo de Ottewill R.H. y col., en Kolloid Zu Z Polymere 215: 161-166 (1967).

Entre las fases sólidas hidrofóbicas funcionalizadas por un grupo carboxilo utilizables según la invención, se citarán las partículas de látex, por ejemplo las conocidas bajo la marca Estapor® (Prolabo, Francia), las partículas magnéticas Dynabeads® de la sociedad Dynal, las microesferas Polybead® de la sociedad Polysciences, Inc. y sus equivalentes, etc.

Los complejos sólidos reactivos susceptibles de ser obtenidos por el procedimiento según la invención son especialmente los complejos de fase sólida-antígeno, los complejos de fase sólida-hapteno, los complejos de fase sólida-anticuerpo, etc., utilizables en inmunoensayos, o los complejos de fase sólida-oligo- o polinucleótido, utilizables en ensayos de hibridación nucleica, de amplificación, etc., los complejos de fase sólida-enzima o los complejos de fase sólida-substrato enzimático, etc.

Estos complejos pueden ser utilizados en "estuches" o "neceseres" o "kits" para ensayos biológicos, como, por ejemplo, y sin restricción, los inmunoensayos, los ensayos de hibridación de ácido nucleico, los ensayos de amplificación de ácido nucleico, los ensayos enzimáticos, etc. conocidos por el experto en la técnica, ya sean cualitativos o cuantitativos.

La invención será mejor comprendida con ayuda de los ejemplos que siguen y que no deben ser considerados en modo alguno como restrictivos del alcance de la invención, sino que se dan a modo simplemente ilustrativo.

Ejemplo 1 Copulación de un péptido sobre perlas carboxílicas a) Reactivos a1) Perlas carboxílicas

Como fase sólida hidrofóbica con grupo carboxilo, se han utilizado perlas de látex carboxílicas magnéticas producidas por la sociedad Prolabo, Francia (referencia Estapor MI-070/60). Están constituidas por partículas polidispersas de poliestireno y de óxido de hierro, funcionalizadas por funciones COOH. La fase sólida utilizada tiene las características siguientes: diámetro medio (0,8 \mum), porcentaje de hierro (62%) y razón de funcionalización (150 \mueq. de COOH/g), presentada en suspensión acuosa a 0,1 g/ml.

Todas las etapas de lavado de las perlas son realizadas de la forma siguiente:

En cada experimento, se separan las perlas magnéticas presentes en los tubos de ensayo de las soluciones con ayuda de un soporte imantado. Se eliminan los sobrenadantes con ayuda de una pipeta, quedando retenidas las perlas magnéticas en dichos tubos con ayuda del soporte imantado. Después de cada adición de una nueva solución o de un nuevo tampón, se vuelven a suspender las perlas por agitación vorticial durante aproximadamente 10 segundos.

Un lavado comprende la adición de la solución de lavado, la resuspensión de las perlas y la eliminación de esta solución por imantación.

a2) Péptido

En este ejemplo, se utilizó el péptido de 17 aminoácidos que tiene la secuencia siguiente: KGSYSVDHFRWGRPVSG-NH_{2}.

Este péptido fue preparado según el modo operativo descrito por E. Atherton y R.L. Sheppard en "Solid phase peptide synthesis, a practical approach", IRL PRESS (1989), Oxford University Press, pp. 25-34.

La solución de tapón fosfato utilizada era una solución acuosa de KH_{2}PO_{4} 50 mM, a pH 6.

Todas las operaciones fueron realizadas a temperatura ambiente, es decir, a 19-24ºC.

b) Inmovilización del péptido sobre perlas carboxílicas b1) Copulación covalente del péptido sobre las perlas carboxílicas

Etapa 1

Lavado de las perlas carboxílicas

En un tubo de ensayo, se lavan 50 \mul de perlas de látex carboxílicas magnéticas 2 veces con 750 \mul de NaOH 0,1 mM, pH 9, una vez con 750 \mul de agua bidestilada y finalmente una última vez con 750 \mul de tampón fosfato.

Etapa 2

Activación de las perlas carboxílicas

A la pella de perlas lavadas obtenidas en la etapa 1, se añaden 250 \mul de tampón fosfato, 200 \mul (30 eq./función COOH) de una solución acuosa de CMC [[metil-p-toluensulfonato de N-ciclohexil-N'-(2-morfolinoetil)-carbodiimida] (Fluka)] y 50 \mul (5 eq./COOH) de una solución acuosa de s-NHS [sulfo-N-hidroxisuccinimida) (Pierce)].

Se deja incubar el conjunto de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se lavan luego las perlas con 500 \mul de tampón fosfato.

Etapa 3

Copulación de un péptido sobre las perlas

A la pella de perlas activadas obtenidas en la etapa 2, se añaden 250 \mul de tampón fosfato y 250 \mul de una solución de tampón borato 37,5 mM/NaCl 50 mM, pH 8,5, que contenía 0,25 eq. (con respecto a las funciones COOH) del péptido descrito en la sección a2).

Se deja incubar el conjunto de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se separan las perlas por imantación y se conserva el sobrenadante para una determinación por HPLC (véase la sección c) más adelante). Después de lavar, se conservan las perlas en tampón PBS, pH 7,4, o cualquier otro tampón equivalente
apropiado.

b2) Adsorción pasiva del péptido sobre las perlas carboxílicas

Se lleva a cabo una copulación de tipo "pasivo" -llamada "adsorción pasiva"- utilizando exactamente los mismos reactivos que antes, pero omitiendo los agentes de activación y de copulación CMC y s-NHS. Después de la copulación de tipo "pasivo", se separan las perlas por imantación y se conserva el sobrenadante para determinación por HPLC (véase la sección c)).

c) Cálculo del rendimiento de la copulación covalente y evaluación de la copulación pasiva por HPLC

Se siguen las copulaciones por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en fase inversa en un aparato (Waters, por ejemplo) con una fase estacionaria apolar (C18) y una fase móvil polar (gradiente de acetonitrilo-TFA al 0,08% en agua-TFA al 0,1%).

Al final de cada copulación (covalente o pasiva), se inyecta en el aparato de HPLC un volumen de 30 \mul de sobrenadante obtenido en la sección b1) o b2).

Además, también se inyecta en el aparato de HPLC un volumen idéntico de "solución patrón" (es decir, de la misma solución de péptido contenido en los 250 \mul de tampón borato 37,5 mM/NaCl 50 mM, pH 8,5, y los 250 \mul de tampón fosfato, utilizada en copulaciones, pero no sometida a copulación con las perlas magnéticas).

Los cromatogramas de HPLC, obtenidos midiendo la absorbancia a 214 nm en función del tiempo T expresado en minutos, están representados en las figuras 1 a 3. El cromatograma de la figura 1 muestra el pico obtenido con una solución patrón (ensayo sin copulación con las perlas magnéticas) a T_{0}. Ésta sirve de referencia indicando la cantidad total de péptido introducida.

El cromatograma de la figura 2 muestra el pico obtenido con un sobrenadante retirado a T_{0+1\ hora} al final de la copulación covalente descrita en la sección b1).

El cromatograma de la figura 3 muestra el pico obtenido con un sobrenadante retirado a T_{0+1\ hora} al final de la adsorción pasiva descrita en la sección b2).

Para cada cromatograma, el área del pico es integrada por un programa (programa Millenium, por ejemplo). Se mide así el área A0 para la solución patrón, el área A1 para la copulación covalente y al área A2 para la copulación de "tipo pasivo".

El rendimiento de copulación es determinado así por una determinación a cambio, conocida por el experto en la técnica, mediante la fórmula siguiente:

% de copulación covalente = \frac{(A0-A1)}{A0}\ x\ 100

% de copulación "pasiva" = \frac{(A0-A2)}{A0}\ x\ 100

d) Comparación de la copulación según la invención y de copulaciones según la técnica anterior

Se realizó el estudio con 3 protocolos de la técnica anterior y el protocolo según la invención. Se realizó en paralelo una copulación en condiciones "pasivas" omitiendo el agente de copulación y el agente de activación para todos los protocolos. Se evaluaron los rendimientos de copulación covalente y de copulación pasiva según el método descrito en c).

Protocolos de la técnica anterior

- Protocolo "Bangs", Bangs Laboratories Inc., Tech note #13c. Covalent coupling protocols, página 3.

Se lavaron las perlas en un tampón de preactivación (tampón fosfato 50 mM, pH 4,5) y se activaron después mediante una solución acuosa de EDC en presencia de un débil porcentaje (20%) de tampón de preactivación. Se realizó la copulación en tampón borato 0,2 M, pH 8,5. Después de la copulación, se bloquearon las funciones carboxílicas que no habían reaccionado con una solución de etanolamina. Se conservaron las perlas en un tampón que contenía BSA, glicina, detergente Tween® y nitruro de sodio.

- Protocolo J. Sackrison. Covalent coupling to latex particles and diagnostic development using microspheres, the latex course, 1997.

Se lavaron las perlas varias veces con una solución de tampón borato 10 mM, pH 8,5, con una solución de acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, y con una solución de dietanolamina 50 mM, pH 10,2 y se activaron después con una solución de CMC en tampón dietanolamina 50 mM, pH 10,2. Se realizó la copulación en tampón fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4.

- Protocolo 1, descrito por D. Bastos-González y col., J. of colloid and interface science 176, 232-239, 1995.

Se añadieron perlas de látex a una solución tampón (MES) de pH 5,6. Se realizó la copulación en medio débilmente ácido (en tampón MES, pH 5,6). Se añadió una solución acuosa de EDC y se puso luego a incubar la muestra a temperatura ambiente. Después de la copulación, se bloquearon las funciones carboxílicas en exceso con un tratamiento con etanolamina.

Los resultados obtenidos por determinación mediante HPLC están indicados en la tabla I en forma de rendimientos (%) de copulación y de diferencia (\Delta) entre copulación covalente y adsorción pasiva:

TABLA I

Protocolo	% de péptido copulado	% de péptido copulado por	\Delta (covalente-pasiva)
	pasivamente	covalencia
Bangs	47	57	10
Latex course (J. Sackrison)	80	82	2
Protocolo 1 (D.	8	13	5
Bastos-González y col.)
Protocolo según la	54	100	46
invención

Se obtienen los mejores rendimientos con el protocolo de copulación según la invención, en comparación con los obtenidos con los protocolos de la técnica anterior; así, con el protocolo de copulación según la invención, el rendimiento de copulación covalente es cuantitativo (100%) y la diferencia entre la copulación covalente y la copulación pasiva es notable, contrariamente a los protocolos de la técnica anterior, donde la diferencia entre las dos formas de copulación es poco significativa.

e) Reproductibilidad del procedimiento de copulación según la invención

Se estudió la reproductibilidad del procedimiento de copulación según la invención por realización, por una parte, de tres copulaciones sobre un mismo lote de perlas y, por otra parte, de una copulación sobre un lote de perlas diferente.

Se realizaron una copulación covalente según el protocolo descrito en la sección b.1 (anterior) y una copulación de tipo "pasivo" según el protocolo descrito en la sección b.2 (anterior) paralelamente a cada experimento. Se determinaron el cálculo del rendimiento de copulación y la evaluación de la copulación pasiva según el protocolo c) anterior.

En la tabla II se indican los resultados obtenidos por determinación mediante HPLC en forma de rendimientos (%) de copulación y de diferencia (\Delta) entre copulación covalente y adsorción pasiva:

TABLA II

Lote de perlas	% de péptido copulado	% de péptido copulado por	\Delta (covalente-pasiva)
	pasivamente	covalencia
477	52	98	46
477	54	100	46
477	58	100	42
583	56	93	37

Estos resultados muestran que, con un mismo lote (lote 477), la reproductibilidad es excelente. Con un lote diferente (lote 583), el rendimiento de copulación es del todo aceptable y comparable al rendimiento obtenido con el primer lote.

Ejemplo 2 a) Copulación de seroalbúmina bovina (BSA) y de perlas magnéticas carboxílicas

Se copulan 175 \mug de BSA (Pantex) según las condiciones descritas para el ejemplo 1, en la sección b1). Se realiza la reacción de copulación propiamente dicha durante 22 horas (en lugar de 1 hora) a temperatura ambiente.

Se realiza una adsorción pasiva según las mismas condiciones omitiendo los agentes de copulación, CMC, y de coactivación, s-NHS. Después de la copulación, se separan las perlas por imantación y se conserva el sobrenadante para una determinación por HPLC.

b) Comparación de la copulación de la BSA según la invención y de copulaciones de la técnica anterior

Se comparó el protocolo según la invención con dos protocolos de la técnica anterior: el protocolo "Bangs" y el protocolo "latex course" (J. Sackrison).

Se evaluaron los rendimientos de copulación covalente y de adsorción pasiva con ayuda de los tres protocolos según el método descrito en el ejemplo 1, en el párrafo c).

Los resultados obtenidos por determinación mediante HPLC están indicados en la tabla III en forma de rendimientos (%) de copulación y de diferencia (\Delta) entre copulación covalente y adsorción pasiva:

TABLA III

Protocolo	% de BSA copulada	% de BSA copulada por	\Delta (covalente-pasiva)
	pasivamente	covalencia
Bangs	13	17	4
Latex course (J. Sackrison)	31	34	3
Protocolo según la invención	25	65	40

Los resultados muestran la superioridad del protocolo de la invención con respecto a los protocolos de la técnica anterior, ya que permite la obtención de un \Delta de copulación (covalente-pasiva) mucho más elevado.

Ejemplo 3 Aplicación a una prueba diagnóstica de detección de los anticuerpos anti-virus VIH

Se utilizaron las perlas obtenidas según el procedimiento de la invención, como se indica a continuación, para la detección de anticuerpos anti-virus VIH en una prueba ELISA conocida: prueba Access® HIV 1-2 New, comercializada por, y disponible en, Bio-Rad Laboratories, Marnes la Coquette, Francia, número de catálogo: 34 020, donde el anticuerpo específico anti-VIH-2 es tomado en sandwich entre un antígeno de captura inmovilizado sobre perlas magnéticas y un antígeno marcado por una enzima. El revelado y la medida de la señal son realizados por adición de un substrato quimioluminiscente de la enzima y lectura de la luminiscencia generada.

a) Material y métodos a1) Antígeno de captura (péptido)

Se sintetizó un péptido de 27 AA que contenía el epitopo inmunodominante esencial, el heptapéptido CAFRQVC, de la gp36 del virus VIH-2 según el método de E. Atherton y R.L. Sheppard mencionado anteriormente y se copuló después a BSA por una copulación covalente con ayuda de un reactivo homobifuncional: bis(sulfosuccinimil)suberato. A continuación, se llamará al conjugado BSA-péptido VIH-2 obtenido "BSA-VIH-2".

a2) Inmovilización del antígeno de captura

Se copuló luego el conjugado BSA-VIH-2 anterior con perlas de látex carboxílicas magnéticas (Estapor) según el protocolo de copulación covalente de la invención y según un protocolo de la técnica anterior.

\bullet Se copularon 12 \mug de conjugado BSA-VIH-2 con 100 \mul de perlas según el método descrito en el ejemplo 1b).

\bullet Se copularon 12 \mug de conjugado BSA-VIH-2 con 100 \mul de perlas según un método de la técnica anterior (protocolo 1 de Bastos-González: véase el ejemplo 1d).

A continuación, se llamará a las perlas magnéticas portadoras de BSA-péptido VIH-2 obtenidas "perlas BSA-VIH-2".

a3) Antígeno de revelado

Se copuló el mismo péptido de 27 AA que contiene el epitopo inmunodominante esencial, el heptapéptido
CAFRQVC, de la gp36 del virus VIH-2 utilizado en a1) anterior con fosfatasa alcalina (en adelante, llamada "PAL"), de la sociedad Biozyme, por copulación covalente con ayuda de un reactivo homobifuncional: bis(sulfosuccinimil)suberato. A continuación, se llamará al conjugado péptido VIH-2-PAL obtenido "péptido-PAL".

a4) Detección de la señal

Se utiliza un substrato, específico para la fosfatasa alcalina y a base de dioxetano, para el revelado. Se hace la lectura de la señal en el luminómetro Access®, de Bio-Rad Laboratories, Francia. Se expresa la señal en unidades RLU (Relative Luminiscence Units/unidades de luminiscencia relativa).

a5) Muestras

Se utilizaron para el ensayo sueros humanos positivos a anticuerpos anti-VIH-2 diluidos en suero humano negativo: qc1, qc2, qc3 y un suero negativo a anticuerpos anti-VIH: C0.

b) Protocolo de ensayo

Se realizaron dos series paralelas.

b1) Se pusieron 50 \mul de suero en presencia de 50 \mug de perlas BSA-VIH-2 obtenidas según el protocolo de copulación covalente de la invención y de 350 \mul de conjugado péptido-PAL. Se puso a incubar la mezcla durante 20 minutos a 37ºC, se separaron luego las perlas por imantación y se eliminó el sobrenadante.

Se añadieron 200 \mul de substrato y se puso a incubar durante 5 minutos a 37ºC.

Se realizó la lectura y se registraron las RLU. Los resultados son expresados por la razón de RLU "Señal/C0": véase la Tabla IV.

b2) Se pusieron 50 \mul de suero en presencia de 50 \mug de perlas BSA-VIH-2, obtenidas según el protocolo 1 de Bastos-González, y de 350 \mul de conjugado péptido-PAL.

El resto del protocolo es idéntico al del modo operativo b1) anterior.

c) Resultados y comparación con la técnica anterior

En la tabla IV se indican los resultados obtenidos con la copulación según la invención y los obtenidos con la copulación según el protocolo 1.

TABLA IV

1

Los resultados muestran, para las muestras positivas, una razón "Señal/C0" obtenida por el protocolo según la invención considerablemente superior a la obtenida por el protocolo 1 de la técnica anterior. Esto se traduce por una mucho mejor inmunorreactividad y una mejor sensibilidad analítica y refleja muy claramente que el método de copulación según la invención permitió una copulación covalente óptima con respecto al protocolo 1.

Ejemplo 4 Ensayos de estabilidad de las perlas de látex carboxílico magnético revestidas del conjugado BSA-VIH-2 ("perlas BSA-VIH-2") de la invención

Se realizó un estudio de estabilidad a largo plazo: 7 meses, 12 meses y 18 meses a +4ºC, con ayuda del protocolo del ejemplo 3 para las perlas BSA-VIH-2 (lote C7P184A, obtenido en el ejemplo 3 a partir de perlas del lote inicial 477 que se vio anteriormente). La tabla V resume los resultados obtenidos, que muestran que el lote no ha perdido significativamente inmunorreactividad en 18 meses a +4ºC. En los resultados que se dan a continuación, y para comodidad de presentación de la Tabla V, se ha substituido la expresión "SEÑAL/C0" por la forma abreviada
"S/C0".

TABLA V

2

Estos resultados muestran claramente que el procedimiento según la invención permite obtener complejos de reactivos afines inmovilizados -sobre fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo- de gran estabilidad en el tiempo.

Ejemplo 5 Copulación covalente de ácido nucleico a parlas de látex carboxílicas magnéticas a) Material y métodos

Se prepararon tampones 5xSSC y 2xSSC según el método descrito en Maniatis T. y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).

Se obtienen sondas (ADN) funcionalizadas por una función amina en 5' por medio de un sintetizador automático y de la utilización del reactivo comercial Aminolink 2 de la Sociedad Perkin Elmer, citadas a continuación: sondas 5'-NH_{2}.

El analito utilizado es ARN o ADN. Los rendimientos de la copulación de sondas son evaluados en un formato de hibridación en sandwich en el aparato Access® de la Sociedad Beckman.

Se copula una sonda de ADN específica del analito con partículas magnéticas según el protocolo descrito a continuación en b). Sirve para capturar el analito (sonda de captura).

Se realiza el revelado con ayuda de una sonda de detección específica (diferente de la primera sonda) del analito marcado, por ejemplo con la enzima fosfatasa alcalina, según procedimientos conocidos por el experto en la técnica.

Se describen ejemplos de marcaje no radiactivo de sondas, por ejemplo, en la patente FR Nº 78.10975, o por M.S. Urdea y col., Nucleic Acids Symp. Ser., 24, 1991, 197-200, o también por R. Sánchez-Pescador, J. Clin. Microbiol., 26, 1988, 1934-1938.

El rendimiento de copulación covalente de ácido nucleico a perlas de látex carboxílicas magnéticas es evaluado como en el ejemplo 1 por HPLC utilizando condiciones adaptadas a los ácidos nucleicos: por ejemplo, fase estacionaria (C18) y fase móvil (gradiente de tampón A: acetato de trietilamonio 10^{-2} M, y tampón B: acetonitrilo/A: 95/5).

b) Copulación covalente de una sonda 5'-NH_{2} con perlas de látex carboxílico magnético

Se copulan 20 \mug de sonda 5'-NH_{2} (es decir, portadora de función NH_{2} en posición 5') con 200 \mul de perlas de látex carboxílico magnético Estapor MI-070/60 según condiciones similares a las del ejemplo b.1.

Se lavan luego las perlas dos veces con 500 \mul de tampón 5xSSC y dos veces con 500 \mul de tampón 2xSSC. Se conservan las perlas en tampón 2xSSC NaN_{3} al 0,02%.

Ensayo de hibridación: se puede hacer la hibridación de las sondas de captura y de detección sobre el analito por separado (en dos etapas) o simultáneamente (en una etapa), especialmente según uno de los métodos descritos por Langhale y Malcolm, Gene 36, 1985, 201-210; o por Ranki y col., Gene 21, 1993, 77-85; por Dunn y Hassel, Cell, 12. 1977, 23-36; o también por Ranki y Soderlund en las patentes US 4.486.539 y US 4.563.419.

El experto en la técnica podrá reproducir sin dificultad experimentos de hibridación y comparar el método de copulación según la invención con técnicas de copulación de la técnica anterior. Se citará como técnica de copulación de la técnica anterior la fijación de la sonda de captura sobre el soporte sólido según procedimientos bien conocidos, especialmente por adsorción pasiva o por copulación covalente (Cook y col., Nucleic Acids Res. 16, 1988, 4077-4095; Nagata y col., FEBS Lett. 183, 1985, 379-382; M. Longlaru y col., EP 420.260 A2; T. Gingeras y col., EP 276.302, y E. Kornes y L.M. Kornes, EP 446.260).

Claims

1. Procedimiento de inmovilización de un reactivo afín sobre una fase sólida hidrofóbica funcionalizada por un grupo carboxilo, que consiste en una etapa deactivación de dicha fase sólida y una etapa de copulación del reactivo afín sobre dicha fase sólida, caracterizado por utilizar, en la etapa de activación de dicha fase sólida, una combinación de una carbodiimida y de un tampón fosfato, en presencia de un coactivador y en medio ácido que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, y por realizar la etapa de copulación en medio básico que tiene un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 10,5.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por utilizar como carbodiimida un compuesto seleccionado entre el grupo consistente en CMC (metil-p-toluensulfonato de N-ciclohexil-N'-(2-morfolinoetil)carbodiimida) y EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por utilizar como coactivador un compuesto seleccionado entre el grupo consistente en s-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida), HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y N-hidroxisuccinimida).

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por utilizar como carbodiimida CMC (metil-p-toluensulfonato de N-ciclohexil-N'-(2-morfolinoetil)carbodiimida) y como coactivador s-NHS (sulfo- N-hidroxisuccinimida).

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por utilizar la carbodiimida a razón de 20 a 50 equivalentes molares por función COOH.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por utilizar el coactivador a razón de 3 a 10 equivalentes molares por función COOH.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por utilizar, en la etapa de activación de la fase sólida, una combinación de 20 a 50 equivalentes molares por función COOH de CMC, en tampón fosfato 30-200 mM y en presencia de 3 a 10 equivalentes molares por función COOH de coactivador sulfo-N-hidroxisuccinimida, en medio ácido que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, y por realizar la copulación en medio básico que tiene un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 10,5.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por utilizar en la etapa de activación de la fase sólida, una combinación de 30 equivalentes molares por función COOH de CMC, en tampón fosfato KH_{2}PO_{4} 50 mM y en presencia de 5 equivalentes molares por función COOH de coactivador sulfo-N-hidroxisuccinimida, a pH 6, y por realizar la copulación en un medio que contiene un volumen de un tampón de pH 8,5 y un volumen de dicho tampón fosfato.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que el reactivo afín contiene una función amina o puede ser provisto artificialmente de ella.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por seleccionar el reactivo afín entre el grupo consistente en proteínas, péptidos, inmunoglobulinas, antígenos, haptenos, anticuerpos, enzimas, substratos enzimáticos, oligonucleótidos y polinucleótidos.