JP2004340722A - ポリアミノ酸担体 - Google Patents
ポリアミノ酸担体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004340722A JP2004340722A JP2003137139A JP2003137139A JP2004340722A JP 2004340722 A JP2004340722 A JP 2004340722A JP 2003137139 A JP2003137139 A JP 2003137139A JP 2003137139 A JP2003137139 A JP 2003137139A JP 2004340722 A JP2004340722 A JP 2004340722A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- polyamino acid
- group
- carrier
- amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】検体中の微量の標的抗体を検出するために、低分子抗原（ペプチド）の活性を損なうことなく担体に結合させることができれば、医療分野における各種疾病等の迅速かつ簡便な診断に使用することができる。
【解決手段】側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有する、単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸、及び前記反応基の全部又は一部に、架橋構造を介して又は介さずに結合しているジオール構造若しくはアミノアルコール構造とからなるペプチド結合用ポリアミノ酸担体を提供する。
【選択図】 なし
【解決手段】側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有する、単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸、及び前記反応基の全部又は一部に、架橋構造を介して又は介さずに結合しているジオール構造若しくはアミノアルコール構造とからなるペプチド結合用ポリアミノ酸担体を提供する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応を利用した標的抗体を検出する分野において、水不溶性担体に低分子抗原を固相化させるために使用するポリアミノ酸担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野において、生体成分から特定の物質を検出もしくは定量する方法として抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く利用されている。抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、特異性が高くかつ検出感度も高いため、臨床検査の重要な手段の一つとなっている。この免疫測定法には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）などが知られている。
【０００３】
これらの測定法を実施するにあたり、被測定物質に対する抗体又は抗原をマイクロタイタープレート、メンブレンフィルター、ビーズなどの水不溶性の固相に結合して使用するが、高感度で安定性の高い診断薬を製造するには抗体又は抗原を上記の水不溶性固相に効率的かつ安定性よく結合させることは非常に重要な技術である。水不溶性の固相としては、例えば、マイクロタイター法に用いられる担体として、ポリスチレン又はその共重合体の粒子である人工担体が開発されている（特開昭５８−２０９９８４号、特開昭６２−１１８２５６号）。合成高分子による人工担体は、化学的、物理的に均質かつ安定であり、大量生産も可能であるという利点を有する。さらに、ゼラチンと水溶性多糖類とからなる水不溶性の人工担体（特開昭５７−１５３６５８号、特開昭５７−１６０４６５号）、及びポリアミノ酸と水溶性多糖類とからなる水不溶性の人工担体（特開平２−１０３４７０号、特開平６−１３００６０号）等が開示されている。しかし、製造工程が多段階にわたり複雑であるため、低分子抗原を結合させた各種担体を製造することは困難である。
【０００４】
上記のような水不溶性の固相（担体）に抗原又は抗体を結合させる方法には、主に物理吸着、共有結合等による方法が知られている（「固定化酵素」千畑一郎編 講談社サイエンティフィク（１９８６）第９−４５頁参照）。共有結合による方法に比べ、物理吸着法は簡便であり、かつ、吸着させる抗原又は抗体の活性を損なうことがないという利点を有する。しかしながら、抗原が低分子である場合、水不溶性固相との相互作用が弱いため、抗原を物理吸着させることは困難であった。
【０００５】
従来、上記の問題点を解決するため、低分子抗原をキャリア蛋白質（高分子担体）に、架橋剤又はカップリング剤を使用して共有結合させる方法が知られている（特開昭５６−７１０２３号）。この方法に用いるキャリア蛋白質としては、例えば、ウシの血清アルブミン、ヒトの血清アルブミン、卵のアルブミン、ポリリジン等を用いることができる。しかしながら、ウシの血清アルブミン、ヒトの血清アルブミン、卵のアルブミン等の天然由来の蛋白質を担体として用いた場合、生体成分中の免疫グロブリンの一部がキャリア蛋白質に対して反応性を示す場合があり、このような非特異的反応を低下させる必要があった。
【０００６】
上記のキャリア蛋白質に、低分子の抗原を共有結合させる方法としては、従来から行われているハプテン抗原の作製法（「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第２８−３３頁）、ハプテンの酵素標識法（「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第４６−５０頁）を適用することができ、例えば抗原に存在する官能基を活性化する方法、キャリア蛋白質に存在する官能基を活性化する方法、抗原及びキャリア蛋白質の双方に反応性を有する２価架橋剤を用いる方法等が知られている。しかしながら、抗原の官能基を活性化する場合、抗原自体の活性が消失したり、抗原が複数の官能基をあわせもっていると抗原−抗原分子間での結合又は重合反応が起きたりという問題が指摘されている。また、２価の反応基を持つ架橋剤としてはグルタルアルデヒドが繁用されている。グルタルアルデヒドは中性水溶液中では簡単な操作により反応を行うことができるという利点を有するが、抗原あるいはキャリア蛋白質単独で重合反応を起こしやすく、結合効率が悪いという欠点を持つ。一方、キャリア蛋白質の官能基を活性化して抗原と結合させる方法には、過ヨウ素酸酸化法が知られている（特開平８−１１４５９２号）。この方法は、キャリア蛋白質のジオール構造を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアルデヒドを利用して、抗原のアミノ基と結合させるものである。この方法は、キャリア蛋白質と抗原との結合効率が良く、官能基の活性化による抗原自身の活性の低下を防ぐことができる。しかしながら、分子中にジオール構造を十分に持たないポリリジンのようなキャリア蛋白質では利用することができない。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５６−７１０２３号公報
【０００８】
【特許文献２】特開平８−１１４５９２号公報
【０００９】
【特許文献３】特開昭５８−２０９９８４号公報
【００１０】
【特許文献４】特開昭６２−１１８２５６号公報
【００１１】
【特許文献５】特開昭５７−１５３６５８号公報
【００１２】
【特許文献６】特開昭５７−１６０４６５号公報
【００１３】
【特許文献７】特開平２−１０３４７０号公報
【００１４】
【特許文献８】特開平６−１３００６０号公報
【００１５】
【非特許文献１】「固定化酵素」千畑一郎編 講談社サイエンティフィク（１９８６）第９−４５頁
【００１６】
【非特許文献２】「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第２８−３３頁
【００１７】
【非特許文献３】「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第４６−５０頁
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
検体中の微量の標的抗体を検出するために、低分子抗原の活性を損なうことなく担体に結合させることができれば、医療分野における各種疾病等の迅速かつ簡便な診断に使用することが可能となる。
【００１９】
従って、本発明の目的は、低分子抗原であるペプチドを高効率で、しかもペプチドの活性を損なうことなく結合できるポリアミノ酸担体を提供することである。また、本発明の目的は、前記ポリアミノ酸担体にペプチドを結合させたペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されるペプチド結合ポリアミノ酸担体を提供することである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定のアミノ酸残基を有するポリアミノ酸及び特定の反応基を有するポリアミノ酸担体を用いることにより、ペプチドの抗原性を損なわずにポリアミノ酸担体に結合させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００２１】
具体的には、本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、ポリアミノ酸担体の側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有する、単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸、及び前記反応基の全部又は一部に、架橋構造を介して又は介さずに結合している、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造とからなる、ことを特徴とする。また、本発明は、前記ポリアミノ酸担体にペプチドを結合させたペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されたペプチド結合ポリアミノ酸担体を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２３】
（１）ポリアミノ酸担体
▲１▼アミノ酸
本発明のポリアミノ酸担体に使用するアミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の中性アミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸が挙げられる。
【００２４】
ポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸は、その側鎖に、反応基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、又は水酸基を有することが好ましい。
【００２５】
好ましくは、アミノ基を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、プロリン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンである。
【００２６】
好ましくは、カルボキシル基を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である。
【００２７】
好ましくは、スルフヒドリル基を有するアミノ酸は、システインである。
【００２８】
好ましくは、水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）は、セリン、スレオニンである。
【００２９】
より好ましくは、本発明のポリアミノ酸担体に使用するアミノ酸は、リジン、オルニチンである。最も好ましくは、リジンである。
【００３０】
また、上記アミノ酸は、グリシン以外の場合、少なくとも一つの不斉炭素原子をもち、光学的に活性であり、Ｄ形、Ｌ形に区別されるが、本発明のおいては、これらの形を区別することなく使用することができる。
【００３１】
さらに、本発明のポリアミノ酸担体に使用されるアミノ酸は、その側鎖の反応基を適当な保護基で保護されたアミノ酸誘導体であってもよい。本明細書において「アミノ酸」と言及するときは、このようなアミノ酸誘導体も含む。保護基は、アミノ酸の反応基を保護するために使用可能な化合物であれば、特に限定されないが、例えば、アミノ酸の水酸基にはｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ベンジル（Ｂｚｌ）基等、アミノ基にはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等が使用できる。
【００３２】
▲２▼ポリアミノ酸
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、典型的には、前記アミノ酸又はアミノ酸誘導体から選択される単一又は２ないし４種類のアミノ酸残基により構成される。
【００３３】
ポリアミノ酸が単一アミノ酸から構成される場合には、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は水酸基から選択される反応基を有するアミノ酸が使用される。ポリアミノ酸が２から４種類のアミノ酸から構成される場合には、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有するアミノ酸を含むランダムポリマー又は２ないし４種類のアミノ酸残基で構成される単位（リジン−アラニン等）の繰り返し構造からなるポリマーを使用することができる。２ないし４種類のアミノ酸からなるランダムポリマーとして、より好ましくは、リジンと中性アミノ酸（アラニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシン）からなるランダムポリマー、オルニチンと中性アミノ酸（ロイシン、セリン、トリプトファン、チロシン）からなるランダムポリマー、グルタミン酸と中性アミノ酸（アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン）からなるランダムポリマー又はアルギニンと中性アミノ酸（セリン、トリプトファン、チロシン、プロリン、スレオニン）からなるランダムポリマー等が使用できる。さらに、リジンとグルタミン酸からなるランダムポリマー又はリジンとグルタミン酸と中性アミノ酸（アラニン、チロシン）からなるランダムポリマー等が使用できる。
【００３４】
上記の単一又は２ないし４種類のアミノ酸により構成されたポリアミノ酸は、天然のタンパク質のアミノ酸配列には見出されにくいものである。このような人工的な配列が生体内に侵入し抗体の産生を誘起する可能性は、通常極めて低いと考えられる。よって、血清、血漿等の生体成分中には本発明のポリアミノ酸担体に対する抗体がほとんど存在しないため、ウシ血清アルブミン等の天然由来の蛋白質からなる担体と異なり、免疫測定において担体に対する非特異的反応が実質的に生じない又は大幅に軽減されることとなる。本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、前記構造を有するものであれば特に限定はされないが、側鎖の反応基と架橋構造又はアミノアルコール構造との結合の容易さから、ポリアミノ酸がリジン残基又はオルニチン残基を含んでいることが好ましい。
【００３５】
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、一般的な合成方法、例えば、前記アミノ酸のＮ−炭酸無水物を乳化重合又は不均一重合する方法（特開平９−１５１２５０号）等で製造することができる。また、市販されているポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン ＭＷ３０，０００−７０，０００又はＭＷ１５０，０００−３００，０００等（シグマ社））を使用することも可能である。
【００３６】
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸の分子量は、ポリアミノ酸を合成するための重合条件、例えば、溶媒、触媒、重合温度、反応時間等を変化させることによって、調節することができる。前記ポリアミノ酸の分子量は、好ましくは粘度平均分子量１，０００〜３００，０００、より好ましくは粘度平均分子量８，０００〜３００，０００である。
【００３７】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と架橋構造、及び／又は、架橋構造とジオール構造若しくはアミノアルコール構造がアミド結合によって結合していることが好ましい。あるいは、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造が、架橋構造を介さずに、直接、アミド結合によって結合していてもよい。
【００３８】
本願明細書において、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」には、酸化によってアルデヒド基を生成できる化学構造を有する化合物が含まれる。ここで、「ジオール構造」とは、２個の水酸基が２個の相異なる炭素原子に結合している構造をいう。また、「アミノアルコール構造」とは、同一分子内にアミノ基とアルコール性の水酸基を有する構造であり、隣り合う２個の炭素原子の一方にアミノ基を有し、他方にアルコール性の水酸基を有する構造が好ましい。本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」の酸化処理によってアルデヒド基を生成し、当該アルデヒド基部分にペプチドを結合させることが可能である。
【００３９】
本発明において使用する「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、さらに、架橋構造と、あるいはポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と直接、結合できるような基を有することが望ましい。例えば、架橋構造又は反応基（以下、「架橋構造等」という場合がある。）がアミノ基を有する場合、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はカルボキシル基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成することが好ましい。架橋構造等がカルボキシル基を有する場合には、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はアミノ基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成できることが好ましい。「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、好ましくはヒドロキシアミノ酸、最も好ましくは、セリン残基、スレオニン残基である。
【００４０】
本願明細書において、「架橋構造」とは、本発明のポリアミノ酸を構成するアミノ酸又はアミノ酸誘導体の側鎖にある反応基と、アルデヒド基を生成させるためのジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを連結するための架橋剤の構造である。
【００４１】
本発明において使用される架橋剤は、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを結合させ得る化合物である。好ましくは、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物、又は架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）である。例えば、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物で、かつ、前記反応基がアミノ基の場合、架橋構造中のカルボキシル基は前記反応基とアミド結合を形成し、そして架橋構造中のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合をする。あるいは、架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）で、かつ、前記反応基がカルボキシル基の場合、架橋構造中のもう一方のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合を形成する。好ましい架橋構造は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）又はエチレンジアミンである。
【００４２】
また、架橋構造は、１又はそれより多くの、及び同種又は異種の前記化合物を直鎖状又は分枝鎖状に結合した架橋剤からなっていてもよい。一方、本発明の目的であるように、担体に結合された場合の低分子抗原の活性が損なわなければ、上述した架橋構造はなくてもよく、ポリアミノ酸担体の反応基にジオール構造若しくはアミノアルコール構造が結合してもよい。
【００４３】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合している反応基が、好ましくは、側鎖の反応基のうち３％ないし３０％であり、より好ましくは、５％ないし２０％である。
【００４４】
上記の本発明のポリアミノ酸担体は、下記の製造方法によって調製されるが、より具体的には、後述する実施例１及び２に従って調製することができる。
【００４５】
（２）ポリアミノ酸担体の製造方法
本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、使用するアミノ酸の反応基、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造を有する化合物、及び架橋剤の種類に応じて当業者が適当な方法で用いることができる。本発明のポリアミノ酸担体の製造方法の好ましい態様を以下に示すが、本発明のポリアミノ酸担体の特徴を有する限り、その製造方法は限定されない。
【００４６】
本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、例えば、側鎖中の反応基としてアミノ基を有するポリアミノ酸、アミノアルコール構造を有するヒドロキシアミノ酸、及び各末端にカルボキシル基／アミノ基をもつ２価の架橋剤を出発原料として用いる場合には、下記の工程：
（ｉ）ヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を保護すること；
（ｉｉ）保護されたヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基を活性化すること；
（ｉｉｉ）架橋剤のアミノ基と活性化したヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させること；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の化合物中の架橋剤構造由来のカルボキシル基を活性化すること；
（ｖ）ポリアミノ酸のアミノ基と（ｉｖ）の化合物中の架橋剤由来のカルボキシル基と反応させ、アミド結合を形成させること；そして
（ｖｉ）（ｉ）で保護されたヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を脱保護すること；
を含む。
【００４７】
（ｉ）−（ｉｉｉ）の工程と、（ｉｖ）−（ｖ）の工程は、順序を逆にして、（ｉｖ）−（ｖ）の工程を先に行ってもよい。
【００４８】
ここで、（ｉ）の工程のヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基の保護は、一般的な方法、例えば、生化学実験講座第１巻、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、ｐ．２７０、成田耕造ら、東京化学同人（１９７７年）に従って行うことができるが、市販品を用いてもよい。ヒドロキシアミノ酸のアミノ基を保護するための試薬としては、Ｂｏｃ基、Ｚ基、Ｆｍｏｃ基等を使用することができる。また、ヒドロキシアミノ酸残基の水酸基を保護するための試薬としては、ｔ−Ｂｕ基、Ｂｚｌ基等を使用することができる。一方、保護されたヒドロキシアミノ酸残基の脱保護には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、無水フッ化水素、ＨＢｒ／酢酸、ピペリジン／ＤＭＦ、水酸化ナトリウム水溶液等の酸又はアルカリ溶液を使用することができる。
【００４９】
工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）のカルボキシル基の活性化には、例えば、スクシンイミドエステル基、ｐ−ニトロフェニル基を使用することができる。
【００５０】
工程（ｉｉｉ）及び（ｖ）のアミド結合を形成させる反応は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＤＭＦ、ジオキサン、ＤＭＳＯ等の溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、トリエチルアミン等の弱アルカリの存在下で、通常、室温で１−２４時間反応させる。
【００５１】
他の側面として、本発明の製造方法によって、架橋構造を有しないポリアミノ酸担体を製造するためには、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を省略することによって達成し得る。
【００５２】
さらに他の側面として、本発明の製造方法によって、架橋構造を１より多く導入する場合には、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返すことによって達成し得る。
【００５３】
また、本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、例えば、側鎖中の反応基としてカルボキシル基を有するポリアミノ酸、アミノアルコール構造を有するヒドロキシアミノ酸残基、及び両末端にアミノ基をもつ架橋剤を用いる場合には、下記の工程：
（ｉ）ヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を保護すること；
（ｉｉ）ヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基を活性化すること；
（ｉｉｉ）架橋剤のアミノ基と活性化したヒドロキシアミノ酸中のカルボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させること；
（ｉｖ）縮合剤を用いてポリアミノ酸中のカルボキシル基と（ｉｉｉ）の化合物中の架橋剤構造由来のアミノ基とを反応させ、アミド結合を形成させること；そして
（ｖ）（ｉ）で保護されたヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を脱保護すること；
を含む。
【００５４】
ここで、前記工程（ｉｖ）で使用される縮合剤は、アミド結合を形成可能な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＷＳＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等を使用することができる。
【００５５】
他の好ましい態様として、本発明のポリアミノ酸担体の製造方法によれば、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合している反応基の導入パーセントが異なるポリアミノ酸担体を製造することができるが、これは、上記の工程（ｉｉｉ）において生成した化合物の使用量を加減することによって達成される。
【００５６】
上記ポリアミノ酸担体の製造は、公知の方法（例えば、Ｍｅｚｏら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，６３，８１−９５（２０００））に基づいて行うことができる。
【００５７】
（３）ペプチドを結合したポリアミノ酸担体とその製造方法
本発明は、上述したポリアミノ酸担体にペプチドを結合させることを含むペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されるペプチド結合ポリアミノ酸担体に関する。本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有することを特徴とする。先ず、これらの構造を酸化処理してアルデヒド基を生成し、次いで、当該アルデヒド基部分にペプチドを結合させることが可能である。
【００５８】
▲１▼製造方法
限定されるわけではないが、本発明のペプチド結合担体の製造方法は、例えば、下記の工程：
（ｉ）ポリアミノ酸担体のジオール構造若しくはアミノアルコール構造を酸化処理によってアルデヒド基を生成すること；
（ｉｉ）一方、所期のペプチドのＮ末端にあらかじめヒドラジノ基を導入すること；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリアミノ酸担体と（ｉｉ）のペプチドとを結合させること
を含む。
【００５９】
本発明のペプチド結合担体の製造方法に従えば、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造からアルデヒド基を生成させるための酸化処理は特に限定されないが、例えば、過ヨウ素酸酸化法を用いることができる。
【００６０】
また、本発明のポリアミノ酸担体に結合されるペプチドには、検体中の標的抗体に対する抗原を用いることができる。このような抗原の大きさは、特に限定されないが、標的抗体に対する抗原のエピトープを少なくとも１つ含むペプチドであることが好ましい。本願明細書において、「ペプチド」というときは、２個以上のアミノ酸残基がアミド結合によって結合したものをいう。本発明によれば、使用されるペプチドは、アミノ酸残基が３個以上あればよく、好ましくは３−５０個、より好ましくは１０−２０個である。
【００６１】
なお、本発明に使用されるペプチドは特に限定されず、天然産のペプチド、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたペプチド、化学合成したペプチド、あるいは蛋白質の酵素処理によって生成したペプチドの何れでもよい。例えば、本願明細書中の実施例３では、ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６由来のアミノ酸配列を有する、１２ｍｅｒ及び１８ｍｅｒのアミノ酸残基からなるＨＩＶ−２ ｇｐ３６合成ペプチドを使用した。
【００６２】
さらに、本発明は、ポリアミノ酸担体に生成されたアルデヒド基と、前記ペプチド中のアミノ基を結合させることを特徴とする。この結合には、該ポリアミノ酸担体へペプチドの結合効率、ペプチドの活性を損なわないこと、及びペプチドへの抗体の反応性等を考慮して、ペプチド中の側鎖ではなくＮ末端のアミノ基を使用することが好ましい。または、アミノ基を有するアミノ酸をペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に結合し、該アミノ酸を使用することが好ましい。
【００６３】
より好ましくは、ポリアミノ酸担体のアルデヒド基とペプチドのアミノ基の選択的結合性を高めるため、ぺプチドの末端にあらかじめヒドラジノ基を導入したペプチドを調製し、使用する。最も好ましくは、後述する実施例２に示すように、ヒドラジノ基の導入のために使用される試薬として、ε−アミノ基にヒドラジノ基を有するヒドラジノベンゾイルリジンを用いる。
【００６４】
▲２▼ペプチド結合ポリアミノ酸担体
本発明のペプチド結合ポリアミノ酸担体は、固相に結合させることにより抗体又は抗原を測定するための免疫測定試薬として用いることができる。前記固相としては、ポリスチレン、ポリエチレン、セファロース等の材質からなるプレート、ビーズ、メンブレンなどが使用できる。これらの固相は、緩衝液中に溶解したペプチド結合ポリアミノ酸担体と接触させることにより、その表面にポリアミノ酸担体を物理吸着できる固相である。緩衝液としては、ペプチド結合ポリアミノ酸担体が安定に存在でき、固相への吸着が阻害されないｐＨが中性からアルカリ性の条件であれば、一般的な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水が使用できる。このように本発明のペプチド結合ポリアミノ酸担体は、穏和な条件で固相に結合させることができるので、ペプチドの抗原性を損なうことなく簡便に免疫測定に供することができる。
【００６５】
このようなペプチド結合ポリアミノ酸担体が吸着した固相からなる免疫測定試薬は、サンドイッチ法、競合法等の公知の免疫測定法に使用することができる。例えば、ヒトについての抗ＨＩＶ−１抗体を測定する場合には、ＨＩＶ−１由来のペプチド断片または合成ペプチドを結合したポリアミノ酸担体を固相に吸着させた免疫測定試薬に、検体又は希釈した検体を接触させ、第１の免疫複合体を形成させた後、固相を洗浄し、続いて、標識抗ヒトＩｇＧ抗体をこの免疫複合体と接触させ、生じた第２の免疫複合体を検出することによって、検体中の抗ＨＩＶ−１抗体を検出することができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６７】
実施例１．セリン化ポリリジン（ＳｐＫ１）の合成
（ａ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸（１）の合成
アミノアルコール構造を有するセリンと架橋剤としてγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を用いて、標記の架橋構造を有するセリンを合成した（スキーム１）。市販されているセリンのアミノ基及び水酸基があらかじめ保護されているセリンを使用した。
【００６８】
Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン２．６１ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２７ｇをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（以下、ＤＭＦという。）に溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２．１１ｇを加え、室温で終夜攪拌した。
【００６９】
反応液に酢酸エチルと水を加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて、５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。
【００７０】
酢酸エチルを溜去し、残渣をＤＭＦに溶解し、ＧＡＢＡ１．０３ｇと炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを水に溶解して加え、終夜攪拌した。
【００７１】
反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸でｐＨを約３として分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。
【００７２】
酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量２．７７ｇ（８０％）
（ｂ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸 Ｎ−コハク酸イミドエステル（２）
上記で調製した化合物（１）のカルボキシル基をスクシンイミドエステルで活性化した（スキーム１）。
【００７３】
化合物（１）１．０４ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．３８ｇをＤＭＦに溶解し、氷冷下１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．６３ｇを加え、室温で終夜攪拌した。
反応液に水と酢酸エチルを加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。
【００７４】
酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量１．２１ｇ（９１％）
スキーム１
【００７５】
【化１】
【００７６】
（ｃ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸｝（３）上記で製造した化合物（２）とポリリジンとをペプチド結合させて、標記化合物（３）を得た（スキーム２）。
【００７７】
ポリリジン（シグマ社製Ｎｏ．Ｐ２６３６、ＭＷ（粘度）３０，３００）２０ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、化合物（２）８．９ｍｇをＤＭＦ２００μｌに溶解して加え、室温で３時間攪拌した。反応液に酢酸１００μｌを加えて透析チューブに移し、水に対して室温３時間透析した後、凍結乾燥した。収量２２．０ｍｇ
スキーム２
【００７８】
【化２】
【００７９】
（ｄ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（４）
上記で製造した化合物（３）におけるポリリジンの未反応のアミノ基に無水コハク酸を反応させ、修飾した（スキーム３）。
【００８０】
上記の化合物（３）１０ｍｇを１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、無水コハク酸２５ｍｇをＤＭＦ２５０μｌに溶解して加え、室温で２時間攪拌した。反応液を透析チューブに移し、水に対し４℃で一夜透析した後、凍結乾燥した。収量１３．７ｍｇ
（ｅ）ポリリジン｛セリン−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（５）
上記で製造した化合物（４）を脱保護し、標記化合物（５）を得た（スキーム３）。
【００８１】
化合物（４）の全量を水２５μｌとトリフルオロ酢酸５００μｌに溶解して、室温で１時間攪拌した。反応液に水を加えて凍結乾燥した。１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、水に対して室温で３時間透析した後、凍結乾燥した。収量１０．７ｍｇ
スキーム３
【００８２】
【化３】
【００８３】
加水分解後のアミノ酸分析により、ポリリジンの反応基の中で、アミノアルコール構造が結合している反応基の割合を調べた。化合物（２）とポリリジンの反応基をモル比１：５で混合した場合には、ポリリジンの反応基４．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応していた。
【００８４】
（ｆ）さらに、アミノアルコール構造と結合している反応基の割合が異なるポリリジン担体を調製するため、上記の化合物（２）とポリリジンの混合比を変化させて、同様の方法でセリン化ポリリジンを調製した。上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：１０で混合した場合には、ポリリジンの反応基９．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。また、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：２０で混合した場合には、ポリリジンの反応基１９．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。
【００８５】
実施例２．セリン化ポリリジン（ＳｐＫ２）の合成２
分子量の異なるポリリジンを用いて、上記実施例１と同様の方法でセリン化ポリリジン（ＳｐＫ２）を調製した。ポリリジンは、シグマ社製Ｎｏ．Ｐ１３９９、ＭＷ（粘度）１８９，４００を５０ ｍｇ用いた。アミノアルコール構造と結合している反応基の割合が異なるポリリジン担体を調製するため、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：１０で混合した場合には、ポリリジンの反応基９．９に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。また、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：２０で混合した場合には、ポリリジンの反応基２０．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。
【００８６】
実施例３．ヒドラジノペプチドの合成
（１）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸の合成
４−ヒドラジノ安息香酸１５．２ｇをアルゴン気流下、水５０ｍｌに縣濁し、水酸化ナトリウム４．８ｇを加えて溶解した。二炭酸ジ−ｔ−ブチル２６．２ｇを１，４−ジオキサン５０ｍｌに溶解して加えて、一夜攪拌した。減圧下に溶媒を約半分溜去し、水を加えて酢酸エチルで２回洗った。水相に酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸で中和し、分液した。もう一度酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸でｐＨを３に調整し、分液した。酢酸エチル相を合わせて、水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去すると結晶が析出した。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗った。収量１６．９ｇ（６７％）
母液を濃縮すると結晶が析出した。濾取し酢酸エチルで洗浄した。収量４．８ｇ。合わせて２１．７ｇ（８６％）。
【００８７】
（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステルの合成
４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸５．０５ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．５３ｇをジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）に溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４．２２ｇを加え終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。結晶が析出した。濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。母液を濃縮し、析出した結晶を濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。初めに析出した結晶と合わせて６．１５ｇ（８８％）の表題化合物を得た。
【００８８】
（３）Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンの合成
Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン３．０ｇと炭酸水素ナトリウム０．６５ｇを水とＤＭＦに縣濁し、氷冷下、４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステル２．７ｇをＤＭＦに溶解して加えた。室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸で酸性にし、分液した。水相を酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去し、得られた油状の残渣を、減圧下に乾燥すると固化した。収量３．５０ｇ（７５％）。
【００８９】
（４）ヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドの合成
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６より誘導される抗体を検出するための抗原ペプチドとして、ＨＩＶ−２ｇｐ３６のアミノ酸配列から１１残基及び１７残基を選択し、ペプチドの合成をおこなった。公知のＦｍｏｃ法に従い、ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を用いて、１１残基及び１７残基のアミノ酸を結合させ、最後にＮα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンを加えることにより、Ｎ末端のリジンにヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドを作成した。
【００９０】
ヒドラジノペプチドの構造
１２残基の配列
Ｌｙｓ（ＨＢｚ）−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ（配列番号１）
ＨＢｚ ＝ヒドラジノベンゾイル
１８残基の配列
Ｌｙｓ（ＨＢｚ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ（配列番号２）
実施例４．セリン化ポリリジンとヒドラジノペプチドとの複合体の作製
上記実施例２で製造した、ポリリジンの反応基２０．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した化合物（５）を過ヨウ素酸酸化し、上記実施例３で製造したヒドラジノペプチドを結合したペプチド結合ポリリジン担体を調製した（スキーム４）。
【００９１】
化合物（５）２ｍｇを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４０μｌを加えて、室温で２０分間攪拌した。反応液を１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけて、同溶液で溶出した。最初の溶出液２．５ｍｌは採取せず、続く２．０ｍｌを回収した。この溶液にヒドラジノペプチドを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解して（１ｍｇ／ｍｌ）加え、室温で３時間攪拌した。４００ｍＭヒドロキシアミン塩酸塩／１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加えて溶液のｐＨを約５として透析チューブに移し、水に対して４℃、一夜透析した後、凍結乾燥した。
【００９２】
加水分解後のアミノ酸分析によりペプチドの導入率を調べたところ、ポリリジンの反応基２０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約１の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基４５．５に対してペプチドが１の割合で反応した。また、ポリリジンの反応基４０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約０．５の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基６２．５に対してペプチドが１の割合で反応した。
【００９３】
スキーム４
【００９４】
【化４】
【００９５】
参考例１．卵白アルブミンとヒドラジノペプチドとの複合体の作製
以下の実施例６において、本発明のペプチド結合ポリリジン担体による免疫反応と比較検討するために、上記実施例３で製造したヒドラジノペプチドを天然由来の蛋白質である卵白アルブミンに結合させた。
【００９６】
卵白アルブミン４ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加え、室温で２０分間攪拌した。反応液を１ｍＭ酢酸水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけて、同溶液で溶出した。最初の溶出液２．５ｍｌを採取せず、続く２．０ｍｌを回収した。
【００９７】
この溶液２０００μｌに２００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液２０μｌを加えた後、１７残基の抗原ペプチドからなるヒドラジノペプチド０．６４ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解（３ｍｇ／ｍｌ）して加え、室温で３時間攪拌した。反応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対して、４℃で一夜透析し、２ｍｌの溶液が得られた。ＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製）によるタンパク定量値は０．７１２ｍｇ／ｍｌであった。
【００９８】
実施例５．ペプチド結合ポリリジン担体によるＨＩＶ−２抗体の検出（１）
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６により誘導される抗体を検出するために、実施例１及び２で製造したペプチド結合ポリリジン担体を用いて簡易クロマトアッセイを行った。
【００９９】
（１）材料
ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１２ｍｅｒ結合ポリリジン
ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１８ｍｅｒ結合ポリリジン
アルカリホスファターゼ標識ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１８ｍｅｒ
リン酸緩衝液：１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＳＤＳ，３％ ｓｕｃｒｏｓｅ）
基質液：５−Ｂｒｏｍｅ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＲＯＣＨＥ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陽性血清（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陰性血清（Ｔｒｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
（２）実験方法及び結果
所定濃度に希釈した合成ペプチド結合ポリリジンを５×５０ｍｍに切断されたニトロセルロース膜ストリップ上に約０．７５μｌ点着した。この試験ストリップを特許第３２３７５４０号に記載のイムノクロマト試験用具にセットした。検体として、ＨＩＶ−２抗体陽性血清（ＰＲＦ２０２−０１、ＰＲＦ２０２−０５、ＰＲＦ２０２−０１５）をＨＩＶ−２抗体陰性血清で希釈して用いた。特開平９−２２９９３８号に記載の方法に準じて免疫反応を行い、反応の有無を確認した。その結果を表１に示す。
【０１００】
本発明の合成ペプチド結合ポリリジンをニトロセルロース膜上に固相化した場合、ＨＩＶ−２抗体陽性血清はいずれも顕著な反応を示した。対照としてペプチドのみを固相化した場合は、反応は認められなかった。陰性対照のＨＩＶ−２抗体陰性血清での反応は検出されなかった。本発明の合成ペプチド結合ポリリジンは、担体の分子量、ペプチドの結合数及びペプチド長に関らず、ペプチドの抗原性が損なわれることなく免疫測定の固相抗原として有用であることが明らかとなった。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
実施例６．ペプチド結合ポリリジン担体によるＨＩＶ−２抗体の検出（２）
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６により誘導される抗体を検出するために、上述した実施例１及び２によって製造したペプチド結合ポリリジン担体を用いて、イムノブロッティングアッセイを行った。本発明のペプチド結合ポリリジン担体の効果を検討するために調製したペプチド結合卵白アルブミンと比較した。
【０１０３】
（１）材料
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６合成ペプチド １８ｍｅｒ
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ペプチド１８ｍｅｒ結合オボアルブミン（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈａｍｅｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ペプチド１８ｍｅｒ結合セリン化ポリリジン
炭酸緩衝液： ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、約ｐＨ９．０
リン酸緩衝液： ０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むもの
ＨＲＰＯウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ，デンマーク）
ＨＲＰＯウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ，デンマーク）
基質液： １−クロロ４−ナフトール、０．０１％過酸化水素水（自社製）
検体：
抗ＨＩＶ−２ ｇｐ３６モノクローナル抗体（富士レビオ社製）
ＨＩＶ−２抗体陽性血清（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陰性検体（Ｔｒｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
（２）実験方法及び結果
炭酸緩衝液で所定濃度に希釈した合成ペプチド、合成ペプチド結合ＯＶＡ、あるいは合成ペプチド結合セリン化ポリリジンを、５×５０ｍｍに切断されたニトロセルロース膜ストリップ上に約２μｌ点着した。この試験ストリップをインキュベーターを用いて３７℃で約１５分間乾燥させた。試験ストリップを試験管に入れ、検体として、ＰＢＳ−Ｔを用いて所定濃度に希釈したＨＩＶ−２モノクローナル抗体（陽性対照）、ＨＩＶ−２抗体陽性血清またはＨＩＶ−２抗体陰性血清（陰性対照）を加えた。３７℃で約３０分間緩やかに撹拌しながらインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０１０４】
次いで、ＰＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰＯウサギ抗マウスＩｇＧあるいはＨＲＰＯウサギ抗ヒトＩｇＧ液に試験ストリップを浸した。室温で３０分間緩やかに撹拌しながらインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０１０５】
その後、基質液を適量加えた。目視にて反応の有無を確認した。その結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
合成ペプチドを固相化した場合、ＨＩＶ−２モノクローナル抗体（陽性対照）、ＨＩＶ−２抗体陽性血清又はＨＩＶ−２抗体陰性血清（陰性対照）のいずれの検体の場合も、検体中のＨＩＶ−２抗体は検出されなかった。合成ペプチド結合ＯＶＡを固相化した場合は、ＨＩＶ２陽性血清で顕著に検出されるが、陰性対照であるＨＩＶ２陰性血清を使用している場合にも検出された。
【０１０８】
これに対し、本発明の合成ペプチド結合ＳｐＫ（セリン化ポリリジン）を固相化した場合、ＨＩＶ２陽性ヒト血清及び陽性対照のＨＩＶ−２モノクローナル抗体は顕著な反応性が観察されたのに対し、陰性対照のＨＩＶ２陰性血清は反応性が全く観察されなかった。
【０１０９】
また、合成ペプチド結合ＯＶＡではなくＯＶＡを固相した場合も、陰性対照であるＨＩＶ２陰性血清に対して反応性がみられた。この結果は、ＯＶＡを担体として用いた場合には、血清に対して非特異的な反応があることを示す。一方、合成ペプチド結合ＳｐＫを担体として用いた場合には、ＯＶＡで見られる非特異的な結合（陰性対照のＨＩＶ２陰性血清に対する反応性）が見られないことを示している。
【０１１０】
【配列表】
【０１１１】
【発明の効果】
本発明により、ポリアミノ酸担体が提供され、該担体を用いたペプチド結合ポリアミノ酸担体の使用による検体中のペプチドに対する抗体の検出を非特異的な反応を抑制し、迅速かつ簡便に行うことが可能となった。したがって、該ポリアミノ酸担体は、医療分野において、各種疾患の診断等に有用であることが明らかになった。
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応を利用した標的抗体を検出する分野において、水不溶性担体に低分子抗原を固相化させるために使用するポリアミノ酸担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野において、生体成分から特定の物質を検出もしくは定量する方法として抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く利用されている。抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、特異性が高くかつ検出感度も高いため、臨床検査の重要な手段の一つとなっている。この免疫測定法には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）などが知られている。
【０００３】
これらの測定法を実施するにあたり、被測定物質に対する抗体又は抗原をマイクロタイタープレート、メンブレンフィルター、ビーズなどの水不溶性の固相に結合して使用するが、高感度で安定性の高い診断薬を製造するには抗体又は抗原を上記の水不溶性固相に効率的かつ安定性よく結合させることは非常に重要な技術である。水不溶性の固相としては、例えば、マイクロタイター法に用いられる担体として、ポリスチレン又はその共重合体の粒子である人工担体が開発されている（特開昭５８−２０９９８４号、特開昭６２−１１８２５６号）。合成高分子による人工担体は、化学的、物理的に均質かつ安定であり、大量生産も可能であるという利点を有する。さらに、ゼラチンと水溶性多糖類とからなる水不溶性の人工担体（特開昭５７−１５３６５８号、特開昭５７−１６０４６５号）、及びポリアミノ酸と水溶性多糖類とからなる水不溶性の人工担体（特開平２−１０３４７０号、特開平６−１３００６０号）等が開示されている。しかし、製造工程が多段階にわたり複雑であるため、低分子抗原を結合させた各種担体を製造することは困難である。
【０００４】
上記のような水不溶性の固相（担体）に抗原又は抗体を結合させる方法には、主に物理吸着、共有結合等による方法が知られている（「固定化酵素」千畑一郎編 講談社サイエンティフィク（１９８６）第９−４５頁参照）。共有結合による方法に比べ、物理吸着法は簡便であり、かつ、吸着させる抗原又は抗体の活性を損なうことがないという利点を有する。しかしながら、抗原が低分子である場合、水不溶性固相との相互作用が弱いため、抗原を物理吸着させることは困難であった。
【０００５】
従来、上記の問題点を解決するため、低分子抗原をキャリア蛋白質（高分子担体）に、架橋剤又はカップリング剤を使用して共有結合させる方法が知られている（特開昭５６−７１０２３号）。この方法に用いるキャリア蛋白質としては、例えば、ウシの血清アルブミン、ヒトの血清アルブミン、卵のアルブミン、ポリリジン等を用いることができる。しかしながら、ウシの血清アルブミン、ヒトの血清アルブミン、卵のアルブミン等の天然由来の蛋白質を担体として用いた場合、生体成分中の免疫グロブリンの一部がキャリア蛋白質に対して反応性を示す場合があり、このような非特異的反応を低下させる必要があった。
【０００６】
上記のキャリア蛋白質に、低分子の抗原を共有結合させる方法としては、従来から行われているハプテン抗原の作製法（「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第２８−３３頁）、ハプテンの酵素標識法（「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第４６−５０頁）を適用することができ、例えば抗原に存在する官能基を活性化する方法、キャリア蛋白質に存在する官能基を活性化する方法、抗原及びキャリア蛋白質の双方に反応性を有する２価架橋剤を用いる方法等が知られている。しかしながら、抗原の官能基を活性化する場合、抗原自体の活性が消失したり、抗原が複数の官能基をあわせもっていると抗原−抗原分子間での結合又は重合反応が起きたりという問題が指摘されている。また、２価の反応基を持つ架橋剤としてはグルタルアルデヒドが繁用されている。グルタルアルデヒドは中性水溶液中では簡単な操作により反応を行うことができるという利点を有するが、抗原あるいはキャリア蛋白質単独で重合反応を起こしやすく、結合効率が悪いという欠点を持つ。一方、キャリア蛋白質の官能基を活性化して抗原と結合させる方法には、過ヨウ素酸酸化法が知られている（特開平８−１１４５９２号）。この方法は、キャリア蛋白質のジオール構造を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアルデヒドを利用して、抗原のアミノ基と結合させるものである。この方法は、キャリア蛋白質と抗原との結合効率が良く、官能基の活性化による抗原自身の活性の低下を防ぐことができる。しかしながら、分子中にジオール構造を十分に持たないポリリジンのようなキャリア蛋白質では利用することができない。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５６−７１０２３号公報
【０００８】
【特許文献２】特開平８−１１４５９２号公報
【０００９】
【特許文献３】特開昭５８−２０９９８４号公報
【００１０】
【特許文献４】特開昭６２−１１８２５６号公報
【００１１】
【特許文献５】特開昭５７−１５３６５８号公報
【００１２】
【特許文献６】特開昭５７−１６０４６５号公報
【００１３】
【特許文献７】特開平２−１０３４７０号公報
【００１４】
【特許文献８】特開平６−１３００６０号公報
【００１５】
【非特許文献１】「固定化酵素」千畑一郎編 講談社サイエンティフィク（１９８６）第９−４５頁
【００１６】
【非特許文献２】「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第２８−３３頁
【００１７】
【非特許文献３】「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素 別冊３１（１９８７）第４６−５０頁
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
検体中の微量の標的抗体を検出するために、低分子抗原の活性を損なうことなく担体に結合させることができれば、医療分野における各種疾病等の迅速かつ簡便な診断に使用することが可能となる。
【００１９】
従って、本発明の目的は、低分子抗原であるペプチドを高効率で、しかもペプチドの活性を損なうことなく結合できるポリアミノ酸担体を提供することである。また、本発明の目的は、前記ポリアミノ酸担体にペプチドを結合させたペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されるペプチド結合ポリアミノ酸担体を提供することである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定のアミノ酸残基を有するポリアミノ酸及び特定の反応基を有するポリアミノ酸担体を用いることにより、ペプチドの抗原性を損なわずにポリアミノ酸担体に結合させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００２１】
具体的には、本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、ポリアミノ酸担体の側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有する、単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸、及び前記反応基の全部又は一部に、架橋構造を介して又は介さずに結合している、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造とからなる、ことを特徴とする。また、本発明は、前記ポリアミノ酸担体にペプチドを結合させたペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されたペプチド結合ポリアミノ酸担体を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２３】
（１）ポリアミノ酸担体
▲１▼アミノ酸
本発明のポリアミノ酸担体に使用するアミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の中性アミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸が挙げられる。
【００２４】
ポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸は、その側鎖に、反応基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、又は水酸基を有することが好ましい。
【００２５】
好ましくは、アミノ基を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、プロリン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンである。
【００２６】
好ましくは、カルボキシル基を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である。
【００２７】
好ましくは、スルフヒドリル基を有するアミノ酸は、システインである。
【００２８】
好ましくは、水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）は、セリン、スレオニンである。
【００２９】
より好ましくは、本発明のポリアミノ酸担体に使用するアミノ酸は、リジン、オルニチンである。最も好ましくは、リジンである。
【００３０】
また、上記アミノ酸は、グリシン以外の場合、少なくとも一つの不斉炭素原子をもち、光学的に活性であり、Ｄ形、Ｌ形に区別されるが、本発明のおいては、これらの形を区別することなく使用することができる。
【００３１】
さらに、本発明のポリアミノ酸担体に使用されるアミノ酸は、その側鎖の反応基を適当な保護基で保護されたアミノ酸誘導体であってもよい。本明細書において「アミノ酸」と言及するときは、このようなアミノ酸誘導体も含む。保護基は、アミノ酸の反応基を保護するために使用可能な化合物であれば、特に限定されないが、例えば、アミノ酸の水酸基にはｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ベンジル（Ｂｚｌ）基等、アミノ基にはｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等が使用できる。
【００３２】
▲２▼ポリアミノ酸
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、典型的には、前記アミノ酸又はアミノ酸誘導体から選択される単一又は２ないし４種類のアミノ酸残基により構成される。
【００３３】
ポリアミノ酸が単一アミノ酸から構成される場合には、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は水酸基から選択される反応基を有するアミノ酸が使用される。ポリアミノ酸が２から４種類のアミノ酸から構成される場合には、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有するアミノ酸を含むランダムポリマー又は２ないし４種類のアミノ酸残基で構成される単位（リジン−アラニン等）の繰り返し構造からなるポリマーを使用することができる。２ないし４種類のアミノ酸からなるランダムポリマーとして、より好ましくは、リジンと中性アミノ酸（アラニン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、チロシン）からなるランダムポリマー、オルニチンと中性アミノ酸（ロイシン、セリン、トリプトファン、チロシン）からなるランダムポリマー、グルタミン酸と中性アミノ酸（アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン）からなるランダムポリマー又はアルギニンと中性アミノ酸（セリン、トリプトファン、チロシン、プロリン、スレオニン）からなるランダムポリマー等が使用できる。さらに、リジンとグルタミン酸からなるランダムポリマー又はリジンとグルタミン酸と中性アミノ酸（アラニン、チロシン）からなるランダムポリマー等が使用できる。
【００３４】
上記の単一又は２ないし４種類のアミノ酸により構成されたポリアミノ酸は、天然のタンパク質のアミノ酸配列には見出されにくいものである。このような人工的な配列が生体内に侵入し抗体の産生を誘起する可能性は、通常極めて低いと考えられる。よって、血清、血漿等の生体成分中には本発明のポリアミノ酸担体に対する抗体がほとんど存在しないため、ウシ血清アルブミン等の天然由来の蛋白質からなる担体と異なり、免疫測定において担体に対する非特異的反応が実質的に生じない又は大幅に軽減されることとなる。本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、前記構造を有するものであれば特に限定はされないが、側鎖の反応基と架橋構造又はアミノアルコール構造との結合の容易さから、ポリアミノ酸がリジン残基又はオルニチン残基を含んでいることが好ましい。
【００３５】
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸は、一般的な合成方法、例えば、前記アミノ酸のＮ−炭酸無水物を乳化重合又は不均一重合する方法（特開平９−１５１２５０号）等で製造することができる。また、市販されているポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン ＭＷ３０，０００−７０，０００又はＭＷ１５０，０００−３００，０００等（シグマ社））を使用することも可能である。
【００３６】
本発明のポリアミノ酸担体に使用するポリアミノ酸の分子量は、ポリアミノ酸を合成するための重合条件、例えば、溶媒、触媒、重合温度、反応時間等を変化させることによって、調節することができる。前記ポリアミノ酸の分子量は、好ましくは粘度平均分子量１，０００〜３００，０００、より好ましくは粘度平均分子量８，０００〜３００，０００である。
【００３７】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と架橋構造、及び／又は、架橋構造とジオール構造若しくはアミノアルコール構造がアミド結合によって結合していることが好ましい。あるいは、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造が、架橋構造を介さずに、直接、アミド結合によって結合していてもよい。
【００３８】
本願明細書において、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」には、酸化によってアルデヒド基を生成できる化学構造を有する化合物が含まれる。ここで、「ジオール構造」とは、２個の水酸基が２個の相異なる炭素原子に結合している構造をいう。また、「アミノアルコール構造」とは、同一分子内にアミノ基とアルコール性の水酸基を有する構造であり、隣り合う２個の炭素原子の一方にアミノ基を有し、他方にアルコール性の水酸基を有する構造が好ましい。本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」の酸化処理によってアルデヒド基を生成し、当該アルデヒド基部分にペプチドを結合させることが可能である。
【００３９】
本発明において使用する「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、さらに、架橋構造と、あるいはポリアミノ酸担体を構成するアミノ酸の側鎖にある反応基と直接、結合できるような基を有することが望ましい。例えば、架橋構造又は反応基（以下、「架橋構造等」という場合がある。）がアミノ基を有する場合、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はカルボキシル基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成することが好ましい。架橋構造等がカルボキシル基を有する場合には、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物はアミノ基を有し、架橋構造等とアミド結合を形成できることが好ましい。「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有する化合物は、好ましくはヒドロキシアミノ酸、最も好ましくは、セリン残基、スレオニン残基である。
【００４０】
本願明細書において、「架橋構造」とは、本発明のポリアミノ酸を構成するアミノ酸又はアミノ酸誘導体の側鎖にある反応基と、アルデヒド基を生成させるためのジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを連結するための架橋剤の構造である。
【００４１】
本発明において使用される架橋剤は、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造とを結合させ得る化合物である。好ましくは、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物、又は架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）である。例えば、架橋構造の一方の末端がカルボキシル基及び他の末端がアミノ基からなる化合物で、かつ、前記反応基がアミノ基の場合、架橋構造中のカルボキシル基は前記反応基とアミド結合を形成し、そして架橋構造中のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合をする。あるいは、架橋構造の両端がアミノ基である化合物（ジアミノ化合物）で、かつ、前記反応基がカルボキシル基の場合、架橋構造中のもう一方のアミノ基は、好ましくはカルボキシル基を有するジオール構造若しくはアミノアルコール構造とアミド結合を形成する。好ましい架橋構造は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）又はエチレンジアミンである。
【００４２】
また、架橋構造は、１又はそれより多くの、及び同種又は異種の前記化合物を直鎖状又は分枝鎖状に結合した架橋剤からなっていてもよい。一方、本発明の目的であるように、担体に結合された場合の低分子抗原の活性が損なわなければ、上述した架橋構造はなくてもよく、ポリアミノ酸担体の反応基にジオール構造若しくはアミノアルコール構造が結合してもよい。
【００４３】
また、本発明のポリアミノ酸担体は、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合している反応基が、好ましくは、側鎖の反応基のうち３％ないし３０％であり、より好ましくは、５％ないし２０％である。
【００４４】
上記の本発明のポリアミノ酸担体は、下記の製造方法によって調製されるが、より具体的には、後述する実施例１及び２に従って調製することができる。
【００４５】
（２）ポリアミノ酸担体の製造方法
本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、使用するアミノ酸の反応基、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造を有する化合物、及び架橋剤の種類に応じて当業者が適当な方法で用いることができる。本発明のポリアミノ酸担体の製造方法の好ましい態様を以下に示すが、本発明のポリアミノ酸担体の特徴を有する限り、その製造方法は限定されない。
【００４６】
本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、例えば、側鎖中の反応基としてアミノ基を有するポリアミノ酸、アミノアルコール構造を有するヒドロキシアミノ酸、及び各末端にカルボキシル基／アミノ基をもつ２価の架橋剤を出発原料として用いる場合には、下記の工程：
（ｉ）ヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を保護すること；
（ｉｉ）保護されたヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基を活性化すること；
（ｉｉｉ）架橋剤のアミノ基と活性化したヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させること；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の化合物中の架橋剤構造由来のカルボキシル基を活性化すること；
（ｖ）ポリアミノ酸のアミノ基と（ｉｖ）の化合物中の架橋剤由来のカルボキシル基と反応させ、アミド結合を形成させること；そして
（ｖｉ）（ｉ）で保護されたヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を脱保護すること；
を含む。
【００４７】
（ｉ）−（ｉｉｉ）の工程と、（ｉｖ）−（ｖ）の工程は、順序を逆にして、（ｉｖ）−（ｖ）の工程を先に行ってもよい。
【００４８】
ここで、（ｉ）の工程のヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基の保護は、一般的な方法、例えば、生化学実験講座第１巻、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、ｐ．２７０、成田耕造ら、東京化学同人（１９７７年）に従って行うことができるが、市販品を用いてもよい。ヒドロキシアミノ酸のアミノ基を保護するための試薬としては、Ｂｏｃ基、Ｚ基、Ｆｍｏｃ基等を使用することができる。また、ヒドロキシアミノ酸残基の水酸基を保護するための試薬としては、ｔ−Ｂｕ基、Ｂｚｌ基等を使用することができる。一方、保護されたヒドロキシアミノ酸残基の脱保護には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、無水フッ化水素、ＨＢｒ／酢酸、ピペリジン／ＤＭＦ、水酸化ナトリウム水溶液等の酸又はアルカリ溶液を使用することができる。
【００４９】
工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）のカルボキシル基の活性化には、例えば、スクシンイミドエステル基、ｐ−ニトロフェニル基を使用することができる。
【００５０】
工程（ｉｉｉ）及び（ｖ）のアミド結合を形成させる反応は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、ＤＭＦ、ジオキサン、ＤＭＳＯ等の溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、トリエチルアミン等の弱アルカリの存在下で、通常、室温で１−２４時間反応させる。
【００５１】
他の側面として、本発明の製造方法によって、架橋構造を有しないポリアミノ酸担体を製造するためには、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を省略することによって達成し得る。
【００５２】
さらに他の側面として、本発明の製造方法によって、架橋構造を１より多く導入する場合には、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を繰り返すことによって達成し得る。
【００５３】
また、本発明のポリアミノ酸担体の製造方法は、例えば、側鎖中の反応基としてカルボキシル基を有するポリアミノ酸、アミノアルコール構造を有するヒドロキシアミノ酸残基、及び両末端にアミノ基をもつ架橋剤を用いる場合には、下記の工程：
（ｉ）ヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を保護すること；
（ｉｉ）ヒドロキシアミノ酸のカルボキシル基を活性化すること；
（ｉｉｉ）架橋剤のアミノ基と活性化したヒドロキシアミノ酸中のカルボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させること；
（ｉｖ）縮合剤を用いてポリアミノ酸中のカルボキシル基と（ｉｉｉ）の化合物中の架橋剤構造由来のアミノ基とを反応させ、アミド結合を形成させること；そして
（ｖ）（ｉ）で保護されたヒドロキシアミノ酸のアミノ基及び水酸基を脱保護すること；
を含む。
【００５４】
ここで、前記工程（ｉｖ）で使用される縮合剤は、アミド結合を形成可能な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＷＳＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等を使用することができる。
【００５５】
他の好ましい態様として、本発明のポリアミノ酸担体の製造方法によれば、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造と結合している反応基の導入パーセントが異なるポリアミノ酸担体を製造することができるが、これは、上記の工程（ｉｉｉ）において生成した化合物の使用量を加減することによって達成される。
【００５６】
上記ポリアミノ酸担体の製造は、公知の方法（例えば、Ｍｅｚｏら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，６３，８１−９５（２０００））に基づいて行うことができる。
【００５７】
（３）ペプチドを結合したポリアミノ酸担体とその製造方法
本発明は、上述したポリアミノ酸担体にペプチドを結合させることを含むペプチド結合担体の製造方法、及び該方法によって製造されるペプチド結合ポリアミノ酸担体に関する。本発明のペプチド結合用ポリアミノ酸担体は、「ジオール構造若しくはアミノアルコール構造」を有することを特徴とする。先ず、これらの構造を酸化処理してアルデヒド基を生成し、次いで、当該アルデヒド基部分にペプチドを結合させることが可能である。
【００５８】
▲１▼製造方法
限定されるわけではないが、本発明のペプチド結合担体の製造方法は、例えば、下記の工程：
（ｉ）ポリアミノ酸担体のジオール構造若しくはアミノアルコール構造を酸化処理によってアルデヒド基を生成すること；
（ｉｉ）一方、所期のペプチドのＮ末端にあらかじめヒドラジノ基を導入すること；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリアミノ酸担体と（ｉｉ）のペプチドとを結合させること
を含む。
【００５９】
本発明のペプチド結合担体の製造方法に従えば、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造からアルデヒド基を生成させるための酸化処理は特に限定されないが、例えば、過ヨウ素酸酸化法を用いることができる。
【００６０】
また、本発明のポリアミノ酸担体に結合されるペプチドには、検体中の標的抗体に対する抗原を用いることができる。このような抗原の大きさは、特に限定されないが、標的抗体に対する抗原のエピトープを少なくとも１つ含むペプチドであることが好ましい。本願明細書において、「ペプチド」というときは、２個以上のアミノ酸残基がアミド結合によって結合したものをいう。本発明によれば、使用されるペプチドは、アミノ酸残基が３個以上あればよく、好ましくは３−５０個、より好ましくは１０−２０個である。
【００６１】
なお、本発明に使用されるペプチドは特に限定されず、天然産のペプチド、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたペプチド、化学合成したペプチド、あるいは蛋白質の酵素処理によって生成したペプチドの何れでもよい。例えば、本願明細書中の実施例３では、ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６由来のアミノ酸配列を有する、１２ｍｅｒ及び１８ｍｅｒのアミノ酸残基からなるＨＩＶ−２ ｇｐ３６合成ペプチドを使用した。
【００６２】
さらに、本発明は、ポリアミノ酸担体に生成されたアルデヒド基と、前記ペプチド中のアミノ基を結合させることを特徴とする。この結合には、該ポリアミノ酸担体へペプチドの結合効率、ペプチドの活性を損なわないこと、及びペプチドへの抗体の反応性等を考慮して、ペプチド中の側鎖ではなくＮ末端のアミノ基を使用することが好ましい。または、アミノ基を有するアミノ酸をペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に結合し、該アミノ酸を使用することが好ましい。
【００６３】
より好ましくは、ポリアミノ酸担体のアルデヒド基とペプチドのアミノ基の選択的結合性を高めるため、ぺプチドの末端にあらかじめヒドラジノ基を導入したペプチドを調製し、使用する。最も好ましくは、後述する実施例２に示すように、ヒドラジノ基の導入のために使用される試薬として、ε−アミノ基にヒドラジノ基を有するヒドラジノベンゾイルリジンを用いる。
【００６４】
▲２▼ペプチド結合ポリアミノ酸担体
本発明のペプチド結合ポリアミノ酸担体は、固相に結合させることにより抗体又は抗原を測定するための免疫測定試薬として用いることができる。前記固相としては、ポリスチレン、ポリエチレン、セファロース等の材質からなるプレート、ビーズ、メンブレンなどが使用できる。これらの固相は、緩衝液中に溶解したペプチド結合ポリアミノ酸担体と接触させることにより、その表面にポリアミノ酸担体を物理吸着できる固相である。緩衝液としては、ペプチド結合ポリアミノ酸担体が安定に存在でき、固相への吸着が阻害されないｐＨが中性からアルカリ性の条件であれば、一般的な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水が使用できる。このように本発明のペプチド結合ポリアミノ酸担体は、穏和な条件で固相に結合させることができるので、ペプチドの抗原性を損なうことなく簡便に免疫測定に供することができる。
【００６５】
このようなペプチド結合ポリアミノ酸担体が吸着した固相からなる免疫測定試薬は、サンドイッチ法、競合法等の公知の免疫測定法に使用することができる。例えば、ヒトについての抗ＨＩＶ−１抗体を測定する場合には、ＨＩＶ−１由来のペプチド断片または合成ペプチドを結合したポリアミノ酸担体を固相に吸着させた免疫測定試薬に、検体又は希釈した検体を接触させ、第１の免疫複合体を形成させた後、固相を洗浄し、続いて、標識抗ヒトＩｇＧ抗体をこの免疫複合体と接触させ、生じた第２の免疫複合体を検出することによって、検体中の抗ＨＩＶ−１抗体を検出することができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６７】
実施例１．セリン化ポリリジン（ＳｐＫ１）の合成
（ａ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸（１）の合成
アミノアルコール構造を有するセリンと架橋剤としてγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を用いて、標記の架橋構造を有するセリンを合成した（スキーム１）。市販されているセリンのアミノ基及び水酸基があらかじめ保護されているセリンを使用した。
【００６８】
Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン２．６１ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１．２７ｇをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（以下、ＤＭＦという。）に溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２．１１ｇを加え、室温で終夜攪拌した。
【００６９】
反応液に酢酸エチルと水を加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて、５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。
【００７０】
酢酸エチルを溜去し、残渣をＤＭＦに溶解し、ＧＡＢＡ１．０３ｇと炭酸水素ナトリウム０．８４ｇを水に溶解して加え、終夜攪拌した。
【００７１】
反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸でｐＨを約３として分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。
【００７２】
酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量２．７７ｇ（８０％）
（ｂ）Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリル−γ−アミノ酪酸 Ｎ−コハク酸イミドエステル（２）
上記で調製した化合物（１）のカルボキシル基をスクシンイミドエステルで活性化した（スキーム１）。
【００７３】
化合物（１）１．０４ｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．３８ｇをＤＭＦに溶解し、氷冷下１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．６３ｇを加え、室温で終夜攪拌した。
反応液に水と酢酸エチルを加え、よく攪拌して分液した。水相を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を合わせて５％クエン酸水溶液、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。
【００７４】
酢酸エチルを溜去すると結晶化した。ｎ−ヘキサンを加えて結晶を濾取した。収量１．２１ｇ（９１％）
スキーム１
【００７５】
【化１】
（ｃ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸｝（３）上記で製造した化合物（２）とポリリジンとをペプチド結合させて、標記化合物（３）を得た（スキーム２）。
【００７７】
ポリリジン（シグマ社製Ｎｏ．Ｐ２６３６、ＭＷ（粘度）３０，３００）２０ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、化合物（２）８．９ｍｇをＤＭＦ２００μｌに溶解して加え、室温で３時間攪拌した。反応液に酢酸１００μｌを加えて透析チューブに移し、水に対して室温３時間透析した後、凍結乾燥した。収量２２．０ｍｇ
スキーム２
【００７８】
【化２】
（ｄ）ポリリジン｛Ｂｏｃ−セリン（ｔ−ブチル）−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（４）
上記で製造した化合物（３）におけるポリリジンの未反応のアミノ基に無水コハク酸を反応させ、修飾した（スキーム３）。
【００８０】
上記の化合物（３）１０ｍｇを１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、無水コハク酸２５ｍｇをＤＭＦ２５０μｌに溶解して加え、室温で２時間攪拌した。反応液を透析チューブに移し、水に対し４℃で一夜透析した後、凍結乾燥した。収量１３．７ｍｇ
（ｅ）ポリリジン｛セリン−γ−アミノ酪酸、スクシニル｝（５）
上記で製造した化合物（４）を脱保護し、標記化合物（５）を得た（スキーム３）。
【００８１】
化合物（４）の全量を水２５μｌとトリフルオロ酢酸５００μｌに溶解して、室温で１時間攪拌した。反応液に水を加えて凍結乾燥した。１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、水に対して室温で３時間透析した後、凍結乾燥した。収量１０．７ｍｇ
スキーム３
【００８２】
【化３】
加水分解後のアミノ酸分析により、ポリリジンの反応基の中で、アミノアルコール構造が結合している反応基の割合を調べた。化合物（２）とポリリジンの反応基をモル比１：５で混合した場合には、ポリリジンの反応基４．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応していた。
【００８４】
（ｆ）さらに、アミノアルコール構造と結合している反応基の割合が異なるポリリジン担体を調製するため、上記の化合物（２）とポリリジンの混合比を変化させて、同様の方法でセリン化ポリリジンを調製した。上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：１０で混合した場合には、ポリリジンの反応基９．６に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。また、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：２０で混合した場合には、ポリリジンの反応基１９．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。
【００８５】
実施例２．セリン化ポリリジン（ＳｐＫ２）の合成２
分子量の異なるポリリジンを用いて、上記実施例１と同様の方法でセリン化ポリリジン（ＳｐＫ２）を調製した。ポリリジンは、シグマ社製Ｎｏ．Ｐ１３９９、ＭＷ（粘度）１８９，４００を５０ ｍｇ用いた。アミノアルコール構造と結合している反応基の割合が異なるポリリジン担体を調製するため、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：１０で混合した場合には、ポリリジンの反応基９．９に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。また、上記の化合物（２）とポリリジンの反応基のモル比が１：２０で混合した場合には、ポリリジンの反応基２０．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した。
【００８６】
実施例３．ヒドラジノペプチドの合成
（１）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸の合成
４−ヒドラジノ安息香酸１５．２ｇをアルゴン気流下、水５０ｍｌに縣濁し、水酸化ナトリウム４．８ｇを加えて溶解した。二炭酸ジ−ｔ−ブチル２６．２ｇを１，４−ジオキサン５０ｍｌに溶解して加えて、一夜攪拌した。減圧下に溶媒を約半分溜去し、水を加えて酢酸エチルで２回洗った。水相に酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸で中和し、分液した。もう一度酢酸エチルを加え、６Ｎ塩酸でｐＨを３に調整し、分液した。酢酸エチル相を合わせて、水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去すると結晶が析出した。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗った。収量１６．９ｇ（６７％）
母液を濃縮すると結晶が析出した。濾取し酢酸エチルで洗浄した。収量４．８ｇ。合わせて２１．７ｇ（８６％）。
【００８７】
（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステルの合成
４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸５．０５ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．５３ｇをジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）に溶解し、氷冷下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４．２２ｇを加え終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルを加え、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗った。結晶が析出した。濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。母液を濃縮し、析出した結晶を濾取し、五酸化二燐上で乾燥した。初めに析出した結晶と合わせて６．１５ｇ（８８％）の表題化合物を得た。
【００８８】
（３）Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンの合成
Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン３．０ｇと炭酸水素ナトリウム０．６５ｇを水とＤＭＦに縣濁し、氷冷下、４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）安息香酸Ｎ−スクシンイミドエステル２．７ｇをＤＭＦに溶解して加えた。室温で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、６Ｎ塩酸で酸性にし、分液した。水相を酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を溜去し、得られた油状の残渣を、減圧下に乾燥すると固化した。収量３．５０ｇ（７５％）。
【００８９】
（４）ヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドの合成
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６より誘導される抗体を検出するための抗原ペプチドとして、ＨＩＶ−２ｇｐ３６のアミノ酸配列から１１残基及び１７残基を選択し、ペプチドの合成をおこなった。公知のＦｍｏｃ法に従い、ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を用いて、１１残基及び１７残基のアミノ酸を結合させ、最後にＮα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−（４−（ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ）ベンゾイル）−Ｌ−リジンを加えることにより、Ｎ末端のリジンにヒドラジノ基を有するＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチドを作成した。
【００９０】
ヒドラジノペプチドの構造
１２残基の配列
Ｌｙｓ（ＨＢｚ）−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ（配列番号１）
ＨＢｚ ＝ヒドラジノベンゾイル
１８残基の配列
Ｌｙｓ（ＨＢｚ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ− Ｃｙｓ（配列番号２）
実施例４．セリン化ポリリジンとヒドラジノペプチドとの複合体の作製
上記実施例２で製造した、ポリリジンの反応基２０．２に対してアミノアルコール構造が１の割合で反応した化合物（５）を過ヨウ素酸酸化し、上記実施例３で製造したヒドラジノペプチドを結合したペプチド結合ポリリジン担体を調製した（スキーム４）。
【００９１】
化合物（５）２ｍｇを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解し、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４０μｌを加えて、室温で２０分間攪拌した。反応液を１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけて、同溶液で溶出した。最初の溶出液２．５ｍｌは採取せず、続く２．０ｍｌを回収した。この溶液にヒドラジノペプチドを１０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解して（１ｍｇ／ｍｌ）加え、室温で３時間攪拌した。４００ｍＭヒドロキシアミン塩酸塩／１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加え、３０分間撹拌した。酢酸２０μｌを加えて溶液のｐＨを約５として透析チューブに移し、水に対して４℃、一夜透析した後、凍結乾燥した。
【００９２】
加水分解後のアミノ酸分析によりペプチドの導入率を調べたところ、ポリリジンの反応基２０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約１の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基４５．５に対してペプチドが１の割合で反応した。また、ポリリジンの反応基４０に対してペプチドを１の割合（ポリリジン担体上のアミノアルコール構造１に対して、ペプチドを約０．５の割合）で混合した場合には、ポリリジンの反応基６２．５に対してペプチドが１の割合で反応した。
【００９３】
スキーム４
【００９４】
【化４】
参考例１．卵白アルブミンとヒドラジノペプチドとの複合体の作製
以下の実施例６において、本発明のペプチド結合ポリリジン担体による免疫反応と比較検討するために、上記実施例３で製造したヒドラジノペプチドを天然由来の蛋白質である卵白アルブミンに結合させた。
【００９６】
卵白アルブミン４ｍｇを１ｍｌの水に溶解し、１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加え、室温で２０分間攪拌した。反応液を１ｍＭ酢酸水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけて、同溶液で溶出した。最初の溶出液２．５ｍｌを採取せず、続く２．０ｍｌを回収した。
【００９７】
この溶液２０００μｌに２００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液２０μｌを加えた後、１７残基の抗原ペプチドからなるヒドラジノペプチド０．６４ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解（３ｍｇ／ｍｌ）して加え、室温で３時間攪拌した。反応液を透析チューブに移し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対して、４℃で一夜透析し、２ｍｌの溶液が得られた。ＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製）によるタンパク定量値は０．７１２ｍｇ／ｍｌであった。
【００９８】
実施例５．ペプチド結合ポリリジン担体によるＨＩＶ−２抗体の検出（１）
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６により誘導される抗体を検出するために、実施例１及び２で製造したペプチド結合ポリリジン担体を用いて簡易クロマトアッセイを行った。
【００９９】
（１）材料
ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１２ｍｅｒ結合ポリリジン
ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１８ｍｅｒ結合ポリリジン
アルカリホスファターゼ標識ＨＩＶ−２ｇｐ３６合成ペプチド１８ｍｅｒ
リン酸緩衝液：１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＳＤＳ，３％ ｓｕｃｒｏｓｅ）
基質液：５−Ｂｒｏｍｅ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＲＯＣＨＥ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陽性血清（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陰性血清（Ｔｒｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
（２）実験方法及び結果
所定濃度に希釈した合成ペプチド結合ポリリジンを５×５０ｍｍに切断されたニトロセルロース膜ストリップ上に約０．７５μｌ点着した。この試験ストリップを特許第３２３７５４０号に記載のイムノクロマト試験用具にセットした。検体として、ＨＩＶ−２抗体陽性血清（ＰＲＦ２０２−０１、ＰＲＦ２０２−０５、ＰＲＦ２０２−０１５）をＨＩＶ−２抗体陰性血清で希釈して用いた。特開平９−２２９９３８号に記載の方法に準じて免疫反応を行い、反応の有無を確認した。その結果を表１に示す。
【０１００】
本発明の合成ペプチド結合ポリリジンをニトロセルロース膜上に固相化した場合、ＨＩＶ−２抗体陽性血清はいずれも顕著な反応を示した。対照としてペプチドのみを固相化した場合は、反応は認められなかった。陰性対照のＨＩＶ−２抗体陰性血清での反応は検出されなかった。本発明の合成ペプチド結合ポリリジンは、担体の分子量、ペプチドの結合数及びペプチド長に関らず、ペプチドの抗原性が損なわれることなく免疫測定の固相抗原として有用であることが明らかとなった。
【０１０１】
【表１】
実施例６．ペプチド結合ポリリジン担体によるＨＩＶ−２抗体の検出（２）
ＨＩＶ−２外皮タンパク質ｇｐ３６により誘導される抗体を検出するために、上述した実施例１及び２によって製造したペプチド結合ポリリジン担体を用いて、イムノブロッティングアッセイを行った。本発明のペプチド結合ポリリジン担体の効果を検討するために調製したペプチド結合卵白アルブミンと比較した。
【０１０３】
（１）材料
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６合成ペプチド １８ｍｅｒ
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ペプチド１８ｍｅｒ結合オボアルブミン（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈａｍｅｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ペプチド１８ｍｅｒ結合セリン化ポリリジン
炭酸緩衝液： ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、約ｐＨ９．０
リン酸緩衝液： ０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むもの
ＨＲＰＯウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ，デンマーク）
ＨＲＰＯウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ，デンマーク）
基質液： １−クロロ４−ナフトール、０．０１％過酸化水素水（自社製）
検体：
抗ＨＩＶ−２ ｇｐ３６モノクローナル抗体（富士レビオ社製）
ＨＩＶ−２抗体陽性血清（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）
ＨＩＶ−２抗体陰性検体（Ｔｒｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
（２）実験方法及び結果
炭酸緩衝液で所定濃度に希釈した合成ペプチド、合成ペプチド結合ＯＶＡ、あるいは合成ペプチド結合セリン化ポリリジンを、５×５０ｍｍに切断されたニトロセルロース膜ストリップ上に約２μｌ点着した。この試験ストリップをインキュベーターを用いて３７℃で約１５分間乾燥させた。試験ストリップを試験管に入れ、検体として、ＰＢＳ−Ｔを用いて所定濃度に希釈したＨＩＶ−２モノクローナル抗体（陽性対照）、ＨＩＶ−２抗体陽性血清またはＨＩＶ−２抗体陰性血清（陰性対照）を加えた。３７℃で約３０分間緩やかに撹拌しながらインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０１０４】
次いで、ＰＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰＯウサギ抗マウスＩｇＧあるいはＨＲＰＯウサギ抗ヒトＩｇＧ液に試験ストリップを浸した。室温で３０分間緩やかに撹拌しながらインキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０１０５】
その後、基質液を適量加えた。目視にて反応の有無を確認した。その結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
合成ペプチドを固相化した場合、ＨＩＶ−２モノクローナル抗体（陽性対照）、ＨＩＶ−２抗体陽性血清又はＨＩＶ−２抗体陰性血清（陰性対照）のいずれの検体の場合も、検体中のＨＩＶ−２抗体は検出されなかった。合成ペプチド結合ＯＶＡを固相化した場合は、ＨＩＶ２陽性血清で顕著に検出されるが、陰性対照であるＨＩＶ２陰性血清を使用している場合にも検出された。
【０１０８】
これに対し、本発明の合成ペプチド結合ＳｐＫ（セリン化ポリリジン）を固相化した場合、ＨＩＶ２陽性ヒト血清及び陽性対照のＨＩＶ−２モノクローナル抗体は顕著な反応性が観察されたのに対し、陰性対照のＨＩＶ２陰性血清は反応性が全く観察されなかった。
【０１０９】
また、合成ペプチド結合ＯＶＡではなくＯＶＡを固相した場合も、陰性対照であるＨＩＶ２陰性血清に対して反応性がみられた。この結果は、ＯＶＡを担体として用いた場合には、血清に対して非特異的な反応があることを示す。一方、合成ペプチド結合ＳｐＫを担体として用いた場合には、ＯＶＡで見られる非特異的な結合（陰性対照のＨＩＶ２陰性血清に対する反応性）が見られないことを示している。
【０１１０】
【配列表】
【発明の効果】
本発明により、ポリアミノ酸担体が提供され、該担体を用いたペプチド結合ポリアミノ酸担体の使用による検体中のペプチドに対する抗体の検出を非特異的な反応を抑制し、迅速かつ簡便に行うことが可能となった。したがって、該ポリアミノ酸担体は、医療分野において、各種疾患の診断等に有用であることが明らかになった。
Claims (13)
- 側鎖にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくは水酸基から選択される反応基を有する、単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸；及び
前記反応基の全部又は一部に、架橋構造を介して又は介さずに結合しているジオール構造若しくはアミノアルコール構造
とからなるペプチド結合用ポリアミノ酸担体。 - 単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸がリジン又はオルニチン残基を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載のポリアミノ酸担体。
- 反応基と架橋構造、及び／又は、架橋構造とジオール構造若しくはアミノアルコール構造、あるいは、前記反応基とジオール構造若しくはアミノアルコール構造が、アミド結合によって結合している、請求項１又は２に記載のポリアミノ酸担体。
- 単一若しくは２ないし４種類のアミノ酸から選択されるアミノ酸残基からなるポリアミノ酸の粘度平均分子量が１，０００〜３００，０００である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリアミノ酸担体。
- 前記反応基の５％ないし２０％に、架橋構造を介して又は介さずに、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造が結合していることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリアミノ酸担体。
- 架橋構造が、γ−アミノ酪酸またはエチレンジアミンを含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリアミノ酸担体。
- アミノアルコール構造を含む置換基がセリン又はスレオニンである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリアミノ酸担体。
- 請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリアミノ酸担体の、ジオール構造若しくはアミノアルコール構造を酸化し、該担体にペプチドを結合させることを含む、ペプチド結合ポリアミノ酸担体の製造方法。
- ペプチドが、末端にあらかじめヒドラジノ基を導入したペプチドである、請求項８に記載の製造方法。
- 末端にあらかじめヒドラジノ基を導入したペプチドが、末端にヒドラジノベンゾイルリジンを有したペプチドである、請求項９に記載の製造方法。
- 請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の製造方法を用いて製造された、ペプチド結合ポリアミノ酸担体。
- 請求項１１に記載のペプチド結合ポリアミノ酸担体を固相に結合した免疫測定試薬。
- 請求項１２に記載の免疫測定試薬を含む、免疫測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003137139A JP4258271B2 (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | ポリアミノ酸担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003137139A JP4258271B2 (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | ポリアミノ酸担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004340722A true JP2004340722A (ja) | 2004-12-02 |
| JP4258271B2 JP4258271B2 (ja) | 2009-04-30 |
Family
ID=33526878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003137139A Expired - Lifetime JP4258271B2 (ja) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | ポリアミノ酸担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4258271B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006275769A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法 |
| JP2010178640A (ja) * | 2009-02-03 | 2010-08-19 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 細胞の吸着を制御可能なポリペプチド |
| WO2021002481A1 (ja) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | 学校法人京都薬科大学 | 生分解性に優れる腎ターゲティング型薬物送達用担体 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1403842B1 (it) | 2011-01-14 | 2013-11-08 | Pc Engineering S R L | Procedimento per il trattamento e la vinificazione dell'uva |
-
2003
- 2003-05-15 JP JP2003137139A patent/JP4258271B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006275769A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法 |
| JP4530895B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2010-08-25 | 住友ベークライト株式会社 | ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法 |
| JP2010178640A (ja) * | 2009-02-03 | 2010-08-19 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 細胞の吸着を制御可能なポリペプチド |
| WO2021002481A1 (ja) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | 学校法人京都薬科大学 | 生分解性に優れる腎ターゲティング型薬物送達用担体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4258271B2 (ja) | 2009-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1220420A (en) | Method of determining antigenically active amino acid sequences | |
| AU704502B2 (en) | Non-dendritic backbone peptide carrier | |
| JPH04504416A (ja) | ペプチドの使用方法と合成方法 | |
| JPH09501152A (ja) | ヒト前立腺腺性カリクレインに特異的な抗体 | |
| JPS58201754A (ja) | 合成ｓｔ毒素、その製造方法およびそのワクチン接種剤としての用途 | |
| CS256960B1 (en) | Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production | |
| JP3070773B2 (ja) | タンパク質の同定または測定方法、およびそれの適用 | |
| JP4130505B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸からなるペプチドによる診断方法の干渉の排除 | |
| JP3387928B2 (ja) | 抗体に対して特異的な結合物質およびイムノアッセイまたはワクチンへのその使用 | |
| JP2005061910A (ja) | Ｈｉｖ抗原抗体測定用免疫測定器具及び測定方法 | |
| JP4258271B2 (ja) | ポリアミノ酸担体 | |
| JP2001055400A (ja) | Ｈｉｖ抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物 | |
| JP4120846B2 (ja) | 活性化ペプチド類および接合体 | |
| ES2390408T3 (es) | Detección de anticuerpos anti-proteína P ribosómica mediante péptidos sintéticos | |
| Winkler et al. | Protein labeling and biotinylation of peptides during spot synthesis using biotin p‐nitrophenyl ester (biotin‐ONp) | |
| JP2010122002A (ja) | 抗体の検出方法及び該方法に用いられる試薬キット | |
| CA2038030C (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor viia, and the use thereof | |
| Zevgiti et al. | Collagen models as a probe in the decay of works of art: synthesis, conformation and immunological studies | |
| FR2737209A1 (fr) | Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c | |
| Dukic-Stefanovic et al. | Characterization of antibody affinities using an AGE-modified dipeptide spot library | |
| JP2002511853A (ja) | Ｈｉｖ抗体の検出方法及びそれに使用する抗原 | |
| JP2705791B2 (ja) | Ａｉｄｓ関連病の検出のための合成抗原 | |
| WO2021045182A1 (ja) | トリプターゼ活性測定用基質 | |
| CS258290B1 (cs) | Peptid s vlastnostmi antigennlch determinant a způsob jeho výroby | |
| CS258288B1 (cs) | Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060317 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060324 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20070117 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080205 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090113 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090126 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4258271 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140220 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140220 Year of fee payment: 5 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |