CS258290B1 - Peptid s vlastnostmi antigennlch determinant a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Řešení se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I H-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala-X (D , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu. Peptid byl připraven syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že jej lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience (AIDS). Peptid přichází dále v úvahu pro produkci monodeterminantních protilátek.

Description

Vynález se týká peptidu s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce X

H-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátů s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu a způsobu jejich výroby.

Látka podle vynálezu je nová a byly u nl prokázány vlastnosti antigenních determinant proteinu p24, což je bílkovinný produkt genu gag viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV). Může sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru způsobujícímu syndrom získané imunodeficience (AIDS) nebo komplex chorob příbuzných AIDS (ARC). Dále je potenciálně též použitelná pro produkci monodetermínantních protilátek.

V současné době se diagnostikuje syndrom získané imunodeficience (AIDS) přítomností protilátek proti viru HIV v krevním séru. Stanovení je prováděno za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, tj. virem HIV (inaktivovaným detergentem), jímž jsou ELISA destičky potaženy. Virus je získáván poměrně složitým způsobem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové pufirikován, než je ho možné použít k potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale i vysoce nebezpečnou, nebot se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem. Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy k vyšetření onemocnění AIDS, vyráběné předními světovými výrobci. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzivní purifikaci některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to bud imunofluorescenoí nebo tzv. metodou western blot. V roce 1987 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HIV budou obsahovat jako antigen jen některé jeho strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryontnlm systému. Firma Biochrom již uvedla na trh diagnostickou soupravu na bázi syntetických peptidů. Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, nebot by se používal jeden definovaný antigen a ne jejioh směs, jak to je při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní vzhledem ke genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění

Látka podle vynálezu byla syntetizována způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerni nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí se.

Peptid obecného vzorce I byl připraven Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerni nosič byl použit polystyren sítovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N«Z-aminoskupiny byly chráněny acidolabilními chránícími skupinami, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku v DCM. Postranní skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TFM5A ve směsi s TFA a thioanisolem. Surový produkt byl čištěn bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptid byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a jeho čistota byla ověřena chromatografickými a elektroforetiokými metodami.

Aminokyselinová sekvence peptidů obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence proteinu p24 viru HIV tak, aby zahrnovala antigenní determinanty zmíněného proteinu. Peptid může sloužit pro diagnostické účely, což bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.

Základem diagnostické reakce je interakce syntetického peptidů podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetický peptid obecného vzorce I je určen pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virálnímu proteinu p24 viru HIV. Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. AO Č. 256 960.

V tabulce ] jsou uvedeny hodnoty absorbancí pro jednotlivá pozitivní séra, ředěná v poměru 1:100. Použitá séra byla pozitivní při testování v komerčním ELISA testu, kde jako antigen byl použit HIV a byla též verifikována metodou western blot. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a v hodnotách absorbance nepřevýšila hranici 0,1.

Tabulka 1

Hodnoty absorbancí pozitivních sér, ředěných v poměru 1:100.

sérum č.	1	2	3 4	5	6	7	8
absorbance	0,53	0,86	0,62 0,88	1,24	0,59	1,85	1,67
sérum č.	9	10	11 12	13	14	15	16
absorbance	0,96	0,72	1,13 0,53	0,70	1,52	0,73	1,47
Peptid	podle vynálezu je	možno	dále použít pro	produkci	monodeterminantních	protilátek

proti proteinu p24, směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat s výhodou králíků, peptidem obecného vzorce I, s výhodou ve směsi s muramyldipeptidem, kovalentně navázaným muramyldipeptidem na peptid obecného vzorce I nebo peptidem obecného vzorce I polymerizovaným glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin k keyhole limpetů, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldipeptid. Séra králíků, kteří byli imunizováni peptidem obecného vzorce I s kovalentně navázaným muramyldipeptidem vykazovala pozitivní reakci v ELISA testu, kde jako antigen byl použit HIV. Hodnoty absorbancí se pohybovaly v rozmezí 0,52 až 0,71 při ředění séra 1:1 000, hodnota absorbance s kontrolním negativním sérem byla menší než 0,1.

Získ.mó výsledky ukazují, že peptid podle vynálezu je možno pužít jako diagnostika a přicház.1 v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.

Následující příklad provedení látku a způsob podle vynálezu pouze dokládá ale nikterak neomezuje.

P ř í k 1 a d

Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,0 g benzhydrylaminové polystyrénové pryskyřice sííované 1 £ divinylbenzenu. Syntéza zahrnovala 12 cyklů, sestávajících z následu jících kroků ‘ (1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1x30 min?

(2) promývání, DCM, 6x1 min;

(3) promývání, 2-propanol, 2x1 min?

51( ? $10 (4) promývání, DCM, 2x1 min;

(5) neutralizace , TEA:DCM (1:9), lxl min, 1x3 min?

(6) prornývání, DCM, 6x1 min;

(7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridů (trojnásobný přebytek), do negativní reakce no amínoskupiny?

(8) promývání, DCM, 3x1 min.

V jednotlivých cykle;ch byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Ala, Boc-Ile, Boc-Asp(OBzl), Boc-Cer(Bzl), Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boc-Arg(Tos) o DCC v reakční nádobce, Boc-Pro, Boc-Glu(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Boc-Arg(Tos), Boc-Met, Boc-Gln a Boc-Gly. První syntetický cyklus začínal krokem č. (4).

Po ukončené syntéze bylo získáno 4,21 g peptidyl-pryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (C,5 g) odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny pomocí kapalného HF metodou low-high. Po odstranění HF byl produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 217 mg. Surový peptid (100 mg) byl čištěn na koloně (1x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze 1 N kyselina octová, průtok 7 ml/h. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 6,4 min, mobilní fáze 50% methanol, 50% vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (Rf 0,42 v soustcivě η-butanol:kyselina octová:voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek 63 mg II-Gly-Cln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala-Ní^

Vysvětlivky zkratek použitých v textu

HIV virus způsobujíc! u lidí imunodeficienci

ABC komplex chorob příbuzných AIDS

AIDS syndrom získané imunodeficience

ELISA enzymoimunologický test

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

TFA kyselina trifluoroctová

DCM dichlormetan

TFMSA kyselina trifluormetansulfonová

IIOBt U-hydroxyben2triazol

TEA trietylamin

Boc t-butyloxykarbonyl

Tos p~toluensulfony1

Bzl benzyl

DCC N, N-dicy klohexy 1 kar bodiimid

HF fluorovodík

Ala alanin

Arg arginin

Asp kyselina asparagová

Gin glutamin

Glu kyselina glutamová

Gly glycin

Ile isoleucin

Met methionin

Pro prolin

Ser serin

Claims (2)

1. Peptid s vlastnostmi anťigenních determinant obecného Vzorce I,

H-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile-Ala-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugát s intunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu spheronu a polystyrenu.

2. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.