CS258288B1 - Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Řešení se týká peptidu s vlastnostmi antigennich determinant obecného vzorce I H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg- -Leu-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu. Peptid byl připraven syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že jej lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience (AIDS). Peptid přichází dále v úvahu pro produkci monodeterminantních protilátek.

Description

Vynález se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I

H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu a způsobu jejich výroby.

Látka podle vynálezu je nová a byly u ní prokázány vlastnosti antigenních determinant glykoproteinu gp 41, což je bílkovinný produkt genu env viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV). Může sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru způsobujícímu syndrom získané imunodeficience (AIDS) nebo komplex chorob příbuzných AIDS (ARC). Dále je potenciálně též použitelná pro produkci monodeterminantních protilátek.

V současné době se diagnostikuje syndrom získané imunodeficience (AIDS) přítomností protilátek proti viru HIV v krevním séru. Stanovení je prováděno za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, tj. virem HIV (inaktivovaným detergentem), jímž jsou ELISA destičky potaženy. Virus je získáván poměrně složitým způsobem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové purifikován, než je ho možné použít k potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale hlavně vysoce nebezpečnou, nebot se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem. Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy k vyšetření onemocnění AIDS, vyráběné předními světovými výrobci. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzivní purifikaci některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to buá imunofluorescenci, nebo tzv. metodou Western blot. V roce 1986 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HIV budou obsahovat jako antigen jen některé jeho strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryotním systému. Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, nebot by se používal jeden definovaný antigen a ne jejich směs, jak to je při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní, vzhledem k genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění. Podobných výsledků by mělo být dosaženo i s použitím některých epitopů proteinů viru HIV, kde se zatím podobná souprava nevyrábí, ale je již na trhu sada monoklonálních protilátek proti oligopeptidúm z vnitřní virové bílkoviny p24, a jsou očekávány v ňejbližší době práce o imunogenních peptidech, syntetizovaných na základě analýzy primární sekvence obalových proteinů viru HIV.

Látka podle vynálezu byla syntetizována způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí se.

Peptid obecného vzorce I byl připraven Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren sítovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N-alfa-aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku v DCM. Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TFMSA ve směsi s TFA a thioanisolem. Surový produkt byl čištěn buď pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci, nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptid byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a jeho čistota byla ověřena chromátografickými a elektroforetickými metodami.

Aminokyselinová sekvence peptidu obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence glykoproteinu gp 41 viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV) tak, aby zahrnovala antigenní determinanty zmíněného glykoproteinu. Peptid může sloužit pro diagnostické účely, což bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.

Základem diagnostické reakce je interakce syntetického peptidu podle vynálezu s protilát kami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetický peptid obecného vzorce I je určen pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virálnímu glykopropteinu gp 41, viru způsobujícímu u lidí imunodeficienci (HIV). Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. AO č. 256 960. Reakce s peptidem vykazovala v průběru tytéž hodnoty absorbancí jako antigen připravený z viru HIV. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a. v hodnotách absorbance nepřevýšila hranici 0,1. Pozitivní séra vykazovala absorbancí 5x až lOx vyšší, přičemž bylo dosaženo ojediněle i hodnot ještě vyšších (1,75).

Peptid podle vynálezu je možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek proti glykoproteinu gp 41, směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou králíků, peptidem obecného vzorce I, s výhodou polymerizovaným glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetů, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů.

Jako ímunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldípeptíd.

Získané výsledky ukazují, že peptid podle vynálezu je možno použít jako diagnostika a přichází v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.

Následujíc! příklad provedení látku a způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nikterak neomezují.

Příklad

Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,0 g benzhydrylaminové pryskyřice sítované 1% divinylbenzenu. Syntéza zahrnovala 11 cyklů, sestávajících z následujících kroků: (1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1x30 min; (2) promývání, DCM, 6x1 min; (3) promývání, 2-propanol, 2x1 min; (4) promývání, DCM, 2x1 min; (5) neutralizace, TEA:DCM (1:9), lxl min, 1x3 min; (6) promývání, DCM, 6x1 min; (7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridů (3násobný přebytek), do negativní reakce na aminoskupiny; (8) promývání, DCM, 3x1 min. V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boc-Arg(Tos) a DCC v reakční nádobce, Boc-Ile, Boc-Ser (Bzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Glu(OBzl) a Boc-Gly. První syntetický cyklus začínal krokem č. (4). Po ukončené syntéze bylo získáno 4,85 g peptidylpryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (0,5 g) odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny pomocí kapalného HF metodou low-high. Po odstranění HF byly produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové, lyofilizován a čištěn na koloně (1x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze IN kyselina octová, průtok 7 ml/hod. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (R_fc 7,9 min, mobilní fáze 40 4 MeOH, 60 % vody obsahující 0,1 4 TPa), chromatografií na tenké vrstvě <R_f 0,35 v soustavě n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a při elektroforéze na papíře při pH 2,5,

Výtěžek: 74 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-ÍH^

Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:

HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci

ARC komplex chorob příbuzných AIDS

AIDS syndrom získané imunodeficience

ELISA enzymoimunologický test

HPLC vysokoúěinná kapalinová chromatografie

TFA kyselina trifluoroctová

DCM dichlormetan

TFMSA kyselina trifluormetansulfonová

HOBt N-hydroxybenztriazol

TEA trietylamin

Boc t-butyloxykarbonyl

Tos p-toluensulfonyl

Bzl benzyl

CDD Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid

HF fluorovodík

Arg arginin

Asp kyselina asparagová

Glu kyselina glutamová

Gly glycin

Ile isoleucin

Leu leuoin

Ser serin

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Peptid s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I,

   H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugát s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu.
2. 2. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormethylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.