CS258288B1 - Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby - Google Patents

Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby Download PDF

Info

Publication number
CS258288B1
CS258288B1 CS871218A CS121887A CS258288B1 CS 258288 B1 CS258288 B1 CS 258288B1 CS 871218 A CS871218 A CS 871218A CS 121887 A CS121887 A CS 121887A CS 258288 B1 CS258288 B1 CS 258288B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
arg
peptide
asp
antigenic determinants
properties
Prior art date
Application number
CS871218A
Other languages
English (en)
Other versions
CS121887A1 (en
Inventor
Viktor Krchnak
Otakar Mach
Original Assignee
Viktor Krchnak
Otakar Mach
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Viktor Krchnak, Otakar Mach filed Critical Viktor Krchnak
Priority to CS871218A priority Critical patent/CS258288B1/cs
Publication of CS121887A1 publication Critical patent/CS121887A1/cs
Publication of CS258288B1 publication Critical patent/CS258288B1/cs

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Řešení se týká peptidu s vlastnostmi antigennich determinant obecného vzorce I H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg- -Leu-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu. Peptid byl připraven syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že jej lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience (AIDS). Peptid přichází dále v úvahu pro produkci monodeterminantních protilátek.

Description

Vynález se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I
H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu a způsobu jejich výroby.
Látka podle vynálezu je nová a byly u ní prokázány vlastnosti antigenních determinant glykoproteinu gp 41, což je bílkovinný produkt genu env viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV). Může sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru způsobujícímu syndrom získané imunodeficience (AIDS) nebo komplex chorob příbuzných AIDS (ARC). Dále je potenciálně též použitelná pro produkci monodeterminantních protilátek.
V současné době se diagnostikuje syndrom získané imunodeficience (AIDS) přítomností protilátek proti viru HIV v krevním séru. Stanovení je prováděno za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, tj. virem HIV (inaktivovaným detergentem), jímž jsou ELISA destičky potaženy. Virus je získáván poměrně složitým způsobem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové purifikován, než je ho možné použít k potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale hlavně vysoce nebezpečnou, nebot se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem. Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy k vyšetření onemocnění AIDS, vyráběné předními světovými výrobci. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzivní purifikaci některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to buá imunofluorescenci, nebo tzv. metodou Western blot. V roce 1986 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HIV budou obsahovat jako antigen jen některé jeho strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryotním systému. Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, nebot by se používal jeden definovaný antigen a ne jejich směs, jak to je při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní, vzhledem k genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění. Podobných výsledků by mělo být dosaženo i s použitím některých epitopů proteinů viru HIV, kde se zatím podobná souprava nevyrábí, ale je již na trhu sada monoklonálních protilátek proti oligopeptidúm z vnitřní virové bílkoviny p24, a jsou očekávány v ňejbližší době práce o imunogenních peptidech, syntetizovaných na základě analýzy primární sekvence obalových proteinů viru HIV.
Látka podle vynálezu byla syntetizována způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí se.
Peptid obecného vzorce I byl připraven Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren sítovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N-alfa-aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku v DCM. Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TFMSA ve směsi s TFA a thioanisolem. Surový produkt byl čištěn buď pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci, nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptid byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a jeho čistota byla ověřena chromátografickými a elektroforetickými metodami.
Aminokyselinová sekvence peptidu obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence glykoproteinu gp 41 viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV) tak, aby zahrnovala antigenní determinanty zmíněného glykoproteinu. Peptid může sloužit pro diagnostické účely, což bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.
Základem diagnostické reakce je interakce syntetického peptidu podle vynálezu s protilát kami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetický peptid obecného vzorce I je určen pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virálnímu glykopropteinu gp 41, viru způsobujícímu u lidí imunodeficienci (HIV). Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. AO č. 256 960. Reakce s peptidem vykazovala v průběru tytéž hodnoty absorbancí jako antigen připravený z viru HIV. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a. v hodnotách absorbance nepřevýšila hranici 0,1. Pozitivní séra vykazovala absorbancí 5x až lOx vyšší, přičemž bylo dosaženo ojediněle i hodnot ještě vyšších (1,75).
Peptid podle vynálezu je možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek proti glykoproteinu gp 41, směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou králíků, peptidem obecného vzorce I, s výhodou polymerizovaným glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetů, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů.
Jako ímunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldípeptíd.
Získané výsledky ukazují, že peptid podle vynálezu je možno použít jako diagnostika a přichází v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.
Následujíc! příklad provedení látku a způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nikterak neomezují.
Příklad
Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,0 g benzhydrylaminové pryskyřice sítované 1% divinylbenzenu. Syntéza zahrnovala 11 cyklů, sestávajících z následujících kroků: (1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1x30 min; (2) promývání, DCM, 6x1 min; (3) promývání, 2-propanol, 2x1 min; (4) promývání, DCM, 2x1 min; (5) neutralizace, TEA:DCM (1:9), lxl min, 1x3 min; (6) promývání, DCM, 6x1 min; (7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridů (3násobný přebytek), do negativní reakce na aminoskupiny; (8) promývání, DCM, 3x1 min. V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boc-Arg(Tos) a DCC v reakční nádobce, Boc-Ile, Boc-Ser (Bzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Glu(OBzl) a Boc-Gly. První syntetický cyklus začínal krokem č. (4). Po ukončené syntéze bylo získáno 4,85 g peptidylpryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (0,5 g) odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny pomocí kapalného HF metodou low-high. Po odstranění HF byly produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové, lyofilizován a čištěn na koloně (1x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze IN kyselina octová, průtok 7 ml/hod. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rfc 7,9 min, mobilní fáze 40 4 MeOH, 60 % vody obsahující 0,1 4 TPa), chromatografií na tenké vrstvě <Rf 0,35 v soustavě n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a při elektroforéze na papíře při pH 2,5,
Výtěžek: 74 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-ÍH^
Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:
HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci
ARC komplex chorob příbuzných AIDS
AIDS syndrom získané imunodeficience
ELISA enzymoimunologický test
HPLC vysokoúěinná kapalinová chromatografie
TFA kyselina trifluoroctová
DCM dichlormetan
TFMSA kyselina trifluormetansulfonová
HOBt N-hydroxybenztriazol
TEA trietylamin
Boc t-butyloxykarbonyl
Tos p-toluensulfonyl
Bzl benzyl
CDD Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid
HF fluorovodík
Arg arginin
Asp kyselina asparagová
Glu kyselina glutamová
Gly glycin
Ile isoleucin
Leu leuoin
Ser serin

Claims (2)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    1. Peptid s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I,
    H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugát s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu.
  2. 2. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormethylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.
CS871218A 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby CS258288B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS871218A CS258288B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS871218A CS258288B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS121887A1 CS121887A1 (en) 1987-11-12
CS258288B1 true CS258288B1 (cs) 1988-08-16

Family

ID=5346012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS871218A CS258288B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS258288B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS121887A1 (en) 1987-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS256960B1 (en) Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
IE64006B1 (en) Antigens particulary envelope antigens of the virus of lymphadenopathies and of the acquired immune-deficiency syndrome and virus process for producing virus envelope antigens use of said antigens in the preparation of immunogenic compositions or for the diagnosis of the presence of antibodies against this virus
WO1994005311A1 (en) Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
EP0138854A1 (en) ANTIGENICALLY ACTIVE AMINO ACID SEQUENCES.
KR930004055B1 (ko) 펩티드 및 그의 용도
US5191015A (en) Polymers and polymer-peptide conjugates
US5229491A (en) Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis non-a, non-b virus
KANDA et al. Synthesis of polyamide supports for use in peptide synthesis and as peptide‐resin conjugates for antibody production
JP2598245B2 (ja) Htlv−iii/lavウイルス関連ペプチドに対する抗体
EP0538283B2 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies
JP3851761B2 (ja) Hiv抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物
CS258288B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby
JP4258271B2 (ja) ポリアミノ酸担体
AU652581B2 (en) Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis non-A, non-B virus
CS258290B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennlch determinant a způsob jeho výroby
CS258289B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby
JPH05301889A (ja) 非a非b型ペプチド
CA2038030C (en) Synthetic peptides which contain sequences from factor viia, and the use thereof
JPH05331193A (ja) 非a非b型肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド
CS277003B6 (cs) Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1
AU635219B2 (en) Synthetic polypeptides immunochemically reactive with hiv-antibodies
JPH05271277A (ja) 非−a、非−b肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド
CA1341594C (en) Synthetic peptides and mixtures therof for detecting hiv antibodies
US6218102B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
CZ279073B6 (en) Peptides with properties of immuno-dominant determinant of glycoprotein gp41 of hiv-1 virus, and process for preparing thereof