CS258289B1 - Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby - Google Patents

Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby Download PDF

Info

Publication number
CS258289B1
CS258289B1 CS871219A CS121987A CS258289B1 CS 258289 B1 CS258289 B1 CS 258289B1 CS 871219 A CS871219 A CS 871219A CS 121987 A CS121987 A CS 121987A CS 258289 B1 CS258289 B1 CS 258289B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
peptide
pro
glu
production
antigenic determinants
Prior art date
Application number
CS871219A
Other languages
English (en)
Other versions
CS121987A1 (en
Inventor
Viktor Krchnak
Otakar Mach
Original Assignee
Viktor Krchnak
Otakar Mach
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Viktor Krchnak, Otakar Mach filed Critical Viktor Krchnak
Priority to CS871219A priority Critical patent/CS258289B1/cs
Publication of CS121987A1 publication Critical patent/CS121987A1/cs
Publication of CS258289B1 publication Critical patent/CS258289B1/cs

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Řešení se týká peptidu s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu. Peptid byl připraven syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že jej lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience (AIDS). Peptid přichází, dále v úvahu pro produkci monodetermínantních protilátek.

Description

Vynález se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I
H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugátu s imunoadjuvantnlmi látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu a způsobu jejich výroby.
Látka podle vynálezu je nová a byly u ní prokázány vlastnosti antigenních determinant proteinu pl4, což je bílkovinný produkt genu tat viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV). Může sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru způsobujícímu syndrom získané imunodeficience (AIDS) nebo komplex chorob příbuzných AIDS (ARC). Dále je potenciálně též použitelná pro produkci monodeterminantních protilátek.
V současné době se diagnostikuje syndrom získané imunodeficience (AIDS) přítomností protilátek proti viru HIV v krevním séru. Stanovení je prováděno za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, tj. virem HIV (inaktivovaným detergentem), jímž jsou ELISA destičky potaženy. Virus je získáván poměrně složitým postupem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové purifikován, než je ho možné použít k potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale hlavně vysoce nebezpečnou, nebot se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem. Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy k vyšetření onemocněni AIDS, vyráběné předními světovými výrobci. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzivní purifíkací některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to bud imunofluorescenci nebo tzv. metodou Western blot. V roce 1987 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HIV budou obsahovat jako antigen jen některé jeho strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryontním systému. Firma Biochrom již uvedla na trh bezpečnou diagnostickou soupravu na bázi syntetických peptidů. Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, nebot by se používal jeden definovaný antigen a ne jejich směs, jak je to při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní, vzhledem ke genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění.
Látka podle vynálezu byla syntetizována způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečisti se.
Peptid obecného vzorce I byl připraven Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren sířovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N'z -aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc-skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo provedeno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku v DCM. Postranní funkční skupiny vicefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vicefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TRMSA ve směsi s TFA a thianisolem. Surový produkt byl čištěn bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptid byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a jeho čistota byla ověřena ohromatografickými a elektrofóretickými metodami.
Aminokyselinová sekvence peptidu obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence proteinu pl4 viru způsobujícího u lidi imunodeficienci (HIV) tak, aby zahrnovala antigenní determinanty zmíněného proteinu. Peptid může sloužit pro diagnostické účely, což , bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.
Základem diagnostické reakce je interakce syntetického peptidu podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetický peptid obecného vzorce I je určen pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci.proti virálnímu proteinu pl4, viru způsobujícímu u lidí imunodeficienci (HIV). Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. AO č. 256 960. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty absorbancí pro jednotlivá pozitivní séra, ředěná v poměru 1:100. Použitá séra byla pozitivní při testování v komerč ním ELISA testu, kde jako antigen byl použit HIV a byla též verifikována metodou Western blot. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a v hodnotách absorbance nepřevýšila hranici 0,1.
Tabulka 1
Hodnoty absorbancí pozitivních sér, ředěných v poměru 1:100
sérum č. 1 2 3 4 5 6 7 8
absorbance 0,49 0,63 0,77 0,79 1,31 0,71 1,46 1,50
sérum č. 9 10 11 12 13 14 15
absorbance 1,02 0,93 1,46 0,55 0,79 1,44 1,58
Peptid podle vynálezu je možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek proti proteinu pl4, směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou myší nebo králíků, peptidem obecného vzorce I, s výhodou ve směsi s muramyldipeptidem, kovalentně navázaným muramyldipeptidem na peptid obecného vzorce I nebo polymerizovaným glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetů, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldipeptid.
Po imunizaci myší peptidem obecného vzorce I s kovalentně navázaným muramyldipeptidem bylo prokázáno, že myší hybridomové linie produkovaly protilátky, které reagovaly s peptidem obecného vzorce I. V ELISA testu se absorbance pohybovala od 0,30 do 0,59. Reakce s kontrolním negativním sérem nepřevýšila hranici 0,1.
Získané výsledky ukazují, že peptid podle vynálezu je možno použít jako diagnostika a přichází v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.
Následující příklad provedení látku a způsob podle vynálezu pouze dokládá, ale nikterak neomezuje.
Příklad
Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,0 g benzhydrylaminové pryskyřice polystyrénové sítované 1 % divinylbenzenu. Syntéza zahrnovala 12 cyklů, sestávajících z následujících kroků:
(1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1x30 min;
(2) promývání, DCM, 6x1 min;
(3) promývání, 2-propanol, 2x1 min;
(4) promývání, DCM, 2x1 min;
(5) neutralizace, TEAsDCM (1:9), lxl min, 1x3 min;
(6) promývání, DCM, 6x1 min;
(7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridů (3násobný přebytek), do negativní reakce na aminoskupiny;
(8) promývání, DCM, 3x1 min.
V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Lys(BrZ), Boc-Trp(For), Boc-Pro, Boc-Glu(OBzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boo-Arg(Tos) a DCC v reakční nádobce, Boc-Pro, Boc-Asp(OBzl), Boc-Val, Boc-Pro, Boc-Glu(OBzl) a Boo-Met. První syntetický cyklus začínal krokem č. (4). Po ukončené syntéze bylo získáno 4,80 g peptidyl-pryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (0,5 g) odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny pomocí kapalného HF metodou low-high. Po odstranění HF byl produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 187 mg. Surový peptid (100 mg) byl čištěn na koloně (1x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze IN kyselina octová, průtok 7 ml/hod. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 11,7 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (Rf 0,35 v soustavě n-butanol:kyselina octová:voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.
Výtěžek: 74 mg H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-NHj
Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu
HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci
ARC komplex chorob příbuzných AIDS
ELISA enzymoimunologický test
HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie
TFA kyselina trifluoroctová
TFMSA kyselina triflurometansulfonová
HOBt N-hydroxybenztriazol
TEA trietylamin
Boc t-butyloxykarbonyl
Tos p-toluensulfonyl
Bzl benzyl
For formyl
DCC N,N'-dicyklohexylkarbodiimid
HF fluorovodík
Arg arginin
Asp asparagová kyselina
Glu glutamová kyselina
Leu leucin
Lys lysin
Met methionin
Pro prolin
Trp tryptofan
Val valin a

Claims (2)

  1. PREDMÉT VYNALEZU
    1. Peptid s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I,
    H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugát s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, špheronu a polystyrenu.
  2. 2. Způsob výroby peptidu obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím. Se se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.
CS871219A 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby CS258289B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS871219A CS258289B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS871219A CS258289B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS121987A1 CS121987A1 (en) 1987-11-12
CS258289B1 true CS258289B1 (cs) 1988-08-16

Family

ID=5346024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS871219A CS258289B1 (cs) 1987-02-24 1987-02-24 Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS258289B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS121987A1 (en) 1987-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1220420A (en) Method of determining antigenically active amino acid sequences
CS256960B1 (en) Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
IE64006B1 (en) Antigens particulary envelope antigens of the virus of lymphadenopathies and of the acquired immune-deficiency syndrome and virus process for producing virus envelope antigens use of said antigens in the preparation of immunogenic compositions or for the diagnosis of the presence of antibodies against this virus
WO1994005311A1 (en) Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
KR930004055B1 (ko) 펩티드 및 그의 용도
Foster et al. A new, improved technique for automated sequencing of non-polar peptides
JPH03503047A (ja) ポリマーおよびポリマー‐ペプチド複合体
US4761470A (en) Immunogenic synthetic peptide capable of eliciting herpes simplex virus neutralizing antibody
KANDA et al. Synthesis of polyamide supports for use in peptide synthesis and as peptide‐resin conjugates for antibody production
JP2598245B2 (ja) Htlv−iii/lavウイルス関連ペプチドに対する抗体
JP3851761B2 (ja) Hiv抗体を検出するための合成ペプチド及びその混合物
CA1270099A (en) Immunogenic hav peptides
DE69106141T2 (de) Non-a non-b sequenzen.
CA1157465A (en) Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation
CS258289B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby
DE69106998T2 (de) Mit Antikörper gegen Hepatitis-Virus non-A, non-B immunochemisch reagierende Peptide.
JP4258271B2 (ja) ポリアミノ酸担体
CS258290B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennlch determinant a způsob jeho výroby
CS258288B1 (cs) Peptid s vlastnostmi antigennich determinant a způsob jeho výroby
EP0595638B1 (en) Epitope-related peptides of human parvovirus
JPH05301889A (ja) 非a非b型ペプチド
DE69200512T2 (de) Mit Antikörper gegen Hepatitis non-A, non-B-Virus immunochemische reaktive Peptide.
CA2038030C (en) Synthetic peptides which contain sequences from factor viia, and the use thereof
CS277003B6 (cs) Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1
CS272926B1 (en) Peptides with properties of hpv-virus protein's antigen determinant and method of their production