CS258289B1 - Peptid s vlastnostmi antigennfch determinant a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Řešení se týká peptidu s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jeho konjugátu s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu. Peptid byl připraven syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že jej lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience (AIDS). Peptid přichází, dále v úvahu pro produkci monodetermínantních protilátek.

Description

Vynález se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I

H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I) , kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugátu s imunoadjuvantnlmi látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, spheronu a polystyrenu a způsobu jejich výroby.

Látka podle vynálezu je nová a byly u ní prokázány vlastnosti antigenních determinant proteinu pl4, což je bílkovinný produkt genu tat viru způsobujícího u lidí imunodeficienci (HIV). Může sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru způsobujícímu syndrom získané imunodeficience (AIDS) nebo komplex chorob příbuzných AIDS (ARC). Dále je potenciálně též použitelná pro produkci monodeterminantních protilátek.

V současné době se diagnostikuje syndrom získané imunodeficience (AIDS) přítomností protilátek proti viru HIV v krevním séru. Stanovení je prováděno za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, tj. virem HIV (inaktivovaným detergentem), jímž jsou ELISA destičky potaženy. Virus je získáván poměrně složitým postupem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové purifikován, než je ho možné použít k potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale hlavně vysoce nebezpečnou, nebot se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem. Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy k vyšetření onemocněni AIDS, vyráběné předními světovými výrobci. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzivní purifíkací některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to bud imunofluorescenci nebo tzv. metodou Western blot. V roce 1987 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HIV budou obsahovat jako antigen jen některé jeho strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryontním systému. Firma Biochrom již uvedla na trh bezpečnou diagnostickou soupravu na bázi syntetických peptidů. Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, nebot by se používal jeden definovaný antigen a ne jejich směs, jak je to při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní, vzhledem ke genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění.

Látka podle vynálezu byla syntetizována způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečisti se.

Peptid obecného vzorce I byl připraven Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren sířovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. N'^z -aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc-skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo provedeno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM nebo nasyceným roztokem chlorovodíku v DCM. Postranní funkční skupiny vicefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery. Po ukončené syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vicefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TRMSA ve směsi s TFA a thianisolem. Surový produkt byl čištěn bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetězci nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptid byl charakterizován aminokyselinovou analýzou a jeho čistota byla ověřena ohromatografickými a elektrofóretickými metodami.

Aminokyselinová sekvence peptidu obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence proteinu pl4 viru způsobujícího u lidi imunodeficienci (HIV) tak, aby zahrnovala antigenní determinanty zmíněného proteinu. Peptid může sloužit pro diagnostické účely, což , bylo prokázáno autory vynálezu a pro produkci monodeterminantních protilátek.

Základem diagnostické reakce je interakce syntetického peptidu podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetický peptid obecného vzorce I je určen pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci.proti virálnímu proteinu pl4, viru způsobujícímu u lidí imunodeficienci (HIV). Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. AO č. 256 960. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty absorbancí pro jednotlivá pozitivní séra, ředěná v poměru 1:100. Použitá séra byla pozitivní při testování v komerč ním ELISA testu, kde jako antigen byl použit HIV a byla též verifikována metodou Western blot. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a v hodnotách absorbance nepřevýšila hranici 0,1.

Tabulka 1

Hodnoty absorbancí pozitivních sér, ředěných v poměru 1:100

sérum č.	1	2	3	4	5	6	7	8
absorbance	0,49	0,63	0,77	0,79	1,31	0,71	1,46	1,50
sérum č.	9	10	11	12	13	14	15
absorbance	1,02	0,93	1,46	0,55	0,79	1,44	1,58

Peptid podle vynálezu je možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek proti proteinu pl4, směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou myší nebo králíků, peptidem obecného vzorce I, s výhodou ve směsi s muramyldipeptidem, kovalentně navázaným muramyldipeptidem na peptid obecného vzorce I nebo polymerizovaným glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetů, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldipeptid.

Po imunizaci myší peptidem obecného vzorce I s kovalentně navázaným muramyldipeptidem bylo prokázáno, že myší hybridomové linie produkovaly protilátky, které reagovaly s peptidem obecného vzorce I. V ELISA testu se absorbance pohybovala od 0,30 do 0,59. Reakce s kontrolním negativním sérem nepřevýšila hranici 0,1.

Získané výsledky ukazují, že peptid podle vynálezu je možno použít jako diagnostika a přichází v úvahu při produkci monodeterminantních protilátek.

Následující příklad provedení látku a způsob podle vynálezu pouze dokládá, ale nikterak neomezuje.

Příklad

Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,0 g benzhydrylaminové pryskyřice polystyrénové sítované 1 % divinylbenzenu. Syntéza zahrnovala 12 cyklů, sestávajících z následujících kroků:

(1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1x30 min;

(2) promývání, DCM, 6x1 min;

(3) promývání, 2-propanol, 2x1 min;

(4) promývání, DCM, 2x1 min;

(5) neutralizace, TEAsDCM (1:9), lxl min, 1x3 min;

(6) promývání, DCM, 6x1 min;

(7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridů (3násobný přebytek), do negativní reakce na aminoskupiny;

(8) promývání, DCM, 3x1 min.

V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Lys(BrZ), Boc-Trp(For), Boc-Pro, Boc-Glu(OBzl), Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boo-Arg(Tos) a DCC v reakční nádobce, Boc-Pro, Boc-Asp(OBzl), Boc-Val, Boc-Pro, Boc-Glu(OBzl) a Boo-Met. První syntetický cyklus začínal krokem č. (4). Po ukončené syntéze bylo získáno 4,80 g peptidyl-pryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (0,5 g) odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny pomocí kapalného HF metodou low-high. Po odstranění HF byl produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20% kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 187 mg. Surový peptid (100 mg) byl čištěn na koloně (1x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze IN kyselina octová, průtok 7 ml/hod. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 11,7 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (Rf 0,35 v soustavě n-butanol:kyselina octová:voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek: 74 mg H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-NHj

Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu

HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci

ARC komplex chorob příbuzných AIDS

ELISA enzymoimunologický test

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

TFA kyselina trifluoroctová

TFMSA kyselina triflurometansulfonová

HOBt N-hydroxybenztriazol

TEA trietylamin

Boc t-butyloxykarbonyl

Tos p-toluensulfonyl

Bzl benzyl

For formyl

DCC N,N'-dicyklohexylkarbodiimid

HF fluorovodík

Arg arginin

Asp asparagová kyselina

Glu glutamová kyselina

Leu leucin

Lys lysin

Met methionin

Pro prolin

Trp tryptofan

Val valin a

Claims (2)

1. PREDMÉT VYNALEZU

   1. Peptid s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I,

   H-Met-Glu-Pro-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-X (I), kde X značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou a jeho konjugát s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, zejména latexu, špheronu a polystyrenu.
2. 2. Způsob výroby peptidu obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím. Se se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.