CS277003B6 - Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1 obecného vzorce I. H-X-Asn-Y-Z (I) kde X značí Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg- -Ser-Ile-Arg-Leu-Val a Y značí Gly-Ser-Leu (Ia) nebo X značí Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro a Y značí Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb) nebo X značí Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro- -Asn-Asn (lc) a Y značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile nebo X značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp a Y značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id) nebo X značí Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp- -Ser (Ie) a Y značí Lys -Ser-Leu-Glu-Gln-Ile a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugátů s imunoadjuvantními látkami typu murymldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu nebo s některými aktivovanými membránami. Peptidy byly připraveny syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že je lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience. Popřípadě může být konjugát kteréhokoliv z peptidů s bílkovinným nosičem použit na přípravu monodeterminantních protilátek proti gp 160 HIV-1.

Description

Peptidy s vlastnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1

Oblast techniky

Vynález se týká peptidů s vlatnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1.

Dosavadní stav techniky

Peptidy podle vynálezu jsou nové a autory vynálezu byly u nich mimo jiné prokázány vlastnosti antigennich determinant glykoproteinu gp 160, což je bílkovinný produkt genu env viru HIV-1 způsobujícího u lidí onemocnění syndromem imunitní nedostatečnosti (AIDS).

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu spočívá v nových peptidech s vlastnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1 obecného vzorce I

H-X-Asn-Y-Z (I) kde X značí Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val a Y značí Fly-Ser-Leu(la), nebo X značí Gys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro a Y značí Pro-Gln-Glu-Val-Val(Ib), nebo X značí Ule-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn a Y značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), nebo X značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp a Y značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr(Id), nebo X značí Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser a Y značí Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile(le) a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugáty s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo mokromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu, nebo s některými aktivovanými membránami.

Peptidy obecného vzorce I byly připraveny Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren síťovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami p-methylbenzhydrylaminovými nebo chlormethylovými. N-«< -aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky s výhodou směsí TFA a DCM nebo HC1 v DCM, čs.autorské osvědčení č. 255 500). Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou HOBt estery. Kondenzace byly urychlovány v ultrazvukové lázni, jak je popsáno v čs. autorském osvědčení č. 271 584. Ukončení

CS 277003 B6 2 reakce bylo monitorováno barevnou změnou acidobazického indikátoru, s výhodou bromfenolovou modří podle čs. autorského osvědčení č. 268 230. Po ukončení syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF. Surový produkt byl čištěn bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptidy byly charakterizovány aminokyselinovou anylýzou a jejich čistota byla ověřena chromatografickými a elektroforetickými metodami.

Aminokyselinová sekvence peptidů obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence glykoproteinu gp 160 viru způsbujícího u lidí imunodeficienci HIV-1 tak, aby zahrnovala arttigenní determinanty zmíněného proteinu.

Základem diagnostické reakce, jejíž provedení blíže objasňuje například čs. autorského osvědčení č. 258 288, je interakce syntetických peptidů podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetické peptidy obecného vzorce I jsou určeny přo detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virovému glykoproteinu gp 160 viru HIV-1. Při praktickém použití lze s výhodou použít například enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. autorském osvědčení č. 256 960. Hodnoty absorbancí pro jednotlivá pozitivní séra, ředěná v poměru 1 . 20 až 100, byly významně vyšší ve srovnání s negativními séry. Použitá séra byla pozitivní při testování v komerčním ELISA testu, kde jako antigen byl použit lyzát HIV-1 a byla také verifikována metodou Western Blot. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a v hodnotách absorbance nepřevýšila v průměru hranici 0,15.

Peptidy podle vynálezu bylo možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek protiu glykoproteinu gp 160, a to polyklonálních nebo monoklonálnich, směřovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou myší nebo králíků, peptidy obecného vzorce I, s výhodou ve směsi s muramyldipeptidem, kovalentně navázaným muramyldipeptidem na peptidy obecného vzorce I nebo peptidy polymerizovánými glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetu, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili autoři vynálezu Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldipeptid.

Detekce protilátek byla provedena testem ElISA s peptidem obecného vzorce I zakotveným na plastikové polystyrénové destičce.’ Přenosný postup ELISA testu je popsán v čs. autorském osvědčení č. 256 960. Za použití vhodného anti-králičího nebo anti-myšího IgG značeného enzymem, s výhodou peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou, poskytovala získaná séra pozitivní reakci až do ředění 10”⁴ až 10“ .

Příklady provedení

Příklad 1

Do průtokového reaktoru (vnitřní objem 10 ml) bylo umístěno 400 mg p-methylbenzhydrylaminové kopoly (styren-1 % divinylbenz en)ové pryskyřice (MBHA, obsah aminoskupin 0,4 meg/g). Syntéza byla provedena na manuálně ovládaném syntetizátoru vlastní konstrukce (viz čs. autorské osvědčení č. 262 081) kontinuální průtokovou metodou (čs.autorské osvědčení č.255 089). N- << -aminoskupiny byly chráněny Boc skupinou, postranní řetězce vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Arg p-toluensulfonovou skupinou a .chráněné aminokyseliny byly aktivovány pro kondenzaci formou HOBt esteru. Jeden syntetický cyklus obsahoval tyto kroky:

1. štěpení Boc chránících skupin, 40 % TFA v DCM, 30 min (3 min promývat, 27 min v klidu),

2. promývání, DCM do slabě kyselého efluentu (kontrolováno navlhčeným pH papírkem),

3. neutralizace, 5 % N-ethyl-N, N-diisopropylaminu v chloroformu, 3 min,

4. promývání, DMF, do neutrálního efluentu,

5. kondenzace, chráněná aminokyselina, 0,8 meq v DCM (nebo DCM : DMF, 4:1, je-li třeba), přidat HOBt, 0,8 meq v DMF, přidat DCC, 0,8 meq v DCM, 30 min při 20°C, odfiltrovat . N,N-dicyklohexylmočovinu, promýt DCM, odpařit DCM za sníženého tlaku (t<25°C), naředit DMF,. zfiltrovat, promýt DMF, doplnit DMF na koncentraci 0,2 M, přidat několik kapek 0,001 M roztokuu bromfenolové modře v DMF (70 mg/100 ml), nastříknout do průtokového reaktoru, ponechat reagovat v ultrazvukové lázni do přechodu acidobazického indikátoru z modré do žluté barvy,

6. promývání, DMF, 5min.

Průtok běhen promývacích cyklů byl cca 20 až 30 ml/min, přetlak inertního plynu 20 až 50 kPa. Syntéza byla ukončena odštěpením Boc chránící skupiny z poslední aminokyseliny (krok /1/) a peptisyl-pryskyřice byla promyta DCM, metanelem a vysušena proududem dusíku. Výtěžek 920 mg. Surový peptid byl získán po štěpení peptidyl-pryskyřice kapalným fluorovodíkem. PO odstranění HF byl produkt a pryskyřice suspendovány v etylacetátu, zfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20 % kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 330 mg. Surový peptid byl čištěn na koloně (2,6x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polysmidový biogel. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek:

mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser-Leu-NH₂

Příklad 2

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ib. K chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-methylbenzylová skupina. Výtěžek peptidylpryskyřice 820 mg, výtěžek surového produktu 262 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 40 % MeOH, 60 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:l:l)a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek:

132,5 mg H-Cys-Val-Pro-ThrAsp-Pro-Asn-Pro-Gln-Glu-Val-Val-hn₂

Příklad 3

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ic. K chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-metylbenzylová skupina. Výtěžek peptid-pryskyřice 1 005 mg, výtěžek surového produktu 346 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami. Čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 6,0 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografii na tenké vrstvě (soustava n-butanol:kyselina octová:voda -4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek:

201 mg H-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-HN₂

Příklad 4

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Id. K chránění postranní funkce tryptofanu byla použita formylová skupina. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 945 mg, výtěžek surového produktu 401 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 7,5 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek: .

199 mg H-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr-NH₂

Příklad 5

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ie. K chránění postranní funkce tryptofanu byla použita formylová skupina. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 840 mg, výtěžek surového produktu 368 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC /Rt 7,5 min, mobilní fáze 55 % MeOH, 45 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek:

94,0 mg H-Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser-Asn-Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile-NH₂

Příklad 6

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid la. Jako polymerni nosič byl použit polystyren síťovaný 1 % divinylbenzenu finkcionalizovaný chlormethylovými skupinami (obsah Cl 0,8 meq/g). První chráněná aminokyselina Boc-Leu byla k nosiči připojena esterifikací pomocí KF. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 940 mg, výtěžek surového produktu 298 mg. Výsledný produit měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 8,5 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 45 % vody obsahující 0,1 %. TFA), chromatografii na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektrofáze na papíře při pH 2,5.

Výtěžek:

104 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser- Leu-OH

Příklad 7

K roztoku 10 mg peptidu la v 10 ml HC1 (pH 3,0) byl za míchání při 0°C přidán roztok 10 mg ECD v 10 ml HC1 (pH 3,0), směs ponechána 15 min při 0°c, potom byl přidán roztok 10 mg KLH v 0,1 M uhličitanovému pufru tak, aby výsledné pH bylo neutrální.Směs byla inkubována 2 h při 20°C, po této době byl za míchání přidán roztok 10 mg MDP v PBS pufru o pH 7,2 a směs byla inkubována 16 h při 8°C.Potom byla reakční směs dialyzována proti PBS, rozplněna po alikvotech na jednotlivé imunizační dávky a uchovávána při -20 °C. Aminokyselinovou analýzou konjugátu bylo zjištěno, že v průměru došlo k vazbě 30 molekul peptidu najednu molekulu bílkovinného nosiče. Při gelové chromatografii byl pozorován charakteristický rozptyl mol.vah od 5 000 do 30 000

Příklad 8

Peptidy la až le podle vynálezu byly potaženy jamky polystyrénových destiček ELISA. Potom byly do jamek odpipetována vhodně naředěná séra ( v tomto případě 1:20) ředicím roztokem, obsahujícím blokujícíindiferentní bílkovinu, obvykle hovězí sérový albumin v koncentraci 2 až 5 % hmot. Po inkubaci 15 minut při 37 °C byly vzorky sér z jamek odsáty, jamky byly 4 x promyty fosfátovým pufrem pH 7,2 s 0,05 % hmot, neionogenního detergentu, například Tweenu 20. Potom byl do jamky adpipetován vhodně naředěný roztok konjugátu prasečího protilidského y -globulinu s křenovou peroxidázou. Inkubace byla 15 minut při 37 °C. Potom byly jamky 4x promyty a byl do nich odpipetován roztok chromogenu, například o-fenylendiaminu. Vyvolání barevné reakce proběhlo za 5 až 7 minut. Reakce byla zastavena přidáním 2N Η$80₄ a intensita zabarvení byla odečtena při 490 nm. Byla používaná negativní séra dárců krve a positivní séra na přítomnost protilátek proti HIV 1, ověřená testy například Wellcome a Western blot).

Absorbance (490 nm)	Negativní séra	Positivní	séra
β β* »» ·» «» «··»«*<»			β β «β «·Β β β β ® β» β. «
Peptid
la	0,107	0,079	0,615	0,524
	0,102	0,062	0,676	0,489
lb	0,080	0,160	0,811	0,850
	0,079	0,157	0,725	0,784
Ic	0,086	0,157	0,903	0,574
	0,097	0,174	0,880	0,588
Id	0,104	0,211	0,905	0,666
	0,106	0,170	0,934	0,779
Ie	0,288	0,092	0,886	0,923
	0,214	0,097	0,928	0,927

Průmyslová využitelnost

Peptidy podle vynálezu mají vlastnosti intigenních determinant glykoproteinu gp 160, což je bílkovinný produkt genu eno viru HIV-1, který způsobuje uý lidí onemocnění syndromem imunitní nedostatečnosti(AIDS). Dále mohou dobře sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru HIV a navíc jsou použitelné pro produkci monodeterminantních protilátek.

Vysvětlivky ke zkratkám použitých v textu:

HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci ARC komplex chorob příbuzných AIDS AIDS syndrom získané imunodeficiens

ELISA enzymoimunologický test

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

TFA kyselina trifluoroctová

DCM dichlormetan

DMF N,N-dimethylformamid

HOBt N-hydroxybenzotriazol

Boc t-butyloxykarbonyl

Tos p-toluensulfonyl

Bzl benzyl

For formyl

DIEA ethyl-diisopropylamin

MeOh methanol

DCC N,N -dicyklohexylkarbodiimid

HF fluorovodík

Arg arginin

Asp kyselina asparágová

Ί

CS 277003 Β6

Asn Cys Gin Gly Glu lie igG Leu Lys Met Pro Ser Thr Trp Val ECD	asparagin cystein glutamin glycin kyselina glutámová. isoleucin imunoglobulin G leucin lysin methionin prolin serin threónin tryptofan val in N-ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid
KLH MDP PBS	hemocyanin keyhole limpetui murymyldipeptid fosforečný pufr.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1, obecného vzorce I

   H-X-Asn-Y-Z (I) kde X a Y značí Gly-Glu-Arg-Asp-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val značí Gly-Ser-Leu (la), nebo X a Y značí Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro značí Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb), nebo X a Y značí Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), nebo X a Y značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id), nebo X a Y značí Val-Ori-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser značí Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile (le), a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugáty s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu nebo s některými aktivovanými membránami.