CS277003B6 - Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product - Google Patents

Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product Download PDF

Info

Publication number
CS277003B6
CS277003B6 CS881386A CS138688A CS277003B6 CS 277003 B6 CS277003 B6 CS 277003B6 CS 881386 A CS881386 A CS 881386A CS 138688 A CS138688 A CS 138688A CS 277003 B6 CS277003 B6 CS 277003B6
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
arg
denotes
ser
asn
val
Prior art date
Application number
CS881386A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CS138688A3 (en
Inventor
Viktor Rndr Csc Krchnak
Josef Ing Vagner
Otakar Rndr Csc Mach
Original Assignee
Leciva
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leciva filed Critical Leciva
Priority to CS881386A priority Critical patent/CS277003B6/en
Publication of CS138688A3 publication Critical patent/CS138688A3/en
Publication of CS277003B6 publication Critical patent/CS277003B6/en

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Řešení se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1 obecného vzorce I. H-X-Asn-Y-Z (I) kde X značí Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg- -Ser-Ile-Arg-Leu-Val a Y značí Gly-Ser-Leu (Ia) nebo X značí Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro a Y značí Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb) nebo X značí Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro- -Asn-Asn (lc) a Y značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile nebo X značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp a Y značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id) nebo X značí Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp- -Ser (Ie) a Y značí Lys -Ser-Leu-Glu-Gln-Ile a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugátů s imunoadjuvantními látkami typu murymldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu nebo s některými aktivovanými membránami. Peptidy byly připraveny syntézou v pevné fázi a bylo prokázáno, že je lze použít jako diagnostikům při detekci protilátek proti viru způsobujícímu u lidí syndrom získané imunodeficience. Popřípadě může být konjugát kteréhokoliv z peptidů s bílkovinným nosičem použit na přípravu monodeterminantních protilátek proti gp 160 HIV-1.The solution relates to peptides with the properties of antigenic determinants of the protein product of the HIV-1 env gene of the general formula I. H-X-Asn-Y-Z (I) where X denotes Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg- -Ser-Ile-Arg-Leu-Val and Y denotes Gly-Ser-Leu (Ia) or X denotes Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro and Y denotes Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb) or X denotes Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro- -Asn-Asn (lc) and Y denotes Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile or X denotes Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp and Y denotes Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id) or X denotes Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp- -Ser (Ie) and Y denotes Lys -Ser-Leu-Glu-Gln-Ile and Z represents a hydroxyl or amino group, and their conjugates with immunoadjuvant substances of the muryl dipeptide type, with carriers of the protein type or macromolecular polymers, for example latex, spheron and polystyrene or with some activated membranes. The peptides were prepared by solid phase synthesis and have been shown to be useful as diagnostics in the detection of antibodies against the virus causing acquired immunodeficiency syndrome in humans. Alternatively, a conjugate of any of the peptides with a protein carrier can be used to prepare monodeterminant antibodies against gp 160 HIV-1.

Description

Peptidy s vlastnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1Peptides with the properties of antigenic determinants of the protein product of the HIV-1 env gene

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká peptidů s vlatnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1.The invention relates to peptides with properties of antigenic determinants of the protein product of the HIV-1 env gene.

Dosavadní stav technikyPrior art

Peptidy podle vynálezu jsou nové a autory vynálezu byly u nich mimo jiné prokázány vlastnosti antigennich determinant glykoproteinu gp 160, což je bílkovinný produkt genu env viru HIV-1 způsobujícího u lidí onemocnění syndromem imunitní nedostatečnosti (AIDS).The peptides according to the invention are new and have shown, inter alia, the properties of the antigenic determinants of the glycoprotein gp160, a protein product of the env gene of the HIV-1 virus causing immunodeficiency syndrome (AIDS) in humans.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Podstata vynálezu spočívá v nových peptidech s vlastnostmi antigennich determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1 obecného vzorce IThe invention relates to novel peptides with the properties of antigenic determinants of the protein product of the env gene of the HIV-1 virus of the general formula I

H-X-Asn-Y-Z (I) kde X značí Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val a Y značí Fly-Ser-Leu(la), nebo X značí Gys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro a Y značí Pro-Gln-Glu-Val-Val(Ib), nebo X značí Ule-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn a Y značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), nebo X značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp a Y značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr(Id), nebo X značí Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser a Y značí Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile(le) a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugáty s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu, s nosiči typu bílkovin nebo mokromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu, nebo s některými aktivovanými membránami.HX-Asn-YZ (I) where X is Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val and Y is Fly-Ser-Leu (Ia), or X is Gys -Val-Pro-Thr-Asp-Pro and Y denotes Pro-Gln-Glu-Val-Val (Ib), or X denotes Ule-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn and Y denotes Thr-Arg -Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), or X denotes Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp and Y denotes Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id), or X denotes Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser and Y denotes Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile (le) and Z denotes a hydroxyl or amine group, and their conjugates with muramyl dipeptide-type immunoadjuvants, with carriers of the type of proteins or wet-molecular polymers, for example latex, spheron and polystyrene, or with some activated membranes.

Peptidy obecného vzorce I byly připraveny Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren síťovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami p-methylbenzhydrylaminovými nebo chlormethylovými. N-«< -aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chránící skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky s výhodou směsí TFA a DCM nebo HC1 v DCM, čs.autorské osvědčení č. 255 500). Postranní funkční skupiny vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou HOBt estery. Kondenzace byly urychlovány v ultrazvukové lázni, jak je popsáno v čs. autorském osvědčení č. 271 584. UkončeníThe peptides of formula I were prepared by the Merrifield solid phase peptide synthesis method. Divinylbenzene crosslinked polystyrene, preferably one percent, with p-methylbenzhydrylamine or chloromethyl functional groups was used as the polymeric support. The N-amino groups were protected by an acid-labile protecting group, preferably a Boc group, its cleavage in the individual stages of the synthesis was carried out acidolytically, preferably with a mixture of TFA and DCM or HCl in DCM, U.S. Pat. The side functional groups of the multifunctional amino acids were protected with benzyl-type groups. Condensations of protected amino acids were performed with appropriately activated derivatives, preferably HOBt esters. Condensations were accelerated in an ultrasonic bath as described in MS. copyright certificate No. 271 584. Termination

CS 277003 B6 2 reakce bylo monitorováno barevnou změnou acidobazického indikátoru, s výhodou bromfenolovou modří podle čs. autorského osvědčení č. 268 230. Po ukončení syntéze byl peptid z pryskyřice odštěpen a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF. Surový produkt byl čištěn bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptidy byly charakterizovány aminokyselinovou anylýzou a jejich čistota byla ověřena chromatografickými a elektroforetickými metodami.CS 277003 B6 2 reaction was monitored by color change of acid-base indicator, preferably bromophenol blue according to MS. No. 268,230. Upon completion of the synthesis, the peptide was cleaved from the resin and the protecting groups of the multifunctional amino acids were removed acidolytically, preferably by the action of liquid HF. The crude product was purified either by column chromatography on supports used in peptide chemistry, preferably carriers acting as molecular sieves. The peptides were characterized by amino acid analysis and their purity was verified by chromatographic and electrophoretic methods.

Aminokyselinová sekvence peptidů obecného vzorce I byla odvozena z aminokyselinové sekvence glykoproteinu gp 160 viru způsbujícího u lidí imunodeficienci HIV-1 tak, aby zahrnovala arttigenní determinanty zmíněného proteinu.The amino acid sequence of the peptides of formula I was derived from the amino acid sequence of the gp160 glycoprotein of the virus causing HIV-1 immunodeficiency in humans to include the artigenic determinants of said protein.

Základem diagnostické reakce, jejíž provedení blíže objasňuje například čs. autorského osvědčení č. 258 288, je interakce syntetických peptidů podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetické peptidy obecného vzorce I jsou určeny přo detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virovému glykoproteinu gp 160 viru HIV-1. Při praktickém použití lze s výhodou použít například enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, jak již bylo popsáno v čs. autorském osvědčení č. 256 960. Hodnoty absorbancí pro jednotlivá pozitivní séra, ředěná v poměru 1 . 20 až 100, byly významně vyšší ve srovnání s negativními séry. Použitá séra byla pozitivní při testování v komerčním ELISA testu, kde jako antigen byl použit lyzát HIV-1 a byla také verifikována metodou Western Blot. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí a v hodnotách absorbance nepřevýšila v průměru hranici 0,15.The basis of the diagnostic reaction, the implementation of which is explained in more detail, for example, Czechoslovakia. No. 258,288, is the interaction of the synthetic peptides of the invention with antibodies produced in an organism that has been infected with a virus. The synthetic peptides of formula I are intended for the detection of antibodies produced by infected individuals against the viral glycoprotein gp160 of HIV-1. In practical use, for example, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be advantageously used, which has been carried out by the inventors as already described in U.S. Pat. author's certificate No. 256 960. Absorbance values for individual positive sera, diluted in a ratio of 1. 20 to 100, were significantly higher compared to negative sera. The sera used were positive when tested in a commercial ELISA assay using HIV-1 lysate as antigen and also verified by Western Blot. The reaction with the control negative serum was at the background level and did not exceed the average of 0.15 in absorbance values.

Peptidy podle vynálezu bylo možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek protiu glykoproteinu gp 160, a to polyklonálních nebo monoklonálnich, směřovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna. Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou myší nebo králíků, peptidy obecného vzorce I, s výhodou ve směsi s muramyldipeptidem, kovalentně navázaným muramyldipeptidem na peptidy obecného vzorce I nebo peptidy polymerizovánými glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský serumalbumin, thyreoglobulin nebo hemocyanin z keyhole limpetu, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili autoři vynálezu Freundovo kompletní adjuvans nebo muramyldipeptid.The peptides of the invention could further be used to produce monodeterminant antibodies to the gp160 glycoprotein, whether polyclonal or monoclonal, directed against an antigenic determinant comprising the peptide to be immunized. The inventors immunized experimental animals, preferably mice or rabbits, with peptides of formula I, preferably in admixture with muramyl dipeptide, covalently linked muramyl dipeptide to peptides of formula I or peptides polymerized by glutaraldehyde or active ester method or after binding to a suitable protein, preferably bovine serum albumin, thyroglobulin or hemocyanin from keyhole limpet, using a condensing agent, preferably glutaraldehyde, carbodiimide, bifunctional reagents or active esters. The inventors used Freund's complete adjuvant or muramyl dipeptide as the immunoadjuvant.

Detekce protilátek byla provedena testem ElISA s peptidem obecného vzorce I zakotveným na plastikové polystyrénové destičce.’ Přenosný postup ELISA testu je popsán v čs. autorském osvědčení č. 256 960. Za použití vhodného anti-králičího nebo anti-myšího IgG značeného enzymem, s výhodou peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou, poskytovala získaná séra pozitivní reakci až do ředění 10”4 až 10“ .Detection of antibodies was performed by an ELISA assay with a peptide of formula I anchored on a plastic polystyrene plate. The portable procedure of the ELISA test is described in MS. Author's Certificate no. 256 960. Using the appropriate anti-rabbit or anti-mouse IgG labeled with an enzyme, preferably a peroxidase or alkaline phosphatase, the resulting sera gave positive reaction up to a dilution of 10 "4-10".

Příklady provedeníExemplary embodiments

Příklad 1Example 1

Do průtokového reaktoru (vnitřní objem 10 ml) bylo umístěno 400 mg p-methylbenzhydrylaminové kopoly (styren-1 % divinylbenz en)ové pryskyřice (MBHA, obsah aminoskupin 0,4 meg/g). Syntéza byla provedena na manuálně ovládaném syntetizátoru vlastní konstrukce (viz čs. autorské osvědčení č. 262 081) kontinuální průtokovou metodou (čs.autorské osvědčení č.255 089). N- << -aminoskupiny byly chráněny Boc skupinou, postranní řetězce vícefunkčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Arg p-toluensulfonovou skupinou a .chráněné aminokyseliny byly aktivovány pro kondenzaci formou HOBt esteru. Jeden syntetický cyklus obsahoval tyto kroky:400 mg of p-methylbenzhydrylamine copoly (styrene-1% divinylbenzene) resin (MBHA, amino group content 0.4 meg / g) was placed in a flow reactor (internal volume 10 ml). The synthesis was performed on a manually operated synthesizer of our own design (see Czechoslovak author's certificate No. 262 081) by a continuous flow method (Czechoslovak author's certificate No. 255 089). The N- << -amino groups were protected by a Boc group, the side chains of the multifunctional amino acids were protected by benzyl-type groups. Arg p-toluenesulfone and protected amino acids were activated for HOBt ester condensation. One synthetic cycle included the following steps:

1. štěpení Boc chránících skupin, 40 % TFA v DCM, 30 min (3 min promývat, 27 min v klidu),1. cleavage of Boc protecting groups, 40% TFA in DCM, 30 min (3 min wash, 27 min at rest),

2. promývání, DCM do slabě kyselého efluentu (kontrolováno navlhčeným pH papírkem),2. washing, DCM into weakly acidic effluent (controlled with moistened pH paper),

3. neutralizace, 5 % N-ethyl-N, N-diisopropylaminu v chloroformu, 3 min,3. neutralization, 5% N-ethyl-N, N-diisopropylamine in chloroform, 3 min,

4. promývání, DMF, do neutrálního efluentu,4. wash, DMF, to neutral effluent,

5. kondenzace, chráněná aminokyselina, 0,8 meq v DCM (nebo DCM : DMF, 4:1, je-li třeba), přidat HOBt, 0,8 meq v DMF, přidat DCC, 0,8 meq v DCM, 30 min při 20°C, odfiltrovat . N,N-dicyklohexylmočovinu, promýt DCM, odpařit DCM za sníženého tlaku (t<25°C), naředit DMF,. zfiltrovat, promýt DMF, doplnit DMF na koncentraci 0,2 M, přidat několik kapek 0,001 M roztokuu bromfenolové modře v DMF (70 mg/100 ml), nastříknout do průtokového reaktoru, ponechat reagovat v ultrazvukové lázni do přechodu acidobazického indikátoru z modré do žluté barvy,5. condensation, protected amino acid, 0.8 meq in DCM (or DCM: DMF, 4: 1, if necessary), add HOBt, 0.8 meq in DMF, add DCC, 0.8 meq in DCM, 30 min at 20 ° C, filter. N, N-dicyclohexylurea, wash with DCM, evaporate with DCM under reduced pressure (t <25 ° C), dilute with DMF. filter, wash with DMF, make up to 0.2 M with DMF, add a few drops of a 0.001 M solution of bromophenol blue in DMF (70 mg / 100 ml), inject into a flow reactor, allow to react in an ultrasonic bath until the acid-base indicator changes from blue to yellow colors,

6. promývání, DMF, 5min.6. wash, DMF, 5min.

Průtok běhen promývacích cyklů byl cca 20 až 30 ml/min, přetlak inertního plynu 20 až 50 kPa. Syntéza byla ukončena odštěpením Boc chránící skupiny z poslední aminokyseliny (krok /1/) a peptisyl-pryskyřice byla promyta DCM, metanelem a vysušena proududem dusíku. Výtěžek 920 mg. Surový peptid byl získán po štěpení peptidyl-pryskyřice kapalným fluorovodíkem. PO odstranění HF byl produkt a pryskyřice suspendovány v etylacetátu, zfiltrovány, promyty etylacetátem a produkt extrahován do 20 % kyseliny octové a lyofilizován. Výtěžek 330 mg. Surový peptid byl čištěn na koloně (2,6x100 cm) obsahující jako stacionární fázi polysmidový biogel. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytické HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 50 % MeOH, 50 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.The flow rate during the washing cycles was about 20 to 30 ml / min, the inert gas overpressure 20 to 50 kPa. The synthesis was terminated by cleavage of the Boc protecting group from the last amino acid (step (1)) and the peptisyl resin was washed with DCM, methanol and dried under a stream of nitrogen. Yield 920 mg. The crude peptide was obtained after cleavage of the peptidyl resin with liquid hydrogen fluoride. After removal of HF, the product and resin were suspended in ethyl acetate, filtered, washed with ethyl acetate and the product extracted into 20% acetic acid and lyophilized. Yield 330 mg. The crude peptide was purified on a column (2.6 x 100 cm) containing a polysmide biogel as stationary phase. Fractions containing homogeneous product were pooled and lyophilized. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values, the purity of the product was confirmed by analytical HPLC (Rt 4.5 min, mobile phase 50% MeOH, 50% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol system : acetic acid: water - 4: 1: 1) and electrophoresis on paper at pH 2.5.

Výtěžek:Yield:

mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser-Leu-NH2 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser-Leu-NH 2

Příklad 2Example 2

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ib. K chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-methylbenzylová skupina. Výtěžek peptidylpryskyřice 820 mg, výtěžek surového produktu 262 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 4,5 min, mobilní fáze 40 % MeOH, 60 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:l:l)a elektroforéze na papíře při pH 2,5.Following the procedure described in Example 1, peptide Ib was synthesized. A p-methylbenzyl group was used to protect the cysteine side group. Yield of peptidyl resin 820 mg, yield of crude product 262 mg. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values, the purity of the product was confirmed by analytical HPLC (Rt 4.5 min, mobile phase 40% MeOH, 60% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol system: acetic acid: water - 4: 1: 1) and electrophoresis on paper at pH 2.5.

Výtěžek:Yield:

132,5 mg H-Cys-Val-Pro-ThrAsp-Pro-Asn-Pro-Gln-Glu-Val-Val-hn2 132.5 mg H-Cys-Val-Pro-ThrAsp-Pro-Asn-Pro-Gln-Glu-Val-Val-hn 2

Příklad 3Example 3

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ic. K chránění postranní skupiny cysteinu byla použita p-metylbenzylová skupina. Výtěžek peptid-pryskyřice 1 005 mg, výtěžek surového produktu 346 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami. Čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 6,0 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografii na tenké vrstvě (soustava n-butanol:kyselina octová:voda -4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.Following the procedure described in Example 1, peptide Ic was synthesized. A p-methylbenzyl group was used to protect the cysteine side group. Yield of peptide-resin 1 005 mg, yield of crude product 346 mg. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values. The purity of the product was confirmed by analytical HPLC (Rt 6.0 min, mobile phase 45% MeOH, 55% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol: acetic acid: water -4: 1: 1 ) and paper electrophoresis at pH 2.5.

Výtěžek:Yield:

201 mg H-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-HN2 201 mg H-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-HN 2

Příklad 4Example 4

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Id. K chránění postranní funkce tryptofanu byla použita formylová skupina. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 945 mg, výtěžek surového produktu 401 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 7,5 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 55 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol : kyselina octová : voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.Following the procedure described in Example 1, peptide Id was synthesized. A formyl group was used to protect the side function of tryptophan. Yield of peptidyl resin 945 mg, yield of crude product 401 mg. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values, the purity of the product was confirmed by analytical HPLC (Rt 7.5 min, mobile phase 45% MeOH, 55% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol system: acetic acid: water - 4: 1: 1) and electrophoresis on paper at pH 2.5.

Výtěžek: .Yield:.

199 mg H-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr-NH2 199 mg H-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr-NH 2

Příklad 5Example 5

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid Ie. K chránění postranní funkce tryptofanu byla použita formylová skupina. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 840 mg, výtěžek surového produktu 368 mg. Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC /Rt 7,5 min, mobilní fáze 55 % MeOH, 45 % vody obsahující 0,1 % TFA), chromatografií na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektroforéze na papíře při pH 2,5.Following the procedure described in Example 1, peptide Ie was synthesized. A formyl group was used to protect the side function of tryptophan. Yield of peptidyl resin 840 mg, yield of crude product 368 mg. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values, the purity of the product was confirmed by analytical HPLC / Rt 7.5 min, mobile phase 55% MeOH, 45% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol system: acetic acid: water - 4: 1: 1) and electrophoresis on paper at pH 2.5.

Výtěžek:Yield:

94,0 mg H-Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser-Asn-Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile-NH2 94.0 mg H-Val-Pro-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser-Asn-Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile-NH 2

Příklad 6Example 6

Podle postupu, který je uveden v příkladu 1, byl syntetizován peptid la. Jako polymerni nosič byl použit polystyren síťovaný 1 % divinylbenzenu finkcionalizovaný chlormethylovými skupinami (obsah Cl 0,8 meq/g). První chráněná aminokyselina Boc-Leu byla k nosiči připojena esterifikací pomocí KF. Výtěžek peptidyl-pryskyřice 940 mg, výtěžek surového produktu 298 mg. Výsledný produit měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena analytickou HPLC (Rt 8,5 min, mobilní fáze 45 % MeOH, 45 % vody obsahující 0,1 %. TFA), chromatografii na tenké vrstvě (soustava n-butanol: kyselina octová: voda - 4:1:1) a elektrofáze na papíře při pH 2,5.Following the procedure described in Example 1, peptide Ia was synthesized. Polystyrene crosslinked with 1% divinylbenzene functionalized with chloromethyl groups (Cl content 0.8 meq / g) was used as polymer carrier. The first protected amino acid Boc-Leu was attached to the support by esterification with KF. Yield of peptidyl resin 940 mg, yield of crude product 298 mg. The resulting product had an amino acid analysis identical to the theoretical values, the purity of the product was confirmed by analytical HPLC (Rt 8.5 min, mobile phase 45% MeOH, 45% water containing 0.1% TFA), thin layer chromatography (n-butanol system : acetic acid: water - 4: 1: 1) and electrophase on paper at pH 2.5.

Výtěžek:Yield:

104 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser- Leu-OH104 mg H-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val-Asn-Gly-Ser-Leu-OH

Příklad 7Example 7

K roztoku 10 mg peptidu la v 10 ml HC1 (pH 3,0) byl za míchání při 0°C přidán roztok 10 mg ECD v 10 ml HC1 (pH 3,0), směs ponechána 15 min při 0°c, potom byl přidán roztok 10 mg KLH v 0,1 M uhličitanovému pufru tak, aby výsledné pH bylo neutrální.Směs byla inkubována 2 h při 20°C, po této době byl za míchání přidán roztok 10 mg MDP v PBS pufru o pH 7,2 a směs byla inkubována 16 h při 8°C.Potom byla reakční směs dialyzována proti PBS, rozplněna po alikvotech na jednotlivé imunizační dávky a uchovávána při -20 °C. Aminokyselinovou analýzou konjugátu bylo zjištěno, že v průměru došlo k vazbě 30 molekul peptidu najednu molekulu bílkovinného nosiče. Při gelové chromatografii byl pozorován charakteristický rozptyl mol.vah od 5 000 do 30 000To a solution of 10 mg of peptide Ia in 10 ml of HCl (pH 3.0) was added a solution of 10 mg of ECD in 10 ml of HCl (pH 3.0) with stirring at 0 ° C, the mixture was left for 15 min at 0 ° C, then a solution of 10 mg KLH in 0.1 M carbonate buffer was added so that the resulting pH was neutral. The mixture was incubated for 2 h at 20 ° C, after which time a solution of 10 mg MDP in PBS buffer pH 7.2 was added with stirring, and the mixture was incubated for 16 h at 8 ° C. The reaction mixture was then dialyzed against PBS, aliquoted into individual immunization doses and stored at -20 ° C. Amino acid analysis of the conjugate revealed that an average of 30 peptide molecules bound per molecule of protein carrier. A characteristic scattering of molecular weights from 5,000 to 30,000 was observed in gel permeation chromatography

Příklad 8Example 8

Peptidy la až le podle vynálezu byly potaženy jamky polystyrénových destiček ELISA. Potom byly do jamek odpipetována vhodně naředěná séra ( v tomto případě 1:20) ředicím roztokem, obsahujícím blokujícíindiferentní bílkovinu, obvykle hovězí sérový albumin v koncentraci 2 až 5 % hmot. Po inkubaci 15 minut při 37 °C byly vzorky sér z jamek odsáty, jamky byly 4 x promyty fosfátovým pufrem pH 7,2 s 0,05 % hmot, neionogenního detergentu, například Tweenu 20. Potom byl do jamky adpipetován vhodně naředěný roztok konjugátu prasečího protilidského y -globulinu s křenovou peroxidázou. Inkubace byla 15 minut při 37 °C. Potom byly jamky 4x promyty a byl do nich odpipetován roztok chromogenu, například o-fenylendiaminu. Vyvolání barevné reakce proběhlo za 5 až 7 minut. Reakce byla zastavena přidáním 2N Η$804 a intensita zabarvení byla odečtena při 490 nm. Byla používaná negativní séra dárců krve a positivní séra na přítomnost protilátek proti HIV 1, ověřená testy například Wellcome a Western blot).Peptides Ia to Ie of the invention were coated on wells of polystyrene ELISA plates. Appropriately diluted sera (in this case 1:20) were then pipetted into the wells with a diluent solution containing a blocking indifferent protein, usually bovine serum albumin at a concentration of 2 to 5% by weight. After incubation for 15 minutes at 37 ° C, serum samples were aspirated from the wells, washed 4 times with phosphate buffer pH 7.2 with 0.05% by weight, a nonionic detergent such as Tween 20. An appropriately diluted porcine conjugate solution was then pipetted into the well. horseradish peroxidase anti-human γ-globulin. Incubation was for 15 minutes at 37 ° C. The wells were then washed 4 times and a solution of a chromogen, such as o-phenylenediamine, was pipetted into them. The color reaction was induced in 5 to 7 minutes. The reaction was stopped by the addition of 2N Η $ 80 4 and the color intensity was read at 490 nm. Negative sera from blood donors and positive sera for the presence of antibodies to HIV 1 have been used, verified by tests such as Wellcome and Western blot).

Absorbance (490 nm) Absorbance (490 nm) Negativní séra Negative sera Positivní Positive séra serum β β* »» ·» «» «··»«*<» β β * »» · »« »« ·· »« * <» β β «β «·Β β β β ® β» β. « β β «β« · Β β β β ® β »β. « Peptid Peptide la la 0,107 0.107 0,079 0.079 0,615 0.615 0,524 0.524 0,102 0.102 0,062 0.062 0,676 0.676 0,489 0.489 lb lb 0,080 0.080 0,160 0.160 0,811 0.811 0,850 0.850 0,079 0.079 0,157 0.157 0,725 0.725 0,784 0.784 Ic Ic 0,086 0.086 0,157 0.157 0,903 0.903 0,574 0.574 0,097 0.097 0,174 0.174 0,880 0.880 0,588 0.588 Id Id 0,104 0.104 0,211 0.211 0,905 0.905 0,666 0.666 0,106 0.106 0,170 0.170 0,934 0.934 0,779 0.779 Ie Ie 0,288 0.288 0,092 0.092 0,886 0.886 0,923 0.923 0,214 0.214 0,097 0.097 0,928 0.928 0,927 0.927

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Peptidy podle vynálezu mají vlastnosti intigenních determinant glykoproteinu gp 160, což je bílkovinný produkt genu eno viru HIV-1, který způsobuje uý lidí onemocnění syndromem imunitní nedostatečnosti(AIDS). Dále mohou dobře sloužit jako vhodné diagnostikům k detekci protilátek proti viru HIV a navíc jsou použitelné pro produkci monodeterminantních protilátek.The peptides of the invention have the properties of the intigenic determinants of the glycoprotein gp160, a protein product of the eno gene of the HIV-1 virus, which causes immunodeficiency syndrome (AIDS) in humans. In addition, they may well serve as suitable diagnostics for the detection of antibodies to HIV and, in addition, are useful for the production of monodeterminant antibodies.

Vysvětlivky ke zkratkám použitých v textu:Explanations of abbreviations used in the text:

HIV virus způsobující u lidí imunodeficienci ARC komplex chorob příbuzných AIDS AIDS syndrom získané imunodeficiensHIV virus causing immunodeficiency in humans ARC complex of AIDS-related diseases AIDS syndrome acquired immunodeficiency

ELISA enzymoimunologický testELISA enzyme immunoassay

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografieHPLC high performance liquid chromatography

TFA kyselina trifluoroctováTFA trifluoroacetic acid

DCM dichlormetanDCM dichloromethane

DMF N,N-dimethylformamidDMF N, N-dimethylformamide

HOBt N-hydroxybenzotriazolHOBt N-hydroxybenzotriazole

Boc t-butyloxykarbonylBoc t-butyloxycarbonyl

Tos p-toluensulfonylTos p-toluenesulfonyl

Bzl benzylBzl benzyl

For formylFor formyl

DIEA ethyl-diisopropylaminDIEA ethyl-diisopropylamine

MeOh methanolMeOh methanol

DCC N,N -dicyklohexylkarbodiimidDCC N, N-dicyclohexylcarbodiimide

HF fluorovodíkHF hydrogen fluoride

Arg argininArg arginine

Asp kyselina asparágováAsp aspartic acid

ΊΊ

CS 277003 Β6CS 277003 Β6

Asn Cys Gin Gly Glu lie igG Leu Lys Met Pro Ser Thr Trp Val ECD Asn Cys Gin Gly Glu lie igG Leu Lys Met Pro Ser Thr Trp Val ECD asparagin cystein glutamin glycin kyselina glutámová. isoleucin imunoglobulin G leucin lysin methionin prolin serin threónin tryptofan val in N-ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid hydrochlorid asparagine cysteine glutamine glycine glutamic acid. isoleucine immunoglobulin G leucine lysine methionine proline serine threonine tryptophan val in N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride KLH MDP PBS KLH MDP PBS hemocyanin keyhole limpetui murymyldipeptid fosforečný pufr. hemocyanin keyhole limpetui murymyldipeptide phosphoric buffer.

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims (1)

Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant bílkovinného produktu genu env viru HIV-1, obecného vzorce IPeptides with the properties of antigenic determinants of the protein product of the env gene of the HIV-1 virus, of general formula I. H-X-Asn-Y-Z (I) kde X a Y značí Gly-Glu-Arg-Asp-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val značí Gly-Ser-Leu (la), nebo X a Y značí Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro značí Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb), nebo X a Y značí Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn značí Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), nebo X a Y značí Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp značí Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id), nebo X a Y značí Val-Ori-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser značí Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile (le), a Z značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a jejich konjugáty s imunoadjuvantními látkami typu muramyldipeptidu s nosiči typu bílkovin nebo makromolekulárních polymerů, například latexu, spheronu a polystyrenu nebo s některými aktivovanými membránami.H-X-Asn-Y-Z (I) where X and Y denotes Gly-Glu-Arg-Asp-Asp-Arg-Ser-Ile-Arg-Leu-Val indicates Gly-Ser-Leu (la), or X and Y denotes Cys-Val-Pro-Thr-Asp-Pro denotes Pro-Gln-Glu-Val-Val (lb), or X and Y denotes Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn denotes Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile (Ic), or X and Y denotes Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp denotes Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-Tyr (Id), or X and Y means Val-Ori-Trp-Asn-Ala-Ser-Trp-Ser means Lys-Ser-Leu-Glu-Gln-Ile (le), and Z denotes a hydroxyl or amine group, and their conjugates with muramyl dipeptide-type immunoadjuvants with carriers of the protein or macromolecular polymers, for example latex, spheron and polystyrene, or with certain activated membranes.
CS881386A 1988-03-03 1988-03-03 Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product CS277003B6 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS881386A CS277003B6 (en) 1988-03-03 1988-03-03 Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS881386A CS277003B6 (en) 1988-03-03 1988-03-03 Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS138688A3 CS138688A3 (en) 1992-06-17
CS277003B6 true CS277003B6 (en) 1992-11-18

Family

ID=5348102

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS881386A CS277003B6 (en) 1988-03-03 1988-03-03 Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS277003B6 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
CS138688A3 (en) 1992-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0261224B2 (en) Synthetic htlv-iii peptides, compositions and uses thereof
HUT71860A (en) Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues
CS256960B1 (en) Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
KANDA et al. Synthesis of polyamide supports for use in peptide synthesis and as peptide‐resin conjugates for antibody production
EP0247557A2 (en) HTLV-III(LAV) Envelope peptides
EP0538283B2 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies
JP2598245B2 (en) Antibodies to HTLV-III / LAV virus-related peptides
EP0326490B2 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
Iglesias et al. Broader cross-reactivity after conjugation of V3 based multiple antigen peptides to HBsAg
CS277003B6 (en) Peptides with antigenic determinant properties of the HIV-1 env gene product
US7053175B1 (en) Synthetic peptides useful in biological assays for detecting infections caused by group O HIV-1 viruses
JP4258271B2 (en) Polyamino acid carrier
JPH05320192A (en) Peptides showing immunochemical reactivity with antibodies against non-A non-B hepatitis viruses
RU2356576C1 (en) SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES
US5239056A (en) Peptide fractions which induce antibodies protecting against the bovine leukemia virus, a process for obtaining such fractions, their coding sequences and vaccines made from such fractions
CS258290B1 (en) Peptide with antigenic determinant properties and method for its production
CS258288B1 (en) Peptide with antigenic determinant properties and method for its production
US6214537B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6218102B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6210874B1 (en) Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
CS258289B1 (en) Peptide with antigenic determinant properties and method for its production
Goetz et al. Synthesis and CD studies of an 88‐residue peptide containing the main receptor binding site of HTLV‐I SU‐glycoprotein
CZ279073B6 (en) Peptides with properties of immuno-dominant determinant of glycoprotein gp41 of hiv-1 virus, and process for preparing thereof
CS272926B1 (en) Peptides with properties of hpv-virus protein&#39;s antigen determinant and method of their production
CZ169293A3 (en) Set for detection of antibodies against human cytomegalovirus and peptides exhibiting immunodominant determinant properties nd conjugates thereof