RU2356576C1 - SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES - Google Patents
SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES Download PDFInfo
- Publication number
- RU2356576C1 RU2356576C1 RU2007146059/15A RU2007146059A RU2356576C1 RU 2356576 C1 RU2356576 C1 RU 2356576C1 RU 2007146059/15 A RU2007146059/15 A RU 2007146059/15A RU 2007146059 A RU2007146059 A RU 2007146059A RU 2356576 C1 RU2356576 C1 RU 2356576C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- adrenoreceptor
- autoantibodies
- peptide
- synthetic antigen
- patients
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для связывания аутоантител специфичных, к β1-адренорецептору из плазмы и сыворотки человека.The invention relates to biochemistry and medicine, in particular to immunology, and serves to bind specific autoantibodies to a β 1 -adrenoreceptor from human plasma and serum.
Кардиомиопатия - группа заболеваний сердечной мышцы неизвестной этиологии, среди них наиболее угрожающей является дилатационная кардиомиопатия. Как правило, ей страдают мужчины молодого и среднего возраста. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) является одной из главных причин тяжелой сердечной недостаточности и наиболее частой причиной пересадки сердца. Несмотря на успехи в терапии ДКМП смертность пациентов, страдающих этим заболеванием, очень велика. В течение 10 лет 70% таких больных погибают. Патогенез этого заболевания до конца не изучен - рассматриваются гипотезы хронической вирусной инфекции и генетической детерминированности, однако последние литературные данные однозначно указывают на аутоиммунную природу этого тяжелейшего заболевания [1, 2]. Также есть литературные данные о том, что проведение процедур терапевтического афереза приводит к существенному улучшению состояния больных ДКМП [3-5]. Аутоантитела, обнаруженные в сыворотке больных ДКМП, являются антителами против собственных антигенов, таких как: миозин, адениннуклеотидный транслокатор, сарколемальный ламинин, β1-адренорецептор, белок мускаринового М2-рецептора и др. [6]. Большинство аутоантител относятся к IgG классу иммуноглобулинов с молекулярной массой около 150 кДа.Cardiomyopathy is a group of diseases of the heart muscle of unknown etiology, among which the most threatening is dilated cardiomyopathy. As a rule, young and middle-aged men suffer from it. Dilated cardiomyopathy (DCMP) is one of the main causes of severe heart failure and the most common cause of heart transplant. Despite the success in the treatment of DCMP, the mortality rate of patients suffering from this disease is very high. Within 10 years, 70% of these patients die. The pathogenesis of this disease has not been fully studied - the hypotheses of chronic viral infection and genetic determination are considered, however, the latest literature data clearly indicate the autoimmune nature of this most serious disease [1, 2]. There is also literature evidence that therapeutic apheresis procedures lead to a significant improvement in the condition of patients with DCMP [3-5]. Autoantibodies found in the serum of patients with DCMP are antibodies against their own antigens, such as myosin, adenine nucleotide translocator, sarcolemal laminin, β 1 -adrenergic receptor, muscarinic M2 receptor protein, etc. [6]. Most autoantibodies belong to the IgG class of immunoglobulins with a molecular weight of about 150 kDa.
Уровень аутоантител к β1-адренорецептору у больных с ДКМП варьирует у разных авторов, однако литературные данные однозначно говорят о том, что именно эти аутоантитела наиболее часто встречаются у больных с ДКМП [7]. На животных моделях показано, что введение синтетического пептида, соответствующего последовательности второй петли β1-адренорецептора, приводит к развитию ДКМП у кроликов [8], следовательно, присутствие антител данной специфичности играет решающую роль в патогенезе этого заболевания. Кроме того, показано, что наличие аутоантител к β1-адренорецептору может быть одним из факторов развития тахиаритмий и острой сердечной недостаточности [9, 10].The level of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor in patients with DCMP varies among different authors, however, the literature data clearly indicate that these autoantibodies are most often found in patients with DCMP [7]. In animal models, it was shown that the introduction of a synthetic peptide corresponding to the sequence of the second loop of the β 1 -adrenoreceptor leads to the development of DCMP in rabbits [8]; therefore, the presence of antibodies of this specificity plays a decisive role in the pathogenesis of this disease. In addition, it was shown that the presence of autoantibodies to the β 1 -adrenoreceptor may be one of the factors in the development of tachyarrhythmias and acute heart failure [9, 10].
Поэтому определение уровня аутоантител к β1-адренорецептору черезвычайно важно для возможной диагностики дилатационной кардиомиопатии.Therefore, the determination of the level of autoantibodies to the β 1 -adrenoreceptor is extremely important for the possible diagnosis of dilated cardiomyopathy.
Известен пептид, использующийся для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору, представляющий собой участок 197-222 [7, 11] 2-ой петли β1-адренорецептора. Наиболее подробный анализ ИФА с использованием пептида 2-ой петли β1-адренорецептора дан в статье [7]. Уровень положительного сигнала при разведении тестируемых сывороток 1/40 у больных ДКМП составлял в среднем 0,2 о.е. При этом только у 13 пациентов из 43 (31%) больных ДКМП был обнаружен достоверный положительный ответ (превышение сигнала в ИФА в 2 и более раз относительно фона здоровых доноров с отрицательным ответом). На популяции здоровых доноров доля положительных ответов составляла 12% [7].A known peptide is used to determine the level of autoantibodies to the β 1 -adrenoreceptor, which is a portion 197-222 [7, 11] of the 2nd loop of the β 1 -adrenoreceptor. The most detailed analysis of ELISA using the peptide of the 2nd loop of β 1 -adrenoreceptor is given in [7]. The positive signal level in the dilution of the tested sera 1/40 in patients with DCMP was an average of 0.2 p.u. Moreover, only 13 patients out of 43 (31%) patients with DCMP showed a reliable positive response (exceeding the signal in ELISA by 2 or more times relative to the background of healthy donors with a negative response). The proportion of positive responses in the population of healthy donors was 12% [7].
Основным недостатком используемого пептида является ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут взаимодействовать только аутоантитела к антигенной детерминанте 2-ой петли β1-адренорецептора, представленной последовательностью данного пептида. Тогда как у больных ДКМП аутоантитела могут быть представлены шире - как к 1-ой, так и ко 2-ой петлям, так и к комплексу двух петель, связанных в природной молекуле β1-адренорецептора дисульфидной связью. Таким образом, ограниченная антигенная специфичность данного пептида может, в свою очередь, объяснять заниженную чувствительность (количество положительных ответов) у больных ДКМП.The main disadvantage of the used peptide is limited specificity, since only autoantibodies to the antigenic determinant of the 2nd loop of the β 1 -adrenoreceptor, represented by the sequence of this peptide, can interact with this peptide. Whereas in patients with DCMP, autoantibodies can be represented more broadly - both to the 1st and 2nd loops, and to the complex of two loops connected in the natural β 1 -adrenoreceptor molecule by a disulfide bond. Thus, the limited antigenic specificity of this peptide can, in turn, explain the low sensitivity (the number of positive responses) in patients with DCMP.
Прототипом заявляемого синтетического антигена является сочетание двух индивидуальных пептидов последовательности 125-133 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu (прототип I), соответствующий 1-ой петле β1-адренорецептора, и последовательности 206-218 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe (прототип II) из 2-ой петли β1-адренорецептора. Пептиды иммобилизованы на агарозную матрицу, активированную BrCN, полученный сорбент является активным ингредиентом колонки «Coraffin», используемой для удаления аутоантител к β1-адренорецептору у больных ДКМП [3]. Упомянутый сорбент представляет собой механическую смесь двух сорбентов с иммобилизованными индивидуальными пептидами, что указано в патенте [12].The prototype of the claimed synthetic antigen is a combination of two individual peptides of the sequence 125-133 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu (prototype I), corresponding to the 1st loop of β 1 -adrenoreceptor, and sequence 206-218 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe (prototype II) from the 2nd loop of the β 1 -adrenoreceptor. Peptides are immobilized on a BrCN activated agarose matrix, the resulting sorbent is the active ingredient in the Coraffin column used to remove autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor in patients with DCMP [3]. Mentioned sorbent is a mechanical mixture of two sorbents with immobilized individual peptides, as indicated in the patent [12].
Существенным недостатком данного сорбента является, во-первых, то, что механическая смесь двух сорбентов с двумя индивидуальными пептидами позволяет связывать аутоантитела, специфичные к антигенным детерминантам, расположенным либо только на 1-ой, либо только на 2-ой внеклеточной петле β1-адренорецептора. Тогда как в природной молекуле эти две внеклеточные петли связаны дисульфидной связью и, следовательно, образуют дополнительную антигенную детерминанту, к которой могут образовываться аутоантитела другой специфичности. Следовательно, аффинность такого сорбента неизбежно будет не достаточной для удаления всех аутоантител к β1-адренорецептору, что доказано в собственных экспериментах авторов.A significant drawback of this sorbent is, firstly, that a mechanical mixture of two sorbents with two individual peptides allows the binding of autoantibodies specific to antigenic determinants located either only on the 1st or only on the 2nd extracellular loop of the β 1 -adrenoreceptor . Whereas in a natural molecule, these two extracellular loops are connected by a disulfide bond and, therefore, form an additional antigenic determinant, to which autoantibodies of a different specificity can form. Consequently, the affinity of such a sorbent will inevitably be insufficient to remove all autoantibodies to the β 1 -adrenoreceptor, which was proved in the authors own experiments.
Исходя из вышесказанного актуальной является задача создания синтетического антигена, наиболее близко повторяющего антигенные свойства природного антигена - β1-адренорецептора, который, следовательно, обладал бы более высокой аффинностью.Based on the foregoing, the urgent task is to create a synthetic antigen that closely repeats the antigenic properties of the natural antigen, the β 1 -adrenoreceptor, which, therefore, would have a higher affinity.
Поставленная задача решается синтезом антигена, представляющего собой индивидуальное химическое соединение, в котором пептиды последовательности 125-133 и 206-218 β1-адренорецептора соединены дисульфидной связью, в отличие от смеси (сочетания) данных пептидов (прототип). Способность такого синтетического антигена связывать аутоантитела к β1 адренорецетору неочевидна, так как заявляемый антиген - искусственная конструкция, не являющаяся линейным эпитопом (в случае линейних эпитопов антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка [13]), включающая 2 фрагмента β1-адренорецептора (125-133 и 206-218), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу спонтанным окислением сульфгидрильных групп фрагментов 125-133 и 206-218 β1-адренорецептора с помощью перекиси водорода [14].The problem is solved by the synthesis of an antigen, which is an individual chemical compound in which the peptides of the sequence 125-133 and 206-218 β 1 -adrenoreceptor are connected by a disulfide bond, in contrast to the mixture (combination) of these peptides (prototype). The ability of such a synthetic antigen to bind autoantibodies to β 1 adrenergic receptor is not obvious, since the claimed antigen is an artificial construct that is not a linear epitope (in the case of linear epitopes, antigenicity can be predicted using computer programs for analysis of the amino acid sequence of a protein [13]), including 2 β fragments 1 -adrenoceptor (125-133 and 206-218), widely separated from each other and connected in one molecule spontaneous oxidation of the sulfhydryl groups of fragments 125-133 and 206-218 β 1 adrenoceptor with hydrogen peroxide [14].
Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли окислением перекисью водорода эквимолекулярной смеси предшественников - нонапептида (125-133) и тридекапептида (208-218).The synthesis of the claimed synthetic antigen was carried out by oxidation of hydrogen peroxide with an equimolecular mixture of the precursors nonapeptide (125-133) and tridecapeptide (208-218).
Синтез пептидов последовательности 125-133 1-ой внеклеточной петли β1-адренорецептора (нонапептид) и последовательности 206-218 2-ой петли β1-адренорецептора (тридекапептид) осуществляли по стандартной технологии синтеза на твердой фазе [15] с использованием Fmoc* - методологии на полимере Ванга. В работе использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIC, HOBT, TIBS фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильной функции серина и тирозина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для ε-аминогруппы лизина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции аспарагина и Pmc - для гуанидиновой функции аргинина. О защите цистеиновых остатков см. примеры 1 и 2. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием карбодиимидного метода с добавкой 1-гидроксибензотриазола.The synthesis of peptides of the sequence 125-133 of the 1st extracellular loop of the β 1 -adrenoreceptor (nonapeptide) and the sequence of 206-218 of the 2nd loop of the β 1 -adrenoreceptor (tridecapeptide) was carried out using standard solid-phase synthesis technology [15] using Fmoc * - methodologies on Wang polymer. We used derivatives of L-amino acids from Bachem (Switzerland), DIC, HOBT, TIBS from Fluka (Switzerland). For the synthesis, N-methylpyrrolidone, dichloromethane, piperidine, methanol and trifluoroacetic acid were used (Applied Biosystems, USA). DMF was purified by distillation over ninhydrin and barium oxide. The following protections were used to block the functional groups of the amino acid side chains: tert-butyl for the carboxyl groups of aspartic and glutamic acids, the hydroxyl function of serine and tyrosine; tert-butyloxycarbonyl (Boc) - protection for the ε-amino group of lysine; trityl (Trt) - group for the carboxamide function of asparagine and Pmc - for the guanidine function of arginine. For the protection of cysteine residues, see examples 1 and 2. The amino acid chain was increased by one amino acid, starting from the C-terminus, using the carbodiimide method with the addition of 1-hydroxybenzotriazole.
Синтез проводили на автоматическом пептидном синтезаторе Applied Biosystems, модель 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. В каждом случае исходили из 0.25 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария). The synthesis was carried out on an automated peptide synthesizer Applied Biosystems, model 431 A according to the standard program for a single condensation of Fmoc amino acids. In each case, 0.25 mmol of Fmoc aminoacylpolymer (Bachem, Switzerland) was proceeded. For solid phase synthesis, a styrene copolymer with 1% divinylbenzene with a hydroxymethylphenoxymethyl anchor group, with a particle size of 200-400 mesh from Bachem (Switzerland), was used.
Стандартный протокол твердофазного синтеза включает следующие стадии:The standard solid phase synthesis protocol includes the following steps:
Протокол твердофазного синтезаSolid Phase Synthesis Protocol
Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Деблокирование сульфгидрильных групп цистеиновых остатков осуществляли действием ацетата ртути. Линейные нонапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ до 97-98% чистоты. Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Beckman (США), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA. Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы Technopharm (РФ). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Ultrasphere ODS (Beckman, США), (5 мкм, 4,6×250 мм); на хроматографе фирмы Gilson (Франция). В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.The peptides were cleaved and released by trifluoroacetic acid with special additives that prevent side reactions. The sulfhydryl groups of cysteine residues were released by the action of mercury acetate. Linear nonapeptide and tridecapeptide were purified using preparative HPLC to 97-98% purity. Preparative HPLC was performed on a Beckman instrument (USA), peptides were detected at 226 nm. Peptides were eluted with a gradient of acetonitrile concentration in 0.1% TFA. For HPLC, acetonitrile from Technopharm (RF) was used. Analytical HPLC was performed on Ultrasphere ODS columns (Beckman, USA), (5 μm, 4.6 × 250 mm); on a chromatograph company Gilson (France). As eluents used buffer A - 0.1% TFA, pH 2.0, buffer B - 80% acetonitrile in buffer A, elution with a concentration gradient of buffer B in buffer A at a flow rate of 1 ml / min.
Синтезированные пептиды характеризовали данными 1H-ЯМР - спектроскопии (1Н-ЯМР - спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана), масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI, Kratos, Англия).The synthesized peptides were characterized by 1 H-NMR spectroscopy ( 1 H-NMR spectra were recorded on a WH-500 Bruker 500 MHz spectrometer (Germany) in DMSO-d at 300 K, peptide concentration was 2-3 mg / ml. Chemical shifts were measured relative to tetramethylsilane), mass spectrometry (mass spectra were recorded on a PC-Kompact MALDI instrument, Kratos, England).
Пример 1. Синтез нонапептида последовательности 125-133 1-ой петли β1-адренорецептора H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)Example 1. Synthesis of the nonapeptide sequence 125-133 of the 1st loop of the β 1 -adrenoreceptor H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (precursor I)
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (предшественник IAcm) проводили исходя из 0,34 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильную группу остатка цистеина защищали ацетамидометильной защитой.Stage 1. Solid-phase synthesis of H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys (Acm) -Glu-Leu-OH (precursor I Acm ) was carried out on the basis of 0.34 g of Fmoc-Leu-polymer containing 0.25 mmol starting amino acids, in accordance with the above standard protocol. The sulfhydryl group of the cysteine residue was protected with acetamidomethyl protection.
Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида (IAcm) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA и 0.5 мл H2O в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.25 г сырого продукта (IAcm), содержащего по данным ВЭЖХ 94% целевого пептида.The final release and cleavage of the nonapeptide (I Acm ) from the polymer was carried out in one step by treating the corresponding nonapeptidyl polymer with a mixture of 10 ml of TFA and 0.5 ml of H 2 O for 2 hours. Then the polymer was filtered off, washed with 2 × 2 ml of the deblocking mixture, the filtrate was evaporated and dry ether was added to the residue. The precipitate was filtered off, washed with dichloromethane (3 × 3 ml), ether (3 × 5 ml), and dried in a vacuum desiccator. Received 0.25 g of crude product (I Acm ) containing, according to HPLC, 94% of the target peptide.
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.15 г (51% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (IAcm). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР - спектроскопии: Glu 2, Ser 1, Gly 1, Leu 1, Phe 2, Туг 1, Cys 1.The peptide was purified using preparative HPLC on a Beckman instrument (USA) using a 130T Diasorb-C16 column (25 × 250 mm), sorbent particle size 10 μm. As eluents, we used: buffer A — 0.1% aqueous TFA solution and buffer B — 80% acetonitrile in water, elution was performed with a gradient of 0.5% per minute of buffer B from 100% buffer A, and a flow rate of 10 ml / min. Peptides were detected at a wavelength of 226 nm. Fractions containing the desired product were combined and lyophilized. As a result, 0.15 g (51% based on the starting amino acid attached to the polymer carrier) of the peptide trifluoroacetate (I Acm ) was obtained . The homogeneity of the product, determined by analytical HPLC, is 98%. Amino acid composition according to 1 H-NMR spectroscopy: Glu 2, Ser 1, Gly 1, Leu 1, Phe 2, Tug 1, Cys 1.
Масс-спектр, m/z: 1165.5 [М+Н]+, вычислено 1164.7, для C54H72N10О17S1. Mass spectrum, m / z: 1165.5 [M + H] + , calculated 1164.7, for C 54 H 72 N 10 О 17 S 1 .
Стадия 2. Получение нонапептида H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)Stage 2. Obtaining the nonapeptide H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (precursor I)
0.05 г (0.043 ммоль) H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (IAcm) растворяли в 5 мл 30% АсОН, добавляли 0.03 г (0.09 ммоль) ацетата ртути в 1.5 мл 30% АсОН, так как пептид плохо растворим, доводили концентрацию раствора до 50% АсОН и перемешивали 1.5 ч при 20°С, затем пропускали ток сероводорода в течение 30 мин. Осадок отфильтровывали, промывали 2×5 мл 30% АсОН. Фильтрат упаривали до объема ~2 мл и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом. Элюирование проводили градиентом буфера Б (0.5% в мин, от 20 до 80%) в буфере А со скоростью потока 10 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Выход 0.038 г (80.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1095.2 ([М+Н+]), вычислено 1094.2 для C51H67N9O16S.0.05 g (0.043 mmol) of H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys (Acm) -Glu-Leu-OH (I Acm ) was dissolved in 5 ml of 30% AcOH, 0.03 g (0.09 mmol) of acetate was added mercury in 1.5 ml of 30% AcOH, since the peptide is poorly soluble, the concentration of the solution was adjusted to 50% AcOH and stirred for 1.5 h at 20 ° С, then a stream of hydrogen sulfide was passed for 30 min. The precipitate was filtered off, washed with 2 × 5 ml of 30% AcOH. The filtrate was evaporated to a volume of ~ 2 ml and chromatographed on a column (25 × 250 mm) with Diasorb. Elution was performed with a gradient of buffer B (0.5% per minute, from 20 to 80%) in buffer A at a flow rate of 10 ml / min. The fractions corresponding to the target product were combined, evaporated, the residue was dissolved in water and lyophilized. Yield 0.038 g (80.0%). Mass spectrum (MALDI-MS): found m / z - 1095.2 ([M + H + ]), calculated 1094.2 for C 51 H 67 N 9 O 16 S.
Пример 2. Синтез тридекапептида последовательности 206-218 2-ой петли β1-адренорецептора H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)Example 2. Synthesis of the tridecapeptide sequence 206-218 of the 2nd loop of the β 1 -adrenoreceptor H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (precursor II)
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (предшественник IIAcm) проводили исходя из 0,37 г Fmoc-Phe-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильные группы остатков Cys4 и Cys10 цистеина защищали тритильной защитой, а Cys11 - ацетамидометильной.Stage 1. Solid-phase synthesis of H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys (Acm) -Asp-Phe-OH (precursor II Acm ) was carried out on the basis of 0.37 g Fmoc A -Phe polymer containing 0.25 mmol of the starting amino acid, in accordance with the above standard protocol. The sulfhydryl groups of the Cys 4 and Cys 10 cysteine residues were protected with trityl protection, and Cys 11 with acetamidomethyl.
Заключительное деблокирование и отщепление тридекапептида (IIAcm) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего тридекапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл Н2O и 0.25 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получали 0.42 г сырого продукта (IIAcm), содержащего по данным ВЭЖХ 60% целевого пептида.The final release and cleavage of the tridecapeptide (II Acm ) from the polymer was carried out in one step by treating the corresponding tridecapeptide peptide with a mixture of 10 ml of TFA, 0.25 ml of H 2 O and 0.25 ml of TIBS for 2 hours. Then the polymer was filtered off, washed with 2 × 2 ml of the deprotection mixture the filtrate was evaporated and dry ether was added to the residue. The precipitate was filtered off, washed with dichloromethane (3 × 3 ml), ether (3 × 5 ml), and dried in a vacuum desiccator. Received 0.42 g of crude product (II Acm ) containing, according to HPLC, 60% of the target peptide.
После этого проводили очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ так же, как в примере 1. В итоге получали 0.13 г (32% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (IIAcm). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляла 98%. Аминокислотный состав 1Н-ЯМР-спектроскопии: Asn 1, Asp 2, Ala 1, Phe 1, Tyr 1, Lys 1, Arg 2, Pro 1, Cys 3.After that, the peptide was purified using preparative HPLC as in Example 1. As a result, 0.13 g (32% based on the starting amino acid attached to the polymer carrier) of trifluoroacetate peptide (II Acm ) was obtained . Product homogeneity determined by analytical HPLC was 98%. Amino acid composition of 1 H-NMR spectroscopy: Asn 1, Asp 2, Ala 1, Phe 1, Tyr 1, Lys 1, Arg 2, Pro 1, Cys 3.
Масс-спектр, m/z: 1661.2 [М+Н]+, вычислено 1661.9 для С68Н104N22O21S3.Mass spectrum, m / z: 1661.2 [M + H] + , calculated 1661.9 for C 68 H 104 N 22 O 21 S 3 .
Стадия 2. Получение тридекапептида H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)Stage 2. Obtaining the tridecapeptide H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (precursor II)
Деблокирование остатка цистеина Cys11 в тридекапептиде H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (IIAcm) проводили действием ацетата ртути, как описано в примере 1.The release of the Cys 11 cysteine residue in the tridecapeptide H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys (Acm) -Asp-Phe-OH (II Acm ) was carried out by the action of mercury acetate, as described in example 1.
Выход тридекапептида 0.027 г (90.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1591.9 ([М+Н+]), вычислено 1590.8 для C65H99N21O20S3.The yield of tridecapeptide 0.027 g (90.0%). Mass spectrum (MALDI-MS): found m / z - 1591.9 ([M + H + ]), calculated 1590.8 for C 65 H 99 N 21 O 20 S 3 .
Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности β1-адренорецептора, соединенные дисульфидной связьюExample 3. A synthetic antigen comprising a nonapeptide (125-133) and a tridecapeptide (208-218) of a β 1 -adrenoreceptor sequence connected by a disulfide bond
0.007 г (0.006 ммоль) нонапептида (участок 125-133 β1-адренорецептора) и тридекапептида (208-218 β1-адренорецептора) 0.009 г (0.006 ммоль) растворяли в 20 мл 10% водного диоксана, добавляли 1 мл 5% водного аммиака до рН 8.0. Вносили в смесь 0.1 мл 3% водной перекиси водорода и перемешивали в течение 10 мин. Полноту окисления SH-групп контролировали с помощью реагента Эллмана (бесцветный раствор). По окончании реакции целевой продукт хроматографировали на колонке 25×600 мм с Sephadex G-25, уравновешенной 2% раствором уксусной кислоты, с целью удаления низкомолекулярных примесей. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и лиофилизировали. Получено 0.013 г синтетического антигена (81%). Масс-спектр: 2679.8 ([М+Н+]), вычислено 2680.9 для С116Н162N30О36S4.0.007 g (0.006 mmol) of nonapeptide (site 125-133 β 1 -adrenoreceptor) and tridecapeptide (208-218 β 1 -adrenoreceptor) 0.009 g (0.006 mmol) was dissolved in 20 ml of 10% aqueous dioxane, 1 ml of 5% aqueous ammonia was added to pH 8.0. 0.1 ml of 3% aqueous hydrogen peroxide was introduced into the mixture and stirred for 10 min. The completeness of the oxidation of SH groups was monitored using Ellman's reagent (colorless solution). At the end of the reaction, the target product was chromatographed on a 25 × 600 mm column with Sephadex G-25 equilibrated with a 2% solution of acetic acid to remove low molecular weight impurities. Fractions containing the desired product were combined and lyophilized. Received 0.013 g of synthetic antigen (81%). Mass spectrum: 2679.8 ([M + H + ]), calculated 2680.9 for C 116 H 162 N 30 O 36 S 4 .
Иммуноферментный анализ аутоантител к β1-адренорецептору на синтетическом антигенеEnzyme-linked immunosorbent assay of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor on a synthetic antigen
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом, представляющим собой 2-ую внеклеточную петлю β1-адренорецептора, проводили в одинаковых условиях постановки непрямого твердофазного ИФА. Методика и условия постановки ИФА были аналогичными описанным в литературе [7].Comparison of the specificity of the claimed synthetic antigen with the peptide described in the literature, which is the 2nd extracellular loop of the β 1 -adrenoreceptor, was carried out under identical conditions for the production of indirect solid-phase ELISA. The methodology and conditions for the production of ELISA were similar to those described in the literature [7].
В состав набора реагентов для определения аутоантител входили следующие компоненты: 96-луночный планшет для иммуноанализа, фирма «Costar», кат. №9018; синтетический антиген (см. пример 3) и пептид 197-222 2-ой внеклеточной петли β1-адренорецептора; 0,1 М Na-карбонатный буфер; раствор для разведения образцов, конъюгатов, блокирующий раствор и раствор для отмывки планшетов - 0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 8 г/л М NaCl, 0,1% Твин-20, 3% обезжиренное сухое молоко и бактериостатик катон CG 2,0 мл/л (ФСБМ-Т); раствор для отмывки планшетов - 0,01 М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т); конъюгат - реагент для анализа: мышиные моноклональные антитела против IgG человека, меченые биотином; конъюгат стрептавидин-пероксидаза; раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 1 мМ/л в диметилформамиде; субстратный буферный раствор - натрий цитрат 5,5-водный, 26 г/л; лимонная кислота 6,92 г/л, натрия перборат 1,1 г/л и катон CG 2,0 мл/л; стоп-реагент - фосфорная кислота 5%.The following components were included in the reagent kit for the determination of autoantibodies: 96-well plate for immunoassay, Costar, Cat. No. 9018; synthetic antigen (see example 3) and peptide 197-222 of the 2nd extracellular loop of β 1 -adrenoreceptor; 0.1 M Na-carbonate buffer; a solution for diluting samples, conjugates, a blocking solution and a solution for washing tablets - 0.01 M Na-phosphate buffer, pH 7.2, containing 8 g / L M NaCl, 0.1% Tween-20, 3% skimmed milk powder and bacteriostatic CG Caton 2.0 ml / L (FSBM-T); the solution for washing the tablets is 0.01 M Na-phosphate buffer pH 7.2, containing 0.15 M NaCl and 0.1% Tween-20 (FSB-T); conjugate - reagent for analysis: mouse monoclonal antibodies against human IgG labeled with biotin; streptavidin peroxidase conjugate; a solution of tetramethylbenzidine (TMB), 1 mmol / L in dimethylformamide; substrate buffer solution - sodium citrate 5.5-aqueous, 26 g / l; citric acid 6.92 g / l, sodium perborate 1.1 g / l and caton CG 2.0 ml / l; stop reagent - phosphoric acid 5%.
Протокол анализаAnalysis protocol
Перед проведением анализа компоненты набора выдерживали при температуре +20°С в течение 60 мин. Для иммобилизации антигена на планшетах для проведения ИФА препараты пептидов разводили до концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М Na2CO3-NaHCO3 рН 9,6. Вносили в лунки планшетов по 100 мкл и инкубировали 20 часов при +20°С. Для исключения неспецифических взаимодействий в лунки планшета вносили по 100 мкл ФСБМ-Т и инкубировали 3 часа при +20°С со встряхиванием. Для удаления несвязанных антигенов лунки планшета промывали 3 раза ФСБМ-Т. Образцы, разведенные в ФСБМ-Т в 20 и 100 раз, вносили пипеткой в соответствующие лунки по 100 мкл, инкубировали при температуре +4°С в течение 12 часов. Промывали планшет ФСБМ-Т не менее 3-х раз. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора реагента для анализа в ФСБМ-Т, инкубировали при температуре +20°С в течение 60 мин со встряхиванием. Промывали планшет раствором ФСБМ-Т три раза. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата в ФСБМ-Т, инкубировали планшет при температуре +20°С в течение 30 мин со встряхиванием. Промывали раствором ФСБ-Т четыре раза, затем немедленно вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора свежеприготовленной субстратной смеси (7 объемов субстратного буферного и 1 объем раствора ТМБ). Закрывали планшет крышкой и инкубировали при температуре +20°С без перемешивания в течение 15 мин, затем вносили по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента регистрировали оптическую плотность в планшете при длине волны 450 нм.Before analysis, the components of the kit were kept at a temperature of + 20 ° С for 60 min. To immobilize the antigen on ELISA plates, peptide preparations were diluted to a concentration of 5 μg / ml in 0.1 M Na 2 CO 3 -NaHCO 3 pH 9.6. 100 μl were introduced into the wells of the plates and incubated for 20 hours at + 20 ° C. To exclude nonspecific interactions, 100 μl of FSBM-T was added to the plate wells and incubated for 3 hours at + 20 ° С with shaking. To remove unbound antigens, the wells of the plate were washed 3 times with FSBM-T. Samples diluted in FSBM-
Определение связывания сорбента с иммобилизованным синтетическим антигеном и характеристика специфичностиDetermination of sorbent binding to immobilized synthetic antigen and specificity characterization
Иммобилизацию заявляемого синтетического антигена и сопоставляемого с ним сочетания пептидов последовательности 125-133 и 206-218 молекулы β1-адренорецептора по прототипу на бромцианактивированную Sepharose 4 FF проводили в соответствии со стандартной методикой иммобилизации белковых лигандов на агарозную матрицу.The claimed synthetic antigen and the corresponding combination of peptides of the sequence 125-133 and 206-218 of the β 1 -adrenoreceptor molecule of the prototype for the bromine-activated Sepharose 4 FF were immobilized according to the standard method of immobilizing protein ligands on an agarose matrix.
Пептиды растворяли до концентрации 0,3-2,5 мг/мл и иммобилизовали на агарозную матрицу, для чего растворы пептидов в 0,2 М боратном буфере с рН 8,0 инкубировали в течение 10 часов с предварительно активированной бромцианом агарозной матрицей.The peptides were dissolved to a concentration of 0.3-2.5 mg / ml and immobilized on an agarose matrix, for which solutions of the peptides in 0.2 M borate buffer with a pH of 8.0 were incubated for 10 hours with a pre-activated bromine cyan agarose matrix.
Концентрацию иммобилизованного лиганда оценивали по разнице в количестве пептида, использованного для проведения реакции иммобилизации и оставшегося в растворе после окончания инкубации с матрицей. Концентрацию пептида в растворе измеряли по оптическому поглощению при 280 нм. По окончании иммобилизации сорбент промывали 10 объемами дистиллированной воды. Затем к полученному сорбенту (2 мл суспензии, содержащий 1 мл осевшего геля) добавляли по 0,5 мл 1М раствора этаноламина, подкисленного HCl до значения рН 8. Смесь перемешивали при 20°С в течение 30 минут, затем сорбент промывали 20 объемами воды.The concentration of the immobilized ligand was estimated by the difference in the amount of peptide used for the immobilization reaction and remaining in the solution after incubation with the matrix. The concentration of the peptide in the solution was measured by optical absorption at 280 nm. At the end of the immobilization, the sorbent was washed with 10 volumes of distilled water. Then, 0.5 ml of a 1 M solution of ethanolamine acidified with HCl to pH 8 was added to the resulting sorbent (2 ml of suspension containing 1 ml of settled gel). The mixture was stirred at 20 ° C for 30 minutes, then the sorbent was washed with 20 volumes of water.
Для определения количества адсорбированных антител на сорбенте с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном и прототипом проводили аффинную хроматографию плазмы крови пациентов больных ДКМП и здорового донора. Соотношение объема сорбента к объему плазмы составлял 2:1, время инкубации - 1 час. После окончания инкубации сорбенты промывали 50-кратным объемом буферной смеси 0.01 М KH2PO4-NaOH с рН 7.0, связавшийся белок элюировали 20-кратным объемом буферной смеси 0,2М глицин-HCl рН 2,5.To determine the amount of adsorbed antibodies on a sorbent with the claimed synthetic antigen and prototype immobilized, affinity chromatography of the blood plasma of patients with DCMP and a healthy donor was performed. The ratio of the sorbent volume to the plasma volume was 2: 1, the incubation time was 1 hour. After incubation, the sorbents were washed with a 50-fold volume of a buffer mixture of 0.01 M KH 2 PO 4 -NaOH with a pH of 7.0, the bound protein was eluted with a 20-fold volume of a buffer mixture of 0.2 M glycine-HCl pH 2.5.
Результатыresults
Чувствительность и специфичность выявления аутоантител к β1-адренорецепторуThe sensitivity and specificity of detection of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом участка 197-222 2-ой внеклеточной петли β1-адренорецептора, проводили в опыте с унифицированными условиями. Условия постановки ИФА соответствовали условиям ИФА, описанным для прототипа [7]. Определение аутоантител проводили в группе больных ДКМП (группа 1, n=9), в смешанной группе больных с пониженной фракцией выброса левого желудочка (как с ДКМП, так и с тахиаритмиями) (группа 2, n=16) и в группе здоровых доноров (группа 3, n=24).A comparison of the specificity of the claimed synthetic antigen with the peptide of the 197-222 portion of the 2nd extracellular loop of the β 1 -adrenoreceptor described in the literature was carried out in the experiment with standardized conditions. The conditions for the production of ELISA corresponded to the ELISA conditions described for the prototype [7]. Autoantibodies were determined in the group of patients with DCMP (group 1, n = 9), in the mixed group of patients with a reduced ejection fraction of the left ventricle (both with DCMP and tachyarrhythmias) (group 2, n = 16) and in the group of healthy donors ( group 3, n = 24).
Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител к β1-адренорецептору в образцах плазмы/сыворотки крови пациентов исследуемых групп и здоровых доноров приведены в таблице.The results of ELISA sensitivity for determining autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor in plasma / serum samples of patients of the studied groups and healthy donors are shown in the table.
Данные представлены как среднее ± отклонение для доверительной вероятности по критерию Стьюдента, уровень статистической значимости результатов **p<0,005, *p<0,1.The data are presented as mean ± deviation for confidence probability by Student's criterion, the level of statistical significance of the results ** p <0.005, * p <0.1.
Приемлемый уровень статистической значимости (p<0,05) между группой здоровых доноров и группами больных в собственных экспериментах авторов наблюдался только для ИФА с использованием синтетического антигена, что свидетельствовало о большей специфичности взаимодействия заявляемого синтетического антигена с аутоантителами к β1-адренорецептору, чем пептида 197-222.An acceptable level of statistical significance (p <0.05) between the group of healthy donors and groups of patients in the authors' own experiments was observed only for ELISA using a synthetic antigen, indicating a greater specificity of the interaction of the claimed synthetic antigen with autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor than peptide 197-222.
Согласно литературным данным частота выявления аутоантител к β1-адренопецептору у больных ДКМП на пептиде 197-222 последовательности β1-адренорецептора составляет 13 положительных ответов из 42, что составляет 30% According to published data, the detection rate of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor in patients with DCMP on peptide 197-222 of the β 1 -adrenoreceptor sequence is 13 of 42 positive responses, which is 30%
[7]. В наших собственных экспериментах при использовании заявляемого синтетического антигена частота выявления аутоантител к β1-адренорецептору у больных ДКМП составило 44% (4 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП), тогда как на пептиде 197-122 последовательности β1-адренорецептора - 33% (3 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП) (данные не приведены). Положительным ответом считали сигнал, в два раза превышавший значение среднего уровня фона. Полученные данные свидетельствуют о большей чувствительности метода выявления аутоантител к β1-адренорецептору при использовании заявляемого синтетического антигена.[7]. In our own experiments using the inventive synthetic antigen, the detection rate of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor in patients with DCMP was 44% (4 positive responses out of 9 patients with DCMP), while on peptide 197-122 of the β 1 -adrenoreceptor sequence - 33% (3 positive response from 9 patients with DCMP) (data not shown). The signal considered to be a positive response was two times the value of the average background level. The data obtained indicate a greater sensitivity of the method for detecting autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor when using the inventive synthetic antigen.
Связывание аутоантител к β1-адренорецептору на сорбентахThe binding of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor on sorbents
Нужно отметить, что в литературе отсутствуют данные, позволяющие сравнить по сорбционным характеристикам заявляемый синтетический антиген с прототипом. Поэтому сорбционные свойства сорбента, содержащего синтетический антиген, и сорбента с прототипом проверяли методом аффинной хроматографии с плазмой крови человека в одинаковых условиях в экспериментах in vitro. Для этого использовали плазму крови пациентов ДКМП (пациент 1 и 2), пациента с тахиаритмией (пациент 3) и здорового донора. Количество связавшихся с тестируемыми сорбентами иммуноглобулинов класса G при проведении аффинной хроматографии индивидуальных плазм больных ДКМП и плазмы здорового донора приведены на чертеже.It should be noted that there is no data in the literature that allows us to compare the claimed synthetic antigen with the prototype according to the sorption characteristics. Therefore, the sorption properties of the sorbent containing the synthetic antigen and the sorbent with the prototype were tested by affinity chromatography with human blood plasma under the same conditions in vitro experiments. For this, the blood plasma of patients with DCMP (patient 1 and 2), a patient with tachyarrhythmia (patient 3), and a healthy donor were used. The number of class G immunoglobulins bound to the tested sorbents during affinity chromatography of individual plasmas of patients with DCMP and healthy donor plasma is shown in the drawing.
На чертеже - Количество связанных аутоантител к β1-адренорецептору из плазмы пациентов и плазмы здоровых доноров на сорбентах с иммобилизованным прототипом и заявляемым синтетическим антигеном.In the drawing - the Number of associated autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor from the plasma of patients and the plasma of healthy donors on sorbents with an immobilized prototype and the claimed synthetic antigen.
По результатам собственных исследований авторов среднее количество сорбированных антител для сорбента с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном (количество IgG в элюате с 1 мл сорбента) в опытах тремя образцами плазмы крови больных ДКМП составляло 227±35 мкг, тогда как на прототипе 70±65 мкг (p<0,05).According to the authors' own research, the average number of adsorbed antibodies for a sorbent with the claimed synthetic antigen immobilized (the amount of IgG in the eluate with 1 ml of sorbent) in experiments with three blood plasma samples of patients with DCMP was 227 ± 35 μg, whereas in the prototype 70 ± 65 μg (p <0.05).
Таким образом, заявляемый синтетический антиген позволяет со значительно большей чувствительностью и аффинностью связывать аутоантитела из плазмы/сыворотки больных с наличием аутоантител к β1-адренорецептору по сравнению с прототипом.Thus, the claimed synthetic antigen allows with significantly greater sensitivity and affinity to bind autoantibodies from plasma / serum of patients with the presence of autoantibodies to β 1 -adrenoreceptor compared to the prototype.
ЛитератураLiterature
1. San Martin M.A. et al. Dilated cardiomyopathy and autoimmunity: an overview of current knowledge and perspectives. // Rev Esp Cardiol. - 2002. - V.55 (5) P.514-524.1. San Martin M.A. et al. Dilated cardiomyopathy and autoimmunity: an overview of current knowledge and perspectives. // Rev Esp Cardiol. - 2002. - V.55 (5) P.514-524.
2. Fu M. et al. Is cardiomyopathy an autoimmune disease? // 2002. - V.51 (4). - P.208-212.2. Fu M. et al. Is cardiomyopathy an autoimmune disease? // 2002.- V.51 (4). - P.208-212.
3. Rönspeck W. et al. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption. // Ther Apher Dial. - 2003. -. V.7 (1). - P.91-97.3. Rönspeck W. et al. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption. // Ther Apher Dial. - 2003. -. V.7 (1). - P.91-97.
4. Staudt A. et al. Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution. // Circulation. - 2001. - V.103 (22). - P.2681-2686.4. Staudt A. et al. Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution. // Circulation. - 2001 .-- V.103 (22). - P.2681-2686.
5. Коновалов Г.А. и др. Аферез иммуноглобулинов - новый подход к лечению тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии. // Кардиология. - 2002 - №6 - С.123-1275. Konovalov G.A. et al. Apheresis of immunoglobulins - a new approach to the treatment of severe forms of dilated cardiomyopathy. // Cardiology. - 2002 - No. 6 - S.123-127
6. Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy. // Artificial Organs. - 2004. - V.28 (2). - P.171-181.6. Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy. // Artificial Organs. - 2004 .-- V.28 (2). - P.171-181.
7. Magnusson Y. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. // Circulation. - 1994. - V.89 (6). - P.2760-2767.7. Magnusson Y. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. // Circulation. - 1994 .-- V.89 (6). - P.2760-2767.
8. Matsui S. et al. Active immunization of combined betal-adrenoceptor and M2-muscarinic receptor peptides induces cardiac hypertrophy in rabbits. // J Card Fail. - 1999. - V.5 (3). - P.246-254.8. Matsui S. et al. Active immunization of combined betal-adrenoceptor and M2-muscarinic receptor peptides induces cardiac hypertrophy in rabbits. // J Card Fail. - 1999 .-- V.5 (3). - P.246-254.
9. Zhang L et. al. Autoantibodies against the myocardial betal-adrenergic and M2-muscarinic receptors in patients with congestive heart failure Chin Med J (Engl). 2002; 115 (8): 1127-31.9. Zhang L et. al. Autoantibodies against the myocardial betal-adrenergic and M2-muscarinic receptors in patients with congestive heart failure Chin Med J (Engl). 2002; 115 (8): 1127-31.
10. Chiale PA, et. al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001; 103 (13): 1765-71.10. Chiale PA, et. al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001; 103 (13): 1765-71.
11. Iwata M. Et al, Autoimmunity Against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenergic Receptors Induces β-Adrenergic Receptor Desensitization and Myocardial Hypertrophy In Vivo. // Circulation Research. - 2001 - V.88. - P.578-586.11. Iwata M. Et al, Autoimmunity Against the Second Extracellular Loop of β 1 -Adrenergic Receptors Induces β-Adrenergic Receptor Desensitization and Myocardial Hypertrophy In Vivo. // Circulation Research. - 2001 - V.88. - P.578-586.
12. Rönspeck W. Peptides for combating the autoantibodies that are responsible for dilatative cardiomyopathy (DCM). // EP 1214350.12. Rönspeck W. Peptides for combating the autoantibodies that are responsible for dilatative cardiomyopathy (DCM). // EP 1214350.
13. Hopp N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.72. 72. P.3824-3828.13. Hopp N., Woods K. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981. V. 72. 72. P.3824-3828.
14. M.B.Сидорова, А.С.Молокоедов, А.А.Азьмуко, Е.В.Кудрявцева, Е.Краузе, М.В.Овчинников, Ж.Д.Беспалова. Применение перекиси водорода для замыкания дисульфидных мостиков в пептидах. // Биоорганическая химия, 2004, том 30, №2, с.115-125.14. M.B. Sidorova, A. S. Molokoedov, A. A. Azmuko, E. V. Kudryavtseva, E. Krause, M. V. Ovchinnikov, J. D. Bespalova. The use of hydrogen peroxide for the closure of disulfide bridges in peptides. // Bioorganic chemistry, 2004, volume 30, No. 2, pp. 115-125.
15. Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis. // The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. / Ed. Е.Gross, J.Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P.3-254.15. Barany G., Merrifild R. B. Solid phase synthesis. // The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. / Ed. E. Gross, J. Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P.3-254.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007146059/15A RU2356576C1 (en) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007146059/15A RU2356576C1 (en) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2356576C1 true RU2356576C1 (en) | 2009-05-27 |
Family
ID=41023270
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007146059/15A RU2356576C1 (en) | 2007-12-13 | 2007-12-13 | SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2356576C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2452964C1 (en) * | 2011-04-15 | 2012-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | METHOD OF IMMUNE-ENZYME ASSAY FOR DETECTING β1-ADRENORECEPTOR AUTOIMMUNE ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD PLASMA AND SERUM |
-
2007
- 2007-12-13 RU RU2007146059/15A patent/RU2356576C1/en active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RONSPECK W et al. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption. Ther Apher Dial. 2003 Feb; 7(1): 91-7. Review. ШУМАКОВ В.И. и др. Дилатационная кардиомиопатия. - М., 2003, Триада. BUVALL L et al. Antibodies against the betal-adrenergic receptor induce progressive development of cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol. 2007 May; 42(5): 1001-7. Epub 2007 Feb 15. JANE-WIT D et al. Beta 1-adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 2007 Jul 24; 116(4):399-410. Epub 2007 Jul 9. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2452964C1 (en) * | 2011-04-15 | 2012-06-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) | METHOD OF IMMUNE-ENZYME ASSAY FOR DETECTING β1-ADRENORECEPTOR AUTOIMMUNE ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD PLASMA AND SERUM |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1844337B1 (en) | Binding compounds, immunogenic compounds and peptidomimetics | |
EP1497318A2 (en) | Binding molecules for fc-region polypeptides | |
AU2002254683A1 (en) | Binding molecules for Fc-region polypeptides | |
CN113248590B (en) | NT-proBNP protein antigenic determinant polypeptide and application thereof | |
JP2011016763A (en) | Method for producing antibody against hydrophobic peptide | |
CN112457392B (en) | Soluble ST2 protein antigenic determinant polypeptide and application thereof | |
CN114989313B (en) | P-tau181 epitope peptide and application thereof in Alzheimer disease detection | |
CN108929374B (en) | Human HBP epitope peptide, antigen, antibody, application and kit | |
CN114957438B (en) | Human Abeta 1-42 epitope polypeptide for detecting Alzheimer disease and preparation method thereof | |
EP2614371A1 (en) | Method for labeling of compounds | |
RU2356576C1 (en) | SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES | |
KR20120007492A (en) | Peptide capable of binding to immunoglobulin | |
EP2284188B1 (en) | Detection of anti-ribosomal P protein antibodies by means of synthetic peptides | |
NZ222942A (en) | Mitochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis and fragments, production by genetic engineering methods, diagnostic test and pharmaceutical use | |
CN107446040B (en) | Human ST2 epitope peptide, antigen, antibody, kit and application | |
Winkler et al. | Protein labeling and biotinylation of peptides during spot synthesis using biotin p‐nitrophenyl ester (biotin‐ONp) | |
CN108218977A (en) | Small peptide from tumour antigen SAGE1 | |
CN110317246B (en) | Human MOG epitope peptide, antigen, antibody, application and chemiluminescence kit | |
US5932692A (en) | Antigenic peptides | |
Sidorova et al. | Synthesis and properties of a new conformational antigen which models an extracellular region of β1-adrenoreceptor | |
CN114920851B (en) | Aβ1-42 antigen and use thereof for detecting Aβ1-42 concentration in Alzheimer's patient | |
RU2452964C1 (en) | METHOD OF IMMUNE-ENZYME ASSAY FOR DETECTING β1-ADRENORECEPTOR AUTOIMMUNE ANTIBODIES IN HUMAN BLOOD PLASMA AND SERUM | |
US5254672A (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor VIIa, and the use thereof | |
CN114774395B (en) | High-purity chitinase 3-like protein 1 epitope peptide for liver disease detection and preparation method thereof | |
CN114836407B (en) | Method for modifying polypeptide by chitinase 3-like protein 1 antigen and carrier protein |