JPH05320192A

JPH05320192A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体に免疫化学反応性を示すペプチド

Info

Publication number: JPH05320192A
Application number: JP3258106A
Authority: JP
Inventors: Winand Johannes Antonius Habets; ウイナンド・ヨハンネス・アントニウス・ハベツツ
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 1993-12-03
Also published as: FI914673A0; EP0479376A1; ATE117696T1; FI914673A; IE913390A1; EP0479376B1; DE69106998T2; KR920008067A; ZA917858B; DK0479376T3; IE65107B1; CA2052702A1; DE69106998D1; ES2070415T3; GR3015781T3; AU652581B2; AU8562391A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＮＡＮＢＨに対する抗体と免疫化学反応する
ペプチドに係わる。試験液中のＮＡＮＢＨまたは抗ＮＡ
ＮＢＨの検出方法、前記検出方法を適用するときに使用
される免疫化学試薬及び試験キットも本発明に属する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス(ＮＡＮＢＨウイルス)に対する抗体と免疫化学的に反
応するペプチドに係わる。

【０００２】本発明は更に、試験液中のＮＡＮＢＨまた
は抗ＮＡＮＢＨを検出する方法と、該検出方法に使用し
得る免疫化学試薬及び試験キットとにも係わる。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】（Ｃ型
肝炎ウイルスによって惹起され得る可能性もあるがそう
でない可能性もある）非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウイルス誘発
性であることが判っている伝播性疾患または疾患系であ
る。非Ａ非Ｂ型肝炎は、既知の肝炎ウイルス、即ちＡ型
肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
及びδ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）によって惹起される他の
形態のウイルス関連肝疾患や、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）またはエプスタインバールウイルス（ＥＢ
Ｖ）によって誘発される肝炎とは区別され得る。ＮＡＮ
ＢＨは最初は、輸血個体において同定された。人間から
チンパンジーへの伝播及びチンパンジーにおける連続継
代は、ＮＡＮＢＨが伝播性感染因子に起因するものであ
ることを立証している。しかしながら、ＮＡＮＢＨの原
因となる伝播因子は未だに全く同定されておらず、疾患
の原因となる因子の数も未知である。

【０００４】疫学的には、３つのタイプのＮＡＮＢＨ、
即ち水系感染による流行のタイプ、血液または注射針関
連タイプ、及び散発性（集団獲得）タイプがあり得るこ
とが示唆されている。しかしながら、ＮＡＮＢＨを惹起
し得る因子の数は未知である。

【０００５】ＮＡＮＢＨの臨床診断及び同定は主に、他
のウイルスマーカーの除外によって行われている。推定
上のＮＡＮＢＨ抗原及び抗体を検出するのに使用される
方法としては、寒天−ゲル拡散、カウンター免疫電気泳
動、免疫蛍光顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、ラジオイム
ノアッセイ及び酵素結合イムノソルベントアッセイ（en
zyme-linked immunosorbent assay）を挙げることがで
きる。しかしながらいずれのアッセイも、ＮＡＮＢＨに
対する診断試験として使用するのに十分な感度、特異性
及び再現性があるとは立証されていない。

【０００６】ＮＡＮＢＨ感染の種々の段階において信頼
性のある診断が下され得る特異的で且つ高感度の方法を
開発するためには、このタイプの免疫優性ウイルスエピ
トープを同定することが極めて重要である。

【０００７】本出願人らの同時係属欧州特許出願第９
０．２００．７７５．６号において本出願人らは、１５
個のアミノ酸とＮＡＮＢＨ抗体に免疫化学的反応性を示
すアミノ酸配列とを含むペプチドを開示している。更
に、前記ペンタデカペプチドの特に強力なフラグメン
ト、特にアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇを有するノ
ナペプチドも開示されている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＮＡＮＢＨ抗
体との免疫化学反応性が向上した新規のペプチドに係わ
る。

【０００９】本発明に従う新規のペプチドは、アミノ酸
配列：Ｘ−ａ−Ｌｙｓ−ｂ−ｃ−Ａｓｎ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ−ＹＩ５６７８９ 10 11 12 13 〔配列中、“ａ”はアミノ酸残基：Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇ
ｌｕまたはｐｙｒｏＧｌｕを表わし、“ｂ”はＴｈｒま
たはＴｒｐを表わし、“ｃ”はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｇｌ
ｕ、ＴｈｒまたはＳｅｒを表わし、“ｄ”はＳｅｒ、Ａ
ｓｎまたはＩｌｅを表わし、“ｅ”はＴｈｒまたはＡｒ
ｇを表わし、“ｆ”はＡｓｎまたはＭｅｔを表わし、
“ｇ”はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＩｌｅまたはＭｅｔ
を表わし、Ｘは、水素、または、記号：ｈ₄−、ｈ₃−ｈ₄−、ｈ₂−ｈ₃−ｈ₄−もしくはｈ₁−ｈ₂
−ｈ₃−ｈ₄− （ここで、ｈ₄はアミノ酸残基ＧｌｎまたはＶａｌであ
り、ｈ₃はアミノ酸残基Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅ
ｔまたはＰｒｏであり、ｈ₂はアミノ酸残基Ｔｈｒまた
はＳｅｒであり、ｈ₁はアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｇｌｙ、
ＬｙｓまたはＴｒｐである）によって示されるアミノ
酸、ジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチド
を表わし、Ｙは、ヒドロキシ、または、記号： −ｈ₁₄もしくは−ｈ₁₄−ｈ₁₅ （ここで、ｈ₁₄は、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択されるア
ミノ酸残基であり、ｈ₁₅は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＬｙｓ
から選択される）によって示されるアミノ酸もしくはジ
ペプチドを表わす〕を特徴とする。

【００１０】上記ペプチドは、本出願人らの同時係属欧
州特許出願第９０．２００．７７５．６号に記載の配
列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを有するペンタデカペプチドと
比較すると、ＮＡＮＢＨ抗体との免疫化学反応性が向上
している。

【００１１】免疫化学反応性が向上しているとは、実施
例４に記載のような試験方法または任意の他の適当なイ
ムノアッセイに新規のペプチドを使用した結果、試験の
特異性及び／または感度がより高くなったならば、この
ペプチドは、前述のペンタデカペプチドと比較して優れ
た免疫化学反応性を示すことを意味する。

【００１２】ＮＡＮＢＨ抗体に対して優れた親和性を示
す本発明の好ましいペプチドは、以下の条件の一方また
は両方を満たす上記一般式に従うペプチドである：Ｘが
水素またはテトラペプチドｈ₁−ｈ₂−ｈ₃−ｈ₄を表わ
す；及びＹがヒドロキシまたはジペプチド−ｈ₁₄−ｈ₁₅
（ここでｈ₁₅はＡｒｇ及びＬｙｓから選択されるのが好
ましい）を表わす。

【００１３】更に本発明は、なおもＮＡＮＢＨ抗体と免
疫化学反応性を示す式Ｉのペプチドのフラグメントと、
式Ｉのペプチドの活性フラグメントが式Ｉのペプチドの
位置９に対応する位置にあるアミノ酸残基Ａｓｎを有す
るという条件で、アミノ酸配列の必須部分として前記式
Ｉのペプチドまたはその活性フラグメントを含む（ポ
リ）ペプチドとを含む。

【００１４】上記ペプチドに加え、これらペプチドの機
能的誘導体（functional derivatives）もまた、本発明
に従うペプチドに属すと考えられる。ペプチドの機能的
誘導体としては、ａ）ペプチドの酸付加塩、ｂ）ペプチ
ドのアミド、特にＣ末端アミド、ｃ）エステル、特にＣ
末端エステル、及びｄ）Ｎ−アシル誘導体、特にＮ末端
アシル誘導体、なかでもＮ−アセチル誘導体が含まれる
ものとする。

【００１５】本発明のペプチドは、試験液中のＮＡＮＢ
Ｈ抗原またはＮＡＮＢＨ抗体の存在を判定する診断方法
に使用するのに特に適している。

【００１６】天然ＮＡＮＢＨとは対照的に、本発明のペ
プチドは、安全な非感染性源由来であるという長所を有
する。更に本発明のペプチドはＮＡＮＢＨ抗体に対する
特に高い親和性を有しており、このことから本発明のペ
プチドは、上記診断試験方法に使用するのに極めて適す
ることになる。

【００１７】従って本発明の別の実施態様は、本発明の
ペプチドを１種以上含む免疫化学試薬（これについては
後述する）である。

【００１８】本発明は更に、１種以上の本発明のペプチ
ドを使用し、試験液中のＮＡＮＢＨに対する抗体を検出
する方法をも含む。

【００１９】更に本発明は、１種以上の本発明のペプチ
ドを使用し、試験液中のＮＡＮＢＨを検出する方法にも
係わる。

【００２０】更に本発明は、少なくとも１種の本発明の
免疫化学試薬を含む、イムノアッセイを実施するのに使
用される試験キットにも係わる。

【００２１】例えば米国特許第４，６８３，２０２号及
び欧州特許第３２９，８２２号にそれぞれ記載のごとく
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸配列ベース
の増幅（ＮＡＳＢＡ）のような核酸増幅技術によってＮ
ＡＮＢＨＤＮＡまたはＲＮＡを検出する試験の基本成
分、所謂プライマーとして、本発明に従うアミノ酸配列
をコードする新規のヌクレオチド配列またはその部分を
使用することも本発明の範囲内にある。

【００２２】本発明の一部には、上述の増幅及び検出方
法を実施するための増幅試験キットも含まれる。

【００２３】更に本発明のペプチドまたはそのフラグメ
ントは、ＮＡＮＢ肝炎疾患を予防及び／または治療する
上で適当な医薬投与形態で使用することもできる。当業
者は、かかるペプチドまたはそのフラグメントを活性成
分として使用して得られるワクチンを製造できるであろ
う。

【００２４】本発明のペプチドの製造は、ペプチド合成
の公知の有機化学方法の１つでまたは組換えＤＮＡ技術
によってなされる。この後者の方法は、１種以上の当該
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換
えポリヌクレオチドを宿主としての適当な微生物中で発
現させることにより、所望のペプチドを製造することを
含む。

【００２５】ペプチド合成の有機化学方法は、均一相中
のまたは所謂固相の助成による縮合反応によって必要な
アミノ酸を結合することを含むと考えられる。

【００２６】縮合反応は以下のように実施することがで
きる：ａ）遊離カルボキシル基と保護された他の反応基とを有
する化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離アミノ基と
そのうちの１つが（誘導体化された）固相支持体であり
得る保護された他の反応基とを有する化合物（アミノ
酸、ペプチド）との縮合剤の存在下の縮合、ｂ）活性化
されたカルボキシル基と遊離または保護された他の反応
基とを有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と、遊離ア
ミノ基とそのうちの１つが（誘導体化された）固相支持
体であり得る遊離または保護された他の反応基とを有す
る化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。

【００２７】カルボキシル基の活性化は特に、カルボキ
シル基を酸のハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾ
ール、または活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシ−
スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
ｐ−ニトロフェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキ
シ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤ
ｈｂｔ）またはペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）の
エステル）に変換することにより実施され得る。

【００２８】上記縮合反応の最も一般的な方法として
は、カルボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリアゾリル
オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェート］、アジド法、混合無水物法、及び
活性化エステルを使用する方法（例えばＴｈｅＰｅｐ
ｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
ＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１−３（編集Ｇｒｏｓｓ，
Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．）１９７９，１９
８０，１９８１（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．））を挙げることができる。

【００２９】縮合反応に関与し得ない反応基は、上述の
ごとく、酸、塩基または還元剤による加水分解によって
極めて容易に再除去し得る基によって効果的に保護され
ている。カルボキシル基は例えば、メタノール、エタノ
ール、第三級ブタノール、ベンジルアルコールまたはｐ
−ニトロベンジルアルコールを用いたエステル化や、ア
ミンまたは固相支持体に結合させたアルコール及びアミ
ンの誘導体を用いたアミド化によって効果的に保護する
ことができる。

【００３０】アミノ基を効果的に保護し得る基は、エト
キシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブト
キシ−カルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）、ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカル
ボニル基、またはスルホン酸から誘導される酸性基（例
えば、ｐ−トルエン−スルホニル、ペンタ−メチルベン
ゼンスルホニル（Ｐｍｓ）、４−メトキシ−２，３，６
−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）または
１，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スル
ホニル（Ｐｍｃ）基）であるが、他にも、置換または未
置換のアリールまたはアラルキル基（例えばベンジル及
びトリフェニルメチル基）またはオルト−ニトロフェニ
ル−スルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メチルビニ
ルのような基を使用することもできる。

【００３１】広範囲にわたる使用し得る保護基の例は、
ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，ＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌ．１−９（編集
Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ及びＭｅｉｅｎｈｏ
ｆｅｒ）１９７９−１９８７（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見ることができる。

【００３２】“固相”法を使用しての前述の本発明のペ
プチドの製造は、例えばＪ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８５，２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐ
ｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．，３５，１６
１−２１４（１９９０）に記載されている。製造される
べきペプチドのアミノ酸の結合は一般に、カルボキシル
末端側から開始する。この方法においては、その上に反
応基があるかまたはその上にかかる基が導入され得る固
相が必要とされる。これは例えば、反応性クロロメチル
基を有するベンゼンとジビニルベンゼンとのコポリマ
ー、またはヒドロキシメチルもしくはアミン官能基で反
応性にされたポリマー固相とすることができる。

【００３３】特に適した固相は、例えば、Ｗａｎｇ（１
９７４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９５，１３２
８に記載されているｐ−アルコキシベンジルアルコール
樹脂（４−ヒドロキシメチル−フェノキシ−メチル−コ
ポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。合
成後、ペプチドを固相から緩和条件下に分離することが
できる。他の適当な支持体は、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，３９９８
（１９８４）及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，８２，１７８（１９８５）によって記載されてい
るような誘導体化されたポリエチレンまたはポリプロピ
レンロッドである。

【００３４】溶液中または固相支持体上で所望のアミノ
酸配列を合成した後、特定の基の特性に従って、例えば
トリフルオロ酢酸によって、または、水素と触媒（例え
ばパラジウム）を用いての緩和還元、塩基（例えばピペ
リジンまたはヒドロキドイオン）もしくは氷酢酸中のＨ
Ｂｒを用いての処理のような種々の通常の方法によって
保護基を除去することもできる。

【００３５】ペプチドを固相支持体上で合成し、そこか
ら分離するならば、これは、リンカーのタイプに従っ
て、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸
またはトリフルオロ酢酸中に溶解させたメタンスルホン
酸を使用し、好ましくはメタノールまたはエタノールと
いった低級アルコールを用いたエステル交換反応で行な
うことができる。エステル交換反応の場合、ペプチドの
低級アルキルエステルが直接形成される。同様に、アン
モニアによって分離しても本発明のペプチドのアミドを
得ることができる。

【００３６】既に記載したように、本発明のペプチドは
組換えＤＮＡ技術によっても製造することができる。こ
の可能性は、ペプチドが（“縦列型”の）反復配列内に
取り込まれるとき、またはペプチドが（ずっと大きい）
タンパク質またはポリペプチドの必須構成要素として製
造されるときには特に重要である。従ってこのタイプの
ペプチド製造も本発明の範囲内にあるものとする。この
ために、組換えＤＮＡの構成要素として、本発明のペプ
チドをコードすると共に天然ＮＡＮＢＨゲノム中ではそ
れにフランキング（flank）しているポリヌクレオチド
断片を実質的に含まないポリヌクレオチドを使用する。

【００３７】本発明のペプチドをコードする上記タイプ
のポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドが取り込
まれた組換えＤＮＡとは同じく本発明の範囲内にあるも
のとする。

【００３８】前述のごとく製造されたペプチド及びその
フラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナルい
ずれの抗体を生産するのにも使用される。当業者は、本
発明のペプチドに対するモノクローナル抗体を容易に生
産することができるであろう。

【００３９】ハイブリドーマによってモノクローナル抗
体を生産することはよく知られている。細胞融合や無限
増殖の抗体産生細胞系の生産もできるが、腫瘍原性ＤＮ
ＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン
バールウイルスによるトランスフェクションといった他
の手法も使用し得る。

【００４０】本発明のペプチドに対するモノクローナル
及びポリクローナルいずれの抗体も診断に極めて適して
いるが、中和性であるこれらの抗体は、受動免疫療法に
も極めて有効である。特にモノクローナル抗体は、抗イ
ディオタイプ抗体を生産するのに使用することができ
る。抗イディオタイプ抗体を生産する技術は当該分野で
は公知である。

【００４１】前記抗イディオタイプ抗体は、非Ａ非Ｂ型
肝炎の予防及び／または治療においても、またＮＡＮＢ
Ｈ抗原の重要なエピトープ領域の解明においても有用で
ある。

【００４２】本発明の“免疫化学試薬”は通常、１種以
上の本発明のペプチドと適当な支持体または標識物質と
からなる。

【００４３】これに関して使用し得る支持体は、例えば
ＢＳＡのような担体タンパク質、微量定量ウェル（micr
otest well）、キュベット、試験管もしくは毛細管の内
壁、膜、フィルター、試験片、または例えばラテックス
粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルまたはゾル粒子とし
ての金属化合物のような粒子である。

【００４４】使用し得る標識物質は特に、放射性同位
体、蛍光化合物、標識タンパク質（例えば酵素）、酵
素、染料ゾル、金属ゾル、またはゾル粒子としての金属
化合物である。

【００４５】前記免疫化学試薬は、試験液中のＮＡＮＢ
Ｈに対する抗体を検出する方法の必須要素である。免疫
化学試薬を試験液と接触させると免疫化学反応が起こ
り、（本発明の）ペプチドとＮＡＮＢＨ抗体との間で免
疫複合体が形成される結果となる。免疫化学試薬の特性
及び他の特徴に従い、起こる免疫化学反応は所謂サンド
イッチ反応、凝集反応、拮抗反応または阻害反応であ
る。

【００４６】上記反応の結果として形成された免疫複合
体は、試験液中の抗体の存在の（直接的または間接的
な）指標である。

【００４７】本発明の免疫化学試薬は、試験液中のＮＡ
ＮＢＨ抗原を検出するのにも使用することができる。こ
の検出方法においては、試験液を抗ＮＡＮＢＨと接触さ
せ、次いでまたは同時に本発明の免疫化学試薬と接触さ
せる。

【００４８】試験液中のＮＡＮＢＨを検出するのに特に
適した方法は、標識物質を賦与された本発明のペプチド
と（試験液中に存在する）ＮＡＮＢＨ抗原との拮抗反応
に基づいており、ここでは、ペプチドと抗原とが固相支
持体に付着させたＮＡＮＢＨに対する抗体について拮抗
する。

【００４９】本発明の試験キットは、必須構成要素とし
て、前述の免疫化学試薬を含む。ＮＡＮＢＨ抗体検出の
ためにサンドイッチ反応を実施する際には、この試験キ
ットは、例えば１）固相支持体（例えば微量定量ウェル
の内壁）に付着させた本発明のペプチド、及び２）標識
した本発明のペプチドまたは標識抗−抗体のいずれかを
含み得る。

【００５０】ＮＡＮＢＨ抗体検出のために拮抗反応を実
施する際には、本発明の試験キットは、１）固相支持体
に付着させた本発明のペプチド、及び２）ＮＡＮＢＨに
対する標識抗体、好ましくは前記ペプチドに対するモノ
クローナル抗体を含み得る。

【００５１】凝集反応を実施する際には、本発明の試験
キットは、粒子またはゾルに付着させた本発明のペプチ
ドからなる免疫化学試薬を含む。

【００５２】ＮＡＮＢＨ抗原検出用の試験キットは、例
えば標識した本発明のペプチドと、固相支持体に付着さ
せたＮＡＮＢＨに対する抗体とを含む。

【００５３】

【実施例】実施例Ｉ H-Arg-Thr-Gln-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-Arg-Arg-OH 1 5 10 15 上記配列を有するペンタデカペプチドを段階的固相ペプ
チド合成によって製造した。ＶＥＧＡＣｏｕｐｌｅｒ
２５０Ｃ自動ペプチド合成装置またはＬａｂｏｒ
ｔｅｃＳＰ６４０半自動ペプチド合成装置を使用し、
ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（Ｗａｎｇ
樹脂；０．６〜０．７ｍｍｏｌ／ｇ，ＢａｃｈｅｍＡ
Ｇ，スイス）及びＮ²−Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ，９−フル
オレニル−メチルオキシカルボニル）で保護されたアミ
ノ酸を用いて合成を行なった。

【００５４】ＤＭＦ−ジクロロメタン（１：１ｖ／
ｖ）中のＤＣＣ（ジシクロヘキシル−カルボジイミド，
１当量）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル，２当量）及びＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピ
リジン，１当量）を使用し、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｃ）−ＯＨを樹脂に、４℃で１８時間かけて結合させる
ことにより合成を開始した。樹脂上の未反応のアルコー
ル官能基を、ベンゾイルクロリド−ピリジンを使用しベ
ンゾイル化することにより２時間かけてブロックした。

【００５５】得られたＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹
脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＭＦ中の２０％ピペ
リジンで６分間、続けて３回処理し、Ｆｍｏｃ基を除去
した。次いで、アミノ酸配列に従ってＦｍｏｃ−アミノ
酸の結合ステップを続けて行ない、保護されたペンタデ
カペプチドをＨ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂上に作製し
た。側鎖保護基は以下のものを使用した：Ａｒｇに対し
てはＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマ
ン−６−スルホニル−）；Ｔｈｒ及びＳｅｒに対しては
ｔＢｕ（ｔｅｒｔ．ブチル）；Ｌｙｓに対してはＢｏｃ
（ｔ−ブチルオキシカルボニル）；及びＡｓｎ及びＧｌ
ｎに対してはＴｒｔ（トリチル）。

【００５６】各結合ステップは、樹脂１ｇ当たり１２〜
１５ｍｌのＤＭＦ中、各々３当量のＦｍｏｃ−アミノ
酸、ＢＯＰ（＝ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジ
メチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフ
ェート）及びＨＯＢｔと、４．５当量のＤＩＰＥＡ（＝
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミン）とを使用し１
５分間実施し、次いでＤＭＦ及びエタノールを用いた洗
浄（各１分間）を３サイクル実施した。結合反応の完了
は、Ｋａｉｓｅｒのニンヒドリン試験によってモニター
した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，５９５−５
９８，１９７０）。Ｓｅｒ¹⁰及びＡｒｇ⁵の結合の後に
ニンヒドリン反応に陽性が認められた。各ケースで、１
当量の対応するＦｍｏｃ−アミノ酸、ＢＯＰ、ＨＯＢｔ
及び１．５当量のＤＩＰＥＡを使用し、３０分間の結合
反応を繰り返した。残りの遊離アミノ基は全て、無水酢
酸−ＤＭＦ（５：９５；ｖ／ｖ）を使用したアセチル化
によって１０分間かけてブロックし、次いでＤＭＦ及び
エタノール（各１分間）を用いそれぞれ洗浄した。

【００５７】各合成サイクル後、前述のごとくＤＭＦ中
の２５％ピペリジンで処理することによりＮ²−Ｆｍｏ
ｃ−保護基を除去した。

【００５８】合成完了後、得られた完全に保護されたペ
ンタデカペプチド樹脂を、トルフルオロ酢酸−水−フェ
ノール−チオアニソール−エタンジチオール（８２：
５：５：５：２．５ｖ／ｖ）の混合物中、室温で１８
時間処理し、樹脂からペプチドを分離すると同時に、全
ての保護基を除去した。反応混合物をジエチルエーテル
に加えて沈澱させ、粗ペプチドを単離した。次いで、ｐ
Ｈ２．１の０．１Ｍリン酸緩衝液中のアセトニトリル勾
配を使用するＣ₁₈−シリカ上のＨＰＬＣによってペンタ
デカペプチドを精製した。

【００５９】実施例II 対応する方法で、H-Lys-Thr-Gln-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-
Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-Arg-Arg-OH、H-Arg-Thr-Gln-Gln-
Arg-Lys-Trp-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-Arg-Arg-OH、H-
Gly-Thr-Gln-Gln-Arg-Lys-Trp-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Ar
g-Arg-Arg-OHを製造した。

【００６０】実施例III Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＯＨ及び誘導体上記ノナペプチドを、実施例Ｉに記載のプロセスに本質
的に従って段階的固相ペプチド合成によって製造した。
多数の配列を同時合成し得るように、実施例Ｉの方法を
改良した。例えば、ビーズ状のポリスチレンベース樹脂
に代えて、ペプチド合成用の固相支持体として、ポリエ
チレンまたはポリプロピレンのような不活性材料で構築
されているブロックに取り付けられた誘導体化されたポ
リマーロッド（１ピン当たり１５０〜３００ｎｍｏｌの
アミンを負荷）を使用した。全ての洗浄ステップ、結合
ステップ及び脱保護ステップは、適当な溶液を含む容器
中に（ブロックに取り付けられている）ロッドを浸漬す
ることにより実施した。

【００６１】鎖延長のためには、濃度３０ｍｍｏｌ／リ
ットルのＨＯＢｔの存在下に、濃度３０ｍｍｏｌ／リッ
トルの予め活性化させたＮ²−Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｏ
ＰｆｐまたはＯＤｈｂｔエステル）を使用した。各合成
サイクル後に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いてＮ
²−Ｆｍｏｃ−基を除去した。側鎖保護基は以下のもの
を使用した：Ａｒｇに対しては−Ｐｍｃ；Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ及びＧｌｕに対しては−ｔＢｕ；Ｌｙｓに対してはＢ
ｏｃ；Ａｓｎ及びＧｌｎに対してはＴｒｔ。

【００６２】典型的な合成サイクルは以下のステップか
らなった：１．脱保護（ＤＭＦ中の２０％ピペリジン）３０分間２．洗浄：ＤＭＦ１×５分間メタノール４×２分間３．空気乾燥１０分間４．洗浄：ＤＭＦ１×５分間５．結合（ＤＭＦ中、３０ｍＭＦｍｏｃアミノ酸活性エステル及び３０ｍＭＨＯＢｔ）１８時間６．洗浄：ＤＭＦ１×２分間メタノール４×２分間ＤＭＦ１×２分間７．空気乾燥１×２分間合成完了後、前述のごとくＤＭＦ中の２０％ピペリジン
で処理することによりＮ²−Ｆｍｏｃ−基を除去し、ト
リフルオロ酢酸−フェノール−エタンジチオール＝９５
−２．５−２．５（ｖ／ｍ／ｖ）を用い室温で４時間処
理することにより他の保護基を除去し、ペプチドと固相
支持体との間の結合はそのまま残した。次いでピンを、
塩化メチレン、メチレンクロリド中の５％ジイソプロピ
ルアミン、塩化メチレン及びメタノールを用いて順次洗
浄し、乾燥した。

【００６３】以下のペプチドを製造した。

【００６４】１．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH ２．H-Glu-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH 3.H-pyroGlu-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH ４．H-Arg-Lys-Trp-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH ５．H-Arg-Lys-Thr-Thr-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH ６．H-Arg-Lys-Thr-Glu-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH ７．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Asn-Thr-Asn-Arg-OH ８．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ile-Thr-Asn-Arg-OH ９．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Arg-Asn-Arg-OH １０．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Met-Arg-OH １１．H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Lys-OH １２．H-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH １３．H-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-Ar
g-OH実施例IV 実施例Ｉのペンタデカペプチドを、標準的なグルタル酸
結合方法によってウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に共有
結合させた。等しい量の０．３ｍＭＢＳＡ，４ｍＭ
ペンタデカペプチド及び７ｍＭグルタル酸の１００ｍ
Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．０を一緒に加えた。

【００６５】室温で一晩インキュベートした後、０．１
培容の４０％スクロース，１Ｍグリシン，０．０８Ｍ
ＮａＨ₂ＰＯ₄，０．０２５ＭＮａＢＨ₄，ｐＨ７．０
を加え、室温で１時間インキュベートすることにより反
応を停止させた。ペプチド−ＢＳＡ結合体を、０．０５
Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．６で２０μｇ／ｍｌに希釈し、
この溶液１３５μｌをマイクロタイタプレートのウェル
に入れた。ペプチド−ＢＳＡ結合体を４℃で一晩吸着さ
せた。次いでプレートを空にし、残留した結合部位を、
０．１ＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．２％ＢＳＡ及び
０．０３ＭＫＩの溶液を用い、室温で２０分間かけて
ブロックした。次いでプレートを室温で一晩空気乾燥
し、シリカゲル上に４℃で保存した。ＮＡＮＢＨに特異
的な抗体を検出するために、血清試料を、ウェル中にピ
ペットで滴下した試料希釈液（ＰＢＳ／２０％正常ヤギ
血清／１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１００μｌ／ウ
ェル）で１：１０に希釈し、３７℃で１時間インキュベ
ートした。

【００６６】ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０（登録商標）で洗浄した後、試料希釈液で希釈した
ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル，３７℃で１時
間）で標識したヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用い、結合
したヒト抗体を検出した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（登録商標）でプレートを４回洗浄した。ペ
ルオキシダーゼ酵素のための基質としてＴＭＢを加え
（１００μｌ／ウェル）、室温で３０分間反応させた。
各ウェルに１００μｌの２ＭＨ₂ＳＯ₄を加えることに
より反応を停止させた。ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋ
ａｍｉｃｒｏｅｌｉｓａリーダーにおいて４５０ｎｍ
での黄色を読み取った。

【００６７】実施例Ｖ更に実施例IIIのペプチドを、ＮＡＮＢＨを有する患者
由来の血清との反応性について試験した。ノナペプチド
１〜１３を、実施例IVに記載したのと実質的に同じ方法
で固相支持体に結合させた。ＮＡＮＢＨを有する患者由
来の血清試料との免疫反応性を実施例IVに記載のごとく
確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ 39/29 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4Ｃ 39/42 9284−4ＣＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列：Ｘ−ａ−Ｌｙｓ−ｂ−ｃ−Ａｓｎ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ−ＹＩ５６７８９ 10 11 12 13 〔配列中、“ａ”はアミノ酸残基：Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇ
ｌｕまたはｐｙｒｏＧｌｕを表わし、 “ｂ”はＴｈｒまたはＴｒｐを表わし、 “ｃ”はＬｙｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＴｈｒまたはＳｅｒ
を表わし、 “ｄ”はＳｅｒ、ＡｓｎまたはＩｌｅを表わし、 “ｅ”はＴｈｒまたはＡｒｇを表わし、 “ｆ”はＡｓｎまたはＭｅｔを表わし、 “ｇ”はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＩｌｅまたはＭｅｔ
を表わし、Ｘは、水素、または、記号：ｈ₄−、ｈ₃−ｈ₄−、ｈ₂−ｈ₃−ｈ₄−もしくはｈ₁−ｈ₂
−ｈ₃−ｈ₄− （ここで、ｈ₄はアミノ酸残基ＧｌｎまたはＶａｌであ
り、ｈ₃はアミノ酸残基Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔま
たはＰｒｏであり、ｈ₂はアミノ酸残基ＴｈｒまたはＳｅｒであり、ｈ₁はアミノ酸残基Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＴｒ
ｐである）によって示されるアミノ酸、ジペプチド、ト
リペプチドもしくはテトラペプチドを表わし、Ｙは、ヒドロキシ、または、記号： −ｈ₁₄もしくは−ｈ₁₄−ｈ₁₅ （ここで、ｈ₁₄は、Ａｒｇ及びＧｌｕから選択されるア
ミノ酸残基であり、ｈ₁₅は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＬｙｓから選択される）に
よって示されるアミノ酸もしくはジペプチドを表わす〕
を有するペプチド、ＮＡＮＢＨ抗体に免疫化学反応性を
示すそのフラグメント及び必須構成要素として前記ペプ
チドを含むポリペプチド、並びにこれらの機能的誘導
体。
【請求項２】請求項１に記載のペプチドを含む免疫化
学試薬。
【請求項３】試験液中のＮＡＮＢＨに対する抗体を検
出する方法であって、請求項２に記載の免疫化学試薬を
前記試験液と接触させ、該試験液中のＮＡＮＢＨ抗体の
存在の指標である、前記ペプチドと該試験液中の抗体と
で形成される免疫複合体の存在を検出することを特徴と
する該方法。
【請求項４】試験液中のＮＡＮＢＨを検出する方法で
あって、請求項２に記載の免疫化学試薬を前記試験液及
び抗ＮＡＮＢＨと接触させ、その後、形成された免疫複
合体の存在を検出し、これから前記試験液中のＮＡＮＢ
Ｈの存在を決定することを特徴とする該方法。
【請求項５】請求項３または４に記載の免疫測定法に
使用される試験キット。