DE69106998T2 - Mit Antikörper gegen Hepatitis-Virus non-A, non-B immunochemisch reagierende Peptide. - Google Patents

Mit Antikörper gegen Hepatitis-Virus non-A, non-B immunochemisch reagierende Peptide.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf Peptide, welche immunochemisch mit Antikörpern reagieren- welche gegen Hepatits-Non-A, Non-B-Virurs (NANBH-Virus) gerichtet sind.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren für den Nachweis von NANBH oder Anti-NANBH in einer Testflüssigkeit und auf ein immunochemisches Reagenz und auf eine Testgarnitur, welche in diesen Nachweisverfahren verwendet werden können.
  • Non-A, Non-B-Hepatits (welche durch Hepatits C-Virus hervorgerufen werden kann oder nicht) ist eine übertragbare Erkrankung oder Familie von Erkrankungen, welche als virusinduziert nachgewiesen wurden. Es kann unterschieden werden zwischen anderen Formen von viral-assoziierten Lebererkrankungen, einschliesslich derjenigen, die durch die bekannten Hepatits-Viren hervorgerufen werden, das heisst Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Delta-Hepatitis-Virus (HDV) und Hepatitis, welche durch Cytomegalovirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) induziert sind. NANBH wurde zuerst in Patienten identifiziert, welche einer Transfusion unterzogen worden waren. Die Uebertragung von Menschen zu Schimpansen und Serienpassagen in Schimpansen ergaben den Nachweis, dass NANBH auf einen oder mehrere ubertragbare infektiöse Mittel zurückzuführen ist. Das für NANBH verantwortliche Mittel ist jedoch noch immer nicht vollständig identifiziert, und die Anzahl Mittel, welche für die Erkrankung(en) ursächlich sind, ist unbekannt.
  • Der epidemiologische Nachweis lässt vermuten, dass drei Typen von NANBH existieren: der durch Wasser getragene epidemische Typus; der mit Blut oder der Nadel assoziierte Typus und der sporadisch auftretende (in der Gemeinschaft aufgenommene) Typus. Die Anzahl Mittel, welche NANBH hervorrufen, ist jedoch unbekannt.
  • Die klinische Diagnose und Identifizierung von NANBH wurde primär durch Exklusion anderer viraler Marker durchgeführt. Unter den Methoden, die verwendet wurden, um putative NANBH-Antigene und -Antikörper nachzuweisen, ist die Agar- Gel-Diffusion, die Gegen-Immunoelektrophorese, die Immunofluorescenz-Mikroskopie, die Immunelektronenmikroskopie, der Radioimmuntest und der enzymgebundene Immunosorbenttest. Keiner dieser Versuche erwies sich jedoch als genügend empflindlich, spezifisch und reproduzierbar, um als diagnostischer Test für NANBH verwendet werden zu können.
  • Für die Entwicklung eines spezifischen und empfindlichen Verfahrens, um eine verlässliche Diagnose in verschiedenen Phasen der Infektion mit NANBH durchführen zu können, ist es von grosser Wichtigkeit, immun-dominante virale Epitope dieses Typus zu identifizieren.
  • Das europäische Patentgesuch EP-A-0 388 232 offenbart die vollständige Aminosäureseguenz des offenen Leserasters von Hepatitis C-Virus. In unserem Gesuch EP-A-90 200 775.6 haben wir ein Peptid mit 15 Aminosäuren und einer Aminosäuresequenz offenbart, welche immunochemisch reaktionsfähig mit NANBH-Antikörpern ist. Ferner wurden sehr potente Fragmente dieses Pentadekapeptids offenbart, insbesondere da Nonapeptid mit der Aminosäuresequenz Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Ser- Thr-Asn-Arg.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Peptide, welche verbesserte immunochemische Reaktionsfähigkeit mit NANBH-Antikörpern aufweisen.
  • Die neuen Peptide gemäss der Erfindung sind durch die folgende Aminosäureseguenz gekennzeichnet:
  • in welcher
  • "a" die Aminosäurereste: Arg, Gln, Glu oder pyroGlu bedeutet,
  • "b" Thr oder Trp bedeutet,
  • "c" Lys, Val, Glu, Thr oder Ser bedeutet,
  • "d" Ser, Asn oder Ile bedeutet,
  • "e" Thr oder Arg bedeutet,
  • "f" Asn oder Met bedeutet,
  • "g" Arg, Lys, Tyr, Ile oder Met bedeutet und in welcher
  • X Wasserstoff oder eine Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid bedeutet, welches durch die Symbole:
  • h&sub4;-, h&sub3;-h&sub4;-, h&sub2;-h&sub3;-h&sub4;- oder h&sub1;-h&sub2;-h&sub3;-h&sub4;- angegeben sind, in welchen
  • h&sub4; der Aminosäurerest Gln oder Val ist,
  • h&sub3; der Aminosäurerest Gln, Glu, His, Met oder Pro ist,
  • h&sub2; der Aminosäurerest Thr oder Ser ist und
  • h&sub1; der Aminosäurerest Arg, Gly, Lys oder Trp ist,
  • Y Hydroxy oder eine Aminosäure oder ein Dipeptid bedeutet, welcher angegeben ist durch die Symbole: -h&sub1;&sub4; oder -h&sub1;&sub4;-h&sub1;&sub5;, in welchen
  • h&sub1;&sub4; ein Aminosäurerest ausgewählt aus Arg und Glu ist, und
  • h&sub1;&sub5; ausgewählt ist aus Arg, Glu und Lys.
  • Die obigen Peptide weisen verbesserte immunochemische Reaktionsfähigkeit mit NANBH-Antikörpern auf, wenn sie mit den Pentadecapeptiden mit der Sequenz Arg-Thr-Gln-Gln-Arg-Lys- Thr-Lys-Arg-Ser-Thr-Asn-Arg-Arg-Arg verglichen werden, wie sie in unserem EP-Gesuch Nr. 90 200 775.6 offenbart sind.
  • Unter verbesserter immunochemischer Reaktionsfähgikeit ist zu verstehen, dass Peptide eine verbesserte immunochemische Reaktionsfähgikeit im Vergleich mit den genannten Pentadecapeptiden aufweisen, wenn die Verwendung der neuen Peptide in einem Testverfahren, wie es im Beispiel 4 beschrieben ist, oder in jedem anderen geeigneten Immunotest zu einer höheren Spezifität und/oder Empfindlichkeit des Tests führt.
  • Bevorzugte Peptide gemäss der Erfindung, welche ausgezeichnete Affinität zu NANBH-Antikörper aufweisen, sind Peptide gemäss der obigen allgemeinen Formel, in welcher allein oder in Kombination
  • X Wasserstoff oder das Tetrapeptid h&sub1;-h&sub2;-h&sub3;-h&sub4; bedeutet und
  • Y Hydroxy oder das Dipeptid -h&sub1;&sub4;-h&sub1;&sub5; bedeutet, wobei h&sub1;&sub5; vorzugsweise ausgewählt ist aus Arg und Lys.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf Fragmente der Peptide der Formel I, welche noch immunochemisch reaktionsfähig mit NANBH-Antikörpern sind, und (Poly)Peptide, welche die genannten Peptide der Formel I oder aktive Fragmente davon als wesentlichen Teil der Aminosäureseguenz enthalten, vorausgesetzt, dass die aktiven Fragmente der Peptide der Formel I den Aminosäurerest Asn in einer Stellung enthalten, welche der Stellung 9 der Peptide der Formel I entspricht. Zusätzlich zu den obigen Peptiden werden auch funktionelle Derivate dieser Peptide als zu den Peptiden gemäss der vorliegenden Erfindung gehörend betrachtet. Funktionelle Derivate der Peptide werden so verstanden, dass sie einschliessen
  • a) Säureadditionssalze der Peptide;
  • b) Amide der Peptide und spezifisch die C-endständigen Amide;
  • c) Ester und spezifisch C-endständige Ester und
  • d) N-acylderivate, spezifisch N-endständige Acylderivate und insbesondere N-acetylderivate.
  • Die Peptide gemäss der Erfindung sind besonders geeignet zur Verwendung in einem diagnostischen Ver fahren Üür die Bestimmung der Gegenwart von NANBH-Antigenen oder NANBH-Antikörper in einer Testflüssigkeit.
  • Im Gegensatz zu der natürlichen NANBH weisen die Peptide gemäss der Erfindung den Vorteil auf, dass sie von sicherer, nicht infektiöser Quelle stammen. Ausserdem weisen die vorliegenden Peptide eine besondere Affinität zu NANBH-Antikörper auf, was die vorliegenden Peptide äusserst geeignet macht zur Verwendung in den oben erwähnten diagnostischen Testverfahren.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht daher aus einem immunochemischen Reagenz (was später erläutert wird) welches Reagenz ein oder mehrere der Peptide der Erfindung enthält.
  • Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren für den Nachweis von Antikörpern, welche gegen NANBH gerichtet sind, in einer Testflüssigkeit, wobei ein oder mehrere der Peptide gemäss der Erfindung verwendet werden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für den Nachweis von NANBH in einer Testflüssigkeit unter Verwendung von einem oder mehreren der Peptide gemäss der Erfindung.
  • Schliesslich bezieht sich die Erfindung auf eine Testgarnitur zur Verwendung bei der Durchführung eines immunologischen Tests, wobei diese Testgarnitur mindestens ein immunochemisches Reagenz gemäss der Erfindung enthält.
  • Es liegt innerhalb des Geltungsbereiches dieser Erfindung, die neue Nukleotidseguenz oder einen oder mehrere Teile davon, welche für die Aminosäuresequenz(en) gemäss der Erfindung codieren, sogenannte Primer, als Grundlage für einen Test zum Nachweis von NANBH-DNA oder -RNA durch eine Nukleisäureamplifikationstechnik, z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder die auf Nukleisäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA), wie in US-Patent Nr. 4,683,202 bzw. EP-329 822 beschrieben, zu verwenden.
  • Ein Teil der Erfindung umfasst eine Testamplifikationsgarnitur zur Durchführung eines Amplifikations- und Nachweisverfahrens wie oben beschrieben.
  • Ausserdem kann ein Peptid oder Fragment gemäss der Erfindung in geeigneten pharmazeutischen Dosierungsformen für die Prävention und/oder Behandlung von NANB-Hepatitiserkrankungen eingesetzt werden. Die Herstellung von derart erhaltenen Impfstoffen unter Verwendung eines solchen Peptids oder eines Fragmentes davon als aktive Bestandteile kann vom Fachmann durchgeführt werden.
  • Die Herstellung der Peptide gemäss der Erfindung wird mit Hilfe von einer der bekannten organisch-chemischen Methoden für die Peptidsynthese oder mit Hilfe von rekombinanter DNA-Techniken durchgeführt. Diese letztgenannte Methode umfasst die Herstellung des gewünschten Peptids, indem ein rekombinantes Polynukleotid mit einer Polynukleotidsequenz, welche für eines oder mehrere der fraglichen Peptide codiert, in einem geeigneten Mikroorganismus als Wirt zur Expression gebracht wird.
  • Die organisch-chemischen Methoden für die Peptidsynthese umfassen die Kupplung der erforderlichen Aminosäuren mit Hilfe einer Kondensationsreaktion, entweder in homogener Phase oder mit Hilfe einer sogenannten Festphase.
  • Die Kondensationsreaktion kann wie folgt durchgeführt werden:
  • a) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Carboxylgruppe und geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Aminogruppe und geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen, wobei eine der Schutzgruppen auch eine (derivatisierte) feste Unterlage sein kann, in Gegenwart eines Kondensationsmittels,
  • b) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer aktivierten Carboxylgruppe und freien oder geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Aminogruppe und freien oder geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen, wobei eine der Schutzgruppen auch eine (derivatisierte) feste Unterlage sein kann.
  • Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann unter anderem durch Umwandlung der Carboxylgruppe in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazold oder einen aktivierten Ester, wie der N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol-, p-Nitrophenyl, 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (ODhbt) oder Pentafluorophenyl (OpFp)-Ester, erfolgen.
  • Die üblichsten Methoden für die obigen Kondensationsreaktionen sind: die Karbodiimidmethode, die POP-Methode [Benzotriazolyloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphat], die Azidmethode, die gemischte Anhydridmethode und die Methode unter Verwendung aktivierter Ester, wie in The Peptides, Analysis, Synethsis, Biology Vol. 1-3 (Ed. Gross, E. und Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.) beschrieben.
  • Die reaktionsfähigen Gruppen, welche an der Kondensationsreaktion nicht teilnehmen dürfen, werden, wie erwähnt, wirksam geschützt durch Gruppen, welche wiederum sehr leicht durch Hydrolyse mit Hilfe von Säure, Base oder Reduktion entfernt werden können. So kann eine Carboxylgruppe wirksam geschützt werden durch z.B. Veresterung mit Methanol, Ethanol, tertiärem Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol, und Amidierung mit Aminen oder Derivaten von Alkoholen und Aminen, die an feste Unterlagen gebunden sind.
  • Gruppen, welche wirksam eine Aminogruppe schützen können, sind die Ethoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl-, 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl(Fmoc)- oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe oder eine Säuregruppe, welche abgeleitet ist von einer Sulfonsäure, wie die p-Toluenesulfonyl-, Penta-methylbenzolsulfonyl (Pms)-, 4-Methoxy-2,3,6- trimethylbenzolsulfonyl (Mtr)- oder 1,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc)-Gruppe, aber andere Gruppen können ebenfalls verwendet werden, wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, z.B. Benzyl und Triphenylmethyl, oder Gruppen wie ortho-Nitrophenyl-sulfenyl und 2-Benzoyl-1-methylvinyl.
  • Eine ausführlichere Aufzählung möglicher Schutzgruppen kann gefunden werden in The peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-9 (Eds. Gross, Udenfriend und Meienhofer) 1979- 1987 (Academic Press, Inc.).
  • Die Herstellung der oben erwähnten Peptide gemäss der Erfindung unter Verwendung der "Festphasen"-Methode ist beispielsweise in J.Am.Chem.Soc., 85 2149 (1963) und Int.J.Peptide Protein Res., 35 161-214 (1990) beschrieben. Die Kupplung der Aminosäuren der herzustellenden Peptide beginnt üblicherweise von dem Carboxylende her. Für diese Methode wird eine Festphase benötigt, auf welcher sich reaktionsfähige Gruppen befinden, oder auf welche solche Gruppen eingeführt werden können. Dies kann z.B. ein Copolymer von Benzol und Divinylbenzol mit reaktionsfähigen Chlormethylgruppen oder eine polymere Festphase, welche mit Hydroxymethyl- oder Aminfunktionen reaktionsfähig gemacht wurde, sein.
  • Eine besonders geeignete Festphase ist z.B. das p-Alkoxybenzylalkoholharz (4-Hydroxymethyl-phenoxy-methyl-copolystol-1% Divinylbenzolharz), das durch Wang (1974), J.Am.Chem.Soc., 95, 1328, beschrieben ist. Nach der Synthese können die Peptide von dieser Festphase unter milden Bedingungen abgespalten werden. Andere geeignete Unterlagen sind derivatisierte Polyethylene- oder Polypropylenstäbe, wie von Geysen, Proc, Natl. Acad. Sci., 81, 3998 (1984) und Proc. Natl. Acad. Sci 82 178 (1985) beschrieben.
  • Nach Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz, entweder in Lösung oder auf einer festen Unterlagen, können die Schutzgruppen durch verschiedene übliche Methoden abgespalten werden, je nach der Natur der jeweiligen Gruppe, z.B. mit Hilfe von Trifluoroessigsäure oder durch milde Reduktion, z.B. mit Wasserstoff und einem Katalisator, wie Palladium, Behandlung mit einer Base, wie z.B. Piperidin oder Hydroxidionen, oder mit HBr in Eisessig.
  • Wenn das Peptid auf einer festen Unterlagen synthetisiert wird, von welcher es abgelöst werden kann, kann dies, je nach dem Typus des Linkers z.B. mit Trifluoroessigsäure, Trifluoromethansulfonsäure oder mit Methansulfonsäure, gelöst in Trifluoroessigsäure, Umesterung mit einem niederen Alkohol, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, erfolgen, in welchem Fall ein niederer Alkylester des Peptids direkt gebildet wird. Auf ähnliche Weise ergibt das Abspalten mit Hilfe von Ammoniumhydroxid das Amid eines Peptids gemäss der Erfindung.
  • Wie bereits oben angeführt, kann das Peptid gemäss der Erfindung ebenso hergestellt werden mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken. Diese Möglichkeit ist wichtig, insbesondere wenn das Peptid in eine sich wiederholende Sequenz einverleibt ist ("in tandem") oder wenn das Peptid als ein wesentlicher Bestandteil eines (viel grösseren) Proteins oder Polypeptids hergestellt werden kann. Diese Herstellungsart des Peptids fällt ebenfalls in den Geltungsbereich der Erfindung. Zu diesem Zweck wird ein Polynukleotid als ein Bestandteil einer rekombinanten DNA verwendet, welches für das Peptid gemäss der Erfindung codiert und welches ausserdem im wesentlichen frei von Polynukleotidsegmenten ist, welche im natürlich vorkommenden NANBH-Genom die oben angegebene Polynukleotidsequenz flankieren.
  • Ein Polynukleotid dieser Art, welches für das Peptid gemäss der Erfindung codiert, und eine rekombinante DNA, in welcher dieses Polynukleotid einverleibt ist, fallen ebenfalls in den Geltungsbereich der Erfindung.
  • Die hergestellten und oben beschriebenen Peptide oder Fragmente davon werden verwendet, um Antikörper, sowohi polyklonale wie monoklonale, zu erzeugen. Monoklonale Antikörper, welche gegen Peptide gemäss der Erfindung gerichtet sind, können leicht durch den Fachmann erzeugt werden.
  • Die Herstellung von Monoklonalen durch Hybridome ist gut bekannt. Zellfusion, unsterbliche Antikörper erzeugende Zelllinien können gebildet werden, während auch andere Techniken zur Verfügung stehen, wie die direkte Umwandlung von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus.
  • Antikörper, sowohl monoklonale wie polyklonale, welche gegen Peptide gemäss der Erfindung gerichtet sind, eignen sich sehr für die Diagnose, während jene Antikörper, welche neutralisierend sind, sehr nützlich sind für die passive Immuntherapie. Besonders monoklonale Antikörper können verwendet werden, um anti-idiotype Antikörper zu entwickeln. Techniken zur Entwicklung anti-idiotyper Antikörper sind in Fachkreisen bekannt.
  • Diese anti-idiotypen Antikörper sind auch nützlich für die Prävention und/oder Behandlung von Non-A-, Non-B-Hepatitis, wie auch für die Aufklärung wichtiger epitoper Regionen von NANBH-Antigenen.
  • Das "immunochemische Reagenz" gemäss der Erfindung besteht üblicherweise aus einem oder mehreren Peptiden gemäss der Erfindung und einer geeigneten Unterlage oder einer Markierungssubstanz.
  • Eine Unterlage, welche in diesem Zusammenhang verwendet werden kann, ist z.B. ein Trägerprotein, wie BSA, ciie innere Wand einer Mikrotestvertiefung oder eine Cuvette, ein Rohr oder eine Kapillare, eine Membran, ein Filter, ein Teststreifen oder ein Partikel, wie z.B. ein Latexpartikel, ein Erythrocyt, ein Farbstoffsol, ein Metallsol oder eine Metallverbindung als Solpartikel.
  • Eine Markierungssubstanz, welche verwendet werden kann, ist unter anderem ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein markierendes Protein, wie ein Enzym, ein Farbstoffsol, ein Metallsol oder eine Metallverbindung als Solpartikel.
  • Dieses immunochemische Reagenz ist eine wesentliche Komponente in einem Verfahren für den Nachweis von Antikörpern, welche gegen NANBH gerichtet sind, in einer Testflüssigkeit. Das immunochemische Reagenz wird daher in Berührung mit dieser Testflüssigkeit gebracht, wobei eine immunochemische Reaktion erfolgt, welche zur Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Peptid (gemäss der Erfindung) und den NANBH.Antikörpern führt Abhängig von der Natur und weiteren Kennzeichen des immunochemischen Reagenz ist die immunochemische Reaktion, welche stattfindet, eine sogenannte Sandwich-Reaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitationsreaktion.
  • Der als Resultat der obigen Reaktion gebildete Immunkomplex ist ein (direktes oder indirektes) Mass für die Gegenwart von Antikörpern in der Testflüssigkeit.
  • Das immunochemische Reagenz gemäss der Erfindung kann auch für den Nachweis von NANBH-Antigen in einer Testflüssigkeit verwendet werden. In dieser Nachweismethode wird die Testflüssigkeit mit Anti-NANBH in Berührung gebracht und anschliessend oder gleichzeitig mit dem immunochemischen Reagenz gemäss der Erfindung.
  • Ein besonders geeignetes Verfahren für den Nachweis von NANBH in einer Testflüssigkeit beruht auf einer Kompetitionsreaktion zwischen einem Peptid gemäss der Erfindung, welches mit einer Markierungssubstanz versehen ist, und einem NANBH-Antigen (in der Testflüssigkeit vorhanden), wobei das Peptid und das Antigen mit dem gegen NANBH gerichteten Antikörper, welcher an eine feste Unterlage gebunden ist, konkurrenzieren.
  • Eine Testgarnitur gemäss der Erfindung umfasst als wesentlichen Bestandteil ein immunochemisches Reagenz, wie oben beschrieben. Bei der Durchführung einer Sandwichreaktion für den Nachweis von NANBH-Antikörpern, kann die Testgarnitur zum Beispiel
  • 1) das Peptid gemäss der Erfindung, gebunden an eine feste Unterlage (z.B. innere Wand einer Mikrotestvertiefung) und
  • 2) entweder ein markiertes Peptid gemäss der Erfindung oder einen markierten Anti-Antikörper enthalten.
  • Bei der Durchführung einer Kompetitionsreaktion für den Nachweis von NANBH-Antikörpern, kann die Testgarnitur
  • 1) das Peptid gemäss der Erfindung, gebunden an eine feste Unterlage, und
  • 2) einen markierten Antikörper, welcher gegen NANBH gerichtet ist, vorzugsweise ein mcnoclonaler Antikörper, der gegen diese Peptid gerichtet ist, enthalten.
  • Bei der Durchführung einer Agglutinationsreaktion enthält die Testgarnitur ein immunochemisches Reagenz, welches aus einem Peptid gemäss der Erfindung, gebunden an Partikel oder Sole, besteht.
  • Eine Testgarnitur für den Nachweis von NANBH-Antigen umfasst zum Beispiel ein markiertes Peptid gemäss der Erfindung und einen Antikörper, der gegen NANBH gerichtet ist, welcher an eine feste Unterlage gebunden ist. Beispiel I
  • Das Pentadecapeptid mit der oben gezeigten Seguenz wurde durch stufenweise Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die Synthese wurde unter Verwendung eines VEGA Coupler 250 C automatisierten Peptid-Synthesizers oder eines Labortec SP640 halbautomatischen Peptid-Synthesizers und unter Verwendung eines p-Benzyloxybenzylalkoholharzes (Wang-Harz; 0,6-0,7 mMol/g, Bachem AG, Schweiz) und Nα-Fmoc-geschüzten Aminosäuren (Fmoc, 9-Fluorenyl-methyloxy-carbonyl) durchgeführt.
  • Die Synthese begann mit der Kupplung von Fmoc-Arg(Pmc)-OH an das Harz unter Verwendung von DCC (Dicyclohexyl-carbodiimide, 1 Äquivalent), HOBt (1-Hydroxybenzo-triazol, 2 Äquivalente) und DMAP (N,N-Dimethylaminopyridin, 1 Äquivalent) in DMF-Dichlormethan (1:1, Vol/Vol) bei 4ºC während 18 Stunden. Nicht umgesetzte Alkoholfunktionen am Harz wurden sodann durch Benzoylierung unter Verwendung von Benzoylchlorid-Pyridin während zwei Stunden blockiert.
  • Das resultierende Fmoc-Arg(Pmc)-Harz (0,38 mMol/g) wurde nacheinander dreimal mit 20% Piperidin in DMF während 6 Minuten behandelt, um die Fmoc-Gruppe zu entfernen. Das geschützte Pentadecapeptid wurde sodann auf dem H-Arg(Pmc)- Harz durch aufeinanderfolgende Kupplungsstufen der Fmoc- Aminosäuren hergestellt, wie durch die Aminosäuresequenz vorgeschrieben. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen wurden verwendet: Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl-) für Arg; tBu (tert.Butyl) für Thr und Ser; Boc(t- butyloxycarbonyl) für Lys und Trt (Trityl) für Asn und Gln.
  • Jede Kupplungsstufe wurde durchgeführt unter Verwendung von je 3 Äquivalenten Fmoc-aminosäure, BOP [-Benzotriazolyloxy- tris(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat], HOBt und 4,5 Äquivalenten DIPEA (-N,N-Diisopropyl-ethylamin) in 12-15 ml DMF pro Gramm Harz während 15 Minuten, gefolgt von 3 Waschzyklen (je eine Minute) mit DMF und Aethanol. Die Vollendung der Kupplungsreaktion wurde mit Hilfe des Ninhydrintests nach Kaiser (Anal. Biochem. 34, 595-598. 1970) überwacht. Eine positive (Ninhydrinreaktion wurde im Anschluss an die Kupplung von Ser¹&sup0; und Arg&sup5; beobachtet. In jedem Fall wurde die Kupplungsreaktion wiederholt unter Verwendung von einem Aequivalent der entsprechenden Fmocaminosäure, BOP, HOBt und 1,5 Äquivalenten DIPEA während 30 Minuten. Alle verbliebenen freien Aminogruppen wurden sodann durch Acetylierung unter Verwendung von Essigsäureanhydrid-DMF (5:95; Vol/Vol) während 10 Minuten und anschliessende Waschungen mit DMF bzw. mit Ethanol (je eine Minute) blockiert.
  • Nach jedem Synthesezyklus wurde die Nα-Fmoc-Schutzgruppe durch Behandlung mit 25% Piperidin in DMF entfernt, wie oben beschrieben.
  • Nach Vollendung der Synthese wurde das resultierende, vollständig geschützte Pentadecapeptidharz in einem Gemisch von Trifluoressigsäure - Wasser -Phenol - Thioanisol - Ethandithiol (82:5:5:5:2,5 Vol/Vol) während 18 Stunden bei Zimmertemperatur behandelt, um eine Freigabe des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entfernung aller Schutzgruppen zu erzielen. Das rohe Peptid wurde nach Ausfällung nach Zusatz des Reaktionsgemisches zu Diethyläther isoliert. Das Pentadecapeptid wurde durch HPLC auf C&sub1;&sub8;-Siliziumoxyd gereinigt unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 2.1.
    • Beispiel II
  • Auf entsprechende Weise wurden hergestellt:
    • Beispiel III
  • H-Arg-Lys-Thr-Lys-Asn-Ser-Thr-Asn-Arg-OH und Derivate davon.
  • Das obenerwähnte Nonapeptid wurde hergestellt durch stufenweise Festphasen-Peptidsynthese, im wesentlichen nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren. Anpassungen wurden durchgeführt, um die gleichzeitige Synthese einer grossen Anzahl an Sequenzen zu ermöglichen, zum Beispiel wurden derivatisierte Polymerstäbe (welche 150-300 nMol Amin/Nadel aufnehmen), montiert in einem Block, beide aus inertem Material, wie Polyethylen oder Polypropylen, als feste Unterlage für die Synthese der Peptide verwendet anstelle von perlenförmigen auf Polystyrol basierenden Harzen. Alle Wasch-, Kupplungs- und Schutzgruppenabspaltungsstufen wurden durchgeführt durch Eintauchen der Stäbe (in dem Block montiert) in Behälter mit den entsprechenden Lösungen. Voraktivierte Nα-Fmoc-aminosäuren (Opfp- oder ODhbt-Ester) wurden in Gegenwart von HOBt, beide in einer Konzentration von 30 mMol/Liter für die Kettenverlängerung verwendet. Die N -Fmoc-Gruppen wurden nach jedem Synthesezyklus mit 20% Piperidin in DMF entfernt. Die folgenden Seitenketten- Schutzgruppen wurden verwendet: -Pmc für Arg; -tBu für Ser, Thr und Glu; Boc for Lys; Trt für Asn und Gln.
  • Ein typischer Synthesezyklus bestand aus den folgenden Stufen:
  • 1. Schutzgruppenentfernung (20% Piperidin in DMF) 30 Min
  • 2. Wäsche:
  • DMF 1 x 5 Min
  • Methanol 4 x 2 Min
  • 3. Lufttrocknung 10 Min
  • 4. Wäsche: DMF 1 x 5 Min
  • 5. Kupplung (30 mM Fmoc-Aminosäure-Aktivester und 30 mM HOBtin DMF) 18 Stunden
  • 6. Wäsche:
  • DMF 1 x 2 Min
  • Methanol 4 x 2 Min
  • DMF 1 x 2 Min
  • 7. Lufttrocknung x 2 Min
  • Nach Vollendung der Synthese wurde die Nα-Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit 20% Piperidin in DMF entfernt, wie oben beschrieben, und die anderen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit Tifluoressigsäure-Phenol-Ethandithiol = 95 - 2,5 -. 2,5 (V/M/V) während 4 Stunden bei Zimmertemperatur entfernt, was die Bindung zwischen Peptid und fester Unterlage intakt hält. Die Nadeln wurden anschliessend mit Methylenchlorid, 5% Diisopropylamin in Methylenchloräd, Methylenchlorid und Methanol gewaschen und getrocknet.
  • Die folgenden Peptide wurden hergestellt:
    • Beispiel IV
  • Das Pentadecapeptid aus Beispiel I wurde covalent mit Rinderserumalbumin (BSA) durch eine Standard-Glutarsäurekonjugationsmethode gekuppelt. Gleiche Volumina der folgenden Lösungen in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,0 wurden zusammen zugefügt: 0,3 mM BSA, 4 mM Pentadecapeptid und 7 mM Glutarsaure. Nach Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur wurde die Reaktion durch Zusatz von 0,1 Volumen 40% Saccarose, 1 M Glycin, 0,08 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,025 M NaBH&sub4;, pH 7,0 und Inkubation während einer Stunde bei Zimmertemperatur unterbrochen. Das Peptid-BSA-Konjugat wurde auf 20 ug/ml in 0,05 M Carbonatpuffer pH 9,6 verdünnt, und 135 ul dieser Lösung wurden in eine Vertiefung einer Mikrotitierplatte gegeben. Die Adsorption des Peptid-BSA-Konjugats wurde über Nacht bei 4ºC fortschreiten gelassen. Die Platten wurden sodann entleert und restliche Bindungsstellen wurden mit einer Lösung von 0,1 MTris pH 7,4, 0,2% BSA und 0,03 M KI während 20 Minuten bei Zimmertemperatur blockiert. Die Platten wurden sodann über Nacht bei Zimmertemperatur luftgetrocknet und über Silicagel bei 4ºC gelagert. Für den Nachweis von für NANBH spezifischen Antikörpern wurde die Serumprobe 1:10 in Probenverdünner (PBS/20% normales Ziegenserum/1% Triton X100) verdünnt in die Vertiefuiig einpipettiert (100 ul pro Vertiefung) und während einer Stunde bei 37ºC inkubiert.
  • Nach dem Waschen der Vertiefungen mit PBS/0,05% Tween 20 wurden die gebundenen menschlichen Antikörper mit Ziegen- Antimenschen-Immunoglobulin, welches mit Peroxidase markiert war (100 ul pro Vertiefung, 1 Stunde bei 37ºC), verdünnt in Probenverdünner, nachgewiesen. Die Platten wurden 4 mal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. TMB wurde zugesetzt (100 ul pro Vertiefung) als ein Substrat für das Peroxidase-Enzym, und die Reaktion wurde während 30 Minuten bei Zimmertemperatur weiterlaufen gelassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 100 ul 2M H&sub2;SO&sub4; zu jeder Vertiefung unterbrochen. Die gelbe Farbe wurde bei 450 nm in einem Organon Teknika Mikroelisalesegerät abgelesen.
    • Beispiel V
  • Die Peptide aus Beispiel III wurden ebenfalls auf ihre Reakionsfähigkeit mit Seren von Patienten mit NANBH getestet. Die Nonapeptide 1 bis 13 wurden an eine feste Unterlage gekuppelt, im wesentlichen auf dieselbe Weise wie in Beispiel IV beschrieben. Die Immunreaktionsfähigkeit mit Serumproben, welche von Patienten mit NANBH erhalten worden waren, wurde festgestellt, wie in Beispiel IV beschrieben.

Claims (5)

1. Ein Polypeptid, das die Sequenz Arg-Lys-Thr-Lys-Asn- Ser-Thr-Asn-Arg als auch Säureadditionssalze, Amide, Ester und N-Acylderivate davon umfasst, wobei das Polypeptid mit NANBH-Antikörpern immunologisch reaktionsfähig ist.
2. Immunochemisches Reagenz, das das Peptid von Anspruch 1 umfasst.
3. Verfahren zum Nachweis von NANBH-Antikörpern in einer Testflüssigkeit, das ein in Kontaktbringen des immunochemischen Reagenz gemäss Anspruch 2 mit der Testflüssigkeit und Nachweisen der Anwesenheit von Immunkomplexen, die sich zwischen dem immunochemischen Reagenz und den Antikörpern in der Testflüssigkeit gebildet haben, umfasst.
4. Verfahren zum Nachweis von NANBH in einer Testflössigkeit, das ein in Kontaktbringen des iinmunochemischen Reagenz gemäss Anspruch 2 mit der Testflüssigkeit und NANBH- Antikörpern und Nachweisen der Anwesenheit von Immunkomplexen, die sich zwischen dem immunochemischen Reagenz und NANBH-Antikörpern gebildet haben, umfasst.
5. Testgarnitur zum Nachweis von NANBH oder NANBH-Antikörpern, die das immunochemische Reagenz von Anspruch 2 umfasst.
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