DE69029092T2

DE69029092T2 - Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus

Info

Publication number: DE69029092T2
Application number: DE69029092T
Authority: DE
Inventors: Robert J. B-1850 Grimbergen Deleys; Geert B-8310 Brugge Maertens; Dirk B-2110 Wijnegem Pollet; Hugo B-9270 Laarne Van Heuverswyn
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1997-04-17
Anticipated expiration: 2010-12-15
Also published as: JPH05503722A; DK0489968T3; WO1992010514A2; WO1992010514A3; CY2043A; DK0644202T3; HU218357B; KR0181344B1; IL100158A; GR3023664T3; KR920703632A; CY2053B1; DE69030124T2; DK0754704T3; US5922532A; ES2095852T3; AU652013B2; ATE185350T1; ES2138784T3; DE69029092D1

Description

Die Ausführung von systematischen Testen für den Hepatitis-B Virus (HBV) hat zur Entfernung von diesem Virus aus der Blutversorgung verholfen. Dennoch ergibt sich eine beteudende Nummer von Fällen mit posttransfusionneller Hepatitis (PTH). Diese Fälle sind im allgemeinen zu nicht-A, nicht-B Hepatitis-Viren (NANBV) zuzuschreiben, deren Diagnose gewöhnlich durch Ausschluß von anderen Virenmarkern gemacht wird.
Der für einen großen Anteil von diesen Fällen verantwortliche Wirkstoff wurde neulich kloniert (Choo, Q-L et al. Science (1988) 244:359-362), und es wurde einen Ersten-Generation-Antikörper-Test entwickelt (Kuo, G. et al. Science (1989) 244:362-364). Der Wirkstoff wurde als positiv-Strang-RNA-haltender Virus identifiziert, und die Sequenz seines Genoms wurde zum Teil bestimmt. Studien deuten darauf, daß dieser Virus, anschließend Hepatitis-C-Virus (HCV) genannt, könnte mit Flaviviren und Pestiviren verwandt sein. Ein Teil des Genoms eines HCV, aus einem Schimpanse isoliert (HCVCDC,CHI), wird in EPO 88310922.5 beschreibt. Die codierenden Sequenzen, die in diesem Text beschreibt sind, schließen Sequenzen aus der 5'-Endgruppe des viralen Genoms, die für vermutliche Strukturproteine codieren, nicht ein. Kurzlich wurden trotzdem Sequenzen, die von diesem Bereich des HCV-Genoms abgeleitet sind (Okamoto, H. et al., Japan J. Exp. Med. 60:167-177, 1990) beschreibt. Die Aminosäuren- Sequenzen, die vom japanischem Klonen HC-J1 kodiert sind, wurden mit den HCVCDH/CHI Sequenzen kombiniert, und zwar in einem Bereich, worin die zwei Sequenzen überlappen, um die in der Figur 1 gezeigte Verbundsequenz zu gewinnen. Speziell wurden die zwei Sequenzen an dem Glycin&sub4;&sub5;&sub1; vereint. Hervorzuheben ist, daß das für die HCV-Aminosäure-Sequenz benutzte Numeriersystem nicht als absolut gemeint ist, weil die Existenz von HCV-Stammvarianten, die Deletionen oder Insertionen beherbergen, äußerst wahrscheinlich ist. Sequenzen, die mit der 5'-Endgruppe des HCV-Genoms übereinstimmen, wurden auch kurzlich in EPO 90302866.0 beschreibt.
Um mögliche HCV-Träger zu entdecken muß man zu großen Mengen von viralen Proteinen Zugang haben. Im Fall von HCV kennt man noch keinen Zuchtverfahren für den Virus, und das schließt die Anwendung von Vireninfizierten Kulturen als virale-Antigenen-Quelle aus. Der gebraüchliche erste-Generation-Antikörper-Test wendet ein Fusionsprotein an, das eine vom HCV-Genom kodierte 363 Aminosäuren-Sequenz enthält. Es wurde noch gefunden, daß Antikörper gegen dieses Protein bei 75 bis 85% der chronischen NANBH-Patienten bestimmt werden könnten. Im Gegensatz dazu hatten nur etwa 15% der Patienten, die in der akuten Phase der Krankheit waren, Antikörper, die dieses Fusionsprotein anerkannten (Kuo, G. et al. Science (1989) 244:362-364). Die Abwesenheit geeigneter bestätigender Tests erschwert aber die Überprüfung dieser Statistiken. Die offenbare Ahnlichkeit vom HCV-Genom mit dem Genom von Flaviviren erläubt es, die Lage der Epitopen, die wahrscheinlich einen diagnostischen Wert haben, vorherzusagen. Eine Analyse des HCV-Genoms zeigt die Anwesenheit eines langen ständigen offenen Leserasters. Vermutlich ist die virale RNA in ein langes Polyprotein translatiert, das später von zellulären und/oder viralen Proteasen geschnitten wird. Analog wie zum Beispiel der Dengue- Fieber-Virus sind vermutlich die viralen Strukturproteine aus dem Amino-Endgruppe-Drittel des viralen Polyproteins abgeleitet. Zur Zeit können die genauen Stellen, worin das Polyprotein geschnitten wird, nur vermutet werden. Jedoch enthalten wahrscheinlich die Strukturproteine Epitopen, die für diagnostische Zwecken nützlich sein würden, sowohl für den Nachweis von Antikörpern als auch für die Generation von Antikörpern, die später für den Nachweis von viralen Antigenen angewandt sein könnten. Analog erwartet man auch, daß Nicht-Strukturproteinbereiche Epitopen enthalten, die einen diagnostischen Wert besitzen, auch wenn diese Proteine nicht als Strukturkomponente viraler Partikeln gefunden werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz des Verbunds
HCVHC-J1,CDC/CHI
Figur 2 zeigt den Antikörper, der sich mit einzelnen Peptiden und verschiedenen Mischungen in einem ELISA Test verbindet.

Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen

Es ist wohl bekannt, daß RNA-Viren oft eine hohe Spontanmutationsrate zeigen, und deshalb erwartet man nicht, daß zwei HCV Isolaten ganz identisch sein werden, auch wenn sie aus dem selben Individualen abgeleitet sind. Zum Ziel der vorliegenden Beschreibung ist ein Virus identisch oder gleichwertig mit HCV betrachtet, wenn er auf dem Nucleinsäureniveau eine 60% oder höhere, und auf dem Aminosäurenniveau eine 70%, vollkommene Homologie mit der HCVHC-J1/CDC/CHI Verbundsequenz zeigt.
Es werden Peptide beschreibt, die von HCV kodierte Proteine immunologisch wiederholen. Um sich den Schwankungen in der Sequenz von Stamm zu Stamm anzupassen kann man konservative sowie nichtkonservative Aminosäuren-Substitutionen durchführen. Diese werden üblicherweise weniger als 35% einer spezifischen Sequenz darstellen. Wenn ein Peptid mit einem Bereich im HCV-Polypeptid, der stark polymorph ist, übereinstimmt, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um besser die verschiedenen Epitopen unterschiedlicher Virenstammen zu wiederholen.
Eine Peptid-Zusainmensetzung nach vorliegender Erfindung enthält zumindest ein Peptid, das unter:
(a) der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die aus:
bestehen,
worin Y H oder ein Verbindungsarm ist, womit das Peptid mit einem Träger oder einer festen Phase, die zumindest 1 und bis nach 60, häufiger 1-10 Aminosäuren, wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, oder chemische Gruppen wie Biotin oder Thioglykolsäure enthält, angeknüpft werden kann,
Y kann, zum Beispiel durch Acetylierung an der N- Endgruppe, modifiziert werden; Z ist eine Bindung oder ein Verbindungsarm wodurch das Peptid mit einem Träger oder mit einer festen Phase, die zumindest 1 und bis nach 60, häufiger 1-10 Aminosäuren, wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, oder chemische Gruppen wie Biotin oder Thioglykolsäure enthält, angeknüpft werden kann;
und X ist NH&sub2; , OH oder eine Bindung, an die eine von diesen zwei Gruppen beteiligt ist;
vorausgesetzt, daß wenn Y oder Z-X Aminosäure(n) bedeuten, sind diese von jeglichen natürlich vorkommenden HCV-Flankenbereichen unterscheiden,
oder,
(b) den Varianten jeder der obengenannten Peptide (I) bis (VII), wobei die erwähnten Varianten konservative sowie nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen zeigen, die weniger als 35% der Variationen von Stamm zu Stamm in bezug auf jede Aminosäuresequenz, (I) bis (VII), in den HCV-Sequenzen darlegen, vorausgesetzt, daß diese Peptidvarianten dazu fähig sind, eine immunologische Konkurrenz mit mindestens einem HCV Stamm zu gewährleisten;
oder
(c) Fragmenten der Peptide (I) bis (VII), mit mindestens 6 Aminosäuren, aus irgendwelcher der Peptidsequenzen 1-20, 7-26, 8-18, 13-32, 37-56, 49-68, 61-80 und 73-92, wie oben definiert;
und obengenannte Fragmenten im wesentlichen die ganze Sensibilität der obengenannten Peptidsequenzen, woraus sie abgeleitet sind, aufrechterhalten;
gewählt ist. Für BE, CH, LI, NL, AT, ES, GR, SE müssen diese Peptide anders als: worin bedeutet worin bedeuten sein Für LU müssen diese Peptiden anders als: worin bedeutet bedeuten sein Für DE, FR, GB, IT müssen diese Peptide anders als: worin bedeutet worin bedeuten ein Peptid, daß das von der Sequenz dargestellte Peptid und ein Peptid, daß aus einem Teil des von der Sequenz dargestellen Peptids besteht, enthält, sein
Außerdem betrifft die Erfindung eine wie oben definierte Peptidzusammensetzung, die weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß sie auch zumindest ein Peptid enthält, daß unter:
(a) der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die aus:
worin Y H oder ein Verbindungsarm ist, womit der Peptid mit einem Träger oder einer festen Phase, die mindestens 1 und bis nach 60, häufiger 1-10 Aminosäuren, wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, oder chemische Gruppen wie Biotin oder Thioglykolsäure enthält, angeknüpft werden kann,
Y kann, zum Beispiel durch Acetylierung an der N- Endgruppe, modifiziert werden; Z ist eine Bindung oder ein Binderarm wodurch das Peptid mit einem Träger oder mit einer festen Phase, die zumindest 1 und bis nach 60, häufiger 1-10 Aminosäuren, wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, oder chemische Gruppen wie Biotin oder Thioglykolsäure enthält, angeknüpft werden kann;
und X ist NH&sub2; , OH oder eine Bindung, an die eine von diesen zwei Gruppen beteiligt ist;
vorausgesetzt, daß wenn Y oder Z-X Aminosäure(n) bedeuten, sich diese von jeglichen natürlich vorkommenden HCV-Flankenbereichen unterscheiden,
oder,
(b) den Varianten jeder der obengenannten Peptide (VIII) bis (XIX), wobei die erwähnten Varianten konservative sowie nicht-konservative Aminosäure- Substitutionen zeigen, die weniger als 35% der Variationen von Stamm zu Stamm in bezug auf jede Aminosäuresequenz, (VIII) bis (XIX), in den HCV- Sequenzen darlegen, vorausgesetzt, daß diese Peptidvarianten dazu fähig sind, eine immunologische Konkurrenz mit mindestens einem HCV-Stamm zu gewährleisten;
oder
(c) Fragmenten der Peptide (VIII) bis (XIX), mit mindestens 6 Aminosäuren, aus irgendwelcher der Peptidsequenzen 1688-1707, 1694-1713, 1706-1725, 1712- 1731, 1718-1737, 1724-1743, 1730-1749, 2263-2282, 2275- 2294, 2287-2306, 2299-2318 und 2311-2330, wie oben definiert;
und obengenannte Fragmenten im wesentlichen die ganze Sensibilität der obengenannten Peptidsequenzen, woraus sie abgeleitet sind, aufrechterhalten;
gewählt ist.
Die Peptide von Bedeutung werden zumindest sechs, manchmal acht, manchmal auch zwölf, Aminosäuren enthalten, die in der vom HCV-Genom kodierten Sequenz eingeschlossen sein werden. Auf jeden Fall wird das Peptid vorzugsweise so klein wie möglich sein; zwar wird es im wesentlichen die ganze Sensibilität des größeren Peptids aufrechterhalten. Wünschenswert kann es manchmal auch sein, zwei oder mehr Peptiden in einer vereinten Peptidstruktur zusammen zu verbinden.
Die Substitutionen, die konservativ gesehen werden sind diejenigen, worin die chemische Natur des Substituenten ähnlich der der originellen Aminosäure ist. Aminosäurekombinazionen, die konservativ gesehen werden könnten, sind Gly, Ala; Asp, Glu; Asn, Gln; Val, Ile, Leu; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr.
Der Charakter der Verbindung des Peptids mit einer festen Phase oder einem Träger muß nicht unbedingt kovalent sein.
In der Natur vorkommende Aminosäuren wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure können zur Amino- oder Carboxyl-Endgruppe zugesetzt werden, und zwar um Funktionsgruppen zur Kupplung mit einer festen Phase oder einem Träger zu vermitteln. Andere chemische Gruppen wie zum Beispiel Biotin und Thioglykolsäure können jedoch den Endgruppen zugesetzt werden, um den Peptiden gewünschte chemische oder physikalische Eigenschaften zu vermitteln. Die Endgruppen der Peptide können auch modifiziert werden, zum Beispiel durch Acetylierung an der N-Endgruppe oder Amidierung an der Carboxy-Endgruppe.
Besonders vorteilhaft ist die Anwendung der Mercapto-Gruppe von Cysteinen oder Thioglykolsäuren zur Acylierung von Amino-Endgruppen um die Peptide zu cyclisieren, oder um zwei Peptide zusammen zu kuppeln. Die Cyclisierung oder Kupplung kann über eine einfache Bindung erfolgen oder kann mit thiol-spezifischen Reagenzien durch Bildung einer Molekularbrücke durchgeführt werden.
Die Peptide können mit einem löslichen Träger gekuppelt sein, entweder um Antikörper zu generieren oder um die Adsorption der Peptide an eine feste Phase zu erleichtern. Der Träger muß einen solchen Charakter besitzen, daß er ein Molekulargewicht von über 5000 hat und nicht von Antikörpern im menschlichen Serum anerkannt werden sollte. Üblicherweise ist der Träger ein Protein. Als Proteine, die häufig verwendet werden kann man Napfschnecken-Hämocyanin, Rinder- Gammaglobulin, Rinder-Serumalbumin und Poly-L-Lysin nennen
Es bestehen viele gut beschreibte Verfahrensweisen, um Peptide mit Trägern zu kuppeln. Die Bindung kann an die N-Endgruppe, an die C-Endgruppe oder an eine innere Stelle des Peptids erfolgen. Das Peptid kann auch zur Kupplung derivatisiert sein. Ausführliche Beschreibungen einer großen Vielfalt von Kupplungsverfahrensweisen sind zum Beispiel in Van Regenmortel, M.H.V., Briand, J.P., Muller, S. und Plaué, S., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol 19, Synthetic Polypeptides as Antigens, Elsevier Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1988 gegeben.
Die Peptide können auch direkt auf einem Oligo- Lysin Kern synthetisiert werden, wobei sowohl die Alpha- als auch die Epsilon-Amino-Lysin-Gruppen als Wachstumspunkte für die Peptide benutzt werden. Die Zahl der den Kern bildenden Lysine ist bevorzugt 3 oder 7. Außerdem kann ein Cystein nahe bei oder an die(der) C-Endgruppe des Komplexes um die Bildung von Homo- oder Hetero-Dimeren zu erleichtern aufgenommen werden. Die Verwendung dieser Verfahrensweise wurde vielfältig für Hepatitis B Antigenen (Tam, J.P., und Lu, Y-A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:9084-9088) sowie für verschiedene andere Antigenen (siehe Tam, J.P., Multiple Antigen Peptide System: A Novel Design for Synthetic Peptide Vaccine and Immunoassay, in Synthetic Peptides, Approaches to Biological Problems, Tam, J.P. und Kaiser, E.T., Herausgeber, Alan R. Liss Inc., New York, 1989) erläutert.
In Abhängigkeit von ihrer beabsichtigten Anwendung können die Peptide markiert oder unmarkiert sein. Markierungen, die angewendet werden können von irgendeiner Art, wie enzymatischer, chemischer, fluorescierender, luminescierender oder radioaktiver sein. Darüberhinaus können die Peptide für die Bindung an Flächen oder feste Phasen, wie zum Beispiel Mikrotiterplatten, Nylonmembranen, Glas- oder Plastikperlen, und chromatographische Träger wie Zellulose, Kieselerde oder Agarose modifiziert sein. Die Verfahrensweisen, wodurch Peptide an feste Träger oder Flächen gebunden oder gekuppelt werden können, sind den Spezialisten wohlbekannt.
Besonders vorteilhaft ist die Anwendung von Peptidmischungen für den Nachweis von Antikörpern, die Hepatitis-C-Virus-spezifisch sind. Als Peptidmischungen, die besonders vorteilhaft angesehen sind kann man folgende erwähnen:
A. II (SEQ ID NO 2), III (SEQ ID NO 4), V (SEQ ID NO 6), IX (SEQ ID NO 10), und XVIII (SEQ ID NO 19),
B. I (SEQ ID NO 1), II (SEQ ID NO 2), V (SEQ ID NO 6), IX (SEQ ID NO 10), XI (SEQ ID NO 12), XVI (SEQ ID NO 17), und XVIII (SEQ ID NO 19),
C. II (SEQ ID NO 2), III (SEQ ID NO 4), IV (SEQ ID NO 5), V (SEQ ID NO 6), VIII (SEQ ID NO 9), XI (SEQ ID NO 12), XVI (SEQ ID NO 17), und XVIII (SEQ ID NO 19),
D. II (SEQ ID NO 2), IX (SEQ ID NO 10), und XVIII (SEQ ID NO 19),
E. II (SEQ ID NO 2), III (SEQ ID NO 4), IV (SEQ ID NO 5), und V (SEQ ID NO 6)
Antikörpern, die die Peptide anerkennen können auf vielfältiger Weise nachgewiesen werden. Ein bevorzugtes Nachweisverfahren ist der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA), worin ein Peptid oder eine Peptidmischung auf einen festen Träger gebunden wird. In den meisten Fällen ist es eine Mikrotiterplatte; es kann aber prinzipiell irgendwelche Art unlösbarer fester Phase sein. Eine oder mehrere Verdünnung(en) eines zu testenden Serums oder einer Körperflüssigkeit werden mit der festen Phase, an die das Peptid gebunden ist, in Berührung gebracht. Die Inkubation ist so lange durchgeführt, bis die Bindungsreaktion stattfindet. Anschließend werden nicht-gebundene Komponenten durch Waschen der festen Phase entfernt. Der Nachweis von Immunkomplexen wird mit Antikörpern, die sich spezifisch mit menschlichen Immunoglobulinen binden, und die mit einem Enzym, das vorzugsweise, aber in nicht beschränkter Weise, eine Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase oder beta-Galactosidase ist, markiert wurden, und das Enzym dazu fähig ist, ein farbloses oder beinahe farbloses Substrat oder Co- Substrat in ein stark gefärbtes Produkt zu verwandeln, oder ein Produkt, das seinerseits dazu fähig ist, einen gefärbten Komplex mit einem Chromogenen zu bilden, durchgeführt. Wahlweise kann das Feststellungssystem ein Enzym das, in Anwesenheit vom(von den) geeigneten Substrat(en) Licht ausstrahlt. Die Masse des gebildeten Produkts wird entweder mit bloßem Auge, spektrophotometrisch, elektrochemisch oder durch Lichtmessung bestimmt, und wird mit einer ähnlich behandelten Kontrolle verglichen. Das Nachweissystem kann auch radioaktiv markierte Antikörper einsetzen, in welchem Fall die Masse des Immunkomplexes durch Szintillationszählung oder Gammastrahlenzählung quantifiziert wird.
Andere Nachweissysteme, die noch benutzt werden können schließen die auf die Einsetzung von aus Staphylococcus aureus Cowan Stamm I abgeleitetem Protein A, aus C-Gruppe Staphylococcus sp. (Stamm 26RP66) abgeleitetem Protein G basierten Systeme ein, oder Systeme, die die Hochaffinität der Biotin-Avidin oder Streptavidin Bindungsreaktion benutzen.
Antikörper, die gegen mit Träger gebundene Peptide produziert wurden können auch in Verbindung mit markierten Peptiden für den Nachweis von im Serum oder in anderen Körperflüssigkeiten anwesenden Antikörpern durch einen kompetitiven Bindungstest benutzt werden. In diesem Fall werden Antikörper, die gegen mit einem Träger gebundene Peptide produziert wurden, an ein festes Stützgerüst, zum Beispiel eine Plastikperle oder eine Plastikröhre, angeschlossen. Das markierte Peptid wird dann mit geeigneten Verdünnungen der zu testenden Flüssigkeit gemischt, dann wird diese Mischung mit dem Antikörper, welcher mit dem festen Träger gebunden ist, in Berührung gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, und die Masse des markierten Peptids wird quantifiziert. Eine Verringerung in der Masse des mit dem festen Träger gebundenen Markers deutet auf die Anwesenheit von Antikörpern in der originellen Probe hin. Ebenso kann auch das Peptid mit dem festen Träger gebunden werden. Dann ist es für die markierten Antikörper zulässig, mit dem Antikörper, welcher in der Probe vorliegt, unter solchen Bedingungen, daß die Peptidmasse begrenzend ist, zu konkurrieren. Wie in vorherigen Beispiel deutet eine Verringerung des gemessenen Signals auf die Anwesenheit von Antikörpern in der getesteten Probe hin.
Ein anderes Verfahren für den Nachweis von Antikörpern ist der homogene immunologische Test. Es sind viele Variationen in der Planung von solchen Testen möglich. Zum Beispiel sind viele mögliche Konfigurationen für homogene enzymatische immunologische Teste und Verfahren für ihre Durchführung in Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoasssays, Elsevier Press, Amersham, Oxford, New York, 1985 gegeben. Nachweissysteme, die benutzt werden können schließen die, die auf Enzymleitung, Biolumineszenz, allosterische Aktivierung und allosterische Hemmung basiert sind ein. Verfahren, die mit Liposomen gefangene Enzyme oder Coenzyme benutzen können auch verwendet werden (siehe zum Beispiel Pinnaduwage, P. und Huang, L., Clin. Chem. (1988) 43/2: 268-272, und Uliman, E.F. et al., Clin. Chem. (1987) 33/9: 1579-1584).
Die Peptidsynthese kann in der Lösung oder auf einen festen Träger durchgeführt werden. Syntheseprotokolle setzen üblicherweise die gewöhnlichen t-butyloxycarbonyl- oder 9- fluorenylmethoxycarbonyl-geschützten aktivierten Aminosäuren ein. Die Verfahrensweisen für die Durchführung der Synthesen, die Art des Seitenkettenschutzes und die Schneidverfahren sind umfassend in, zum Beispiel, Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Company, 1984; und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989 beschreibt.
Die Erfindung betrifft auch eine Ausrüstung für den Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Viren in einer Körperflüssigkeit, die mindestens folgende Komponenten einschließt:
- eine erfindungsgemäße Peptidzusammensetzung,
- ein Mittel für den Nachweis eines zwischen obengenannten Peptiden und obengenannten Antikörpern gebildeten immunologischen Komplexes.

Experimenteller Teil

I. Synthese der Peptide

Die gesamten beschriebenen Peptide wurden auf Pepsyn K polyamid-Kieselguhrharz (Milligen, Novato, Kalifornien) synthetisiert, das mit Ethylendiamin funktionalisiert wurde und auf welches der säurelabile Linker 4-(α-Fmoc-amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäre gekuppelt wurde (Rink, Tetrahedron Lett. (1987) 28:3787). Seitenkettenschutz auf Basis von t- Butyl und Fmoc α-amino-Schutz wurden benutzt. Die Guanidinogruppe des Arginins wurde mit der 2,2,5,7,8- pentamethylchroman-6-sulfonyl Fraktion geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidins wurde entweder mit t-Boc oder Trityl, und die Sulfhydrylgruppe des Cysteins wurde mit einer Tritylgruppe geschützt. Kupplungen wurden mit Performen von O-pentafluorophenylestern durchgeführt, mit Ausnahme des Arginins, wofür eine über Diisopropylcarbodiimid-vermittelte Hydroxybenzotriazol-esterbildung verwendet wurde. Mit Ausnahme des Peptids I wurden alle Peptide mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert. Alle Synthesen wurden auf einem Milligen 9050 PepSynthetizer (Novato, Kalifornien) mit kontinuierlichem Flußverfahren durchgeführt.
Nach Schneidung mit Trifluoressigsäure in Anwesenheit von Spülmitteln und Extraktion mit Diäthyläther wurden alle Peptide mit C&sub1;&sub8;- Umkehrphasenchromatographie analysiert.

II. Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Viren

A. Verwendung von Peptiden, die auf eine Nylonmembran aufgebracht sind.

Peptide wurden in einen geeigneten Puffer gelöst, um eine konzentrierte Stammlösung vorzubereiten, die dann weiter in eine Phosphatpuffer-Salzlösung (phosphate-buffered saline (PBS)) oder Natriumcarbonat- Pufferlösung, pH 9,6 um Arbeitslösungen vorzubereiten gelöst wurde. Die Peptide wurden als Linien auf eine Nylonmembran (Pall, Portsmouth, Vereinigtes Königreich) aufgebracht, wonach die Membran mit Casein um nichtbesetzte Bindungsstellen zu blockieren behandelt wurde. Die Membran wurde dann senkrecht zur Richtung der Peptidlinien in Streifen geschnitten. Jeder Streifen wurde dann mit einer Serumprobe, die auf 1-100 verdünnt wurde, aus einem mit HCV infizierten Menschen inkubiert. Zum Nachweis der Antikörperbindung wurden die Streifen mit Ziegen-anti-menschlichen Immunoglobulin-Antikörpern, die mit dem Enzym alkalischen Phosphatase konjugiert waren, inkubiert. Nach Entfernung des nicht gebundenen Konjugats durch Waschen wurde eine 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat- und Tetrazolium-Nitroblau- enthaltende Substratlösung hinzugefügt.
Positive Reaktionen sind als gefärbte Linien, die den Stellungen der Peptide, die spezifisch anerkannt sind entsprechen sichtbar. Die Reaktionsschemata von sechsunddreißig verschiedenen Seren sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die in Tabelle 1 dargestellen Ergebnisse sind noch in Tabelle 2 zusammengefaßt.

B. Anwendung von Peptiden in einem enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA)

Peptid-Stammlösungen werden in einen Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6 , verdünnt und um Mikrotiterplatten zu einer Peptidkonzentration von 2 Mikrogrammen per Milliliter zu beschichten eingesetzt. Eine Mischung, die aus den Peptiden II, III, V, IX, und XVIII bestand, war auch um Platten zu beschichten eingesetzt. Nach der Beschichtung wurden die Platten mit Casein blockiert. Fünfzehn HCV-Antikörper-positive Seren und Kontrollseren aus sieben nicht-infizierten Blutspendern wurden zu 1-20 verdünnt und in Vertiefungen der mit Peptiden bedeckten Platten inkubiert. Antikörperbindung wurde durch Inkubation der Platten mit Ziegen-anti-menschlichen Immunoglobulin- Antikörpern, die mit dem Enzym Meerrettich Peroxidase konjugiert waren nachgewiesen. Nach Entfernung des nicht gebundeten Konjugats durch Waschen wurde eine Lösung, die H&sub2;O&sub2; und 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin enthielt hinzugefügt. Die Reaktionen wurden nach einem geeigneten Zeitabstand durch Zufügung von Schwefelsäure gestoppt. Positive Reaktionen verursachten das Auftreten einer gelben Farbe, die mit einer konventionnellen Mikrotiterplatteleseeinrichtung quantifiziert wurde. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Um für irgendwelche nicht-spezifische Bindungen zu korrigieren, die den physikalischen oder chemischen Eigenschaften der Peptiden selbst zugeschrieben konnten, wurde ein einzelner Schwellenwert für jedes Peptid bestimmt. Diese Schwellenabsorptionsfähigkeit wurde als durchschnittliche optische Dichte der negativen Proben plus 0,200 berechnet. Proben, die höhere Absorptionsfähigkeitswerte zeigen als die Schwellenwerte werden als positiv gesehen. Die Ergebnisse für die fünfzehn positiven Serumproben sind weiter in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Obwohl offensichtlich einige der Peptide von einem großen Prozentsatz der Seren von HCV-infizierten Menschen anerkannt sind ist es auch klar, daß kein einziges Peptid von allen Seren anerkannt ist. Demgegenüber wurde die Peptidmischung von allen fünfzehn Seren anerkannt, und für sechs Seren aus fünfzehn waren die optischen Dichten gleich oder höher als die einzelnen Werte, die für irgendwelches Peptid erhalten waren. Diese Ergebnisse dienen dazu, die Vorteile der Benutzung von Peptidmischungen für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV zu erläutern.

C. Bindung von Antikörpern in Seren aus HCV-infizierten Patienten mit verschiedenen einzelnen Peptiden und Peptidmischungen in einem ELISA.

Fünf Peptide wurden einzeln und zu sieben verschiedenen Kombinationen um Mikrotiterplatten zu beschichten eingesetzt. Anschließend wurden die Platten mit Verdünnungen von fünfzehn HCV-Antikörper-positiven Seren inkubiert, um die relativen Vorteilen der Benutzung von Mischungen im Vergleich zu einzelnen Peptiden für den Nachweis von Antikörpern zu bewerten. Die eingesetzten Mischungen und die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt.
Im allgemeinen wirken die Mischungen besser als die einzelnen Peptiden. Offensichtlich war dies besonders für die Mischung Nr 12 (Peptide I, III, V, IX, und XVIII), die von allen zwölf getesteten Seren anerkannt wurde. Diese Ergebnisse unterstreichen die Vorteile der Benutzung von Peptidmischungen in diagnostischen Testen für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV.

D. Einsetzung einer Peptidmischung in einem ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV.

Eine Mischung von Peptiden, II, III, V, IX, und XVIII wurde hergestellt und um Mikrotiterplatten gemäß selber Verfahrensweise wie für den Test von einzelnen Peptiden zu beschichten benutzt. Insgesamt neunundvierzig Seren waren aus Patienten mit klinisch diagnostizierter aber undifferenzierter chronischer nicht-A, nicht-B Hepatitis sowie neunundvierzig Seren aus gesunden Blutspendern getestet Der Nachweis der Antikörperbindung wurde mit Ziegen-anti-menschlichen Immunoglobulin-Antikörpern, die mit Meerrettich Peroxidase konjugiert waren erreicht. Die resultierenden Werten der optischen Dichte sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Peptidmischung nicht von Antikörpern in Seren aus gesunden Blutspendern (0/49 reaktiv), aber von einem großen Verhältnis (41/49, oder 84%) der Seren aus Patienten mit chronischer NANBH anerkannt ist. Deshalb zeigen diese Ergebnisse wohl, daß die beschriebenen Peptide wirksam als Mischungen für die Diagnose von einer HCV-Infektion eingesetzt werden können.

E. Nachweis von Antikörpern gegen HCV in Seren aus Patienten mit akuter NANBH-Infektion, mit Verwendung von einzelnen Peptiden, die auf Nylonmembranen gebunden sind, und von einer Peptidmischung in einem ELISA-Test, sowie Vergleich mit einer kommerziellen Ausrüstung.

Peptide wurden auf Nylonmembranen aufgebracht, oder vermischt und wie oben gesagt um Mikrotiterplatten zu beschichten verwendet. Die Peptidmischung bestand aus den Peptiden II, III, V, IX, und XVIII. Seren aus neunundzwanzig Patienten mit akuter nicht-A, nicht-B Hepatitis wurden dann für die Anwesenheit von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Viren getestet. Diese selben Seren wurden auch mit einer kommerziellen Ausrüstung (Ortho, Emeryville, CA, USA) bewertet.
Die Ergebnisse dieser vergleichenden Untersuchung sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Um den auf Peptidbasis ELISA mit der kommerziellen Ausrüstung vergleichen zu können sind auch die Ergebnisse für die beiden Teste als Signal/Rausch-Verhältnis (S/N), das durch Teilung der für jede Probe gemessenen optischen Dichte durch das Schwellenwert berechnet wurde, gegeben. Ein Signal/Rausch Verhältnis, das größer oder gleich 1,0 ist wird als positive Reaktion angesehen. Für die kommerzielle Ausrüstung wird der Schwellenwert gemäß den Anweisungen des Herstellers berechnet. Der Schwellenwert für den peptid-basierten ELISA wird als durchschnittliche optische Dichte von fünf negativen Proben plus 0,200 berechnet.
Die Einteilung, die für die Bestimmung der Antikörper-Anerkennung durch auf Nylon angebrachte Peptide benutzt wird ist die selbe, die in Tabelle 1 wiedergegeben ist. Unter den neunundzwanzig Proben, die getestet wurden gaben fünfundzwanzig (86%) positive Ergebnisse im peptid-basierten ELISA, das heißt, letztere ein oder mehr auf Nylon angebrachte Peptide anerkannten. Im Gegensatz dazu bekammen nur vierzehn der neunundzwanzig Seren positive Ergebnisse im kommerziellen ELISA. Diese Ergebnisse dienen dazu, die Vorteile der Benutzung von Peptidmischungen für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV sowie die Notwendigkeit Peptide, die Aminosäuresequenzen aus verschiedenen Bereichen des HCV-Polyproteins enthalten einzuschließen zu erläutern. Peptide
Tabelle 1. Anerkennung der Peptide, die auf Nylonmembranen angebracht sind, durch Seren aus mit HCV infizierten Menschen.
Leerwert: keine Reaktion; 0,5: schwach positiv; 1: eindeutig positiv; 2: starke Reaktion; 3: intensive Reaktion; ND: nicht bestimmt. Tabelle 2. Zusammensetzung der Antikörperbindung an auf Nylon angebrachte HCV-Peptide von Seren aus infizierten Patienten. Tabelle 3. Vergleich einzelner Peptide in einem ELISA Test für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV. Tabelle 4. Zusammensetzung der Antikörperbindung an einzelne Peptide in einem ELISA Test. Tabelle 5. Anwendung einer Peptidmischung für den Nachweis von Antikörpern gegen HCV in Seren aus chronischen NANBH-Patienten und Vergleich mit Seren aus gesunden Blutspendern. Tabelle 6. Vergleich des Nachweises von Antikörpern gegen HCV durch auf Nylon angebrachte Peptide, einen peptid-basierten ELISA, und eine kommerzielle Ausrüstung.
Schwelle: 0,250 Schwelle: 0,623
0: keine Reaktion; 0,5: schwach positiv; 1: deutlich positiv; 2: starke Reaktion; 3: intensive Reaktion;
*O.D. überschreitet 3000 und ist außer Bereich.
Die gegebenen Werte sind deshalb Minimalwerte.

Claims

1. Eine Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein Peptid, welches ausgewählt ist aus:

(a) der Gruppe von Aminosäuresequenzen, bestehend aus:

wobei Y H oder ein Verbindungsarm ist, durch den das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm mindestens eine Aminosäure und bis zu 60 Aminosäuren, meistens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z.B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z. B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist, Y z. B.durch N-terminale Acetylierung modifiziert sein kann; Z eine Bindung oder ein Verbindungsarm ist, durch die (den) das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm wenigstens eine Aminosäure und bis zu 60 Aminosäuren, meistens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z.B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z.B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist;

und X NH2, OH oder eine Bindungsgruppe ist, die eine dieser beiden Gruppen beinhaltet;

und wobei, wenn Y oder Z-X (eine) Aminosäure(n) ist (sind), sich diese von jeglichen natürlich vorkommenden HCV- Flankenbereichen unterscheiden,

oder,

(b) den Varianten jeder der oben genannten Peptide (I) bis (VII), wobei diese Varianten sowohl konservative als auch nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen darstellen, die für eine Variation von Stamm zu Stamm von weniger als 35% in HCV- Sequenzen in bezug auf jede der Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) sorgen, vorausgesetzt, diese Peptidvarianten sind in der Lage, für eine immunologische Konkurrenz mit mindestens einem HCV-Stamm zu sorgen;

oder,

(c) Fragmenten der Peptide (I) bis (VII) mit mindestens 6 Aminosäuren von irgendeiner der Peptid-Sequenzen 1-20, 7-26, 8- 18, 13-32, 37-56, 49-68, 61-80 und 73-92, wie oben definiert; wobei diese Fragmente im wesentlichen die gesamte Sensitivität der Peptid-Sequenzen, von welchen sie abstammen, beibehalten,

und vorausgesetzt, daß die Peptide sich von der folgenden Liste von Peptiden unterscheiden: wobei darstellt

ein Peptid daß das durch die Sequenze darstelltes Peptid enthält und ein Peptid, daß aus einem Teil des durch die Sequenze darstellten Peptides besteht,

2. Eine Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1, weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem mindestens ein Peptid aufweist, das ausgewählt ist aus:

(a) der Gruppe von Aminosäure-Sequenzen, bestehend aus:

wobei Y H oder ein Verbindungsarm ist, durch den das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm mindestens eine Aminosäure und bis zu 60 Aminosäuren, meistens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z.B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z.B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist, Y z. B.durch N-terminale Acetylierung modifiziert sein kann; Z eine Bindung oder ein Verbindungsarm ist, durch die (den) das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm wenigstens eine Aminosäure und bis zu 60 Aminosäuren, meistens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z.B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z.B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist;

oder,

(b) den Varianten jeder der oben genannten Peptide (VIII) bis (XIX), wobei diese Varianten sowohl konservative als auch nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen darstellen, die für eine Variation von Stamm zu Stamm von weniger als 35% in HCV- Sequenzen in bezug auf jede der Aminosäuresequenzen (VIII) bis (XIX) sorgen, vorausgesetzt, diese Peptidvarianten sind in der Lage, für eine immunologische Konkurrenz mit mindestens einem HCV- Stamm zu sorgen;

oder,

(c) Fragmenten der Peptide (VIII) bis (XIX) mit mindestens 6 Aminosäuren von irgendeiner der Peptid-Sequenzen 1688- 1707, 1694-1713, 1706-1725, 1712-1731, 1718-1737, 1724-1743, 1730- 1749, 2263-2282, 2275-2294, 2287-2306, 2299-2318 und 2311-2330, wie oben definiert; wobei diese Fragmente im wesentlichen die gesamte Sensitivität der Peptid-Sequenzen, von welchen sie abstammen, beibehalten.

3. Eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eines der folgenden Gemische von Peptiden enthält, wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 definiert:

(a) Peptide II, III, V, IX und XVIII,

(b) Peptide I, II, V, IX, XI, XVI und XVIII,

(c) Peptide II, III, IV, V, VIII, XI, XVI und XVIII,

(d) Peptide II, IX und XVIII,

(e) Peptide II, III, IV und V.

4. Eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide N-terminal, C-terminal oder intern an ein Trägermolekül gebunden sind, um Antikörper zu bilden oder die Adsorption der Peptide an eine feste Phase zu vereinfachen.

5. Eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine erkennbare Markierung enthalten.

6. Verwendung einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Inkorporierung in ein Immunoassay für den Nachweis der Gegenwart von Antikörpern gegen in einer Körperflüssigkeit vorliegende Hepatitis-C-Viren.

7. Ein Verfahren für den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Viren, die in einer Körperflüssigkeit, z.B. in einem Serum oder Plasma, vorliegen, umfassend wenigstens die folgenden Schritte:

(a) das in-Berührung-bringen einer zu diagnostizierenden Körperflüssigkeit eines Menschens mit einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und

(b) das Nachweisen des immunologischen Komplexes, der sich zwischen den besagten Antikörpern und dem (den) verwendeten Peptid(en) gebildet hat.

8. Eine Ausrüstung zum Nachweis von Antikörpern gegen Anti- Hepatitis-C-Viren in einer Körperflüssigkeit, umfassend mindestens die folgenden Komponenten:

- eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

- Mittel zum Nachweisen eines immunologischen Komplexes, der sich zwischen den besagten Peptiden und den Antikörpern gebildet hat.

9. Ein Verfahren nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide als Linien auf eine Nylonmembran aufgebracht werden, wobei die Nylonmembran vorzugsweise senkrecht zur Richtung der Peptidlinien in Streifen geschnitten wird, sodaß jeder Streifen mit einer angemessen verdünnten Serumprobe von einem Menschen inkubiert werden kann.

10. Eine Ausrüstung nach Anspruch 8, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide als Linien auf eine Nylonmembran aufgebracht sind und die Nylonmembran vorzugsweise senkrecht zur Richtung der Peptidlinien in Streifen geschnitten ist, sodaß jeder Streifen mit einer angemessen verdünnten Serumprobe von einem Menschen inkubiert werden kann.

11. Eine Ausrüstung nach Anspruch 8 oder 10, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide einzeln oder in Kombination verwendet werden, um die Vertiefungen von Mikrotiterplatten auszukleiden.

12. Die Verwendung einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Inkorporierung in eine Impfzusammensetzung gegen HCV.

13. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Bilden von Antikörpern gegen HCV.

14. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die besagten Peptide solche sind, die durch Cyklisieren irgendeines der Peptide der Ansprüche 1 oder 2 oder durch Kuppeln von zwei Peptiden der Ansprüche 1 oder 2 erhalten werden.

15. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die besagten Peptide solche sind, die direkt durch Synthetisieren der Peptide von Anspruch 1 oder 2 auf einem Oligo- Lysinkern erhalten werden, wobei sowohl die alpha- als auch die epsilon-Aminogruppen von Lysinen als Wachstumspunkte für die Peptide verwendet werden.