KR100317509B1 - C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법 - Google Patents

C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스 (HCV)의 그룹 I에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 NS4-관련 항원성 펩티드; C형 간염 바이러스 (HCV)의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 NS4-관련 항원성 펩티드; 상기 펩티드들을 별도 부분에 포함하는 HCV 그룹 I 또는 II를 확인하기 위한 키트; HCV를 분류하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 혼합감염된 환자를 진단하는 것과 함께 HCV 그룹 I 또는 II를 특이적으로 검출하는 데 사용될 수 있고, 따라서 HCV 그룹 II-감염 환자는 초기에 인퍼페론 치료를 효과적으로 받을 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 HCV 감염을 진단하는데에도 유용하다.

Description

C형 간염 바이러스를 분류하기 위한 항원성 펩티드, 이 펩티드를 포함하는 키트 및 이 펩티드를 사용하여 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법
본 발명은 C형 간염 바이러스를 분류하기 위한 항원성 펩티드, 이 펩티드를 포함하는 키트 및 이 펩티드를 사용하여 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 C형 간염으로 통칭되는 비-A 비-B형 간염은 A형 간염 및 B형 간염 바이러스 이외의 특정 바이러스에 의해 유발되는 전염성 간염이며, 흔히 만성 간염으로 되고 그에 따라 높은 비율로 간경변 또는 간염을 초래하므로 이 질병은 심각한 사회문제로 되어 왔다. C형 간염은 환자나 건강한 보균자에서 바이러스 발현양이 아주 적고 또 이 간염을 유발하는 바이러스가 한가지 유형인지 두가지 이상의 유형으로 존재하는지에 대해 알려진 바가 없기 때문에 그 진단이 매우 곤란하다. 최근에 와서야 소위 "제외진단법"에 의해 비-A 비-B형 간염의 진단이 실행되었는데, 이 제외진단법은 알라닌 아미노기 전이효소 및 아스파라긴산 아미노기 전이효소의 증가량을 확인하고; 간염이 A형 간염, B형 간염인지 아니면 간 기능장애를 유발할 수 있는 CMV 및 EBV와 같은 공지 바이러스들에 의한 간염인지를 결정하며; 또 마지막으로 간염이 상술한 질병 이외의 것이면 비-A 비-B형 간염으로 진단하는 것으로 구성된 방법이다. 그러나 비-A 비-B형 간염의 임상증후가 다른 바이러스에 의한 간염의 임상증후와 유사하기때문에 제외진단법에 의해서는 다른 바이러스에 의한 간염으로 부터 비-A 비-B형 간염을 구별하거나 비정상적 ALT값을 갖지 않는 건강한 보균자를 확인하는 것이 용이하지 않다. 이러한 이유들로 인하여 건강한 보균자의 혈액을 수혈하는 것에 의한 바이러스 감염을 예방하기가 어렵기 때문에 비-A 비-B형 간염은 간염의 90%이상을 차지하는 것으로 추산된다. 일본에서는 비-A 비-B형 간염 환자의 수가 연간 약 백만명에 달하고 있다.
이러한 상황을 개선하기 위하여, 많은 연구자들이 비-A 비-B형 간염을 진단하기 위한 물질을 개발하려 했으나 개발된 물질의 대부분은 신뢰도가 낮은 것들이었다.
이들 물질중에서 최고의 신뢰도를 갖는 물질은 엠.호돈 일행 (PCT 특허출원 WO89/04669호; PCT/JP90/500880호)에 의해 치론 코포레이숀(미합중국)에서 개발된 물질로 보고있다. 치론 코포레이숀사는 C형 간염 바이러스 (HCV, 치론 코포레이숀에 의해 명명됨)의 전체 게놈 구조를 알아내기 위해 관련 바이러스 유전자를 클로닝하고 또 HCV 유전자의 일부를 발현시키는 것에 의해 수득된 항원성 단백질을 포함하는 진단용 키트를 개발하였다.
그 이후로 일본에서는 면역스크리닝법에 의해 비-A 비-B형 간염에 특이적인 많은 HCV 유전자를 분리하여 왔다. 그 결과, HCV는 치론 코포레이숀에 의해 분리된 HCV의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 고도의 상동성을 갖는 HCV 그룹 I과 상동성이 적어서 HCV I과는 상이한 바이러스로 생각되는 HCV 그룹 II로 분류될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (일본국 특허출원 91-189268호). 치론 코포레이숀에 의해 시판되고 있는 키트는 비-A 비-B형 간염을 앓고 있는 일본인 환자의 혈청으로 실험할 때 50 내지 70%의 낮은 양성 반응률을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 면역학적 면에서 좀 더 높은 정확도를 갖는 진단시약의 개발이 요청되어왔다.
상술한 바와 같이 HCV는 치론 코포레이숀에 의해 클론된 그룹 I과 본 발명의 발명자에 의해 클론된 그룹 II로 분류될 수 있고, 이들 그룹 I 과 II는 모두 전염성 간염 병원체이다. 대부분의 연구는 이들 두개의 HCV 그룹이 바이러스적 및 임상적인 병리학적 면에서 어떻게 임상적으로 상호작용하는가에 관한 것이었다. 그의 일례가 비-A 비-B형 간염의 인터페론 (IFN) 치료이다. 항 바이러스제인 IFN은 HCV의 영속적인 감염을 방지함으로써 만성 간염 증후를 예방하는 것으로 알려져 있지만, 만성 간염 및 간경변과 같은 진행성 질병에 대한 IFN 치료 효과는 약 30%로 적은 반면, 급성 간염에 대한 그의 효과는 높은 것으로 알려져 있다. 미야자키 일행 (1992년 일본 간학회 제 28차 회의, 일반강의 4, 초록 75페이지)은 PCR 수법을 사용함으로써, IFN 치료 효과가 높은 C형 간염 환자가 HCV 그룹 II에 감염된 사실을 발견하였다.
HCV 유전자는 감염된 소량의 혈청을 사용하여 PCR 수법에 의해 증식되고 검출될수 있지만, 이 수법은 그 처리가 복잡하기 때문에 많은 시료를 시험하는데에는 사용될 수 없다. HCV 그룹 I 또는 HCV 그룹 II중 어느 하나에 특이적으로 감염된 환자를 확인하기 위한 효소결합 면역흡착검사법 (이후 "엘리사법"이라 칭함)이 개발된다면, HCV 그룹 II-감염 환자는 초기에 효과적으로 IFN 치료를 받을 수 있을 것이다. 이러한 방법은 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염된 혼합감염 환자를 확인하는데에도 또한 유용할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스를 분류하기 위해 사용할 항원성 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 사용하여 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HCV 그룹 I 및 HCV 그룹 II에 대한 항체에 각각 특이적으로 반응할 수 있는 조합된 2개의 항원성 펩티드를 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이 키트를 사용하여 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 바와 같이, C형 간염 바이러스, 즉 HCV는 그의 아미노산 서열 사이의 상동성을 비교하여 크게 그룹 I 및 그룹 II로 분류된다. 그 상동성은 치론 코포레이숀에 의해 클론된 HCV I (PCT 특허출원 WO90/11089호, PCT/JP90/500880호)과 비교한 것을 기초로 하여 결정될 수 있으므로, HCV는 약 80% 이상의 상동성을 갖는 그룹과 약 80% 미만의 상동성을 갖는 그룹으로 분류될 수 있다. 전자는 그룹 I이고 또 후자는 그룹 II로 볼 수 있다. 여기서, 그룹 I 및 그룹 II는 상술한 정의를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "분류"라는 말은 그룹 I을 그룹 II로 부터 구별하거나 또는 그룹 I 및 그룹 II를 나누고 또 그룹 I 및 그룹 II를 확인하거나 인지하는 것을 의미한다.
과거 수년간, 전체 길이의 HCV 클론이 단리되었고 또 이들의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열도 결정되었다. 그 결과, 그룹 I은 I형 및 II형으로 나뉠 수 있는 반면 그룹 II는 III형 및 IV형으로 나뉜다는 것이 밝혀졌다. 예컨대, HCV I형은 치론 코포레이숀에 의해 단리된 "HCV I" (PCT 특허출원 WO90/11089호, PCT/JP90/500880호 참조)이고, HCV II형은 시모토노 일행에 의해 단리된 "J" (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 9524-9528 (1990) 참조)이며, HCV III형은 오카모토 일행에 의해 단리된 "J6"(J.Gen. Virol.72:2697-2704 (1991)참조)이고, 또 HCV IV형은 오카모토 일행에 의해 단리된 "J8" (Virology 188: 331-341 (1992) 참조)이다. 아미노산 서열에 기초한 I형 및 II형 사이 또는 III형 및 IV형 사이의 상동성은 약 85% 이다.
본 발명자들은 C형 간염 환자의 혈청으로 부터 취한 HCV 유전자를 클로닝하고, 이렇게 수득한 DNA 단편을 중식시키고 또 이 DNA 단편을 대규모로 발현시켜 수득한 다양한 펩티드중에서, HCV 그룹 I 또는 II를 갖는 C형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응할 수 있는 항원성 펩티드가 존재한다는 사실을 발견하였다. 따라서 2개 그룹을 분류하는데 유용한 펩티드가 PCT/JP90/500880호에 기재된 HCV I-코드화 폴리펩티드의 아미노산 번호 1674 내지 1760에 해당되는 영역에 존재하고, 이 펩티드 영역은 HCV 게놈과 더불어 NS4 영역에 의해 코드화된다는 사실도 밝혀졌다. 특히 바람직하게는, HCV 그룹 I을 확인하는데 유용한 것으로 밝혀진 항원성 펩티드는 서열번호 1에 도시한 아미노산 서열을 갖는 C14-1 펩티드 및 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열을 갖는 C14-1-2 펩티드이며 이 C14-1-2 펩티드는 C14-1 펩티드와 관련이 있다. HCV그룹 II를 확인하는 데 유용한 것으로 밝혀진 항원성 펩티드는 서열번호 3에 도시한 아미노산 서열을 갖는 C14-2 펩티드 및 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열을 갖는 C14-2-2 펩티드이고, 후술한 펩티드는 C14-2 펩티드와 관련이 있다. 이들 서열들은 오카모토 일행 (Okamoto 일행, 상동)에 의해 단리된 J6 및 J8 게놈에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 아미노산 번호 1680 내지 1764 영역에 해당된다. 분류에 있어서, 다른 유용한 펩티드는 상술한 4개 펩티드의 단편일 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열 또는 그 서열의 일부를 갖고 또 C형 간염 바이러스 그룹 I에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 항원성 펩티드; 및 서열번호 3 또는 서열번호 4에 도시된 아미노산서열 또는 그 서열의 일부를 갖고 또 C형 간염 바이러스 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 항원성 펩티드를 제공한다.
시편 (예컨대, 혈액)중의 HCV는 상술한 펩티드를 항원으로 사용하여 HCV 그룹 I 또는 HCV 그룹 II로 분류될 수 있다.
본 발명에 따르면, HCV 그룹 I 및 II에 대한 항체와 각각 특이적으로 반응할 수 있는 2개의 항원성 펩티드는 조합되어 키트를 형성할 수 있고 또 이러한 키트는 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염된 혼합감염된 환자를 진단하는데 유용하다.
따라서 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖고 C형 간염 바이러스의 그룹 I에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 동일한 기능을 갖는 상기 펩티드의 변형물로 구성된 군으로 부터 선정되는 한개 이상의 제 1 항원성 펩티드 및 서열번호 3 및 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖고 C형 간염 바이러스의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 동일한 기능을 갖는 상기 펩티드의 변형물로 구성된 군으로 부터 선정된 한개 이상의 제 2 항원성 펩티드를 각기 별도 부분에 포함하는 C형 간염 바이러스의 그룹 I 또는 그룹 II를 확인하기 위한 키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 "동일한 기능을 갖는 상기 펩티드의 변형물"이라는 용어는 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 부분서열중의 구성 아미노산 대신 한개 이상의 상이한 아미노산을 갖지만 상기 정의된 HCV 그룹 I 또는 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드를 의미한다. 제 1도에서C14-1 및 C14-1-2 사이 또는 C14-2 및 C14-2-2 사이를 비교한 것에서 부터 알 수 있듯이, 아미노산 치환의 예는 Ile-Val, Leu-Ile, Val-Ala, Met-Ile, Lys-Arg, Asp-Gln등과 같은 유사한 화학 구조를 갖는 아미노산 사이의 치환을 포함한다.
본 발명에서 사용된 것과 같은 항원성 펩티드는 바이러스성 항체와의 항원-항체 반응에 악영향을 주지 않는 다른 불활성 펩티드와 융합될 수 있거나, 또는 이들은 화학적으로 (예컨대, 펩티드의 N-말단을 아실화하는 것에 의해) 변형될 수 있다. 항원성 펩티드의 다른 예는 이들의 항 이디오타입 항체이다.
유용한 펩티드 단편의 예는 하기 서열을 갖는 단편을 포함하며, 하기한 예에 한정되지 않는다: 서열번호 1에 도시한 아미노산 서열중의 아미노산 위치 20 내지 44(제 1도에서 "1-Y"로 표시), 37 내지 62 (1-Z) 또는 이들의 결합물; 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열중의 아미노산 위치 20 내지 44 (1-Y), 37 내지 62 (1-Z), 53 내지 74 (1-B), 64 내지 87 (1-A) 또는 이들의 결합물; 서열번호 3에 도시한 아미노산 서열중의 아미노산 위치 20 내지 44 (2-Y), 37 내지 62 (2-Z) 또는 이들의 결합물; 및 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열중의 아미노산 위치 20 내지 44 (2-Y), 37 내지 62 (2-Z), 53 내지 74 (2-B) , 64 내지 87 (2-A) 또는 이들의 결합물. 여기서 "결합물"이라는 용어는 서열 20 내지 62, 20 내지 74 등과 같은 2개 이상의 단편 서열의 결합물을 의미한다.
항원성 펩티드는 재조합 DNA 수법 또는 펩티드 합성 수법에 의해 제조될 수 있다.
통상의 재조합 DNA 수법에 의한 항원성 펩티드의 제조방법은,
서열번호 1, 2, 3 또는 4에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖는 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 갖는 복제가능한 발현 벡터를 작성하고;
상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환된 세포를 수득하며;
DNA 단편이 발현하기에 적합한 조건하에서 상기 형질전환된 세포를 배양하고; 또 필요로 하는 펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
다음은 발현 벡터를 작성하는 예이다. 필요로하는 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 통상의 플라스미드 (예컨대, pUC119)에 결찰시킨 다음 증식시킨다. 생성한 플라스미드를 2개의 제한효소를 사용하여 이중으로 분해시키고, 수득한 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동법을 이용하여 분리 및 정제한다. 다르게는 pAT.trp.trpE(JP-A-89-215,289호 참조)와 같은 적합한 발현 벡터를 동일한 제한효소를 사용하여 이중으로 분해시킨 다음 수득한 벡터 단편을 유사한 방식으로 정제한다. 벡터 단편을 상술한 DNA 단편에 결찰시키면 HCV 그룹 I 또는 II-특이적 항원이 발현될 수 있는 소망하는 발현 벡터를 생성하게된다 (하기 실시예 참조).
발현에 유용한 프로모터들은 트립토판 합성효소 오페론 (trp) 프로모터, 락토오스 오페론 (lac) 프로모터, 람다 파아지 PL또는 PR프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터 및 SV40 프로모터와 같은 대장균, 파아지, 바이러스 등으로 부터 얻은 것들이다. 발현 벡터 DNA에는 항생물질 내성 유전자와 같은 선택마커, 복제기점, 전사 종결 인자, 리보솜 결합 위치 등과 같은 것이 존재할 수 있다.
형질전환에 사용하기 위한 숙주 세포의 예로는 대장균, 고초균 및 효모와 같은 일반적 미생물, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유류 세포를 들 수 있다. 바람직한 숙주세포는 원핵생물, 특히 대장균이다. 형질전환은 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 통상의 방법에 의해 실행될 수 있다. 세균 세포 (예컨대, 대장균)가 숙주 세포로 사용되면, 염화 루비듐 (하나한, DNA 클로닝: A practical approach, IRC Press (1985)) 또는 염화 칼슘 (만델, 엠과 히가, 에이, J.Mol.Biol., 53;159-162 (1970))을 사용한 직접적 혼입법이 유리하다. 고등생물 세포가 숙주 세포로 사용되면, 바이러스성 벡터를 사용한 혼입법이 유리하다.
발현 벡터를 갖고 있는 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하여 소망하는 펩티드를 생산한다.
소망하는 펩티드를 숙주 세포로 부터 정제하는 것은 다음과 같이 실행한다: 숙주세포를 초음파로 파괴시킨 다음 C형 간염 바이러스 cDNA에 의해 코드화된 펩티드 또는 이 펩티드와 다른 펩티드 (예컨대, trpE)의 융합 펩티드를 함유하는 불용성 분획을 원심분리에 의해 분리하고, 우레아 함유 완충액을 사용하여 상기 분획으로 부터 재조합 펩티드를 용해시킨 다음 이것을 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (예컨대, Q-세파로오스) 처리시켜 부분적으로 정제시킨다. 재조합 펩티드를 더 정제시키기 위해서는 겔 여과 (예컨대, HiLoad Superdex)와 같은 과정을 이용할 수 있다.
이와 다르게는, 본 발명의 펩티드는 액체상 방법 및 고체 상 방법 모두를 포함하는 통상의 펩티드 합성 수법 (일본국 생화학 협회가 1977년 편찬한 생화학 실험강의 I, "단백질 화학 IV: 생화학적 변형 및 펩티드 합성", 207-495 페이지)에의해 제조할 수 있다. 대체로, 소망하는 펩티드가 긴 펩티드이면, 약 5 내지 10개 아미노산으로 구성된 소형 펩티드를 합성 수지상 위에서 합성하고 순서대로 또는 단계별로 서로 결합시키며 소망하는 펩티드는 하기 보호해제로써 수득할 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 펩티드는 대체로 진공 또는 동결건조하에서 건조시킨 후 어두운 냉실에서 고체 형태로 저장된다. 키트 형태로 포장되면, HCV 그룹 I 항체 특이적 항원성 펩티드 및 HCV 그룹 II 특이적 항원성 펩티드는 각각 키트의 별도 부분에 존재하게된다. 이러한 부분의 예는 유리 또는 수지로 제조된 두껑 달린 바이얼 및 앰풀, 마이크로타이터 플레이트 등이다. 바람직한 부분은 엘리사법용 마이크로타이터 플레이트 웰상에 흡착된 펩티드가 적합한 과정 (동결건조)에 의하여 안정화될 수 있어서 이 펩티드가 HCV 항체에 대한 결합능력을 유지할 수 있는 부분이다. 마이크로타이터 플레이트 대신, 응집시키기 위한 튜브, 비이드 및 지지체 (예컨대, 적혈구)가 사용될 수 있다. 본 발명의 키트에서 면역분석법에 필요한 시약은 경우에 따라 완충액, 효소 라벨링되거나 또는 방사성 라벨링된 제 2 항체, 발색제, 면역반응 종결제등을 포함할 수 있다.
표 1 내지 표 4는 C형 간염으로 임상적으로 진단된 환자의 혈청으로 부터 취한 폴리펩티드, 즉 trpE.C14-1, trpE.C14-1-2, trpE.C14-2, trpE.C14-2-1 (서열번호 3에서 아미노산 잔기 23 내지 63으로 구성됨) 또는 trpE.C14-2-2 의 면역반응의 EIA 결과를 나타낸다. 그 결과는 trpE.C14-1 및 trpE.C14-1-2가 HCV 그룹 I을 특이적으로 확인할 수 있는 반면에 trpE.C14-2, trpE.C14-2-1 및 trpE.C14-2-2는 HCV 그룹 II를 특이적으로 확인할 수 있다는 것을 나타낸다.
표 5, 6 및 7은 HCV 그룹 I 또는 II와 특이적으로 반응할 수 있는 본 발명의 펩티드 단편과 C형 간염에 걸린 환자로 부터 취한 다양한 혈청의 면역반응의 EIA 결과를 나타낸다. 표 5, 6 및 7의 결과는 환자가 HCV 그룹 I만으로 감염된 경우 뿐만 아니라 HCV 그룹 II만으로 감염되거나 또는 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염된 경우를 나타낸다. C형 간염을 진단하기 위한 시판되고 있는 시약인 대조용 시약 이뮤체크-HCV (Immucheck-HCV) (예컨대, 일본국 효고쿠에 소재하는 국제시약사 제품)는 HCV 그룹 II로 부터 HCV 그룹 I을 구별하지 못한다.
따라서 본 발명은 ,
서열번호 1 또는 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖는 항원성 펩티드를 HCV에 대한 항체를 함유하는 것으로 추정되는 시편과 접촉시켜 면역반응을 일어키고; 또
그룹 I에 속하는 HCV에 대한 항체를 양성으로 검출하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법을 제공한다.
서열번호 3 또는 서열번호 4에 도시한 아미노산 또는 그의 부분서열을 갖는 항원성 펩티드가 사용되면, HCV 그룹 II에 대한 항체를 양성으로 검출할 수 있으므로 이 분류 방법은 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 키트의 용도에도 관한 것이다. 따라서 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2에 도시한 아미노산 또는 그의 부분서열을 갖고 또 C형 간염 바이러스의 그룹 I에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 이 펩티드와 동일한 기능을 갖는 그의 변형물로 구성된 군으로 부터 선정된 한개 이상의 제 1 펩티드, 및 서열번호 3 및 서열번호 4에 도시한 아미노산 또는 그의 부분서열을 갖고 또 C형 간염 바이러스의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 이 펩티드와 동일한 기능을 갖는 그의 변형물로 구성된 군으로 부터 선정된 한개 이상의 제 2 펩티드를 면역반응에 의해 항체를 정량적으로 또는 정성적으로 측정할 수 있도록 C형 간염 바이리스에 대한 항체를 함유하는 것으로 추정되는 시편과 각기 접촉시키고, 이때 제 1 및 제 2 펩티드는 상기 정의한 바와 같이 키트내에 포함되어 있으며; 또
C형 간염 바이러스의 그룹 I 또는 그룹 II에 대한 항체를 검출하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법을 제공한다.
유용한 면역학적 분석법은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 적합한 수법, 예컨대, 웨스턴 블럿 분석법, 효소 면역측정법, 면역침강법 및 방사성면역측정법이다. 측정조건은 사용한 측정법의 유형에 따라서 달리 선택할 수 있다 (하기 실시예 참조). 시편은 통상적으로 혈액, 특히 혈청이다.
본 발명을 하기 실시예로써 자세히 설명하지만 이는 제한을 의미하지 않는다.
실시예 1
C14-1 및 C14-1-2 발현 플라스미드의 작성
RT-PCR법에 의한 HCV 항원 코드화 DNA의 클로닝;
만성 C형 간염 환자의 혈청으로 부터 취한 HCV 유전자를 클론하기 위하여, 역전사효소 (RT)-PCR 수법을 이용하였고, 이때 클로닝은 소량의 혈장을 사용하여실행될수 있다.
100 ㎕의 C형 간염 환자의 혈청에 먼저 200 ㎕의 6M GTC 용액 (6M 구아니딘 티오시아네이트, 37.5 mM 시트르산 나트륨, 0.75% 사르코실, 0.2 M β-머캅토에탄올) 및 1 ㎕의 효모 t-RNA (10 ㎎/㎖)를 부가하여 교반한다. 수득한 혼합물에 20 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2), 30 ㎕의 TE-포화 페놀 (pH 7.5 - 8.0) 및 70 ㎕의 클로로포름/이소아밀 알코올 (49:1)을 급히 부가하고, 10초간 교반한 다음 얼음위에서 15분간 방치한다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후, 수성층을 제거하고, 동 부피의 이소프로필 알코올과 혼합하며 또 -20 ℃에서 1시간 이상 동안 방치한다. 동일 조건하에서 원심분리시킨 후, 침전물을 회수하고 이것을 100 ㎕의 4M GTC (6 M GTC를 멸균수로 희석시킨 것)에 용해시키고, 동부피의 이소프로필 알코올과 혼합하며 또 -20 ℃에서 1시간 이상 동안 방치시킨다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 원심분리시킨후, RNA 침전물을 회수하고, 70% 에탄올 (1㎖)을 사용하여 세척하며 실온에서 공기건조시키고 또 10 ㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 RNA 용액은 나중에 사용한다.
HCV cDNA 합성은 다음과 같이 실행한다:
10 ㎕의 RNA 용액을 실리콘 처리된 튜브 (0.5㎖)에 넣고, 70 ℃에서 3분간 가열시킨 다음 얼음에서 급냉시킨다. 이어 상기 용액에 1 ㎕의 RNA분해효소 억제제 (50 단위체/㎕; 예컨대, 타카라 스조 제품), 1 ㎕의 dNTP (각각 20 mM), 100 mM DTT, 4 ㎕의 5 X RT 완충액 (250 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 375 mM KCl, 15 mMMsCl2), 1 ㎕의 랜덤 올리고헥사머 프라이머 (100 pmol/㎕) 및 역전사효소 (BRL) (200 단위체/㎕)를 부가하고 또 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체 부피를 20 ㎕로 만든다. HCV cDNA 합성은 42 ℃에서 2시간 동안 실행한다. 반응 혼합물을 94 ℃에서 5분간 가열시켜 효소를 불활성화시킨다.
PCR은 수득한 cDNA를 사용하여 다음과 같이 실행한다:
이용된 PCR은 먼저 2개의 프라이머를 사용하여 제 1 단계 PCR을 실행한 다음 제 1 PCR 생성물의 DNA 서열의 내부에 존재하는 2개의 프라이머를 사용하여 제 2 단계 PCR을 실행하는 2단계 방법이다. 이 방법에 의하여, 검출된 DNA의 감도 및 특이성을 증대시킬 수 있다.
C14-1 영역을 증대시키기 위해, 공지 서열을 참조하여 하기의 프라이머를 합성한다 (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 9524-9528, 1990):
제 1 PCR에 사용된 프라이머:
5S1: 5'-AGGTCGTCACTAGCACCTGGGTGC-3' (서열번호 : 10); 및
5A1: 5'-TGTATCCCGCTGATGAAGTTCCAC-3' (서열번호 : 11);
제 2 PCR에 사용된 프라이머:
5S2: 5'-GAATTCACGACAGGCAGCGTGGTC-3' (서열번호: 12); 및
5A2: 5'-CTATTACAGCAATCCGAGCGCCCT-3' (서열번호: 13).
0.5㎖ 튜브에, cDNA 합성 반응용액 20 ㎕, 10 × PCR 완충액 (100 mM 트리스-HCl(pH 8.3)) 8 ㎕, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.1% 젤라틴), 2개의 제 1 단계 프라이머(각각 75 pmole) 및 8 ㎕의 2 mM dNTP를 도입한 다음 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체 부피를 100 ㎕로 만든다. 94 ℃에서 10분간 가열시킨 후, 이 혼합물에 1 ㎕의 AmpliTaq (5 단위체; 예컨대, 퍼킨-엘머-세투스 제품)를 교반하면서 부가하고 또 간단한 원심분리시키기 전에 혼합물 용액에 무기오일을 붓는다. PCR의 조건은 다음과 같다: 변성, 94 ℃에서 1분간; 어닐링, 55 ℃에서 1분간; 연장, 72 ℃에서 2분간; 및 30 사이클. 새로운 0.5 ㎖ 튜브에, 10 ㎕의 PCR 반응 혼합물, 9 ㎕의 10 × PCR 완충액, 2개의 제 2 단계 PCR 프라이머 (각각 75 pmole) 및 9 ㎕의 1 mM dNTP 를 부가하고 또 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체 부피를 100 ㎕로 만든다. 94 ℃에서 10분간 가열시킨 후, 이 혼합물에 1 ㎕의 AmpliTaq (5 단위체)를 교반하면서 부가하고 또 간단한 원심분리시키기 전에 혼합물 용액에 무기오일을 붓는다. 제 2 PCR은 제 1 PCR과 동일한 조건하에서 실행된다. 반응후, 10 ㎕의 반응 혼합물을 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분석하며, 이때 특이적으로 증대된 DNA 단편을 검출할 수 있다.
PCR에 의해 증대된 C14-1 DNA 단편 (약 200 bp)을 저 융점 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분리하고, 이 DNA 단편을 함유하는 겔을 68 ℃의 멸균수 200 ㎕에 15분간 용해시킨다. 이 용액을 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)-포화페놀을 사용하여 2회 추출하여 DNA 단편을 함유하는 수성층을 분리시킨다. 수성상을 에탄올 침전처리시켜 DNA 단편 침점물을 수득하고 여기에 2 ㎕의 10 × 키나제 완충액(0.5 M 트리스-HCl, pH 7.6, 0.1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘, 1 mM EDTA pH 8.0), 1 ㎕의 10 mM ATP 및 1 ㎕의 T4 키나제 (10 단위체/㎕; 예컨대, 타카라 스조 제품)를 부가한 다음 멸균수를 부가하여 전체 부피를 20 ㎕로 만든다. 이 혼합물을 37 ℃에서 1시간 동안 5' 말단 포스포릴화 반응시킨다. 68 ℃에서 10 분간 가열시키는 것에 의해 키나제를 불활성화시킨 후, 반응 혼합물을 pUC119 (Vieira, J. 및 Messing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11 (1987))를 사용하여 결찰시킨다. pUC119 (1 ㎍)를 20 ㎕의 제한반응 용액 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 7 mM MgCl2, 20 mM KCl, 10 단위체의 SmaI 효소 (예컨대, 타카라 스조 제품)중, 37 ℃ 에서 1시간 동안 분해시키고, 이 반응 혼합물을 68 ℃에서 10분간 가열시키고 80 ㎕의 멸균수를 부가한 후 SmaI 클로닝 벡터 용액을 수득한다. 10 ㎕의 포스포릴화된 DNA 단편과 2 ㎕의 SmaI 벡터의 결찰반응은 2 ㎕의 10 × 완충액 (0.66 M 트리스-HCl pH 7.6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT), 1 ㎕의 10 mM ATT, 1 ㎕의 T4 리가제 (350 단위체/㎕: 타카라 스조 제품) 및 4 ㎕의 멸균수중, 16 ℃ 에서 하룻밤 동안 실행한다.
10 ㎕의 결찰반응 혼합물을 대장균 JM109주에 넣어 형질전환시킨다. 감수성 대장균 균주는 염화 칼슘을 사용하여 미리 제조한 것이다(만델, 엠 및 히가, 에이., J. Mol Biol.53, 159-162 (1970)).
형질전환된 대장균을 37 ℃의 LB-Amp 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천, 암피실린 (25 ㎍/㎖))상에서 하룻밤 동안 배양한 다음 여기에 50 ㎕의 2% X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)를 10 ㎕의 100 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)와 함께 부가한다. 플레이트상에 형성된 백색 콜로니를 백금 루프를 이용하여 1회 덜어내어 25 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5 % NaCl)중, 37 ℃에서 교반하면서 하룻밤 동안 배양한다. 1.5 ㎖의 배양액을 원심분리시켜 세균 세포를 수집하고 이것을 알칼리성 용균 방법 (마니아티스 일행에 의한 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982)에 의해 소규모 제조방법으로 플라스미드 DNA를 수득한다. 1 ㎍의 수득한 플라스미드 DNA를 30 ㎕의 제한반응용액 (100 mM 트리스-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2, 각기 10 단위체의 EcoRI 및 HindIII (예컨대, 타카라 스조 제품))중, 37 ℃에서 1시간 동안 분해시키고, 그 분해물을 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 크기 분석하여 약 250 bp 크기의 삽입 DNA 단편을 확인한다. 이 삽입 DNA 단편을 함유하는 클론을 pUC.C14-1로 칭한다. 이 C14-1 DNA 단편을 생거의 디데옥시 사슬종결법 (생거, 에프. 사이언스, 214, 1205-1210 (1981))에 의해 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 그로 부터 아미노산 서열을 추론 결정한다. 결정된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 하기 서열 1 및 5에 각각 나타낸다.
NS3의 후반부에서 부터 NS5의 전반 까지의 게놈 HCV RNA 영역 (C6-2로 칭함)을 단리하기 위하여, 하기 프라이머를 사용한 이외에는 상기와 동일한 방식으로 RT-PCR을 실행한다:
제 1 PCR에 사용된 프라이머:
KK1: 5'-GGCTATACCGGTGACTTTGA-3' (서열번호 : 14); 및
A6 : 5'-GTCTCAGCTCCCTTCCGATC-3' (서열번호 : 15);
제 2 PCR에 사용된 프라이머:
KK5: 5'-GATCTACTGCTAACACATGTGTCA-3' (서열번호 : 16); 및
A6 : (상동)
상기 반응후, 중대된 단편을 회수한 다음 상기 기술한 방식으로 pBM 벡터 (이후 참조)에 삽입시켜 C6-2를 작성한다.
주형인 1 ng의 C6-2를 50 pmole의 각 프라이머들
(5'-GCGAATTCACAACAGGCAGTGTGGTCATT-3' (서열번호 : 17) 및
5'-GCTCATTAGAAGGTCTCAAGGGCTCGCCA-3' (서열번호 : 18)),
67 mM의 트리스-HCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH4)2SO4, 0.2 mM dNTP, 2 mM의 MgCl2, 0.2 ㎎/㎖ 젤라틴 및 0.05%의 트리톤 X-100과 혼합하여 전체부피를 50 ㎕로 만들고, 이 혼합물에 2.5 단위체의 Taq DNA 폴리머라제를 부가한다. 파라핀 오일을 붓고, C6-2 단편의 PCR (94 ℃에서 30초간, 55 ℃에서 60초간, 72 ℃에서 120초간, 30 사이클)을 실행한다. 반응 혼합물을 아가로오스 겔 전기영동 처리시켜 약 260 bp의 단편을 단리하고 이것을 유리 분말법 (Gene Clean II; 예컨대, BI0101)에 의해 50 ㎕의 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) 중에서 회수한다. 회수된 DNA 용액 (25 ㎕)에 3 ㎕의 10 × T4 완충액 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT), 3 ㎕의 2 mM dNTP 및 3 ㎕의 ATP를 부가한 다음 이 혼합물에 5 단위체의 DNA 폴리머라제 I (예컨대, 뉴 잉클랜드 바이오랩 제품) 및 10 단위체의 T4 폴리뉴클레오티딜 키나제 (예컨대, 타카라 스조 제품)을 부가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 소망하는 DNA 단편은 유리분말법에 의해 25 ㎕의 TE 용액에서 회수한다.
한편, 1 ㎍의 pT7T3 19U (예컨대, 파마시아 제품)를 20 ㎕의 제한계 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 7 mM MgCl2, 20 mM KCl, 10 단위체의 SmaI)중, 37 ℃에서 1시간 동안 제한반응에 의해 분해시킨다. 이 반응 혼합물에 10 ㎕의 1 M 트리스-HCl (pH 8.0), 70 ㎕의 멸균수 및 2 단위체의 세균의 알칼리성 포스파타제 (예컨대, 타카라 스조 제품) 를 부가하여 68 ℃에서 30 분간 반응시킨다. 반응후, 용액중의 DNA를 페놀/클로로포름을 사용하여 추출한 다음 에탄올을 사용하여 침강시킨다. 회수한 DNA (10 ㎕)를 10 ㎖의 TE 완충액에 용해시킨 후, 그 용액의 1 ㎕를 10 ㎕의 상술한 PCR DNA 단편과 혼합하고 여기에 50 ㎕의 결찰액 A 및 10 ㎕의 결찰액 B (DNA 결찰 키트; 예컨대, 타카라 스조 제품) 를 부가하고 잘 혼합하여 16℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 수득한 DNA 용액 10 ㎕를 사용하고 하나한의 방법 (DNA 클로닝: A practical approach (디.엠. 글로버 편찬), vol.1, p.109, IRC 출판사 (1985))에 따라 대장균 XL1-블루 (예컨대, 스트라겐 제품)를 형질전환시킨다. 생성한 클론은 형질전환된 세포가 EcoRI 및 SalI에 의해 분해되어 약 290 bp의 단편을 생성할 수 있는 플라스미드 DNA의 클론이다. 단리된 DNA 단편은 서열번호 6 에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖고 또 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는펩티드 (즉, C14-1-2)를 코드화한다는 것을 알 수 있다.
발현 벡터의 작성
1 ㎕의 PUC.C14-1 DNA를 20 ㎕의 제한액 (100 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2, 각 10 단위체의 EcoRI 및 BamHI (예컨대, 타카라 스조 제품))중, 37 ℃에서 1시간 동안 분해시키고 또 저융점 아가로오스 겔 전기영동처리시켜 약 200 bp의 정제된 DNA 단편을 제조한다. 한편, 1 ㎍의 발현 벡터 pAT.trp.trpE DNA(JP-A-89-215,289호)를 동일한 조건하에서 처리시켜 벡터 DNA 단편을 수득한다. 생성한 EcoRI-BamHI 처리된 벡터 DNA (1 ㎍)를 350 단위체의 T4 리가제 (예컨대, 타카라 스조 제품) 및 물을 함유하는 5 ㎕의 10 × 리가제 완충액 (660 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 66 mM MgCl2, 100 mM 디티오트레이톨 (DTT), 10 mM ATP)중에서 상기 제조된 C14-1 DNA 단편과 전체부피 50 ㎕로 16 ℃에서 철야로 결찰시킨다.
수득한 10 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 대장균 C600주를 형질전환시킨다. 형질전환시킬 감수성 대장균 균주는 염화 칼슘을 사용하여 제조해둔 것이다 (만델, 엠 및 히가. 에이., J.Mol.Biol, 53, 159-162 (2970)). 형질전환된 세포를 25 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)상에서 배양하고 37 ℃에서 철야로 저장한다. 플레이트상에 형성된 콜로니를 백금 루프를 이용하여 1회 덜어내어 25 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지상, 37 ℃에서 철야로 배양한다. 수득한 배양물(1.5 ㎖)을 원심분리하여 세균 세포를 수집하고 알칼리성 용균 방법 (마니아티스 일행, 상기 동일)에 의해 플라스미드DNA를 소규모로 제조한다.
생성한 DNA (1 ㎍)를 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 2회 분해시키고, 또 분해물중에서 발현 플라스미드 pAT.trp.trpE C14-1를 스크리닝하고 그로 부터 약 200 bp의 EcoRI-BamHI 단편을 수득할 수 있다.
이와 유사한 방식으로, 약 290 bP의 EcoRI-SalI 단편이 수득될 수 있는 발현 플라스미드 pAT.trp.trpE C14-1-2는 pUC.C14-1-2 DNA로 부터 작성할 수 있다.
실시예 2
C14-2 발현 벡터의 작성
HCV 항원-코딩 DNA의 클로닝:
HCV 그룹 II로 볼 수 있는 클론 C10-14 (FERM P-3436; 일본국 특허출원 91-189,268호)의 PCR은 하기와 같은 PCR 프라이머를 사용하여 실행한다:
5'-GAATCGCGACCGGCTGCATTTCC-3' (서열번호 : 19) 및
5'-CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT-3' (서열번호 : 20)
C10-14 클론 DNA (1 ng)를 10 ㎕의 10 × PCR 완충액 (0.1 M 트리스-HCl (pH 8.3), 0.5 M KCl), 2개의 프라이머 (각각 75 pmole) 및 10 ㎕의 2 mM dNTP에 부가하고, 그 혼합물에 멸균수를 부어 전체부피를 100 ㎕로 만든다. 94 ℃에서 10분간 가열시킨후, 1 ㎕의 AmpliTaq (5 단위체/㎕; 예컨대, 퍼킨 엘머 세투스 제품)를 상기 혼합물에 부가한 다음 이 혼합물 위로 2방울의 무기오일을 부가한다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 변성, 94 ℃에서 1분간; 어닐링, 55 ℃에서 l분간; 연장, 72 ℃에서 2분간; 및 30 사이클.
PCR 증대된 C14-2 DNA 단편 (약 200 bp)을 저융점 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분리시키고, DNA 단편을 함유하는 겔을 68 ℃에서 15분간 200 ㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 용액을 TE 완충액 ( 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)-포화 페놀을 사용하여 2회 추출하여 DNA 단편을 함유하는 수성층을 분리시킨다. 수성층을 에탄올 침강처리시켜 DNA 단편 침강물을 수득하고 여기에 2 ㎕의 10 × 키나제 완충액(0.5 M 트리스-HCl, pH 7.6, 0.1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘, 1 mM EDTA pH 8.0), 1 ㎕의 10 mM ATP 및 1 ㎕의 T4 키나제 (10 단위체/㎕; 예컨대, 타카라 스조 제품)를 부가한 다음 멸균수를 부가하여 전체부피를 20 ㎕로 만든다. 이 혼합물을 37 ℃에서 1시간 동안 5' 말단 포스포릴화 반응시킨다. 68 ℃에서 10분간 가열시킴으로써 키나제를 불활성화시킨 후, 반응 혼합물을 pUC119 (비에이라, 제이., 및 메싱, 제이., Methods in Enzymology, 153, 311 (1987))와 결찰시킨다. pUC119 (1 ㎍)를 20 ㎕의 제한반응용액 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 7 mM MgCl2, 20 mM KCl, 10단위체의 SmaI 효소 (예컨대, 타카라 스조 제품))중, 37 ℃에서 1 시간 동안 미리 분해처리시키고, 반응 혼합물을 68 ℃ 에서 10 분간 가열시켜 SmaI 클로닝 벡터 용액을 수득한후 80 ㎕의 멸균수를 부가한다. 10 ㎕의 포스포릴화된 DNA 단편과 2 ㎕의 SmaI 벡터의 결찰반응은 2 ㎕의 10 × 완충액 ( 0.66 M 트리스-HCl pH 7.6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT), 1 ㎕의 10 mM ATT, 1 ㎕의 T4 리가제 (350 단위체/㎕; 예컨대, 타카라 스조 제품) 및 4 ㎕의 멸균수중, 16 ℃에서 철야로 실행한다.
10 ㎕의 결찰반응 혼합물을 사용하여 대장균 균주 JM109를 형질전환시킨다. 감수성 대장균 균주는 염화 칼슘법을 이용하여 미리 제조해 둔 것이다 (만델, 엠. 및 히가, 에이., J.Mol.Biol.53 , 159 - 162 (1970)).
형질전환된 대장균을 37 ℃에서 LB-Amp 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5 % NaCl, 1.5 % 한천, 암피실린 (25 ㎍/㎖))상에서 철야로 배양하고 여기에 50 ㎕의 2 % X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)을 10 ㎕의 100 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)와 함께 부가한다. 플레이트 위에 생성된 백색 콜로니를 백금 루프를 사용하여 l회 들어내어 25 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (1% 트립톤, 0.5 % 효모 추출액, 0.5 % NaCl)상, 37 ℃에서 교반하면서 철야로 교반한다. 1.5 ㎖의 배양액을 원심분리하여 세균 세포를 수집하고, 이것을 알칼리성 용균 방법 (마니아티스 일행, 상동)에 따라 처리시켜 소규모로 플라스미드 DNA 를 수득한다. 수득한 플라스미드 DNA 중의 1 ㎍를 37 ℃에서 1 시간 동안 30 ㎕의 제한반응용액 (100 mM 트리스-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2, 각기 10 단위체의 EcoRI 및 HindIII (예컨대, 타카라 스조 제품))중에서 분해시키고 그 분해물을 아가로오스 겔 전기영동처리에 의해 크기별로 분석하여 약 250 bp 삽입 DNA 단편을 확인한다. 삽입 DNA 단편을 함유하는 클론을 pUC.C14-2로 칭한다. 생거의 디데옥시사슬 종결법 (생거, 에프., 상동)에 의해 상기 C14-2 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 또 그로 부터 아미노산 서열도 추론할 수 있다. 결정된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 하기 서열번호3 및 7에 각각 나타낸다.
PCR 프라이머로서
5'-GAATTCCCTGATAAGGAAATTTTA-3' (서열번호 : 21) 및
5'-CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT-3' (서열번호 : 22)
를 사용한 이외에는 상술한 클로닝 과정을 반복하여, 약 140 bp의 C14-2-1 DNA 단편을 함유하는 클론을 제조하고 그것을 pUC.C14-2-1 로 칭한다. 이 C14-2-1 DNA 단편은 서열번호 3에 도시한 아미노산 서열중의 위치 23 내지 63의 서열을 갖는 펩티드를 코드화한다.
발현 플라스미드의 작성
실시예 1에서와 유사한 방식으로, 약 200 bp의 EcoRI-BamHI DNA 단편이 제조될수 있는 발현 플라스미드 pAT.trp.trpE.C14-2는 pUC.C14-2 DNA를 출발물질로 사용하여 작성한다. 이 플라미드의 작성방법은 제 2도에 도시한다. 발현 플라스미드 pAT.trp.trpE.C14-2-1은 또한 pUC.C14-2-1 DNA로 부터 유사한 방식으로 작성한다.
실시예 3
C14-2-2 발현 플라스미드의 작성
HCV 항원-코드화 DNA의 클로닝:
만성 C형 간염 환자의 혈청으로 부터 취한 HCV 유전자를 클론하기 위해, RT-PCR 수법을 이용한다.
100 ㎕의 C형 간염 한자의 혈청에 먼저 200 ㎕의 6 M GTC 용액 ( 6 M 구아니딘 티오시아네이트, 37.5 mM 시트르산 나트륨, 0.75 % 사르코실, 0.2 M β-머캅토에탄올) 및 1 ㎕의 효모 t-RNA (10 ㎎/㎖)를 부가하여 교반한다. 수득한 혼합물에 20 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2), 30 ㎕의 TE-포화 페놀 (pH 7.5 - 8.0) 및 70 ㎕와 클로로포름/이소아밀 알코올 (49:1)을 신속하게 부가한 후, 10초간 교반한 다음 얼음상에서 15분간 방치한다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리시킨 후, 수성층을 제거하고, 동부피의 이소프로필 알코올과 혼합하며, 또 -20℃에서 1시간 이상 동안 방치시킨다. 동일 조건하에서 다시 원심분리시킨 후, 침전물을 회수하여 100 ㎕의 4 M GTC (멸균수를 사용하여 6M GTC를 희석한 것)에 용해시키고, 동부피의 이소프로필 알코올과 혼합하여 -20℃에서 1시간 이상 동안 방치시킨다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 20분간 원심분리시킨 후, RNA 침전물을 회수하고, 70 % 에탄올 (1 ㎖)을 사용하여 세척하며, 실온에서 공기건조시키고, 또 10 ㎕의 멸균수에 용해시킨다. 이 RNA 용액은 나중에 사용한다.
HCV cDNA 합성은 다음과 같이 실행한다:
10 ㎕의 RNA 용액을 실리콘 처리된 튜브 (0.5㎖)에 넣고, 70 ℃에서 3분간 가열시킨 다음 얼음에서 급냉시킨다. 이어 상기 용액에 1 ㎕의 RNA분해효소 억제제 (50단위체/㎕; 예컨대, 타카라 스조 제품), 1 ㎕의 dNTP (각각 20 mM), 100 mM의 DTT, 4 ㎕의 5 X RT 완충액 (250 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 1 ㎕의 랜덤 올리고헥사머 프라이머 (100 pmol/㎕) 및 역전사효소 (BRL) (200 단위체/㎕)를 부가하고 또 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체부피를 20 ㎕로 만든다. HCV cDNA 합성은 42 ℃에서 2시간 동안 실행한다. 반응 혼합물을 94 ℃에서 5분간 가열시켜 효소를 불활성화시킨다.
PCR은 실시예 1에 정의된 바와 같이 2단계 방법을 이용하여 실행한다.
C14-2-2 영역을 함유하는 HCV NS4 영역을 증대시키기 위해, 공지 서열(J.Gen.Virol.72: 2697-2704 (1991))을 참조하여 하기의 프라이머를 합성한다:
제 1 PCR에 사용된 프라이머:
5'-GGATCACCGGTGACTTTGA-3' (서열번호 : 23); 및
5'-CCCCAAAATGTTGAGAAGGATA-3' (서열번호 : 24);
제 2 PCR에 사용된 프라이머:
5'-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3' (서열번호 : 25); 및
5'-GTGCTAGTTGACAACGGACTGGT-3' (서열번호 : 26).
0.5㎖ 튜브에, cDNA 합성 반응용액 20 ㎕, 10 × PCR 완충액 (100 mM 트리스-HCl (pH 8.3)) 8 ㎕, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.1% 젤라틴), 2개의 제 1 단계 프라이머 (각각 75 pmole) 및 8 ㎕의 2 mM dNTP를 도입한 다음 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체부피를 100 ㎕로 만든다. 94 ℃에서 10분간 가열시킨 후, 이 혼합물에 1 ㎕의 AmpliTaq (5단위체; 예컨대, 퍼킨-엘머-세투스 제품)를 교반하면서 부가하고 또 간단한 원심분리시키기 전에 혼합물 용액에 무기오일을 붓는다. PCR의 조건은 다음과 같다: 변성, 94 ℃에서 1분간: 어닐링, 55 ℃에서 1분간: 연장, 72 ℃에서 2분간: 및 30 사이클. 새로운 0.5 ㎖ 튜브에, 10 ㎕의 PCR 반응혼합물, 9 ㎕의 10 × PCR 완충액, 2개의 제 2 단계 PCR 프라이머 (각각 75 pmole) 및9 ㎕의 1 mM dNTP를 부가하고 또 이 혼합물에 멸균수를 부가하여 전체부피를 100 ㎕로 만든다. 94 ℃에서 10분간 가열시킨 후, 이 혼합물에 1 ㎕의 AmpliTaq (5단위체)를 교반하면서 부가하고 또 간단한 원심분리시키기 전에 혼합물 용액에 무기오일을 붓는다. 제 2 PCR은 제 1 PCR과 동일한 조건하에서 실행된다. 반응후, 10 ㎕의 반응 혼합물을 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분석하며, 이때 특이적으로 증대된 DNA 단편을 검출할 수 있다.
PCR에 의해 증대된 C14-8 DNA 단편 (약 700 bp)을 저 융점 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분리하고, 이 DNA 단편을 함유하는 겔을 68 ℃의 멸균수 200 ㎕에 15분간 용해시킨다. 이 용액을 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)-포화페놀을 사용하여 2회 추출하여 DNA 단편을 함유하는 수성층을 분리시킨다. 수성층을 에탄올 침전처리시켜 DNA 단편 침점물을 수득하고 여기에 2 ㎕의 10 × 키나제 완충액(0.5 M 트리스-HCl, pH 7.6, 0.1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘, 1 mM EDTA pH 8.0), 1 ㎕의 10 mM ATP 및 1 ㎕의 T4 키나제 (10 단위체/㎕: 예컨대, 타카라 스조 제품)를 부가한 다음 멸균수를 부가하여 전체부피를 20 ㎕로 만든다. 이 혼합물을 37 ℃에서 1시간 동안 5' 말단 포스포릴화 반응시킨다. 68 ℃에서 10 분간 가열시키는 것에 의해 키나제를 불활성화시킨 후, 반응 혼합물을 pBM (1992, 7월 10일 출원된 일본국 특허 출원 92-207,391호 참조)과 결찰시킨다. pBM (1 ㎍)을 20 ㎕의 제한반응용액 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 7 mM MgCl2, 20 mM KCl, 10 단위체의 SmaI 효소(예컨대, 타카라 스조 제품)중, 37 ℃ 에서 1시간 동안 분해시키고, 이 반응 혼합물을 68 ℃에서 10분간 가열시키고 80 ㎕의 멸균수를 부가한 후 SmaI 클로닝 벡터 용액을 수득한다. 10 ㎕의 포스포릴화된 DNA 단편과 2 ㎕의 SmaI 벡터의 결찰반응은 2 ㎕의 10 × 완충액 (0.66 M 트리스-HCl pH 7.6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT), 1 ㎕의 10 mM ATT, 1 ㎕의 T4 리가제 (350 단위체/㎕: 예컨대, 타카라 스조 제품) 및 4 ㎕의 멸균수중, 16 ℃ 에서 하룻밤 동안 실행한다.
pBM 벡터는 다음과 같이 작성될 수 있다: EcoRV-BalI 서열 (1259 bp)은 EcoRV 및 BalI을 사용하여 pBR322 (Sutchliffe, J.G., Cold Spring Harbor Symposium, 43, 77-90 (1979))로 부터 분리해낸다. pBR322 단편의 EcoRI-Hind III에 pUC119 다중클로닝 부위 (비에이라, 제이 및 메싱, 제이., Methods in Enzymology, 153, 3-11 (1987))의 EcoRI-HindIII 를 혼입시켜 플라스미드 △pBR Mcs를 생산한다. pBR322의 VspI-ScaI 서열을 pUC119의 VspI-ScaI 서열로 대체하고 pBR322의 VspI-ScaI에 존재하는 PstI을 제거하여 소망하는 pBM 벡터 (3122 bp)를 수득한다. 이 pBM에는 PstI36, HindIII49, VspI2298, ScaI2605및 EcoRI3120의 제한부위와 함께 암피실린 내성 서열 (Amp) 및 복제기점 (Ori)이 존재한다.
10 ㎕의 결찰반응 혼합물을 대장균 JM109주에 넣어 형질전환시킨다. 감수성 대장균 균주는 염화 칼슘을 사용하여 미리 제조한 것이다 (하나한, DNA 클로닝: A practical approach, IRC Press (1985)).
형질전환된 대장균을 37 ℃의 LB-Amp 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천, 암피실린 (25 ㎍/㎖))상에서 철야로 배양한다. 플레이트상에 형성된 백색 콜로니를 백금 루프를 이용하여 1회 덜어내어 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5 % NaCl)중, 37 ℃에서 교반하면서 철야로 배양한다. 1.5 ㎖의 배양액을 원심분리시켜 세균 세포를 수집하고 이것을 알칼리성 용균 방법 (마니아티스 일행, 상동) 에 처리시켜 소규모 제조방법으로 플라스미드 DNA를 수득한다. 수득한 플라스미드 DNA중의 1 ㎍ 을 30 ㎕의 반응완충액(100 mM 트리스-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2, 각기 10 단위체의 EcoRI 및 HindIII (예컨대, 타카라 스조 제품))중, 37 ℃에서 1시간 동안 분해시키고, 그 분해물을 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 크기 분석하여 약 700 bp크기의 삽입 DNA 단편을 확인한다. 이 삽입 DNA 단편을 함유하는 클론을 C14-8 로 칭한다. 이 C14-8 DNA 단편을 생거의 디데옥시 사슬종결법에 의해 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 그로부터 아미노산 서열을 추론 결정한다. 결정된 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 하기 서열번호 9에 나타낸다.
C14-8 DNA 로 부터 C14-2-2 DNA 단편을 제조하기 위하여, 하기 프라이머를 사용한 이외에는 상기와 동일한 방식으로 PCR을 실행한다:
5'-GCGAATTCGCGACCGGGTGTGTTTCCAT-3' (서열번호:27); 및
5'-TCATTAGAACTGCTCCACCTTGGGCCA-3' (서열번호:28).
주형인 1 ng의 C14-8 DNA를 50 pmole의 각 프라이머들, 67 mM의 트리스-HCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH4)2SO4, 0.2 mM dNTP, 2 mM의 MgCl2, 0.2 ㎎/㎖ 젤라틴 및 0.05%의 트리톤 X-100과 혼합하여 전체부피 50 ㎕로 만들고, 이 혼합물에 2.5 단위체의 Taq DNA 폴리머라제를 부가한다. 파라핀 오일을 붓고, PCR (94 ℃에서 30초간, 55 ℃에서 60초간, 72 ℃에서 120초간, 30 사이클)을 실행한다. 반응 혼합물을 아가로오스 겔 전기영동 처리시켜 약 260 bp의 단편을 단리하고 이것을 유리 분말법 (Gene Clean II, 예컨대, BIO101)에 의해 50 ㎕의 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA)에서 회수한다. 회수된 DNA 용액 (25 ㎕)에 3 ㎕의 10 × T4 완충액 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT), 3 ㎕의 2 mM dNTP 및 3 ㎕의 ATP를 부가한 다음 이 혼합물에 5 단위체의 DNA 폴리머라제 I (예컨대, 뉴 잉클랜드 바이오랩 제품) 및 10 단위체의 T4 폴리뉴클레오티딜 키나제 (예컨대, 타카라 스조 제품)을 부가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 소망하는 DNA 단편은 유리분말법에 의해 25 ㎕의 TE 용액에서 회수한다.
한편, 1 ㎕의 pUC118 (비에이라, 제이., 상동)을 20 ㎕의 제한계 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 7 mM MgCl2, 20 mM KCl, 10 단위체의 SmaI)중, 37 ℃에서 1시간 동안 제한반응에 의해 분해시킨다. 이 반응 혼합물에 10 ㎕의 1 M 트리스-HCl (pH 8.0), 70 ㎕의 멸균수 및 2 단위체의 세균의 알칼리성 포스파타제 (예컨대, 타카라 스조 제품)을 부가하여 68 ℃에서 30분간 반응시킨다. 반응후, 용액중의 DNA를 페놀/클로로포름을 사용하여 추출한 다음 에탄올을 사용하여 침강시킨다. 회수한 DNA (10 ㎕)를 10 ㎖의 TE 완충액에 용해시킨 후, 그 용액의 1 ㎕를 10 ㎕의 상술한 PCR DNA 단편과 혼합하고 여기에 50 ㎕의 결찰액 A 및 10 ㎕의 결찰액 B (DNA 결찰 키트; 예컨대, 타카라 스조 제품)을 부가하고 잘 혼합하여 16 ℃에서 1시간 동안반응시킨다. 10 ㎕의 수득한 DNA 용액을 사용하고 하나한의 방법 (Hanahan, 상동)에 따라 대장균 XL1-블루(예컨대, 스트라겐 제품)를 형질전환시킨다.
생성한 클론으로 부터 재조합 플라스미드 DNA를 회수한다. 1.5 ㎍의 플라스미드 DNA를 M13RP1 프라이머 (예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 제품) 또는 -21M13 프라이머 (예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 제품) 존재하에서 사이클링 서열결정법(어플라이드 바이오시스템스사가 제공한 사용법 참조)에 따라서 반응시킨다. 이 반응생성물을 DNA 서열결정기기 모델 370A (버젼1.30; 예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 제품)으로 분석하여 서열번호 8에 나타낸 그의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 이 DNA 단편 (C14-2-2)은 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드화한다.
발현 벡터의 작성
1 ㎍의 pUC.C14-2-2 DNA를 20 ㎕의 제한용액 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 7 mM MgCl2, 각 10 단위체의 EcoRI 및 SalI (예컨대, 타카라 스조 제품))중, 37 ℃에서 1시간 동안 분해시키고 아가로오스 겔 전기영동처리와 유리 분말처리시켜 소망하는 DNA를 정제시킨다. 한편, 1 ㎍의 발현벡터 pAT.trp.trpE DNA(JP-A-89-215,289호)를 동일한 조건하에서 처리시켜 벡터 DNA 단편을 수득한다. 생성한 EcoRI-SalI 처리된 벡터 DNA (1 ㎍)를 DNA 결찰 키트 (예컨대, 타카라 스조 제품)를 사용하고 제조자가 추천한 방법에 따라서 상기 제조된 C14-2-2 DNA 단편과 16 ℃에서 1시간 동안 결찰시킨다.
수득한 10 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 대장균 C600주를 형질전환시킨다. 형질전환용 감수성 대장균 균주는 염화 칼슘을 사용하여 제조한 것이다 (하나한, 상동). 형질전환된 세포를 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)상에서 배양하고 37 ℃에서 철야로 저장한다. 플레이트상에 형성된 콜로니를 백금 루프를 이용하여 1회 덜어내어 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지상, 37 ℃에서 철야로 배양한다. 수득한 배양물 (1.5 ㎖)을 원심분리하여 세균 세포를 수집하고 알칼리성 용균 방법 (마니아티스 일행, 상기 동일)에 의해 플라스미드 DNA를 소규모로 제조한다.
생성한 DNA (1 ㎍)을 EcoRI 및 SalI을 사용하여 2회 분해시키고, 또 분해물중에서 발현 플라스미드 pAT.trp.trpE C14-2-2를 스크리닝하고 그로 부터 약 200 bp의 EcoRI-SalI 단편을 생산할 수 있다.
실시예 4
C14-1, C14-1-2, C14-2, C14-2-1 및 C14-2-2 DNA 단편에 의해 코드화되는 펩티드의 발현 및 정제
실시예 1 내지 3에서 작성된 5개의 발현 플라스미드를 각각 함유하는 대장균 C600 세포를 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 40 ㎖의 LB-배지로 접종하고, 여기서 37 ℃에서 철야로 계대배양한다. 배양물 (50 ㎖)을 4 리터의 M9-CA 배지 (0.6% Na2HPO4, 0.5% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 0.5% 카사아미노산, 0.2% 글루코오스)에 접종시키고 37 ℃에서 배양한다. OD600이 0.3에 달하면, 최종 농도 40 ㎍/l 까지 배양물에 인돌아크릴산을 부가하고 16시간 동안 더 배양한다. 이 배양물을 원심분리하여 12 g의 세균 세포를 수득한다. 이 세포에 60 ㎖와 용균 완충액 (50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 30 mM NaCl, 5 mM EDTA)을 부가한 후 12 ㎎의 리소짐 (예컨대, 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 제품)을 부가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 초음파를 150초간 가하여 세포를 파괴시키고, 15,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여 소망하는 DNA 및 trpE에 의해 코드화되는 펩티드로 구성되는 융합 펩티드를 함유하는 불용성 분획을 분리한다. 55 ㎖의 가용화 완충액(4 M 우레아, 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 0.1 % NP-40)을 상기 분획에 부가하여 융합 펩티드를 추출한다.
이 추출물에 우레아 및 DTT를 각각 최종 농도 6 M 및 50 mM로 부가한다. 4 ℃에서 1시간 이상 동안 방치시킨 후, 이 혼합물을 6 M 우레아 및 5 mM DTT를 함유하는 50 mM 트리스-HCl (pH 8.5)와 평형을 이룬 Mono Q 칼럼 (예컨대, 파마시아 제품)에 부가한다. 소망하는 펩티드는 0 M 내지 0.2 M의 NaCl 구배를 이용하여 칼럼으로 부터 용출된다. 용출된 분획을 모아서 6 M 우레아, 0.15 M NaCl 및 5 mM DTT를 함유하는 50 mM 트리스-HCl (pH 8.5)와 평형을 이룬 HiLoad Superdex 75pg 칼럼에 부가하여 융합 펩티드를 정제시킨다.
상술한 과정을 통하여, 다음을 수득한다: trp.C14-1 (Mr, 약 8 kDa); trpE.C14-1-2 (Mr, 약 11 kDa); trpE.C14-2 (Mr, 약 10 kDa); trpE.C14-2-1 (Mr, 약 6 kDa); 및 trpE.C14-2-2 (Mr, 약 11 kDa).
실시예 5
C14-1, C14-1-2, C14-2 및 C14-2-2 펩티드 단편의 제조
어플라이드 바이오시스템스 펩티드 합성기 모델 430A (예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 제품)를 사용하여 페스트 모크 시스템의 권장 실험법에 따라서 펩티드 단편을 합성한다. 합성의 말기에, 통상의 방법으로 보호해제 및 수지제거하고 HPLC에 의하여 펩티드를 정제시킨다.
소망하는 피이크의 분획을 수집하고 소망하는 펩티드를 확인하기 위해 아미노산 분석기 JLC-300 (예컨대, JEOL LTD 제품)을 이용하여 아미노산 함량을 분석하거나 또는 단백질 서열결정기 모델 477A (예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 제품)를 이용하여 아미노산 서열을 분석한다.
실시예 6
C형 간염 환자의 혈청에서 HCV 항체의 측정
(ⅰ) 웨스턴 블럿 분석법에 의한 HCV 항체의 검출
발현된 펩티드 trpE.C14-2 (1 ㎍)를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Laemmli, Nature 227, 680 (1970))처리시키고 또 니트로셀룰로오스 필터 (예컨대, 바이오 라드 제품)로 옮긴다. 이 필터를 실온에서 1시간 동안 블록킹 용액 (4% 블록-Ace (예컨대, 스노우 브랜드 밀크 프로덕트 컴패니 제품), 2% BSA, 0.1 M 인산 나트륨 (pH 7.4))중에 침지시킨다. 이후, 필터상의 펩티드를 건강한 사람과 C형 간염환자로 부터 취한 혈청 (1/100 로 희석됨)과 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 필터를 세척 용액 (20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 500 mM NaCl, 0.05% 트윈-20)을 사용하여 세척하고, 필터를 실온에서 30분간 퍼옥시다제-라벨링된 염소항-사람 IgG(1/1000로 희석됨)과 반응시킨다. 다시 세척한 후, 필터를 디아미노벤지딘 (기질로서) 용액에 침지시킨다. 일단 발색이 확인되면, 필터를 순수한 물에 담궈서 반응을 중지시킨다.
제 3도에 도시한 바와 같이, 발현된 펩티드는 C형 간염 환자의 혈청과는 강하게 반응하지만 건강한 사람의 혈청과는 반응하지 않으므로 이 펩티드는 웨스턴 블럿 필터상에서 특수한 밴드로 검출될 수 있다.
(ⅱ) 효소-면역측정법(ELISA)에 의한 HCV의 분류 (A):
융합 펩티드 trpE.C14-1, trpE.C14-1-2, trpE.C14-2, trpE.C14-2-1 및 trpE.C14-2-2를 사용한 엘리사법에 의해 HCV를 분류하기 위해 만성 C형 간염을 앓는 일본인 환자의 혈청 여러개를 시험한다, 엘리사법은 다음과 같이 통상의 방식으로 실행한다: 정제된 항원을 8 M의 우레아를 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.5)을 사용하여 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 희석시킨 다음 4 ℃ 또는 실온의 마이크로플레이트상에 고정화시킨다. 세정용액으로 수회 세척한 후, 시험용 희석 혈청을 플레이트의 웰에 넣고 30 ℃ 또는 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세척한 후, 각 웰에 퍼옥시다제-라벨링된 항-사람 IgG (마우스 모노클로날 항체)를 부가하여 30 ℃ 또는 실온에서 반응시킨다. 플레이트를 수회 세척한 후 50 ㎕의 o-페닐렌디아민 용액을 부가하여 37 ℃에서 발색반응을 일어킨다. 2 M H2SO4를 부가함으로써 더 이상의 발색을 중지시키고 492 nm에서 흡수를 측정한다. 동시에, 대조를 위하여 건강한 사람의 혈청뿐만 아니라 시판되고 있는 치론 키트 C100-3 (예컨대, 오르토제품)을 사용하여 동일한 방식으로 측정한다. 그 결과를 하기 표 1, 2, 3 및 4에 나타낸다.
표 1, 2, 3 및 4는 융합 펩티드 trpE.C14-1 및 trpE.C14-1-2가 HCV 그룹 I에 특이적인 항체를 인식하는 반면, 융합 펩티드 trpE.C14-2, trpE.C14-2-1 및 trpE.C14-2-2는 HCV 그룹 II에 특이적인 항체를 인식할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한 표의 결과는 C14-1 및/또는 C14-1-2 펩티드가 C14-2 및/또는 C14-2-1 및/또는 C14-2-2 펩티드와 조합되어 사용되면, 사용된 펩티드는 C형 간염 환자가 HCV 그룹 I만으로 또는 HCV 그룹 II 만으로 또는 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염되었는지 여부를 판단하는데 아주 유용하다는 것을 나타낸다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
(ⅲ) 엘리사법에 의한 HCV의 분류 (B):
실시예 5 에서 제조된 trpE.C14-1, trpE.C14-2-2 및 C14-1, C14-1-2, C14-2 및 C14-2-2 펩티드 단편 (1-Y, 1-Z, 1-B, 2-Y, 2-B 및 2-Z) 을 사용하여 엘리사법에 의해 HCV를 분류하기 위해 만성 C형 간염을 앓는 일본인 환자로 부터 취한 여러개의 혈청을 시험한다.
trpE.C14-1-2 또는 trpE.C14-2-2는 상기 기술한 바와 동일한 방식으로 미리 마이크로플레이트의 웰에 고정화시켜 놓는다. 20 ㎕의 시편을 실시예 5에서 합성된 각 펩티드 (0.1 ㎎/㎖) 20 ㎕와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 방치시킨다. 플레이트의 웰에 존재하는 펩티드 용액에 200 ㎕의 희석 시편을 부가한다. 30 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고, 플레이트를 퍼옥시다제-라벨링된 항-사람 IgG (마우스 모노클로로날 항체)과 30℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 세척한 후, o-페닐렌디아민 용액을 상기 반응 혼합물에 부가하여 30 ℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 1 M 황산 용액을 부가하여 상기 반응을 중지시키고 색 캄페레이터를 이용한 492 nm에서 흡수로써 발색을 측정한다. 대조를 위하여, 시판되고 있는 HCV 진단 시약 이뮤체크-HCV (Immucheck-HCV) (예컨대, 국제시약사 제품)을 면역반응에 사용한다.
그 결과를 하기 표 5, 6 및 7에 나타낸다.
표 5에 기재된 시편 모두가 HCV 그룹 I에 속한다는 사실은 trpE.C14-1-2와의 반응결과로 부터 알 수 있고, 또 표 5는 또한 시편과 trpE.C14-1-2의 반응이 실시예 5에서 제조된 HCV 그룹 I 서열을 갖는 펩티드를 부가하는 것에 의해 억제된다는 것을 나타낸다. 또한 표 7에 기재된 모든 시편 모두가 HCV 그룹 II에 속한다는 사실은 trpE.C14-2-2와의 반응결과로 부터 알 수 있고, 또 표 7은 시편과 trpE.C14-2-2와의 반응이 실시예 5에서 제조된 HCV 그룹 II 서열을 갖는 펩티드를 부가하는 것에 의해 억제된다는 것을 나타낸다. 표 6에 기재된 모든 시편이 HCV 그룹 I 및 II 모두에 속한다는 사실은 trpE.C14-1-2 또는 trpE.C14-2-2와의 반응결과로 부터 알 수 있고 또 표 6은 시편과 trpE.C14-1-2 또는 trpE.C14-2-2와의 반응이 실시예5에서 제조된 HCV 그룹 I 또는 II를 갖는 펩티드를 부가하는 것에 의해 억제될 수 있음을 나타낸다.
따라서, trpE.C14-1-2 또는 trpE.C14-2-2는 항-HCV 항체와 특이적으로 반응할 수 있고 또 trpE.C14-1-2 또는 trpE.C14-2-2와 항-HCV 항체와의 면역반응이 실시예 5에서 제조된 펩티드 단편에 의해 억제되는 것을 측정함으로써 환자가 HCV 그룹 I만으로 또는 HCV 그룹 II만으로 또는 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염되었는지 결정할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 펩티드 단편은 HCV 를 분류하는데 아주 유용하다. 이와 달리 표 5, 6 및 7에서 볼 수 있듯이, 이뮤체크-HCV (Immucheck-HCV) 에 의한 분류는 아주 어렵다.
[표 5]
1) COI : 컷 오프 지수
2) 1-Y=Z: 1-Y 및 1-Z는 항-HCV 항체와 trpE.C14-1-2와의 반응을 동일 정도로 억제한다.
3) 1-Z>B>Y: 1-Z, 1-B 및 1-Y는 1-Z>1-B>1-Y의 순으로 상기 반응을 억제한다.
4) 1-Z=B: 1-Z 및 1-B는 같은 정도로 상기 반응을 억제한다.
[표 6]
1) COI: 컷 오프 지수
2) 1-Z=Y: 1-Z 및 1-Y 는 항-HCV 항체와 trpE.C14-1-2와의 반응을 같은 정도로 억제한다.
3) 2-B>Y: 2-B 및 2-Y는 항-HCV 항체와 trpE.C14-2-2와의 반응을 2-B>2-Y의 순으로 억제한다.
4) 2-Y>Z>X: 2-Y, 2-Z 및 2-X는 2-Y>2-Z>2-X의 순으로 상기 반응을 억제한다.
5) 2-Y=B: 2-Y 및 2-B는 같은 정도로 상기 반응을 억제한다.
[표 7]
1) COI: 컷 오프 지수
2) 2-Z=B: 2-Z 및 2-B는 항-HCV 항체와 trpE.C14-2-2와의 반응을 같은 정도로 억제한다.
(ⅳ) 엘리사법에 의한 HCV의 분류 (C):
실시예 5에서 제조한 펩티드 단편 (1-Z, 1-Y) 을 마이크로플레이트의 웰에 고정화시킨다. 각 웰에 C형 간염 환자의 혈청을 부가한다. 상기 (ⅱ)에서와 동일한 방식으로 반응시킨 후, 492 nm에서 흡수를 측정한다. 그 결과를 하기 표 8에 나타낸다. 표에서 부터 알 수 있듯이 HCV의 분류는 1-Z 및 1-Y와 같은 펩티드 단편을 사용하여 실행한다. 그러나 몇몇 시편은 "Z" 또는 "Y"만에 반응하는데 이는 펩티드 단편이 바람직하게는 2개 이상의 펩티드 단편이 서로 조합되거나 결합되어 있는 것을 의미한다.
[표 8]
실시예 7
키트의 제조
정제된 항원 (그룹 I 및 II)을 8 M의 우레아를 함유하는 포스페이트 완충액을 사용하여 최종 농도 5 ㎍/㎖ 까지 각각 희석시킨다. 각 희석 용액을 웰당 100 ㎕의 양으로 상이한 복수의 플레이트에 위치시키고 4 ℃에서 철야로 방치한다. 용액을 플레이트로 부터 따라 내고 블록킹 용액 (300 ㎕/웰)을 플레이트의 웰에 넣고 실온에서 2시간 동안 방치시킨다. 웰을 기우려 따라 내고, 웰들을 세척한 다음 동결건조시킨다. 각 동결건조된 플레이트 (그룹 I 및 II)를 상이한 백 또는 주머니에 넣고 밀봉하며 키트용 박스로 포장하여 4 ℃에서 저장한다. 키트내에는, 상이한 용기 (예컨대 병 또는 바이얼)내에 든 다음과 같은 시약이 존재한다: HCV 그룹 I 및 II와 특이적으로 반응할 수 있는 소정의 양성 혈청; 시편인 혈청을 희석시키기 위한 희석액; 세척액; 효소-라벨링된 항-사람 IgG 마우스 모노클로날 항체; 및 발색액;
실시예 8
RT-PCR 에 의한 HCV의 분류와 인터페론 (IFN) 치료 효과의 상호관계
IFN 치료 효과와 RT-PCR에 의한 HCV의 분류와의 상호관계는 HCV 그룹 I 및 II를 각각 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 다음과 같이 조사한다:
100 ㎕의 C형 간염 환자의 혈청을 6M GTC 용액 (6 M 구아니딘 티오시아네이트, 25 mM 시트르산 나트륨, 0.5% 사르코실, 0.2 M β-머캅토에탄올) 300 ㎕와 혼합한다. 이 혼합물에 40 ㎕의 2 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2), 400 ㎕의 페놀 및 80 ㎕의 클로로포름/이소아밀 알코올 (49:1)을 교반하면서 부가한다. 수성충을 제거하고 이소프로필 알코올을 부가하며 원심분리시켜 cDNA 합성을 위한 RNA 침전물을 수득한다. cDNA 합성은 RNA 침전물을 함유하는 반응 혼합물 (10 mM 트리스-HCl, 0.01% 젤라틴, 1 mM DTT, 100 pmole의 프라이머)중, RNA 분해효소 억제제 및 역전사 효소 존재하, 37℃에서 2시간 동안 실행한다. 수득한 cDNA는 2 단계 PCR에 사용한다.
PCR은 다음과 같이 실행한다: 상기 제조된 반응 혼합물 (cDNA 함유) 100 ㎕에 10 mM 트리스-HCl, 0.01% 젤라틴, 각각 2 mM의 dNTP, 1.5 mM MgCl2및 프라이머 (각각 50 pmole; 이하 참조) 를 부가한다. 사용된 PCR 조건은 다음과 같다: 변성, 94 ℃에서 1.5분간; 어닐링, 50 ℃에서 2분간; 연장, 70 ℃에서 2분간; 35 사이클. 조사된 프라이머 중에서, 하기한 4개의 프라이머는 HCV 그룹 II에 특이적인 206 bp DNA 단편의 검출을 가능하게 한다:
제 1 단계 PCR에 사용된 프라이머:
KK21: 5'-GGATACACCGGTGACTTTGA-3' (서열번호:29); 및
KK22: 5'-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3' (서열번호:30);
제 2 단계 PCR에 사용된 프라이머:
KK26: 5'-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3' (서열번호:31) 및
KK27: 5'-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3' (서열번호:32).
한편, HCV 그룹 I에 특이적인 153 bp의 DNA 단편은 다음 4개 프라이머를 사용하여 검출할 수 있다:
제 1 단계의 PCR에 사용된 프라이머:
KK1: 5'-GGCTATACCGGCGACTTCGA-3' (서열번호:33); 및
KK2: 5'-GACATGCATGTCATGATGTA-3' (서열번호:34);
제 2 단계의 PCR에 사용된 프라이머:
KK5: 5'-GATCGACTGTAACACATGTG-3' (서열번호:35); 및
KK8: 5'-CACATTTGATCCCACGATGG-3' (서열번호:36).
결과를 하기 표 9에 나타낸다. 표는 놀라운 IFN 효능을 갖는 환자로 부터 취한 9개 혈청의 78%가 그룹 II에 속하는 한편, 그의 22%는 그룹 I에 속하므로 IFN 치료 효과를 갖는 대부분의 환자는 HCV 그룹 I으로 감염되어 있다는 것을 나타낸다.
상술한 실시예로 부터 알 수 있듯이, 본 발명의 항원성 펩티드 또는 이를 포함하는 키트는 C형 간염 환자가 HCV 그룹 I 또는 HCV 그룹 II에 의해 감염되었는지또는 HCV 그룹 I 및 II 모두에 감염 (혼합감염)되었는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 환자가 HCV 그룹 II에 의해 감염된 것으로 밝혀지면, 환자는 IFN 치료가 HCV 그룹 II에 대하여 특히 효과적이라는 사실에서 볼 때 초기에 IFN 치료를 효과적으로 받을 수 있을 것이다. 본 발명의 펩티드 및 키트는 또한 HCV 감염을 진단하는데에도 매우 효과적이다.
[표 9]
서열번호 : 1
서열길이 : 63
서열유형 : 아미노산
위 상 : 직선형
분자유형 : 펩티드
서열번호 : 2
서열길이 : 87
서열유형 : 아미노산
위 상 : 직선형
분자유형 : 펩티드
서열번호 : 3
서열길이 : 63
서열유형 : 아미노산
위 상 : 직선형
분자유형 : 펩티드
서열번호 : 4
서열길이 : 87
서열유형 : 아미노산
위 상 : 직선형
분자유형 : 펩티드
서열번호 : 5
서열길이 : 189
서열유형 : 핵산
가 닥 : 이중가닥
위 상 : 직선형
분자유형 : cDNA 내지 게놈 RNA
서열번호 : 6
서열길이 : 267
서열유형 : 핵산
가 닥 : 이중가닥
위 상 : 직선형
분자유형 : cDNA 내지 게놈 RNA
서열번호 : 7
서열길이 : 189
서열유형 : 핵산
가 닥 : 이중가닥
위 상 : 직선형
분자유형 : cDNA 내지 게놈 RNA
서열번호 : 8
서열길이 : 261
서열유형 : 핵산
가 닥 : 이중가닥
위 상 : 직선형
분자유형 : cDNA 내지 게놈 RNA
서열번호 : 9
서열길이 : 667
서열유형 : 핵산
가 닥 : 이중가닥
위 상 : 직선형
분자유형 : cDNA 내지 게놈 RNA
서열번호 : 10
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 11
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형
서열번호 : 12
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 13
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 14
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 15
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형:
서열번호 : 16
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 17
서열길이 : 29
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 18
서열길이 : 29
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 19
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 20
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 21
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 22
서열길이 : 24
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 23
서열길이 : 19
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 24
서열길이 : 22
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형:
서열번호 : 25
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 26
서열길이 : 23
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 27
서열길이 : 28
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 ; 직선형
분자유형 :
서열번호 : 28
서열길이 : 28
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 29
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 30
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 31
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 32
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 33
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 34
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 35
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
서열번호 : 36
서열길이 : 20
서열유형 : 핵산
가 닥 : 단일가닥
위 상 : 직선형
분자유형 :
제 1도는 항원성 펩티드 C14-1, C14-1-2, C14-2 및 C14-2-2의 아미노산 서열과 HCV 분류에 유용한 펩티드 단편을 조사하기 위한 항원결정기 (굵은 선으로 표시) 지도임.
* 표시는 C14-1 및 C14-1-2 사이 또는 C14-2 및 C14-2-2 사이의 상동 아미노산임.
제 2도는 C14-2-발현 벡터 pAT.trpE.C14-2를 작성하는 방법을 도시함.
제 3도는 발현 펩티드 trpE.C14-2와 C형 간염 환자의 혈청과의 항원-항체 반응을 나타내는 웨스턴 블럿 사진임 (2 레인).
대조용은 건강한 사람의 혈청으로 실행함 (1 레인).

Claims (7)

  1. 서열번호 3 또는 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열을 갖고 또 C형 간염 바이러스의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 항원성 펩티드.
  2. 서열번호 3에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62 및 이들의 결합물로 구성된 군으로부터 선정되거나, 또는 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62, 53 내지 74 및 이들의 결합물로 구성된 군으로부터 선정되는 부분 아미노산 서열을 갖고 C형 간염 바이러스의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 항원성 펩티드.
  3. 제1항에 따른 항원성 펩티드를 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것으로 추정되는 시편과 접촉시켜 면역반응을 일으키고; 또
    그룹 II에 속하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 양성으로 검출하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법.
  4. 제2항에 따른 항원성 펩티드를 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것으로 추정되는 시편과 접촉시켜 면역반응을 일으키고; 또
    그룹 II에 속하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 양성으로 검출하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법.
  5. 서열번호 1 및 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖고 또 C형 간염 바이러스의 그룹 I에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 이 펩티드와 동일한 기능을 갖는 그의 변형물로 구성된 군으로부터 선정된 한 개 이상의 제1 항원성 펩티드; 및
    서열번호 3 및 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열 또는 그의 부분서열을 갖고 또 C형 간염 바이러스의 그룹 II에 대한 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 펩티드 및 이 펩티드와 동일한 기능을 갖는 그의 변형물로 구성된 군으로부터 선정된 한 개 이상의 제2 항원성 펩티드를 각기 별도 부분에 포함하고,
    상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 부분서열은 서열번호 1에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62 및 이들의 결합물로 구성된 군, 또는 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62, 53 내지 74 및 이들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택되고,
    상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 부분서열은 서열번호 3에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62 및 이들의 결합물로 구성된 군, 또는 서열번호 4에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62, 53 내지 74 및 이들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    C형 간염 바이러스의 그룹 I 또는 그룹 II를 확인하기 위한 키트.
  6. 제5항에 정의한 바와 같은 하나 이상의 제1 항원성 펩티드 및 제5항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 제2 항원성 펩티드를, 면역반응에 의해 항체를 정량적으로 또는 정성적으로 측정할 수 있도록, C형 간염 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것을 추정되는 시편과 각각 접촉시키고; 또
    C형 간염 바이러스의 그룹 I 또는 그룹 II에 대한 항체를 검출하는 것을 포함하는 C형 간염 바이러스를 분류하는 방법.
  7. 서열번호 1 또는 서열번호 2에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 부분 서열을 갖는 항원성 펩티드를 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것으로 추정되는 시편과 접촉시켜 면역반응을 일으키고; 또
    그룹 I에 속하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 양성으로 검출하는 것을 포함하며,
    상기 부분 서열은 서열번호 1에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62 및 이들의 결합물로 구성된 군, 또는 서열번호 2에 도시한 아미노산 서열중 아미노산 위치 20 내지 44, 37 내지 62, 53 내지 74 및 이들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    C형 간염 바이러스를 분류하는 방법.
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