JP3669717B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングのための抗原性ペプチド、それを含有するキットおよびそれを使用するグルーピング方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングのための抗原性ペプチド、それを含有するキットおよびそれを使用するグルーピング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎（通常、Ｃ型肝炎と称される）は、ウイルス性の伝染性肝炎と考えられており、慢性化しやすく、肝硬変、肝癌へ移行する率が高いことから、社会的に問題となっている。しかしながら患者あるいは健康キャリアー体内でのウイルス発現量が少ないこと、また感染性ウイルスが同定されておらず、原因ウイルスが１種なのかあるいは２種以上存在するのかも分かっていないことなどからその確定診断は、非常に困難である。現在まで非Ａ非Ｂ型肝炎の診断は、臨床的には、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルの上昇を確認し、その上でＡ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＤ型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既知のウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ等による肝炎か否かの診断を行ない、これらの疾病に該当しない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断する、いわゆる除外診断によって行なわれていた。しかし、非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床像は他のウイルス性肝炎のものと似通っており、上記のような除外診断法では、他のウイルス性の肝炎との鑑別診断は難しい。また、ＡＬＴ値に異常のみられない健康キャリアーを同定するのはさらに困難である。このため、健康キャリアーからの輸血による感染を防止することは困難で、輸血後肝炎の９０％以上をこの肝炎が占めており、患者数は我国だけでも年間１００万人にのぼるといわれている。
【０００３】
かかる状況を改善するため、多くの研究者が非Ａ非Ｂ型肝炎の診断用材料の開発を行なってきたが、信頼性が低いものが多かった。これらの診断用材料で最も信頼性の高いものは、カイロン社の M. Houghtonら（特表平２−５００８８０号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）によって開発されたものだと考えられている。カイロン社は、得られた問題のウイルス遺伝子を用いて遺伝子のクローニングを行ない、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ＝カイロン社命名）のほぼ全遺伝子を明らかにし、一部遺伝子を発現して得られた抗原蛋白質を用いて診断用のキット化を行なっている。
【０００４】
その後、日本でもイムノスクリーニングにより、多くの非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子が分離された結果、カイロン社の分離したＨＣＶに核酸、アミノ酸レベルでの相同性の高いＨＣＶ・グループＩと、相同性が低く、ＨＣＶ・グループＩとは異なるウイルスと考えてよい程度の相同性しか示さないグループＩＩとに分類できることが示された（本出願人による特許出願特願平３−１８９２６８号）。カイロン社のキットは日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清では５０〜７０％程度の反応しか示さないことが証明され、疫学的な面でより感度の高い診断薬の開発が急務であったが、最近、ウイルスの構造蛋白を含む診断用キットの開発により、患者血清スクリーニングの結果が５０〜７０％程度の検出感度から９０％以上に上昇し、遺伝子増幅（ＰＣＲ）による結果と相関性を示すことで、輸血用血液のスクリーニング用診断薬の開発は充分な成果がでてきている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＣＶは、カイロン社のクローニングしたグループＩと本出願人のクローニングしたグループＩＩに分類され、各々伝染性の肝炎の病因体として存在しているが、ウイルス学的及び臨床病理学的な面からみると、ＨＣＶの２つのグループが臨床的にどのような病態と関連があるのか関心がもたれている。その１つの例として、インターフェロン（ＩＦＮ）治療例が挙げられる。抗ウイルス剤であるＩＦＮはＨＣＶの持続感染を断ち切ることにより、肝炎の慢性化を防ぐと考えられているが、その効果については急性肝炎には有効率は高いが、慢性肝炎や肝硬変など進展した症例については治療効果は低い（約３０％）ことが分かっている。山梨医科大学の宮崎らは、ＩＦＮが著効したＣ型肝炎患者にグループＩＩが高頻度に感染していることを、ＰＣＲ法により同定した（宮崎ら，第２８回日本肝臓学会，一般講演４，要旨集第７５頁，１９９２年）。
【０００６】
ＰＣＲ法は、少量の血清より目的の遺伝子を増幅検出することが可能であるが、操作が煩雑であり大量のサンプルを取扱う手法としては問題がある。そこで酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ）の系で、グループＩとグループＩＩに特異的に感染している患者をスクリーニングする方法が開発されたならば、グループＩＩ型感染患者に対して有効なＩＦＮ治療を実施することが可能となろう。また、グループＩおよびグループＩＩの両方に感染している患者、所謂重感染患者の検出に有用であろう。
【０００７】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングに使用するための抗原性ペプチド、およびこのペプチドを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングに使用するための、該ウイルスのグループＩ抗体およびグループＩＩ抗体とそれぞれ特異的に反応し得る抗原性ペプチドを組み合わせて含むキット、並びに、このキットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前述したように、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、アミノ酸配列の相同性比較によって、グループＩとグループＩＩに大別される。相同性は、カイロン社がクローニングしたＨＣＶＩ（特表平２−５００８００号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）との比較から判定され、約８０％より高い相同性を示すグループと約８０％より低い相同性を示すグループとに分けることができ、前者をグループＩ、後者をグループＩＩと称する。なお、本明細書中では、グループＩおよびグループＩＩに対しこの定義を採用する。また、グルーピングとはグループＩとＩＩとに振り分けること、または、グループＩもしくはグループＩＩを識別することを意味する。
【００１０】
この数年の間に次々とＨＣＶの全長クローンが単離されそのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が決定された結果、グループＩはタイプＩとタイプ II に、またグループＩＩはタイプIII とタイプ IV にそれぞれ更に分類できることが分かってきた。例えば、タイプＩのＨＣＶにはカイロン社が単離した「ＨＣＶＩ」（特表平２−５００８００号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）、タイプ II には下遠野らが単離した「Ｊ」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9524〜9528 (1990) ）、タイプIII には岡本らが単離した「Ｊ６」（J. Gen. Virol. 72:2697〜2704 (1991) ）、タイプ IV には岡本らが単離した「Ｊ８」（Virology 188:331〜341 (1992)）が挙げられる。アミノ酸配列に基づく相同性は、タイプＩとタイプ
II 、また、タイプIII とタイプ IV ではともに約８５％である。
【００１１】
本発明者らは、Ｃ型肝炎患者血漿よりＨＣＶ遺伝子をクローニングし、増幅したＤＮＡ断片を大量発現させて得られるペプチドの中に、ＨＣＶグループＩまたはＩＩをもつＣ型肝炎患者血清と特異的に抗原抗体反応を起こす抗原性ペプチドを見出した。すなわち、両グループの識別に有効なペプチド部分が、ＨＣＶゲノム上のＮＳ４領域によってコードされ、特表平２−５００８００号公報に記載されるＨＣＶＩのコードするポリペプチドのアミノ酸番号１６７４〜１７６０の領域に対応する部分に存在することが判明した。具体的には、ＨＣＶグループＩの識別に有用な抗原性ペプチドとして、配列表中配列番号：１に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−１ペプチドおよびＣ１４−１関連の、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−１−２ペプチドが見出され、またＨＣＶグループＩＩの識別に有用な抗原性ペプチドとして、配列番号：３に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−２ペプチドおよびＣ１４−２関連の、配列番号：４に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−２−２ペプチドが見出された。これらの配列は岡本ら（上掲）が単離したＪ６、Ｊ８のゲノムがコードするポリペプチドのアミノ酸番号１６８０〜１７６４の領域に対応することが判明した。グルーピングは上記４種のペプチドの各ペプチド断片であっても有効であった。
【００１２】
従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチド、並びに、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを提供する。
【００１３】
これらのペプチド類を単独に抗原として使用することによって、血液等の検体中のＨＣＶをグループＩかまたはグループＩＩのいずれかにグループ分けすることができる。
【００１４】
本発明はさらに、上記４種のペプチド類から選択される、ＨＣＶのグループＩまたはグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る抗原性ペプチドを組み合わせてキット化してもよく、これによって両方のグループに重感染している患者の検出に有効に使用し得る。
【００１５】
従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：１および配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチドと、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：３および配列番号：４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドとをそれぞれ異なる区画に含んでなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩまたはグループＩＩを識別するためのキットを提供する。
【００１６】
本明細書中「同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体」とは、上記定義のＨＣＶグループＩまたはグループＩＩの抗体との特異的反応を可能にする範囲の変異であって、配列番号：１，２，３または４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列中の少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸との置換をもつペプチドを指す。たとえば、図１中Ｃ１４−１とＣ１４−１−２の比較またはＣ１４−２とＣ１４−２−２の比較から明らかなように、そのようなアミノ酸置換としてイソロイシン−バリン、ロイシン−イソロイシン、バリン−アラニン、メチオニン−イソロイシン、リジン−アルギニン、アスパラギン酸−グルタミンのような化学的性質の類似したアミノ酸間の置換が挙げられる。
【００１７】
本発明で使用し得る抗原性ペプチドは、該ウイルス抗体との抗原−抗体反応に影響しない範囲で、不活性な他のペプチドと融合していてもよく、またそのペプチドＮ末端のアシル化等の化学修飾を受けていてもよい。さらに、該ペプチドの中には、抗イディオタイプ抗体も包含される。
【００１８】
有効なペプチド断片の具体例としては、これらに限定されないが、エピトープ解析の結果、図１に太線で示したような、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（１−Ｙ）、３７〜６２（１−Ｚ）もしくはその組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（１−Ｙ）、３７〜６２（１−Ｚ）、５３〜７４（１−Ｂ）、６４〜８７（１−Ａ）もしくはその組み合わせ、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（２−Ｙ）、３７〜６２（２−Ｚ）もしくはその組み合わせ、配列番号：４に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（２−Ｙ）、３７〜６２（２−Ｚ）、５３〜７４（２−Ｂ）、６４〜８７（２−Ａ）もしくはその組み合わせの配列を有する断片類である。ここで、組み合わせとは２つ以上の断片配列の結合を意味し、たとえば配列２０〜６２、配列２０〜７４等が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗原性ペプチド類は、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成技術によって製造することができる。
【００２０】
組換えＤＮＡ技術による方法は、業界で一般的に使用される技術であって、配列番号：１、２、３または４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む複製可能な発現ベクターを構築する工程、前記発現ベクターを宿主細胞に移入して形質転換体を得る工程、前記ＤＮＡ断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体を培養する工程、及び、前記ペプチドを回収する工程を含む。
【００２１】
たとえば、発現ベクターは次のようにして作製することができる。目的のペプチドをコードするＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９のような慣用プラスミドに連結し、増幅後、得られたプラスミドを制限酵素で二重消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製する。一方、ｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のような発現用ベクターを同じ制限酵素で二重消化し、同様にベクター断片を精製する。このベクターＤＮＡと前述のＤＮＡ断片を連結することによって、ＨＣＶのグループＩ特異的抗原を発現しうる発現ベクターを得る（後述の実施例参照）。
【００２２】
発現用プロモーターとしては、大腸菌、ファージ、ウイルス等由来のものが使用される。例えば、トリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージＰL 、ＰR 、アルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが挙げられる。また、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカー配列、複製開始点、転写終結因子、リボソーム結合部位等を発現ベクター内に任意に存在させることができる。
【００２３】
形質転換宿主としては、大腸菌，枯草菌，酵母などのこの分野で慣用される微生物、または、昆虫，植物もしくは動物細胞が用いられるが、好ましくは原核生物、特に大腸菌である。形質転換は発現ベクターを宿主細胞に移入するための慣用的方法によって実施される。宿主として細菌（例えば大腸菌）を用いる場合には、塩化ルビジウム［Hanahan, DNA cloning:A practical approach, IRC Press(1985)］または塩化カルシウム［Mandel,M. とHige, A. J. Mol. Biol., 53:159-162(1970)］を用いる直接取込み法が使用できる。また、宿主として高等生物細胞を用いる場合には、ウイルスベクターによる取込み法が簡便に使用できる。
【００２４】
次に、発現ベクターを含む宿主を適切な培地中で培養して目的ペプチドを産生する。宿主からの目的物の精製方法としては、宿主細胞を例えば超音波破砕した後に遠心分離を行なってＣ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされるペプチド又は該ペプチドと他のペプチド（例えば、ｔｒｐＥなど）とからなる融合ペプチドを含有する不溶性画分を得、このポリペプチドを尿素含有バッファで可溶化抽出し、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えば、Q-Sepharose など）に掛けて部分精製することができる。さらにゲル濾過（例えば、HiLoad Superdex など）等により単一分子として目的の組換えペプチドを精製することができる。
【００２５】
もう１つのペプチド製造方法であるペプチド合成技術については、液相法および固相法があり、例えば、日本生化学会編生化学実験講座１「タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾とペプチド合成」第 207〜495 頁（1977年）に記載の技術を適用することにより製造することができる。一般に長鎖ペプチドの場合には、合成樹脂固相上で約５〜１０アミノ酸ずつからなる小ペプチドを合成し、各小ペプチドを順次または段階的に結合した後、脱保護して目的ペプチドを得ることができる。
【００２６】
組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成技術によって製造されたペプチド類は、通常、真空乾燥または凍結乾燥されて固体状態で冷暗所に保存される。キットに包装する際には、ＨＣＶグループＩ抗体に特異的な抗原性ペプチドとＨＣＶグループＩＩ抗体に特異的な抗原性ペプチドとをそれぞれ異なる区画に配置してキットをつくる。そのような区画として、例えばガラスもしくは樹脂性の蓋付バイアルやアンプル、マイクロプレート等が適当である。ＥＬＩＳＡ反応に用いるマイクロプレートに、それぞれのペプチドを別々のウェルに吸着（結合）させたものを、凍結乾燥などの方法により安定に性能（抗体との結合能）が維持できる状態にしたものを包装し、これを区画とした形態であればさらに望ましい。またマイクロプレートの代わりに適当なチューブ、ビーズ、また赤血球などの通常の凝集法に用いられる担体などに、前記のごとくペプチドを吸着（結合）させたものを用いることも出来る。キット中には、免疫学的分析に必要な緩衝剤、酵素標識もしくは放射標識第二抗体、発色剤、反応停止剤等の試薬類を適宜包含させてもよい。
【００２７】
表１〜表４に、酵素抗体法によりポリペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１（配列番号：３のアミノ酸位置２３〜６３の配列を含む）およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２を、臨床的にＣ型肝炎と判定された患者血清と反応させ比較した結果を示したが、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２はＨＣＶグループＩを、一方、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２はＨＣＶグループIIをそれぞれ特異的に識別することが可能であることが判る。
【００２８】
表５〜表７には、酵素抗体法による種々のＣ型肝炎患者血清と、ＨＣＶグループＩまたはグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る本発明のペプチド断片との反応結果を示している。表５の結果は、患者がＨＣＶグループＩのみに感染していることを、表６の結果は、患者がＨＣＶグループＩとＩＩの両方に重感染していることを、そして表７の結果は、患者がＨＣＶグループＩＩのみに感染していることを示している。比較として、市販のＣ型肝炎感染診断薬Ｉｍｕｃｈｅｃｋ−ＨＣＶ（国際試薬（株）製）を用いて同様に測定した結果からは、ＨＣＶのグループＩとＩＩの識別は全く困難であることが判る。
【００２９】
従って、本発明は、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを、ＨＣＶを含むと推定される検体と接触させて免疫学的反応を行ない、グループＩに属するＨＣＶを陽性として検出することからなる、ＨＣＶのグルーピング方法を提供する。同様に、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを使用した場合には、グループＩＩに属するＨＣＶを陽性として検出することが可能であり、このようなグルーピング方法も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明はさらに上記定義のキットの使用に関する。すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１および配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチド、並びに、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３および配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドの各々を、Ｃ型肝炎ウイルス抗体を含むと推定される検体と別個に接触させて免疫学的反応により検体中の該ウイルス抗体を定性的または定量的に測定し、グループＩまたはグループＩＩに属する該ウイルス抗体を検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供する。
【００３１】
免疫学的測定方法としては、当業界で慣用の技術、例えば、ウェスタンブロット法、酵素免疫測定法、免疫沈降法、ラジオアイソトープ免疫測定法などが用いられる。測定条件は測定法に応じて任意に選択される。具体的には、後述の実施例が参照される。また、検体は通常、血液、特に血清である。
【００３２】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】
実施例 １ Ｃ１４−１およびＣ１４−１−２発現プラスミドの作製
ＲＴ−ＰＣＲによる抗原用ＤＮＡのクローニング：
慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿よりＨＣＶ遺伝子をクローニングする方法として少量の血漿でクローニングが可能なＲＴ（リバース・トランスクリプターゼ）−ＰＣＲ法を利用してＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
【００３４】
先ず、Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mMクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−ＲＮＡ（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。更に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。遠心機で１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心する。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心し、沈殿させる。沈殿物を４ＭのＧＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、−２０℃に１時間以上静置する。１５０００ rpm、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００３５】
ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン処理チューブ（０．５ml）に分注した後、７０℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ（各２０mM）１μｌ、１００mMＤＴＴ、５×ＲＴ緩衝液（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３７５mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で計２０μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは検出ＤＮＡの増幅感度と特異性を挙げる為に２ステップ法を用いた。即ち、先ず２種のプライマーで１回目のＰＣＲをかける（１st step PCR ）。次にそのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側に存在する２種のプライマーを用いて２回目のＰＣＲをかける（２nd step PCR ）方法である。
【００３６】
Ｃ１４−１領域を増幅するために既報の配列（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 9524〜9528, 1990）を参考にしてプライマーを合成した。
【００３７】
１st ＰＣＲに際してはプライマー５Ｓ１：５’−ＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣＴＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣ−３’及び５Ａ１：５’−ＴＧＴＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ−３’を使用し、２nd ＰＣＲにはプライマー５Ｓ２：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣ−３’と５Ａ２：５’−ＣＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＣＣＴ−３’を用いた。
【００３８】
ＰＣＲの条件は、０．５mlチューブ中に上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 、０．１％ gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２種（各７５ pmole）、２mM ｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、 Ampli Taq（Perkin-Elmer-Cetus）１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。次に新しい０．５mlチューブに１st ＰＣＲ反応終了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴＰｓ ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２nd ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
【００３９】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−１（約２００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との連結反応を行なう。pUC119（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００４０】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
【００４１】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約２５０bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＵＣ・Ｃ１４−１と命名した。得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入Ｃ１４−１ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。Ｃ１４−１ ＤＮＡ断片は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった（この塩基配列は配列番号：５に示す）。
【００４２】
ＮＳ３領域の後半からＮＳ４領域を含み、ＮＳ５領域の前半までを含む形で単離するために（Ｃ６−２と命名した）、１stＰＣＲにはＫＫ１：５’−ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’とＡ６：５’−ＧＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’、２ndＰＣＲにはＫＫ５：５’−ＧＡＴＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＴＧＴＣＡ−３’とＡ６を用い、前記と同様の手法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を行なわせ、上記と同様の方法により増幅された断片を得た。断片を前記と同様の方法によりｐＢＭベクターに挿入することによりＣ６−２を得た。
【００４３】
１ngのＣ６−２を鋳型とし、５０pmolのプライマー（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴ−３’及び５’−ＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡ−３’）、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００となるよう反応液を混合し（全反応液量５０μｌ）、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、パラフィンオイルを重層させた後、９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、１２０秒の条件で３０サイクル反応を行なった。反応液をアガロース電気泳動にかけ約２６０ｂｐの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法（Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎII，ＢＩＯ１０１社）により５０μｌのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ］に回収した。この回収したＤＮＡ溶液２５μｌに３μｌの１０×Ｔ４バッファー［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭ ＤＴＴ］と３μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、３μｌのＡＴＰを加え、５ＵのＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）、１０ＵのＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液からガラスパウダー法によりＤＮＡ断片を２５μｌのＴＥ溶液に回収した。
【００４４】
一方１μｇのｐＴ７Ｔ３ １９Ｕ［ファルマシア社］を２０μｌの反応液系［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭ ＫＣｌ，１０Ｕ ＳｍａＩ］で３７℃１時間反応させることにより切断した。この反応液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０μｌ、滅菌水を７０μｌ、２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造）を加え６８℃において３０分間反応させた。反応終了後ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液により溶液を抽出した後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを１０μｌのＴＥ溶液に溶解した後、１μｌを用い回収したＰＣＲ断片１０μｌと共に混合し、ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液５０μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂ液１０μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造）を加え、良く混合した後１６℃１時間反応を行なわせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎａｈａｎの方法［ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ１０９，ＩＲＣ ｐｒｅｓｓ，（１９８５）］に従って形質転換させた。得られた形質転換体のＤＮＡを調製しＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで切断することにより約２９０ｂｐの断片の生じるクローンを得ることができた。この単離したＤＮＡ断片は配列番号６に示される配列を持ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列を持つペプチドをコードしている。
【００４５】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−１ ＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液［100mM Tris-HCl (pH7.5)、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（宝酒造）］２０μｌ中で、３７℃１時間消化反応し、低融点アガロース電気泳動により約２００bpのＤＮＡ断片を精製する。次に発現ベクターであるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のＤＮＡ１μｇを同様の反応液中で３７℃１時間消化し、低融点アガロース電気泳動により、ベクターＤＮＡ断片を精製する。得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ１４−１ ＤＮＡ断片を１０×リガーゼ用バッファー［660mM Tris-HCl (pH7.5)、66mM MgCl2 、100mM ジチオスレイトール、10mM ATP］５μｌ、３５０単位のＴ4 リガーゼ（宝酒造）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。
【００４６】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。
【００４７】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重消化し、アガロース電気泳動を行なって、約２００bpのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−１発現プラスミドを選別した。
【００４８】
同様に、ｐＵＣ・Ｃ１４−１−２ ＤＮＡを用いて、約２９０bpのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−１−２発現プラスミドを構築した。
【００４９】
実施例 ２ Ｃ１４−２発現プラスミドの作製
抗原用ＤＮＡのクローニング：
ＨＣＶグループＩＩ型と考えられるクローンＣ１０−１４（特願平３−１８９２６８号）（微工研条寄第３４３６号）をＰＣＲ用プライマー ５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣ−３’と５’−ＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴ−３’でＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲの条件はＣ１０−１４クローンＤＮＡ １ngに１０×ＰＣＲバッファー［0.1M Tris-HCl (pH 8.3), 0.5M KCl］１０μｌ、プライマー２種（各７５ pmole）、２mM dNTP 10μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（パーキンエルマ・シータス）を１μｌ（５単位／μｌ）加え混合した後、ミネラルオイルを２滴重層する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃、１分間、アニーリング５５℃、１分間、伸長７２℃、２分間の条件で３０サイクル行なった。
【００５０】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−２（約２００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との連結反応を行なう。pUC119（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００５１】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
【００５２】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプシン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約２５０bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＵＣ・Ｃ１４−２と命名した。
【００５３】
得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した（配列番号：７参照）。Ｃ１４−２ ＤＮＡ断片は配列番号：３に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった。
【００５４】
上記クローニングにおいて、ＰＣＲ用プライマーを５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡ−３’および５’−ＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴ−３’に代えた以外は全く同様の操作により、約１４０bpのＣ１４−２−１ＤＮＡ断片を含むクローンを得、これをｐＵＣ・Ｃ１４−２−１と命名した。Ｃ１４−２−１ＤＮＡ断片は配列番号：３に示されるアミノ酸配列中位置２３〜６３の配列をもつペプチドをコードする。
【００５５】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−２ ＤＮＡを用いて、実施例１と同様にして、約２００bpのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２発現プラスミドを構築した。この構築手順を図２に示す。同様に、ｐＵＣ・Ｃ１４−２−１ＤＮＡを用いてｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１発現プラスミドを構築した。
【００５６】
実施例 ３ Ｃ１４−２−２発現プラスミドの作製
ＲＴ−ＰＣＲによる抗原用ＤＮＡのクローニング：
慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿からのＨＣＶ遺伝子のクローニングに際しては、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用してＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
【００５７】
先ず、Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mMクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−ＲＮＡ（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。更に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。遠心機で１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心する。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心し、沈殿させる。沈殿物を４ＭのＧＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、−２０℃に１時間以上静置する。１５０００ rpm、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００５８】
ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン処理チューブ（０．５ml）に分注した後、７０℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ（各２０mM）１μｌ、１００mMＤＴＴ、５×ＲＴ緩衝液（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３７５mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で計２０μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは実施例１に定義した２ステップ法を用いて行なった。
【００５９】
Ｃ１４−２−２領域を含むＮＳ４領域を増幅するために既報の配列（J. Gen. Virol. 72 ：2697〜2704 (1991) ）を参考にしてプライマーを合成した。
【００６０】
ＮＳ４領域は１st ＰＣＲに際してはプライマー：
５’−ＧＧＡＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’，５’−ＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡを使用し、２nd ＰＣＲにはプライマー５’−ＧＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’，５’−ＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＴ−３’を用いた。
【００６１】
ＰＣＲの条件は、０．５mlチューブ中に上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 、０．１％ gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２種（各７５ pmole）、２mM ｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、 Ampli Taq（Perkin-Elmer-Cetus）１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。次に新しい０．５mlチューブに１st ＰＣＲ反応終了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴＰｓ ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２nd ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
【００６２】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−８（約７００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後ｐＢＭ（平成４年７月１０日出願の特願平４−２０７３９１号）との連結反応を行なう。ｐＢＭ（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００６３】
ｐＢＭの作製は次に示す手順で行なった。すなわち、ｐＢＲ３２２（Sutchliffe, J. G., Cold Spring Harbor Symposium, 43, 77-90 (1979) ）の制限酵素ＥｃｏＲ ＶサイトからＢａｌ Ｉサイトの間の配列を制限酵素で欠失させ、ＥｃｏＲ ＩサイトとＨｉｎｄ IIIサイト間にｐＵＣ１１９（Vieria, J., Messing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲ ＩサイトからＨｉｎｄ IIIサイトまでを組み込み（ΔｐＢＲ Ｍｃｓ）、次にｐＢＲ３２２のＶｓｐ ＩサイトからＳｃａ Ｉサイトの間の配列をｐＵＣ１１９のＶｓｐ ＩサイトからＳｃａ Ｉサイト間の配列に置き換え、この間のＰｓｔ Ｉサイトを欠失させて全長３１２２ｂｐのｐＢＭベクターを作製した。
【００６４】
次に、上記連結反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、ハナハンの方法［DNA cloning : A practical approach, IRC Press (1985)］により作られる。
【００６５】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（５０μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約７００bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＳ１４−ＮＳ３と命名した。得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入Ｃ１４−８ ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。尚、Ｃ１４−８断片の配列は配列番号９に示した。
【００６６】
Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ断片を得るために、さらにＰＣＲ反応を行なった。用いたプライマーは、５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴ−３’と５’−ＴＣＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡである。ＰＣＲ反応は１ｎｇのＣ１４−８ＤＮＡを鋳型に５０ｐｍｏｌの上記プライマー、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．８），１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００となるよう反応液を混合し（全反応液量５０μｌ）、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、パラフィンオイルを重層させた後、９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、１２０秒の条件で３０サイクル反応を行なった。反応液をアガロース電気泳動にかけ約２６０bpの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ II，ＢＩＯ１０１社）により５０μｌのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ］に回収した。この回収したＤＮＡ溶液２５μｌに３μｌの１０×Ｔ４バッファー［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭ ＤＴＴ］と３μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、３μｌのＡＴＰを加え、５ＵのＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）、１０ＵのＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液からガラスパウダー法によりＤＮＡ断片２５μｌのＴＥ溶液に回収した。
【００６７】
一方１μｇのｐＵＣ１１８［Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，ｐｐ３−１１（１９８７）］を２０μｌの反応液系［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭ ＫＣｌ，１０Ｕ ＳｍａＩ］で３７℃１時間反応させることにより切断した。この反応液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０μｌ、滅菌水を７０μｌ、２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造）を加え６８℃において３０分間反応させた。反応終了後ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液により溶液を抽出した後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを１０μｌのＴＥ溶液に溶解した後、１μｌを用い回収したＰＣＲ断片１０μｌと共に混合し、ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液５０μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂ液１０μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造）を加え、良く混合した後１６℃１時間反応を行なわせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎａｈａｎの方法［ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ１０９−，ＩＲＣ ｐｒｅｓｓ，（１８８５）］に従って形質転換させた。
【００６８】
得られたクローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、調製した組換え体プラスミドＤＮＡ約１．５μｇをＭ１３ＲＰ１プライマー（アプライドバイオシステム社）または−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応させ、反応産物をＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７０Ａ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３０、アプライドバイオシステム社）を用いて分析し塩基配列を決定した（配列番号：８参照）。Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ断片は配列番号：４に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった。
【００６９】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液［50mM Tris-HCl (pH7.5) 、100mM NaCl、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ（宝酒造）］２０μｌ中で、３７℃１時間消化反応し、アガロース電気泳動により分離しガラスパウダー法により調製する。次に発現ベクターであるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のＤＮＡ１μｇを同様の反応液中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動により分離しガラスパウダー法により調製する。得られたＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ１４−２−２ ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用い、メーカーの推奨する方法により１６℃で１時間保温し、連結反応を行なった。
【００７０】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、ハナハンの方法［前掲］により作られる。形質転換大腸菌を５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。
【００７１】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで二重消化し、アガロース電気泳動を行なって、約２６０bpのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−２−２発現プラスミドを選別した。
【００７２】
実施例 ４
Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２、Ｃ１４−２−１およびＣ１４−２−２ ＤＮＡによってコードされるペプチド類の発現及び精製：
上記実施例１〜３で作製した５種類の各発現プラスミドを有する大腸菌Ｃ６００を５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地４０mlに接種し、３７℃で一晩培養する。この培養液５０mlを５０μｇ／mlのアンピシリンを含む４ｌのＭ９−ＣＡ培地（0.6 ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ， 0.5％ ＫＨ2 ＰＯ4 ， 0.5％ ＮａＣｌ， 0.1％ ＮＨ4 Ｃｌ， 0.1mM ＣａＣｌ2 ，２mM ＭｇＳＯ4 ， 0.5％カザミノ酸， 0.2％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ600 ＝０．３のときに終濃度４０mg／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離し、約１２ｇの菌体を集めた。得られた菌体に溶菌バッファー［50mM Tris-HCl (pH8.0) 、30mM NaCl, 5mM EDTA ］６０mlを加え懸濁し、リゾチーム（生化学工業）１２mgを加え３７℃で１時間反応させた。超音波破砕１５０秒により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離１５０００ rpm、１５分間、４℃で行ない、目的のＤＮＡによってコードされるペプチドとｔｒｐＥの融合ペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に可溶化バッファー［４Ｍ尿素、50mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1% NP-40 ］を５５ml加えて、融合ペプチドを可溶化抽出した。
【００７３】
可溶化した抽出物に尿素、ＤＴＴをそれぞれ終濃度６Ｍ、５０ｍＭとなるように加え、４℃１時間以上おいた後に、６Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社）カラムにかけた。０Ｍから０．２ＭのＮａＣｌの濃度勾配をかけることにより目的ペプチドをカラムから溶出させた。溶出分画を集め、６Ｍ尿素、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラム（ファルマシア社）にかけることにより、融合ペプチドを精製した。得られた融合ペプチドは、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１（Ｍｒ約８ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（Ｍｒ約１１ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２（Ｍｒ約１０ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１（Ｍｒ約６ｋＤａ）およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２（Ｍｒ約１１ｋＤａ）である。
【００７４】
実施例 ５
Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２ペプチド断片の調製
ペプチドは Applied Biosystems Peptide Synthesizer モデル 430Ａ（Applied Biosystems）を用い、Fast Moc system のプロトコールにしたがい合成した。合成終了後、常法にしたがって脱保護、脱樹脂を行ない、ＨＰＬＣで精製した。
【００７５】
目的のピークと思われるものを分取し、アミノ酸分析機（日本電子、ＪＬＣ−３００）でアミノ酸含有量を調べるか、あるいは Protein Sequencer（Applied Biosystemsモデル 477Ａ）でアミノ酸配列の確認を行なった。
【００７６】
実施例 ６ Ｃ型肝炎患者血清中のＨＣＶ抗体の測定
（ｉ）ウェスタンブロット法によるＨＣＶ抗体の検出：
発現ペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−２ １μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)］に掛けた後、常法に従ってニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にブロッティングした。このフィルターを、ブロッキング液［４％ブロックエース（雪印）、２％ＢＳＡ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）］で室温、１時間静置後、正常人血清およびＣ型肝炎患者血清を１００倍希釈液で室温で１時間反応させる。洗浄液［20mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween-20 ］で洗った後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）を、１０００倍希釈で室温３０分間反応させた。再びフィルターを洗浄し、基質であるジアミノベンチジン溶液に浸し、発色を確認後、純水に浸して反応を停止した。図３に示したように、正常人血清に対しては全く反応していないが、患者血清に対しては強く反応し、特異的なバンドとして検出された。
【００７７】
（ii）酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ法）によるＨＣＶのグルーピング（その１）：
慢性期にある種々の日本人Ｃ型肝炎患者血清を、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２融合ペプチドを用いてＥＬＩＳＡ法によりＨＣＶのグルーピング判定を行なった。ＥＬＩＳＡ法は、常法を用いて行ない、精製抗原を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．５）で５μｇ／mlの濃度に希釈し、４℃あるいは室温でマイクロプレートに固定する。洗浄液で数回洗浄後、希釈被検血清を加え、３０℃あるいは室温で１時間インキュベートする。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え、３０℃あるいは室温で反応させる。更に数回洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン溶液を５０μｌ加え、３７℃で発色させる。２Ｍ Ｈ2 ＳＯ4 で発色を停止させ、比色計で４９２ｎｍの吸光度測定を行なった。なお、対照として正常人血清、また比較として市販のカイロン社キットＣ１００−３（オルソ社）を用いて同時に測定した。結果を表１、表２、表３及び表４に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
【００８１】
【表４】
表１〜表４の結果は、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２融合ペプチドはともにＨＣＶグループＩを特異的に識別し、一方、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２融合ペプチドはともにＨＣＶグループＩＩを特異的に識別することを示している。この結果はさらに、同一のＣ型肝炎患者血清について、Ｃ１４−１および／またはＣ１４−１−２ペプチドと、Ｃ１４−２および／またはＣ１４−２−１および／またはＣ１４−２−２ペプチドとを組み合わせて使用してＨＣＶグルーピング判定を実施することにより、該患者がＨＣＶのグループＩのみかまたはグループＩＩのみかまたはグループＩとグループＩＩの両方に感染しているかを判定できることを示している。
【００８２】
（iii ）ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶのグルーピング（その２）：
慢性期にある種々の日本人Ｃ型肝炎患者血清を、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２、実施例５で調製したＣ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２のペプチド断片：１−Ｙ、１−Ｚ、１−Ｂ、２−Ｙ、２−Ｂ、２−Ｚを用いてＥＬＩＳＡ法によりＨＣＶのグルーピング判定を行なった。
【００８３】
ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２ペプチドを上記の様にプレートに固定した。検体２０μｌと実施例５で調製したペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを等量混和し、室温１時間静置した。これに検体希釈液を２００μｌ加えた後にペプチドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２ｎｍの発色を測定した。
【００８４】
また、比較として市販のＨＣＶ感染診断薬Ｉｍｕｃｈｅｃｋ−ＨＣＶ（国際試薬（株）製）を使用して同様に測定を行なった。結果を表５、表６および表７に示す。
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
表５に示した検体は全てＨＣＶグループＩに属することはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応性により明らかであり、実施例５で調製したグループＩの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２との反応が阻害されていることが明らかである。表７に示した検体は全てＨＣＶグループＩＩに属することはｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２との反応性より明らかであり、実施例５で調製したグループＩＩの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２との反応が阻害されていることが明らかである。さらに表６に示した検体は全てＨＣＶグループＩＩ、Ｉ両者に属すことはｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２との反応性より明らかであり、実施例５で調製したグループＩ、ＩＩそれぞれの配列を持つペプチドを加えることによりｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２との反応が阻害されていることが明らかである。これらの結果からｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２と抗体との反応性が特異的なものであることが分かる。さらにこれらの実施例５で調製した配列を持つペプチドによる、グループＩ、ＩＩそれぞれのペプチドに対する阻害を調べることにより、該患者がＨＣＶのグループＩのみかまたはグループＩＩのみかそれとも両者に感染しているかを知ることが出来る。一方、比較としてのＩｍｕｃｈｅｃｋ−ＨＣＶでは各表から明らかなようにグルーピング判定が困難である。
【００８８】
（iv）ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶのグルーピング（その３）
実施例５で調製したペプチドをマイクロプレートに固定した。そこに検体を加え、前記の方法により反応を行なわせ、反応停止後、比色計で４９２ｎｍの発色を測定した。結果を表８に示す。それぞれのペプチドによりグルーピングを行なうことができることは明らかである。しかし各ペプチドとの反応は、ある検体においてはＺのみであり、ある検体においてはＹのみである。このことからグルーピングに用いるペプチドは、実施例５で調製したペプチドを組み合わせたもの、あるいはつなげたものであることが望ましい。
【００８９】
【表８】
実施例 ７
キットの作成
精製した抗原を５μｇ／ｍｌとなるように８Ｍ尿素を含む燐酸緩衝液に希釈する。希釈液をグループごとに別々のマルチプレートに、ウェルあたり１００μｌ加え、４℃にて一夜静置する。液を捨てウェルあたり３００μｌのブロッキング液を加え、室温において２時間静置する。液を捨て洗浄液でウェルを洗浄した後、マルチプレートを凍結乾燥させる。凍結乾燥させたプレートをグループごとに異なる袋に入れ、シールし、キットの箱に入れ、４℃において保存する。キットにはさらにグループ特異的な反応が確認されているグループＩ、グループＩＩに対応する陽性血清、検体血清を希釈するために希釈液、洗浄液、酵素標識抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体、発色液を適当な瓶などの容器に別々に入れた状態で箱に入れる。また取り扱い説明書もキットに添付する。
【００９０】
実施例 ８
インターフェロン（ＩＦＮ）治療効果とＲＴ−ＰＣＲ法によるグルーピングの相関
グループＩＩを特異的に検出可能なプライマー及びグループＩに特異的なプライマーを設定しＩＦＮの治療効果とＰＣＲによるグルーピングの相関をみた。
【００９１】
Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）３００μｌを加え撹拌する。さらに４０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、４００μｌフェノール、８０μｌクロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を加えよく撹拌する。水溶液層をとりイソプロピルアルコールを加え、これを遠心し、沈澱を得る。これをＲＮＡとしてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成はTris−HCl 10mM、ゼラチン0.01％、 dNTP 各１mM、MgCl2 4mM, DTT 1mM、プライマー100 pmole の反応液に RNaseインヒビター、逆転写酵素を加え、３７℃２時間反応して行った。このｃＤＮＡを用い２ステップ法ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、ｃＤＮＡを含む反応液 100μｌに Tris-HCl 10mM，ゼラチン0.01％ dNTP 各２mM, MgCl2 1.5mM，プライマー各50pmole を加え、アンプリフィケーションサイクルは変性９４℃、１．５分、アニーリング５０℃、２分、伸長７０℃、２分の条件で３５サイクル行った。いくつかのプライマーを検討した結果以下の４種のプライマーを用いるとグループＩＩに特異的なＤＮＡ断片が検出可能となった。
【００９２】
ｌｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ
ＫＫ２１：５’−ＧＧＡＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’
ＫＫ２２：５’−ＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡ−３’
２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲ
ＫＫ２６：５’−ＧＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’
ＫＫ２７：５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ−３’
この４種のプライマーを用いたＰＣＲで２０６塩基対のＤＮＡ断片が検出される。以下の４種のプライマーを用いることによりグループＩに特異的なＤＮＡ断片が検出可能である。
【００９３】
ｌｓｔ ＰＣＲ
ＫＫ１：ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ−３’
ＫＫ２：ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＴＡ−３’
２ｎｄ ＰＣＲ
ＫＫ５：ＧＡＴＣＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＴＧ−３’
ＫＫ８：ＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’
これらのプライマーで１５３塩基対のＤＮＡ断片が検出される。
【００９４】
表９に示すように、著効９例につき７８％がグループＩＩ、２２％がグループＩであり、ＩＦＮ治療効果を示す患者は主としてグループＩＩに属することが確められた。
【００９５】
【表９】
【００９６】
【発明の効果】
本発明の抗原性ペプチドおよび該ペプチドからなるキットは、Ｃ型肝炎患者がＨＣＶのグループＩおよびグループＩＩのどちらに感染しているかを判定し得ると共に、グループＩとグループＩＩの両方に感染（所謂、重感染）しているケースの判定にも有効に使用し得る利点をもつ。患者がＨＣＶグループＩＩに感染していると判定された場合には、抗ウイルス剤であるＩＦＮ治療がＨＣＶグループＩＩに対し著効であるという事実に鑑みて、該患者に対し迅速かつ有効なＩＦＮ治療を実施することが可能である。また、本発明のペプチドおよびキットはＨＣＶ感染の確認にも有用である。
【００９７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列番号：２
配列の長さ：８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列番号：３
配列の長さ：６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列番号：４
配列の長さ：８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列番号：５
配列の長さ：１８９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列番号：６
配列の長さ：２６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列番号：７
配列の長さ：１８９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列番号：８
配列の長さ：２６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列番号：９
配列の長さ：６６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２抗原性ペプチドのアミノ酸配列、並びにＨＣＶグルーピングに有効なペプチド断片（太線）検索のためのエピトープマッピングを示す。図中、星印(*) はＣ１４−１とＣ１４−１−２の間のおよび、Ｃ１４−２とＣ１４−２−２の間の相同アミノ酸を表わす。
【図２】この図は、Ｃ１４−２発現ベクターｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２の構築手順を示す。
【図３】この図は、発現ペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−２とＣ型肝炎患者血清（右レーン）との抗原抗体反応を示す電気泳動（ウェスタンブロット）写真である。左レーンはコントロール（正常人血清）である。
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングのための抗原性ペプチド、それを含有するキットおよびそれを使用するグルーピング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎（通常、Ｃ型肝炎と称される）は、ウイルス性の伝染性肝炎と考えられており、慢性化しやすく、肝硬変、肝癌へ移行する率が高いことから、社会的に問題となっている。しかしながら患者あるいは健康キャリアー体内でのウイルス発現量が少ないこと、また感染性ウイルスが同定されておらず、原因ウイルスが１種なのかあるいは２種以上存在するのかも分かっていないことなどからその確定診断は、非常に困難である。現在まで非Ａ非Ｂ型肝炎の診断は、臨床的には、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルの上昇を確認し、その上でＡ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＤ型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既知のウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ等による肝炎か否かの診断を行ない、これらの疾病に該当しない場合に非Ａ非Ｂ型肝炎と診断する、いわゆる除外診断によって行なわれていた。しかし、非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床像は他のウイルス性肝炎のものと似通っており、上記のような除外診断法では、他のウイルス性の肝炎との鑑別診断は難しい。また、ＡＬＴ値に異常のみられない健康キャリアーを同定するのはさらに困難である。このため、健康キャリアーからの輸血による感染を防止することは困難で、輸血後肝炎の９０％以上をこの肝炎が占めており、患者数は我国だけでも年間１００万人にのぼるといわれている。
【０００３】
かかる状況を改善するため、多くの研究者が非Ａ非Ｂ型肝炎の診断用材料の開発を行なってきたが、信頼性が低いものが多かった。これらの診断用材料で最も信頼性の高いものは、カイロン社の M. Houghtonら（特表平２−５００８８０号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）によって開発されたものだと考えられている。カイロン社は、得られた問題のウイルス遺伝子を用いて遺伝子のクローニングを行ない、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ＝カイロン社命名）のほぼ全遺伝子を明らかにし、一部遺伝子を発現して得られた抗原蛋白質を用いて診断用のキット化を行なっている。
【０００４】
その後、日本でもイムノスクリーニングにより、多くの非Ａ非Ｂ型肝炎に特異的な遺伝子が分離された結果、カイロン社の分離したＨＣＶに核酸、アミノ酸レベルでの相同性の高いＨＣＶ・グループＩと、相同性が低く、ＨＣＶ・グループＩとは異なるウイルスと考えてよい程度の相同性しか示さないグループＩＩとに分類できることが示された（本出願人による特許出願特願平３−１８９２６８号）。カイロン社のキットは日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清では５０〜７０％程度の反応しか示さないことが証明され、疫学的な面でより感度の高い診断薬の開発が急務であったが、最近、ウイルスの構造蛋白を含む診断用キットの開発により、患者血清スクリーニングの結果が５０〜７０％程度の検出感度から９０％以上に上昇し、遺伝子増幅（ＰＣＲ）による結果と相関性を示すことで、輸血用血液のスクリーニング用診断薬の開発は充分な成果がでてきている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＣＶは、カイロン社のクローニングしたグループＩと本出願人のクローニングしたグループＩＩに分類され、各々伝染性の肝炎の病因体として存在しているが、ウイルス学的及び臨床病理学的な面からみると、ＨＣＶの２つのグループが臨床的にどのような病態と関連があるのか関心がもたれている。その１つの例として、インターフェロン（ＩＦＮ）治療例が挙げられる。抗ウイルス剤であるＩＦＮはＨＣＶの持続感染を断ち切ることにより、肝炎の慢性化を防ぐと考えられているが、その効果については急性肝炎には有効率は高いが、慢性肝炎や肝硬変など進展した症例については治療効果は低い（約３０％）ことが分かっている。山梨医科大学の宮崎らは、ＩＦＮが著効したＣ型肝炎患者にグループＩＩが高頻度に感染していることを、ＰＣＲ法により同定した（宮崎ら，第２８回日本肝臓学会，一般講演４，要旨集第７５頁，１９９２年）。
【０００６】
ＰＣＲ法は、少量の血清より目的の遺伝子を増幅検出することが可能であるが、操作が煩雑であり大量のサンプルを取扱う手法としては問題がある。そこで酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ）の系で、グループＩとグループＩＩに特異的に感染している患者をスクリーニングする方法が開発されたならば、グループＩＩ型感染患者に対して有効なＩＦＮ治療を実施することが可能となろう。また、グループＩおよびグループＩＩの両方に感染している患者、所謂重感染患者の検出に有用であろう。
【０００７】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングに使用するための抗原性ペプチド、およびこのペプチドを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングに使用するための、該ウイルスのグループＩ抗体およびグループＩＩ抗体とそれぞれ特異的に反応し得る抗原性ペプチドを組み合わせて含むキット、並びに、このキットを用いるＣ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前述したように、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、アミノ酸配列の相同性比較によって、グループＩとグループＩＩに大別される。相同性は、カイロン社がクローニングしたＨＣＶＩ（特表平２−５００８００号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）との比較から判定され、約８０％より高い相同性を示すグループと約８０％より低い相同性を示すグループとに分けることができ、前者をグループＩ、後者をグループＩＩと称する。なお、本明細書中では、グループＩおよびグループＩＩに対しこの定義を採用する。また、グルーピングとはグループＩとＩＩとに振り分けること、または、グループＩもしくはグループＩＩを識別することを意味する。
【００１０】
この数年の間に次々とＨＣＶの全長クローンが単離されそのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が決定された結果、グループＩはタイプＩとタイプ II に、またグループＩＩはタイプIII とタイプ IV にそれぞれ更に分類できることが分かってきた。例えば、タイプＩのＨＣＶにはカイロン社が単離した「ＨＣＶＩ」（特表平２−５００８００号及びＷＯ ９０／１１０８９公報）、タイプ II には下遠野らが単離した「Ｊ」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9524〜9528 (1990) ）、タイプIII には岡本らが単離した「Ｊ６」（J. Gen. Virol. 72:2697〜2704 (1991) ）、タイプ IV には岡本らが単離した「Ｊ８」（Virology 188:331〜341 (1992)）が挙げられる。アミノ酸配列に基づく相同性は、タイプＩとタイプ
II 、また、タイプIII とタイプ IV ではともに約８５％である。
【００１１】
本発明者らは、Ｃ型肝炎患者血漿よりＨＣＶ遺伝子をクローニングし、増幅したＤＮＡ断片を大量発現させて得られるペプチドの中に、ＨＣＶグループＩまたはＩＩをもつＣ型肝炎患者血清と特異的に抗原抗体反応を起こす抗原性ペプチドを見出した。すなわち、両グループの識別に有効なペプチド部分が、ＨＣＶゲノム上のＮＳ４領域によってコードされ、特表平２−５００８００号公報に記載されるＨＣＶＩのコードするポリペプチドのアミノ酸番号１６７４〜１７６０の領域に対応する部分に存在することが判明した。具体的には、ＨＣＶグループＩの識別に有用な抗原性ペプチドとして、配列表中配列番号：１に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−１ペプチドおよびＣ１４−１関連の、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−１−２ペプチドが見出され、またＨＣＶグループＩＩの識別に有用な抗原性ペプチドとして、配列番号：３に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−２ペプチドおよびＣ１４−２関連の、配列番号：４に示されるアミノ酸配列をもつＣ１４−２−２ペプチドが見出された。これらの配列は岡本ら（上掲）が単離したＪ６、Ｊ８のゲノムがコードするポリペプチドのアミノ酸番号１６８０〜１７６４の領域に対応することが判明した。グルーピングは上記４種のペプチドの各ペプチド断片であっても有効であった。
【００１２】
従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチド、並びに、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを提供する。
【００１３】
これらのペプチド類を単独に抗原として使用することによって、血液等の検体中のＨＣＶをグループＩかまたはグループＩＩのいずれかにグループ分けすることができる。
【００１４】
本発明はさらに、上記４種のペプチド類から選択される、ＨＣＶのグループＩまたはグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る抗原性ペプチドを組み合わせてキット化してもよく、これによって両方のグループに重感染している患者の検出に有効に使用し得る。
【００１５】
従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：１および配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチドと、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：３および配列番号：４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドとをそれぞれ異なる区画に含んでなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩまたはグループＩＩを識別するためのキットを提供する。
【００１６】
本明細書中「同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体」とは、上記定義のＨＣＶグループＩまたはグループＩＩの抗体との特異的反応を可能にする範囲の変異であって、配列番号：１，２，３または４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列中の少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸との置換をもつペプチドを指す。たとえば、図１中Ｃ１４−１とＣ１４−１−２の比較またはＣ１４−２とＣ１４−２−２の比較から明らかなように、そのようなアミノ酸置換としてイソロイシン−バリン、ロイシン−イソロイシン、バリン−アラニン、メチオニン−イソロイシン、リジン−アルギニン、アスパラギン酸−グルタミンのような化学的性質の類似したアミノ酸間の置換が挙げられる。
【００１７】
本発明で使用し得る抗原性ペプチドは、該ウイルス抗体との抗原−抗体反応に影響しない範囲で、不活性な他のペプチドと融合していてもよく、またそのペプチドＮ末端のアシル化等の化学修飾を受けていてもよい。さらに、該ペプチドの中には、抗イディオタイプ抗体も包含される。
【００１８】
有効なペプチド断片の具体例としては、これらに限定されないが、エピトープ解析の結果、図１に太線で示したような、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（１−Ｙ）、３７〜６２（１−Ｚ）もしくはその組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（１−Ｙ）、３７〜６２（１−Ｚ）、５３〜７４（１−Ｂ）、６４〜８７（１−Ａ）もしくはその組み合わせ、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（２−Ｙ）、３７〜６２（２−Ｚ）もしくはその組み合わせ、配列番号：４に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４（２−Ｙ）、３７〜６２（２−Ｚ）、５３〜７４（２−Ｂ）、６４〜８７（２−Ａ）もしくはその組み合わせの配列を有する断片類である。ここで、組み合わせとは２つ以上の断片配列の結合を意味し、たとえば配列２０〜６２、配列２０〜７４等が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗原性ペプチド類は、組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成技術によって製造することができる。
【００２０】
組換えＤＮＡ技術による方法は、業界で一般的に使用される技術であって、配列番号：１、２、３または４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む複製可能な発現ベクターを構築する工程、前記発現ベクターを宿主細胞に移入して形質転換体を得る工程、前記ＤＮＡ断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体を培養する工程、及び、前記ペプチドを回収する工程を含む。
【００２１】
たとえば、発現ベクターは次のようにして作製することができる。目的のペプチドをコードするＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９のような慣用プラスミドに連結し、増幅後、得られたプラスミドを制限酵素で二重消化し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製する。一方、ｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のような発現用ベクターを同じ制限酵素で二重消化し、同様にベクター断片を精製する。このベクターＤＮＡと前述のＤＮＡ断片を連結することによって、ＨＣＶのグループＩ特異的抗原を発現しうる発現ベクターを得る（後述の実施例参照）。
【００２２】
発現用プロモーターとしては、大腸菌、ファージ、ウイルス等由来のものが使用される。例えば、トリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージＰL 、ＰR 、アルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが挙げられる。また、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカー配列、複製開始点、転写終結因子、リボソーム結合部位等を発現ベクター内に任意に存在させることができる。
【００２３】
形質転換宿主としては、大腸菌，枯草菌，酵母などのこの分野で慣用される微生物、または、昆虫，植物もしくは動物細胞が用いられるが、好ましくは原核生物、特に大腸菌である。形質転換は発現ベクターを宿主細胞に移入するための慣用的方法によって実施される。宿主として細菌（例えば大腸菌）を用いる場合には、塩化ルビジウム［Hanahan, DNA cloning:A practical approach, IRC Press(1985)］または塩化カルシウム［Mandel,M. とHige, A. J. Mol. Biol., 53:159-162(1970)］を用いる直接取込み法が使用できる。また、宿主として高等生物細胞を用いる場合には、ウイルスベクターによる取込み法が簡便に使用できる。
【００２４】
次に、発現ベクターを含む宿主を適切な培地中で培養して目的ペプチドを産生する。宿主からの目的物の精製方法としては、宿主細胞を例えば超音波破砕した後に遠心分離を行なってＣ型肝炎ウイルスｃＤＮＡでコードされるペプチド又は該ペプチドと他のペプチド（例えば、ｔｒｐＥなど）とからなる融合ペプチドを含有する不溶性画分を得、このポリペプチドを尿素含有バッファで可溶化抽出し、イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えば、Q-Sepharose など）に掛けて部分精製することができる。さらにゲル濾過（例えば、HiLoad Superdex など）等により単一分子として目的の組換えペプチドを精製することができる。
【００２５】
もう１つのペプチド製造方法であるペプチド合成技術については、液相法および固相法があり、例えば、日本生化学会編生化学実験講座１「タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾とペプチド合成」第 207〜495 頁（1977年）に記載の技術を適用することにより製造することができる。一般に長鎖ペプチドの場合には、合成樹脂固相上で約５〜１０アミノ酸ずつからなる小ペプチドを合成し、各小ペプチドを順次または段階的に結合した後、脱保護して目的ペプチドを得ることができる。
【００２６】
組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成技術によって製造されたペプチド類は、通常、真空乾燥または凍結乾燥されて固体状態で冷暗所に保存される。キットに包装する際には、ＨＣＶグループＩ抗体に特異的な抗原性ペプチドとＨＣＶグループＩＩ抗体に特異的な抗原性ペプチドとをそれぞれ異なる区画に配置してキットをつくる。そのような区画として、例えばガラスもしくは樹脂性の蓋付バイアルやアンプル、マイクロプレート等が適当である。ＥＬＩＳＡ反応に用いるマイクロプレートに、それぞれのペプチドを別々のウェルに吸着（結合）させたものを、凍結乾燥などの方法により安定に性能（抗体との結合能）が維持できる状態にしたものを包装し、これを区画とした形態であればさらに望ましい。またマイクロプレートの代わりに適当なチューブ、ビーズ、また赤血球などの通常の凝集法に用いられる担体などに、前記のごとくペプチドを吸着（結合）させたものを用いることも出来る。キット中には、免疫学的分析に必要な緩衝剤、酵素標識もしくは放射標識第二抗体、発色剤、反応停止剤等の試薬類を適宜包含させてもよい。
【００２７】
表１〜表４に、酵素抗体法によりポリペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１（配列番号：３のアミノ酸位置２３〜６３の配列を含む）およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２を、臨床的にＣ型肝炎と判定された患者血清と反応させ比較した結果を示したが、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２はＨＣＶグループＩを、一方、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２はＨＣＶグループIIをそれぞれ特異的に識別することが可能であることが判る。
【００２８】
表５〜表７には、酵素抗体法による種々のＣ型肝炎患者血清と、ＨＣＶグループＩまたはグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る本発明のペプチド断片との反応結果を示している。表５の結果は、患者がＨＣＶグループＩのみに感染していることを、表６の結果は、患者がＨＣＶグループＩとＩＩの両方に重感染していることを、そして表７の結果は、患者がＨＣＶグループＩＩのみに感染していることを示している。比較として、市販のＣ型肝炎感染診断薬Ｉｍｕｃｈｅｃｋ−ＨＣＶ（国際試薬（株）製）を用いて同様に測定した結果からは、ＨＣＶのグループＩとＩＩの識別は全く困難であることが判る。
【００２９】
従って、本発明は、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを、ＨＣＶを含むと推定される検体と接触させて免疫学的反応を行ない、グループＩに属するＨＣＶを陽性として検出することからなる、ＨＣＶのグルーピング方法を提供する。同様に、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列もしくはその部分配列を有する抗原性ペプチドを使用した場合には、グループＩＩに属するＨＣＶを陽性として検出することが可能であり、このようなグルーピング方法も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明はさらに上記定義のキットの使用に関する。すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１および配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチド、並びに、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３および配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有するペプチド類および同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドの各々を、Ｃ型肝炎ウイルス抗体を含むと推定される検体と別個に接触させて免疫学的反応により検体中の該ウイルス抗体を定性的または定量的に測定し、グループＩまたはグループＩＩに属する該ウイルス抗体を検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法を提供する。
【００３１】
免疫学的測定方法としては、当業界で慣用の技術、例えば、ウェスタンブロット法、酵素免疫測定法、免疫沈降法、ラジオアイソトープ免疫測定法などが用いられる。測定条件は測定法に応じて任意に選択される。具体的には、後述の実施例が参照される。また、検体は通常、血液、特に血清である。
【００３２】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】
実施例 １ Ｃ１４−１およびＣ１４−１−２発現プラスミドの作製
ＲＴ−ＰＣＲによる抗原用ＤＮＡのクローニング：
慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿よりＨＣＶ遺伝子をクローニングする方法として少量の血漿でクローニングが可能なＲＴ（リバース・トランスクリプターゼ）−ＰＣＲ法を利用してＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
【００３４】
先ず、Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mMクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−ＲＮＡ（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。更に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。遠心機で１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心する。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心し、沈殿させる。沈殿物を４ＭのＧＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、−２０℃に１時間以上静置する。１５０００ rpm、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００３５】
ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン処理チューブ（０．５ml）に分注した後、７０℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ（各２０mM）１μｌ、１００mMＤＴＴ、５×ＲＴ緩衝液（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３７５mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で計２０μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは検出ＤＮＡの増幅感度と特異性を挙げる為に２ステップ法を用いた。即ち、先ず２種のプライマーで１回目のＰＣＲをかける（１st step PCR ）。次にそのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列の内側に存在する２種のプライマーを用いて２回目のＰＣＲをかける（２nd step PCR ）方法である。
【００３６】
Ｃ１４−１領域を増幅するために既報の配列（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 9524〜9528, 1990）を参考にしてプライマーを合成した。
【００３７】
１st ＰＣＲに際してはプライマー５Ｓ１：５’−ＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣＴＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣ−３’及び５Ａ１：５’−ＴＧＴＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ−３’を使用し、２nd ＰＣＲにはプライマー５Ｓ２：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣ−３’と５Ａ２：５’−ＣＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＣＣＴ−３’を用いた。
【００３８】
ＰＣＲの条件は、０．５mlチューブ中に上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 、０．１％ gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２種（各７５ pmole）、２mM ｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、 Ampli Taq（Perkin-Elmer-Cetus）１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。次に新しい０．５mlチューブに１st ＰＣＲ反応終了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴＰｓ ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２nd ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
【００３９】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−１（約２００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との連結反応を行なう。pUC119（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００４０】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
【００４１】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約２５０bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＵＣ・Ｃ１４−１と命名した。得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入Ｃ１４−１ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。Ｃ１４−１ ＤＮＡ断片は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった（この塩基配列は配列番号：５に示す）。
【００４２】
ＮＳ３領域の後半からＮＳ４領域を含み、ＮＳ５領域の前半までを含む形で単離するために（Ｃ６−２と命名した）、１stＰＣＲにはＫＫ１：５’−ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’とＡ６：５’−ＧＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’、２ndＰＣＲにはＫＫ５：５’−ＧＡＴＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＴＧＴＣＡ−３’とＡ６を用い、前記と同様の手法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を行なわせ、上記と同様の方法により増幅された断片を得た。断片を前記と同様の方法によりｐＢＭベクターに挿入することによりＣ６−２を得た。
【００４３】
１ngのＣ６−２を鋳型とし、５０pmolのプライマー（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴ−３’及び５’−ＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡ−３’）、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン，０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００となるよう反応液を混合し（全反応液量５０μｌ）、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、パラフィンオイルを重層させた後、９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、１２０秒の条件で３０サイクル反応を行なった。反応液をアガロース電気泳動にかけ約２６０ｂｐの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法（Ｇｅｎｅ ＣｌｅａｎII，ＢＩＯ１０１社）により５０μｌのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ］に回収した。この回収したＤＮＡ溶液２５μｌに３μｌの１０×Ｔ４バッファー［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭ ＤＴＴ］と３μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、３μｌのＡＴＰを加え、５ＵのＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）、１０ＵのＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液からガラスパウダー法によりＤＮＡ断片を２５μｌのＴＥ溶液に回収した。
【００４４】
一方１μｇのｐＴ７Ｔ３ １９Ｕ［ファルマシア社］を２０μｌの反応液系［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭ ＫＣｌ，１０Ｕ ＳｍａＩ］で３７℃１時間反応させることにより切断した。この反応液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０μｌ、滅菌水を７０μｌ、２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造）を加え６８℃において３０分間反応させた。反応終了後ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液により溶液を抽出した後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを１０μｌのＴＥ溶液に溶解した後、１μｌを用い回収したＰＣＲ断片１０μｌと共に混合し、ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液５０μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂ液１０μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造）を加え、良く混合した後１６℃１時間反応を行なわせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎａｈａｎの方法［ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ１０９，ＩＲＣ ｐｒｅｓｓ，（１９８５）］に従って形質転換させた。得られた形質転換体のＤＮＡを調製しＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで切断することにより約２９０ｂｐの断片の生じるクローンを得ることができた。この単離したＤＮＡ断片は配列番号６に示される配列を持ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列を持つペプチドをコードしている。
【００４５】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−１ ＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液［100mM Tris-HCl (pH7.5)、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（宝酒造）］２０μｌ中で、３７℃１時間消化反応し、低融点アガロース電気泳動により約２００bpのＤＮＡ断片を精製する。次に発現ベクターであるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のＤＮＡ１μｇを同様の反応液中で３７℃１時間消化し、低融点アガロース電気泳動により、ベクターＤＮＡ断片を精製する。得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ１４−１ ＤＮＡ断片を１０×リガーゼ用バッファー［660mM Tris-HCl (pH7.5)、66mM MgCl2 、100mM ジチオスレイトール、10mM ATP］５μｌ、３５０単位のＴ4 リガーゼ（宝酒造）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。
【００４６】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。
【００４７】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重消化し、アガロース電気泳動を行なって、約２００bpのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−１発現プラスミドを選別した。
【００４８】
同様に、ｐＵＣ・Ｃ１４−１−２ ＤＮＡを用いて、約２９０bpのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−１−２発現プラスミドを構築した。
【００４９】
実施例 ２ Ｃ１４−２発現プラスミドの作製
抗原用ＤＮＡのクローニング：
ＨＣＶグループＩＩ型と考えられるクローンＣ１０−１４（特願平３−１８９２６８号）（微工研条寄第３４３６号）をＰＣＲ用プライマー ５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣ−３’と５’−ＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴ−３’でＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲの条件はＣ１０−１４クローンＤＮＡ １ngに１０×ＰＣＲバッファー［0.1M Tris-HCl (pH 8.3), 0.5M KCl］１０μｌ、プライマー２種（各７５ pmole）、２mM dNTP 10μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（パーキンエルマ・シータス）を１μｌ（５単位／μｌ）加え混合した後、ミネラルオイルを２滴重層する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃、１分間、アニーリング５５℃、１分間、伸長７２℃、２分間の条件で３０サイクル行なった。
【００５０】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−２（約２００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後 pUC119 ［Vieira, J.とMessing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ］との連結反応を行なう。pUC119（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００５１】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Mandel, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)］により作られる。
【００５２】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプシン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（２５μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、２５μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約２５０bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＵＣ・Ｃ１４−２と命名した。
【００５３】
得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した（配列番号：７参照）。Ｃ１４−２ ＤＮＡ断片は配列番号：３に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった。
【００５４】
上記クローニングにおいて、ＰＣＲ用プライマーを５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡ−３’および５’−ＣＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴ−３’に代えた以外は全く同様の操作により、約１４０bpのＣ１４−２−１ＤＮＡ断片を含むクローンを得、これをｐＵＣ・Ｃ１４−２−１と命名した。Ｃ１４−２−１ＤＮＡ断片は配列番号：３に示されるアミノ酸配列中位置２３〜６３の配列をもつペプチドをコードする。
【００５５】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−２ ＤＮＡを用いて、実施例１と同様にして、約２００bpのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２発現プラスミドを構築した。この構築手順を図２に示す。同様に、ｐＵＣ・Ｃ１４−２−１ＤＮＡを用いてｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１発現プラスミドを構築した。
【００５６】
実施例 ３ Ｃ１４−２−２発現プラスミドの作製
ＲＴ−ＰＣＲによる抗原用ＤＮＡのクローニング：
慢性期非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血漿からのＨＣＶ遺伝子のクローニングに際しては、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用してＨＣＶ遺伝子のクローニングを行なった。
【００５７】
先ず、Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、３７．５mMクエン酸ナトリウム、０．７５％ザルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）２００μｌと酵母のｔ−ＲＮＡ（１０mg／ml）１μｌを加え撹拌する。更に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、ＴＥ飽和フェノール（ｐＨ７．５〜８．０）３０μｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）７０μｌを加え素早く混合し、１０秒間撹拌した後、氷中に１５分間静置する。遠心機で１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心する。水層を採り、等量のイソプロピルアルコールと混合し−２０℃に１時間以上置く。これを１５０００ rpm、２０分間４℃で遠心し、沈殿させる。沈殿物を４ＭのＧＴＣ（６Ｍ ＧＴＣを滅菌水で希釈したもの）１００μｌに溶解し、等量のイソプロピルアルコールと混合し、−２０℃に１時間以上静置する。１５０００ rpm、２０分間、４℃で遠心し沈殿物を得る。７０％エタノール１mlで洗浄後、室温で風乾し、１０μｌの滅菌水に溶解しＲＮＡとして使用した。
【００５８】
ｃＤＮＡ合成はＲＮＡ１０μｌをシリコン処理チューブ（０．５ml）に分注した後、７０℃、３分間加熱し、氷上で急冷する。次にＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）１μｌ（５０単位／μｌ）、ｄＮＴＰｓ（各２０mM）１μｌ、１００mMＤＴＴ、５×ＲＴ緩衝液（２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３７５mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 ）４μｌ、ランダムオリゴヘキサマープライマー（１００pmol／μｌ）１μｌ、逆転写酵素（ＢＲＬ）（２００単位／μｌ）１μｌを加え、滅菌水で計２０μｌに合わせる。４２℃で２時間反応後、９４℃で５分間加熱し酵素を失活させた。このｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは実施例１に定義した２ステップ法を用いて行なった。
【００５９】
Ｃ１４−２−２領域を含むＮＳ４領域を増幅するために既報の配列（J. Gen. Virol. 72 ：2697〜2704 (1991) ）を参考にしてプライマーを合成した。
【００６０】
ＮＳ４領域は１st ＰＣＲに際してはプライマー：
５’−ＧＧＡＴＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’，５’−ＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡを使用し、２nd ＰＣＲにはプライマー５’−ＧＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’，５’−ＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＴ−３’を用いた。
【００６１】
ＰＣＲの条件は、０．５mlチューブ中に上記ｃＤＮＡ合成反応液を２０μｌと１０×ＰＣＲ緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ2 、０．１％ gelatine ）８μｌ、１st step プライマー２種（各７５ pmole）、２mM ｄＮＴＰｓ ８μｌを加え、滅菌水で１００μｌにする。９４℃で１０分間加熱し、 Ampli Taq（Perkin-Elmer-Cetus）１μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心する。ＰＣＲ反応は、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃１分間、伸長７２℃２分間の条件で３０サイクル行なった。次に新しい０．５mlチューブに１st ＰＣＲ反応終了液１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液９μｌを加え、２nd step プライマー２種（各７５ pmole）、１mM ｄＮＴＰｓ ９μｌ、滅菌水で１００μｌとする。９４℃で１０分間加熱し、Ampli Taq １μｌ（５単位）を加え撹拌後、ミネラルオイルを重層し軽く遠心し、先の条件で２nd ＰＣＲを行なう。反応後、反応液１０μｌをアガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を検出した。
【００６２】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片Ｃ１４−８（約７００bp）を低融点アガロース電気泳動により単離し、滅菌水２００μｌを加え、６８℃１５分間ゲルを溶解させた。ＴＥバッファー［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、１mM EDTA ］飽和フェノールで２回抽出操作を行ない、ＤＮＡ断片が溶解している水層をエタノール沈殿した。沈殿物に１０×キナーゼバッファー（0.5M Tris-HCl pH7.6 、0.1M MgCl2 、50mM DTT、１mMスペルミジン、１mM EDTA pH 8.0）２μｌ、10mM ATP 1μｌ、Ｔ4 キナーゼ（宝酒造）１μｌ（１０単位／μｌ）を加え滅菌水で２０μｌとし、３７℃１時間反応し、５’末端のリン酸化を行なう。６８℃１０分間加熱し、キナーゼを失活させた後ｐＢＭ（平成４年７月１０日出願の特願平４−２０７３９１号）との連結反応を行なう。ｐＢＭ（１μｇ）は制限酵素反応液２０μｌ（10mM Tris-HCl pH8.0 、7mM MgCl2 、20mM KCl、１０単位のＳｍａＩ酵素（宝酒造））中で３７℃１時間反応し、６８℃１０分間加熱した後、滅菌水８０μｌを加え、ＳｍａＩクローニングベクターとする。リン酸化されたＤＮＡ断片１０μｌとＳｍａＩベクター２μｌを１０×バッファー（0.66M Tris-HCl pH7.6、50mM MgCl2 、50mM DTT）２μｌ、10mM ATT １μｌ、Ｔ4 リガーゼ（宝酒造）１μｌ（３５０単位／μｌ）、滅菌水４μｌを加え、２０μｌとし、１６℃で一晩連結反応を行なった。
【００６３】
ｐＢＭの作製は次に示す手順で行なった。すなわち、ｐＢＲ３２２（Sutchliffe, J. G., Cold Spring Harbor Symposium, 43, 77-90 (1979) ）の制限酵素ＥｃｏＲ ＶサイトからＢａｌ Ｉサイトの間の配列を制限酵素で欠失させ、ＥｃｏＲ ＩサイトとＨｉｎｄ IIIサイト間にｐＵＣ１１９（Vieria, J., Messing, J., Methods in Enzymology, 153, 3-11(1987) ）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲ ＩサイトからＨｉｎｄ IIIサイトまでを組み込み（ΔｐＢＲ Ｍｃｓ）、次にｐＢＲ３２２のＶｓｐ ＩサイトからＳｃａ Ｉサイトの間の配列をｐＵＣ１１９のＶｓｐ ＩサイトからＳｃａ Ｉサイト間の配列に置き換え、この間のＰｓｔ Ｉサイトを欠失させて全長３１２２ｂｐのｐＢＭベクターを作製した。
【００６４】
次に、上記連結反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、ハナハンの方法［DNA cloning : A practical approach, IRC Press (1985)］により作られる。
【００６５】
形質転換大腸菌を２％ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）５０μｌと１００mM ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１０μｌが塗布されたＬＢ−Ａｍｐプレート［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、アンピシリン（５０μｇ／ml）］上で３７℃一晩培養した。プレート上に生じたコロニーの中で白色を呈するコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に移し、一晩３７℃で振盪培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを反応液３０μｌ（100mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl 、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造）およびＨｉｎｄ III（宝酒造）酵素）中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動を行なって挿入ＤＮＡ断片の大きさを計算する。約７００bpの挿入ＤＮＡ断片が検出されるクローンをｐＳ１４−ＮＳ３と命名した。得られたクローンをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終止法［Sanger, F. Science, 214, 1205〜1210 (1981) ］を用いて、挿入Ｃ１４−８ ＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。尚、Ｃ１４−８断片の配列は配列番号９に示した。
【００６６】
Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ断片を得るために、さらにＰＣＲ反応を行なった。用いたプライマーは、５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴ−３’と５’−ＴＣＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡである。ＰＣＲ反応は１ｎｇのＣ１４−８ＤＮＡを鋳型に５０ｐｍｏｌの上記プライマー、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．８），１６．６ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．２ｍｇ／ｍｌゼラチン、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００となるよう反応液を混合し（全反応液量５０μｌ）、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、パラフィンオイルを重層させた後、９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、１２０秒の条件で３０サイクル反応を行なった。反応液をアガロース電気泳動にかけ約２６０bpの断片を分離した。分離した断片をガラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ II，ＢＩＯ１０１社）により５０μｌのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ］に回収した。この回収したＤＮＡ溶液２５μｌに３μｌの１０×Ｔ４バッファー［０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭ ＤＴＴ］と３μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、３μｌのＡＴＰを加え、５ＵのＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）、１０ＵのＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応液からガラスパウダー法によりＤＮＡ断片２５μｌのＴＥ溶液に回収した。
【００６７】
一方１μｇのｐＵＣ１１８［Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３，ｐｐ３−１１（１９８７）］を２０μｌの反応液系［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２０ｍＭ ＫＣｌ，１０Ｕ ＳｍａＩ］で３７℃１時間反応させることにより切断した。この反応液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０μｌ、滅菌水を７０μｌ、２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造）を加え６８℃において３０分間反応させた。反応終了後ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合液により溶液を抽出した後、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを１０μｌのＴＥ溶液に溶解した後、１μｌを用い回収したＰＣＲ断片１０μｌと共に混合し、ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａ液５０μｌとｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂ液１０μｌ（ＤＮＡライゲーションキット、宝酒造）を加え、良く混合した後１６℃１時間反応を行なわせた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨａｎａｈａｎの方法［ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ１０９−，ＩＲＣ ｐｒｅｓｓ，（１８８５）］に従って形質転換させた。
【００６８】
得られたクローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、調製した組換え体プラスミドＤＮＡ約１．５μｇをＭ１３ＲＰ１プライマー（アプライドバイオシステム社）または−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応させ、反応産物をＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７０Ａ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３０、アプライドバイオシステム社）を用いて分析し塩基配列を決定した（配列番号：８参照）。Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ断片は配列番号：４に示されるアミノ酸配列をもつペプチドをコードすることが分かった。
【００６９】
発現プラスミドの構築：
ｐＵＣ・Ｃ１４−２−２ ＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液［50mM Tris-HCl (pH7.5) 、100mM NaCl、7mM MgCl2 、１０単位のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ（宝酒造）］２０μｌ中で、３７℃１時間消化反応し、アガロース電気泳動により分離しガラスパウダー法により調製する。次に発現ベクターであるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ（特開平１−２１５２８９号）のＤＮＡ１μｇを同様の反応液中で３７℃１時間消化し、アガロース電気泳動により分離しガラスパウダー法により調製する。得られたＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のＣ１４−２−２ ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用い、メーカーの推奨する方法により１６℃で１時間保温し、連結反応を行なった。
【００７０】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は、ハナハンの方法［前掲］により作られる。形質転換大腸菌を５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレート（１％トリプトン、０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを一白金耳取り、５０μｇ／mlアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法（Maniatisら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 1982 ）により行なった。
【００７１】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで二重消化し、アガロース電気泳動を行なって、約２６０bpのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片が生じるｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ Ｃ１４−２−２発現プラスミドを選別した。
【００７２】
実施例 ４
Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２、Ｃ１４−２−１およびＣ１４−２−２ ＤＮＡによってコードされるペプチド類の発現及び精製：
上記実施例１〜３で作製した５種類の各発現プラスミドを有する大腸菌Ｃ６００を５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地４０mlに接種し、３７℃で一晩培養する。この培養液５０mlを５０μｇ／mlのアンピシリンを含む４ｌのＭ９−ＣＡ培地（0.6 ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ， 0.5％ ＫＨ2 ＰＯ4 ， 0.5％ ＮａＣｌ， 0.1％ ＮＨ4 Ｃｌ， 0.1mM ＣａＣｌ2 ，２mM ＭｇＳＯ4 ， 0.5％カザミノ酸， 0.2％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ600 ＝０．３のときに終濃度４０mg／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離し、約１２ｇの菌体を集めた。得られた菌体に溶菌バッファー［50mM Tris-HCl (pH8.0) 、30mM NaCl, 5mM EDTA ］６０mlを加え懸濁し、リゾチーム（生化学工業）１２mgを加え３７℃で１時間反応させた。超音波破砕１５０秒により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離１５０００ rpm、１５分間、４℃で行ない、目的のＤＮＡによってコードされるペプチドとｔｒｐＥの融合ペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に可溶化バッファー［４Ｍ尿素、50mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1% NP-40 ］を５５ml加えて、融合ペプチドを可溶化抽出した。
【００７３】
可溶化した抽出物に尿素、ＤＴＴをそれぞれ終濃度６Ｍ、５０ｍＭとなるように加え、４℃１時間以上おいた後に、６Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ファルマシア社）カラムにかけた。０Ｍから０．２ＭのＮａＣｌの濃度勾配をかけることにより目的ペプチドをカラムから溶出させた。溶出分画を集め、６Ｍ尿素、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラム（ファルマシア社）にかけることにより、融合ペプチドを精製した。得られた融合ペプチドは、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１（Ｍｒ約８ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２（Ｍｒ約１１ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２（Ｍｒ約１０ｋＤａ）、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１（Ｍｒ約６ｋＤａ）およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２（Ｍｒ約１１ｋＤａ）である。
【００７４】
実施例 ５
Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２ペプチド断片の調製
ペプチドは Applied Biosystems Peptide Synthesizer モデル 430Ａ（Applied Biosystems）を用い、Fast Moc system のプロトコールにしたがい合成した。合成終了後、常法にしたがって脱保護、脱樹脂を行ない、ＨＰＬＣで精製した。
【００７５】
目的のピークと思われるものを分取し、アミノ酸分析機（日本電子、ＪＬＣ−３００）でアミノ酸含有量を調べるか、あるいは Protein Sequencer（Applied Biosystemsモデル 477Ａ）でアミノ酸配列の確認を行なった。
【００７６】
実施例 ６ Ｃ型肝炎患者血清中のＨＣＶ抗体の測定
（ｉ）ウェスタンブロット法によるＨＣＶ抗体の検出：
発現ペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−２ １μｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)］に掛けた後、常法に従ってニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にブロッティングした。このフィルターを、ブロッキング液［４％ブロックエース（雪印）、２％ＢＳＡ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）］で室温、１時間静置後、正常人血清およびＣ型肝炎患者血清を１００倍希釈液で室温で１時間反応させる。洗浄液［20mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl, 0.05% Tween-20 ］で洗った後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗体）を、１０００倍希釈で室温３０分間反応させた。再びフィルターを洗浄し、基質であるジアミノベンチジン溶液に浸し、発色を確認後、純水に浸して反応を停止した。図３に示したように、正常人血清に対しては全く反応していないが、患者血清に対しては強く反応し、特異的なバンドとして検出された。
【００７７】
（ii）酵素抗体測定法（ＥＬＩＳＡ法）によるＨＣＶのグルーピング（その１）：
慢性期にある種々の日本人Ｃ型肝炎患者血清を、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−１およびｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２融合ペプチドを用いてＥＬＩＳＡ法によりＨＣＶのグルーピング判定を行なった。ＥＬＩＳＡ法は、常法を用いて行ない、精製抗原を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７．５）で５μｇ／mlの濃度に希釈し、４℃あるいは室温でマイクロプレートに固定する。洗浄液で数回洗浄後、希釈被検血清を加え、３０℃あるいは室温で１時間インキュベートする。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え、３０℃あるいは室温で反応させる。更に数回洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン溶液を５０μｌ加え、３７℃で発色させる。２Ｍ Ｈ2 ＳＯ4 で発色を停止させ、比色計で４９２ｎｍの吸光度測定を行なった。なお、対照として正常人血清、また比較として市販のカイロン社キットＣ１００−３（オルソ社）を用いて同時に測定した。結果を表１、表２、表３及び表４に示す。
【００７８】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００８２】
（iii ）ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶのグルーピング（その２）：
慢性期にある種々の日本人Ｃ型肝炎患者血清を、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２、実施例５で調製したＣ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２のペプチド断片：１−Ｙ、１−Ｚ、１−Ｂ、２−Ｙ、２−Ｂ、２−Ｚを用いてＥＬＩＳＡ法によりＨＣＶのグルーピング判定を行なった。
【００８３】
ｔｒｐＥ・Ｃ１４−１−２、ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２−２ペプチドを上記の様にプレートに固定した。検体２０μｌと実施例５で調製したペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを等量混和し、室温１時間静置した。これに検体希釈液を２００μｌ加えた後にペプチドを固定したプレートに加えた。３０℃１時間反応させた後、洗浄を行ない、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（マウスモノクローナル抗体）を加え３０℃１時間反応させた。洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、３０℃１時間反応させた後１Ｍ硫酸溶液を加えることにより反応を停止させ、比色計で４９２ｎｍの発色を測定した。
【００８４】
また、比較として市販のＨＣＶ感染診断薬Ｉｍｕｃｈｅｃｋ−ＨＣＶ（国際試薬（株）製）を使用して同様に測定を行なった。結果を表５、表６および表７に示す。
【００８５】
【表５】
【表６】
【表７】
【００８８】
（iv）ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶのグルーピング（その３）
実施例５で調製したペプチドをマイクロプレートに固定した。そこに検体を加え、前記の方法により反応を行なわせ、反応停止後、比色計で４９２ｎｍの発色を測定した。結果を表８に示す。それぞれのペプチドによりグルーピングを行なうことができることは明らかである。しかし各ペプチドとの反応は、ある検体においてはＺのみであり、ある検体においてはＹのみである。このことからグルーピングに用いるペプチドは、実施例５で調製したペプチドを組み合わせたもの、あるいはつなげたものであることが望ましい。
【００８９】
【表８】
キットの作成
精製した抗原を５μｇ／ｍｌとなるように８Ｍ尿素を含む燐酸緩衝液に希釈する。希釈液をグループごとに別々のマルチプレートに、ウェルあたり１００μｌ加え、４℃にて一夜静置する。液を捨てウェルあたり３００μｌのブロッキング液を加え、室温において２時間静置する。液を捨て洗浄液でウェルを洗浄した後、マルチプレートを凍結乾燥させる。凍結乾燥させたプレートをグループごとに異なる袋に入れ、シールし、キットの箱に入れ、４℃において保存する。キットにはさらにグループ特異的な反応が確認されているグループＩ、グループＩＩに対応する陽性血清、検体血清を希釈するために希釈液、洗浄液、酵素標識抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体、発色液を適当な瓶などの容器に別々に入れた状態で箱に入れる。また取り扱い説明書もキットに添付する。
【００９０】
実施例 ８
インターフェロン（ＩＦＮ）治療効果とＲＴ−ＰＣＲ法によるグルーピングの相関
グループＩＩを特異的に検出可能なプライマー及びグループＩに特異的なプライマーを設定しＩＦＮの治療効果とＰＣＲによるグルーピングの相関をみた。
【００９１】
Ｃ型肝炎患者血漿１００μｌに６ＭのＧＴＣ液（６Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．２Ｍメルカプトエタノール）３００μｌを加え撹拌する。さらに４０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、４００μｌフェノール、８０μｌクロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）を加えよく撹拌する。水溶液層をとりイソプロピルアルコールを加え、これを遠心し、沈澱を得る。これをＲＮＡとしてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成はTris−HCl 10mM、ゼラチン0.01％、 dNTP 各１mM、MgCl2 4mM, DTT 1mM、プライマー100 pmole の反応液に RNaseインヒビター、逆転写酵素を加え、３７℃２時間反応して行った。このｃＤＮＡを用い２ステップ法ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、ｃＤＮＡを含む反応液 100μｌに Tris-HCl 10mM，ゼラチン0.01％ dNTP 各２mM, MgCl2 1.5mM，プライマー各50pmole を加え、アンプリフィケーションサイクルは変性９４℃、１．５分、アニーリング５０℃、２分、伸長７０℃、２分の条件で３５サイクル行った。いくつかのプライマーを検討した結果以下の４種のプライマーを用いるとグループＩＩに特異的なＤＮＡ断片が検出可能となった。
【００９２】
ｌｓｔ ｓｔｅｐ ＰＣＲ
ＫＫ２１：５’−ＧＧＡＴＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡ−３’
ＫＫ２２：５’−ＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡ−３’
２ｎｄ ｓｔｅｐ ＰＣＲ
ＫＫ２６：５’−ＧＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡ−３’
ＫＫ２７：５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ−３’
この４種のプライマーを用いたＰＣＲで２０６塩基対のＤＮＡ断片が検出される。以下の４種のプライマーを用いることによりグループＩに特異的なＤＮＡ断片が検出可能である。
【００９３】
ｌｓｔ ＰＣＲ
ＫＫ１：ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ−３’
ＫＫ２：ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＴＡ−３’
２ｎｄ ＰＣＲ
ＫＫ５：ＧＡＴＣＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＴＧ−３’
ＫＫ８：ＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’
これらのプライマーで１５３塩基対のＤＮＡ断片が検出される。
【００９４】
表９に示すように、著効９例につき７８％がグループＩＩ、２２％がグループＩであり、ＩＦＮ治療効果を示す患者は主としてグループＩＩに属することが確められた。
【００９５】
【表９】
【発明の効果】
本発明の抗原性ペプチドおよび該ペプチドからなるキットは、Ｃ型肝炎患者がＨＣＶのグループＩおよびグループＩＩのどちらに感染しているかを判定し得ると共に、グループＩとグループＩＩの両方に感染（所謂、重感染）しているケースの判定にも有効に使用し得る利点をもつ。患者がＨＣＶグループＩＩに感染していると判定された場合には、抗ウイルス剤であるＩＦＮ治療がＨＣＶグループＩＩに対し著効であるという事実に鑑みて、該患者に対し迅速かつ有効なＩＦＮ治療を実施することが可能である。また、本発明のペプチドおよびキットはＨＣＶ感染の確認にも有用である。
【００９７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の長さ：８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の長さ：６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の長さ：８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の長さ：１８９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列の長さ：２６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列の長さ：１８９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列の長さ：２６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列の長さ：６６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、Ｃ１４−１、Ｃ１４−１−２、Ｃ１４−２およびＣ１４−２−２抗原性ペプチドのアミノ酸配列、並びにＨＣＶグルーピングに有効なペプチド断片（太線）検索のためのエピトープマッピングを示す。図中、星印(*) はＣ１４−１とＣ１４−１−２の間のおよび、Ｃ１４−２とＣ１４−２−２の間の相同アミノ酸を表わす。
【図２】この図は、Ｃ１４−２発現ベクターｐＡＴ・ｔｒｐ・ｔｒｐＥ・Ｃ１４−２の構築手順を示す。
【図３】この図は、発現ペプチドｔｒｐＥ・Ｃ１４−２とＣ型肝炎患者血清（右レーン）との抗原抗体反応を示す電気泳動（ウェスタンブロット）写真である。左レーンはコントロール（正常人血清）である。
Claims (7)
- Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：１もしくは配列番号：２に示されるアミノ酸配列、それらの部分配列を有する抗原性ペプチド類または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの抗原性ペプチドを、Ｃ型肝炎ウイルス抗体を含むと推定される検体と接触させて免疫学的反応を行ない、グループＩに属するＣ型肝炎ウイルスを陽性として検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法。
- Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る配列番号：３もしくは配列番号：４に示されるアミノ酸配列、それらの部分配列を有する抗原性ペプチド類または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの抗原性ペプチドを、Ｃ型肝炎ウイルス抗体を含むと推定される検体と接触させて免疫学的反応を行ない、グループＩＩに属するＣ型肝炎ウイルスを陽性として検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法。
- Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはそれらの部分配列を有する抗原性ペプチド類、または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチド、並びに、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列またはそれらの部分配列を有する抗原性ペプチド類、または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドの各々を、Ｃ型肝炎ウイルス抗体を含むと推定される検体と別個に接触させて免疫学的反応により検体中の該ウイルス抗体を定性的または定量的に測定し、グループＩまたはグループＩＩに属する該ウイルス抗体を検出することからなる、Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピング方法。
- Ｃ型肝炎ウイルスのグループＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：１または配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはそれらの部分配列を有する抗原性ペプチド類、または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第１抗原性ペプチドと、該ウイルスのグループＩＩ抗体と特異的に反応し得る、配列番号：３または配列番号：４に示されるアミノ酸配列またはそれらの部分配列を有する抗原性ペプチド類、または同じ機能をもつ該ペプチド類の変異体から選択される少なくとも１つの第２抗原性ペプチドとをそれぞれ異なる区画に含んでなる、請求項３に記載のグルーピング方法に使用するためのキット。
- 前記部分配列が、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２もしくはその組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２、５３〜７４もしくはその組み合わせ、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２もしくはその組み合わせ、配列番号：４に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２、５３〜７４もしくはその組み合わせから成る配列である、請求項４に記載のキット。
- 前記部分配列が、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２もしくはその組み合わせ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２、５３〜７４もしくはその組み合わせからなる配列である請求項１に記載のグルーピング方法に用いる抗原性ペプチド。
- 前記部分配列が、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２もしくはその組み合わせ、配列番号：４に示されるアミノ酸配列中アミノ酸位置２０〜４４、３７〜６２、５３〜７４もしくはその組み合わせからなる配列である請求項２に記載のグルーピング方法に用いる抗原性ペプチド。
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| JP19418593A Expired - Lifetime JP3669717B2 (ja) | 1992-07-16 | 1993-07-09 | Ｃ型肝炎ウイルスのグルーピングのための抗原性ペプチド、それを含有するキットおよびそれを使用するグルーピング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3669717B2 (ja) |
| TW (1) | TW369600B (ja) |
-
1993
- 1993-07-09 JP JP19418593A patent/JP3669717B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-16 TW TW082105684A patent/TW369600B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07133292A (ja) | 1995-05-23 |
| TW369600B (en) | 1999-09-11 |
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