JPH06507552A

JPH06507552A - 肝炎疾患の診断において有用なｄｎａ配列及びコードされたポリペプチド

Info

Publication number: JPH06507552A
Application number: JP5513494A
Authority: JP
Inventors: ライアン，テレンス，イー; サイード，バドル; キーゼルバーグ，マーク，ケー; バイルン，ロバート，イー; スティーヴンス，プリシラ，ウィルキンス; 暉勝有馬; トッド，ジョン，エー
Original assignee: デイド、ベーリング、インコーポレイテッド
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-03
Publication date: 1994-09-01
Also published as: EP0578817A1; CA2107363A1; US5437974A; AU3606093A; WO1993015111A1; CN1080957A; AU665408B2; EP0578817A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１８、前記ホスト細胞が真核細胞である、請求項１６に記載のポスト細胞。

１９、配列表において配列番号二６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドの製造のための方法であって、請求項１６に記載の形質転換されたホスト細胞を前記ポリペプチドの発現に適した条件下に培養し、そして該ポリペプチドを回収することよりなるものである方法。

２０、配列表において配列番号６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、前記ポリペプチドの化学合成よりなるものである方法。

２１、ＮＡＮＢＨを診断する方法であって、患者からの血清を、配列表において配列番号二６によって定義された該ポリペプチドの診断的有用性を有するポリペプチドと接触させ、そして前記血清が前記ポリペプチドと免疫反応する成分を含有するか否かを判定することよりなるものである方法。

２２、　輸血用の血液をスクリーニングする方法であって、前記血液から血清を単離し、該血清を、配列表において配列番号二６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドと接触させ、該血清が該ポリペプチドと免疫反応する成分を含むが否かを判定し、そして該判定に基づいて前記血液の分類及び処理を行うことよりなるものである方法。

２３、人の身体成分中のＮＡＮＢＨ因子のゲノムの存在を検出するための方法であって、前記ヒトの身体成分の増幅させた又は増幅させていない核酸を、請求項５に記載の核酸を含んでなるプローブと、該プローブ及び前記ゲノムのハイブリダイゼーションを促進する条件下に接触させ、そして該プローブが該ヒトの身体成分の該核酸にハイブリダイゼーションするか否かを判定することよりなるものである方法。

２４、ＮＡＮＢＨの予防、改善又は治療のためのワクチンであって、配列表において配列番号＝６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体よりなるものであるワクチン。

２５、　精製され及び単離されたポリペプチドであって、抗体の抗原結合部位を含んでなり、該抗原結合部位が、配列表において配列番号＝６によって定義された該ポリペプチド中のＮＡＮＢＨ診断的エピトープに実質的に類似のエピトープに特異性を有するものである、ポリペプチド。

２６、　前記ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のポリペプチド。

２７、ＮＡＮＢＨに対する受身免疫のための組成物であって、請求項２４に記載のポリペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体を含んでなるものである組成物。

明細書肝炎疾患の診断において有用なりＮＡ配列及びコードされたポリペプチド発明の分野本発明は、ＤＮＡ配列及びコードされたポリペプチドに関し、ここに該コードされたポリペプチドは、非Ａ非Ｂ肝炎を有する特定の患者中の抗体によって特異的に認識される抗原を表す。より詳しくは、本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスのゲノム中に表されていない核酸配列及びコードされたポリペプチドに関する。本発明の核酸及びコードされたポリペプチドは、非Ａ非Ｂ肝炎についての種々のアッセイにおいて有用であろう。

発明の背景Ａ型肝炎ウィルス及びＢ型肝炎のウィルスだめの特異的な且つ鋭敏な免疫診断的アッセイの開発は、非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ又はＮＡＮＢ肝炎）として集合的に知られていた数種の症候群の同定をもたらした（Ｆｉｅｌｄｓ及びＫｎｉｐｅ編、ＶｉｒｏｌｏｇＹ、第２版、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｒａｖａｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、　２２３９−７３．１９９０におけるｎｏｎ−Ａ　ｎｏｎ−Ｂ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓにおいて、ｌ（ｏｌｌｉｎｇｅｒによる概説されている）。一つの症候群は、輸血又は他の経皮膚的事由に明確に関連づけられており、非Ａ非Ｂ輸血後肝炎（ＮＡＮＢＰＴＨ）と名付けられた。もう一つの症候群は、疫学的に糞−口汚染と関係づけられており、腸性非Ａ非Ｂ肝炎として知られている。第３の症候群は、これについては感染事由は確認されていないが、散発性ＮＡＮＢＨとして分類されている。分子ウィルス学における技術の適用は、ＮＡＮＢＰＴＨに関連した新しいウィルス性因子（Ｃ型肝炎ウィルス）を同定しくＫｕｏ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：　３６２　（１９８９））、並びに腸性ＮＡＮＢＨに関連した新しいウィルス性因子（Ｅ型肝炎ウィルス）を同定する（Ｒｅｙｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：　１３３　（１９９０））のに役立った。

ＮＡＮＢＰＴＨの伝染に関連ありとされた、濃縮された血液製品又は血漿からのウィルス様粒子の生物物理学的及び生化学的特徴づけがなされた。これらの研究は、その感染力が有機溶媒による処理によって除去されるものである、エンベロープを有する２５乃至４０ｎｍの直径ウィルス様粒子も、別個に又は上述のエンベロープを有する粒子と関連して、観察された（Ｂｒａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９７９））。交叉チャレンジ試験は、１種より多くのタイプのウィルス性因子がＮＡＭＢＰＴＨを引き起こし得るということを示唆するものと解釈できる（Ｂｒａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　６：　１８５　（１９８０）；　ＨｏｌｌｉｎｇｅｒＮＡＮＢＰＴＨに感染したチノパンツー及びヒトの血漿中に見出されたＲＮＡの分子的クローニングは、エンベロープを有するフラビウイルス又はペスチウイルスのそれに類似した構成を有する（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄＰｕｒｃｅｌｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　２０５７　（１９９０））　、約ｌＯキロ塩基対のウィルスゲノムの存在を示した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５　（１９８８）；　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ヨーロッパ特許出願第９０３０２８６６．０　（１９９０）：　有為及び深井、ヨーロッパ（＋９８９）　、岡本等、Ｊａｐａｎ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　６０：　１６７　（１９９０）；　Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａイルスタイブは、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と名づけられ、そのコードされたタンパク質に対する抗体は、最終的にＮＡＮＢＰＴＨ患者の約６０乃至８０％に見出された（Ａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２１：　ＩＮＡＮＢＰＴＨの原因の一つとして明確に実証する、コツホの要請に一致する感染力のデータは、得られなかった。しかしながら、多くのＮＡＮＢＰＴＨ例はＨＣＶによる感染に関連している、という相関的な議論を行うことができる。

ＮＡＮＢＮＰＴ）Ｉのための強力な診断的マーカーの一つとして、ＨＣＶは広く受け入れられてはいるものの、他のウィルス性因子がこの症候群を引き起こし得るか否か、及び散発性ＮＡＮＢＨとして同定された症例においてＨＣＶが如何なる役割を演じているか、については依然明らかでない。本発明者の一人（Ｔ、　Ａ、）を含む数人の研究者が、ＮＡＮＢＰＴＨ患者からの血清と反応性である、ＨＣＶ及びその変異体の既知の配列に表されていないポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を同定した〔有為等、　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　Ｊｐｎ、、　２４：　５４０　（１９８９）；　有為等、釦ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　Ｊｐｎ、、　２４：　５４５　（１９８９）；　有為等、　Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ。

ｇｙ　Ｊｐｎ、、　２４：　６８５　（１９８９）；有為等、　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　Ｊ　ｎ、、　２５：　２１８　（１９９０）：有為及び深井、ヨーロッパ特許出願第８９３０９２６１．９　（１９８９）〕。これらのｃＤＮＡは、見たところヒトのゲノムによってはコードされておらず、従って、肝炎疾患状態に対するホスト特異的な応答ではない。診断におけるそれらの有用性が確立されたものの、それらの源及び該疾患過程との関係は、はっきりしないままである。

発明の概要本出願人は、ＮＡＮＢＨ患者の血漿画分から核酸を調製した。物理的及び化学的手順により、これらの両分のウィルス及びウィルス様粒子を濃厚化した。抽出した核酸を、二本鎖の相補的ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）へと変換し、バクテリオファージλの誘導体中に導入した。ＮＡＮＢＨ患者からの組換えＤＮＡを含むこれらの λファージを、次いで、ＮＡＮＢ）Ｉ患者の血液中に含まれる抗体と反応性である組換えコード化タンパク質の産生の有無についてスクリーニングした。

−の組換えファージ（２０Ｅと命名した）が、ＮＡＮＢ肝炎患者から得られた特定の血清と特異的に反応するポリペプチド配列をコードする組換えＤＮＡ挿入体を含むことが見出された。このポリペプチド抗原は、数人のＮＡＮＢ肝炎患者の血液中の抗体を検出し、この疾患の検出及びスクリーニングにおいて有用性を有するように思われる。クローン２０Ｂのヌクレオチド配列及びそのコードされたポリペプチドは、殆どのＮＡＮＢ肝炎症例を引き起こすと考えられているウィルス、すなわちＨＣＶ、とは関係づけられいない。加えて、クローン２０Ｂの配列は、ヒト染色体のＤＮＡ内には含まれていないように見える。この後者の結果は、クローン２０Ｅが、ＮＡＮＢ肝炎に関連したＣ型肝炎ウィルス以外の外部の感染因子のゲノム内に含まれているということを示唆しており、従って、ヒト患者におけるＮＡＮＢ肝炎の発生の更なる病因的因子又は寄与因子を表しているものであろう。

本発明の他の面においては、本出願人は、患者サンプル中の抗２０Ｅポリペプチド抗体及び２０Ｂ関連核酸のための、種々の免疫診断的及びプローブアッセイを記述している。問題の２０Ｅポリペプチドは、適合性のホスト細胞中における、組換えバクテリオファージ又は組換えプラスミドベクターの発現によって、又は化学的合成によって、製造される。クローン２０巳によって表される因子に対する防護のためのワクチンは、２０Ｂポリペプチド中に表された免疫診断的エピトープの一つ又はより多くを含む組成物として処方される。更に、２０Ｅポリペプチドの免疫診断的エピトープの一つ又はより多くに対して向けられたポリクローナル及びモノクローナル抗体は、当業者に知られた方法を用いて容易に製造することができる。そのような抗体、又はその活性のフラグメントは、クローン２０Ｅによって表される因子に対する受動免疫性薬剤として有用である。加えて、本発明において記述されたＤＮＡ配列に並ぶＤＮＡ配列は、ＮＡＮＢＨ及び他の疾患の診断において有用性を有するであろう。クローン２０Ｂの配列は与えられており、これらの追加の配列は標準的技術を使用して容易に単離できる。

図面の簡単な説明図１：（Ａ）　野性型のλｇｔ１１クローン２０Ｅに感染させたＥ、　Ｃｏ１１を含む細菌学的プレートから持ち上げそしてＮＡＮＢ肝炎にかかっている患者からのプールした血漿と反応させた膜。酸膜に結合した抗体は、色素原性酵素反応によって検出されており、暗い斑点を生じている。

（Ｂ）野性型のλｇｉｌｌに感染したＥ、　Ｃｏ１１を含む細菌学的プレートから持ち上げ、そして図１　（Ａ）に示されたのと同じ血漿と反応させた膜。

図２＝（Ａ）λｇｉｌｌファージクローン２０Ｅ中に見出された組換え挿入体のＤＮＡ配列。

（Ｂ）λｇｔｌｌファージクローン２０Ｅ中に見出された組換え挿入体の推定アミノ酸配列。

図３：（Ａ）ヒトのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子のエキソン１４のコンカテマー化された４５０塩基対フラグメントでプローブされた、Ｂａｍ旧消化ヒト胎盤ＤＮＡのサザンプロット。

（Ｂ）クローン２０Ｅ配列ＤＮＡを表すコンカテマー化された９０塩基対フラグメントでプローブされた、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　（レーン１　）　、ＥｃｏＲ［（ランド２）、及びＢａｍ旧消化（レーン３）ヒト胎盤ＤＮＡのサザンプロット。

この図（Ｂ）における該ＤＮＡは、同じゲル中において電気泳動され、図３（Ａ）におけるサンプルと同じ膜に移された。

図４＝（Ａ）　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、より入手した（ＮＡＮＢ肝炎）患者０２１９００からの連続的血清サンプルと反応させた、精製されたグルタチオン−３−）ランスフェラーゼ／クローン２０Ｅタンパク質のウェスタンプロット。アスタリスクは、ＥＬＩＳＡ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、）によって検出可能の抗ＨＣＶ抗体が最初に検出できるようになる採血を表す。

（Ｂ）上記の患者についての、精製されたグルタチオン−８−トランスフェラーゼ／クローン２０Ｅタンパク質に対するウェスタンプロット免疫反応性と、抗ＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、）の反応性との比較。

図５＝（Ａ）　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、より入手した（ＮＡＮＢ肝炎）患者２０８３０Ｄからの連続的血清サンプルと反応させた、精製されたグルタチオン−８−トランスフェラーゼ／クローン２０Ｂタンパク質に対するウェスタンプロット。アスタリスクは、ＥＬＩＳＡ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＩｎＣ，）によって検出可能の抗ＨＣＶ抗体が最初に検出できるようになる採血を表す。

（Ｂ）上記の患者についての、精製されたグルタチオン−３−トランスフェラーゼ／クローン２０Ｂタンパク質に対するウェスタンプロット免疫反応性と、抗ＨＣＶ　ＥＬ［ＳＡ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、）の反応性との比較。

図６＝（Ａ）　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　［ｎｃ、より入手した（ＮＡＮＢ肝炎）患者００２６９Ｂからの連続的血清サンプルと反応させた、精製されたグルタチオン−８−トランスフェラーゼ／クローン２０Ｅタンパク質のウェスタンプロット。アスタリスクは、ＥＬ［ＳＡ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、）によって検出可能の抗ＨＣＶ抗体が最初に検出できるようになる採血を表す。

（Ｂ）上記の患者についての、精製されたグルタチオン−３−）ランスフェラーゼ／クローン２０Ｂタンパク質に対するウェスタンプロット免疫反応性と、抗ＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ反応性（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｅｎｃ、　）との比較（Ｎ、Ｄ、　＝実施せず）。

好ましい具体例の詳細な説明ＮＡＮＢＨに対する診断的有用性を有し、且つ、いかなる他の記述されたＮＡＮＢＨ因子との検出可能な関係をも有しない核酸及びアミノ酸配列を表すポリペプチドがあれば、それは先行技術に対する有意な進歩を表すものであろう。そのようなポリペプチド、並びに対応する核酸は、ＮＡＮＢＨのための完全な予防的及び診断的療法を開発するために現在払われている努力において、大きな価値のあるものであろう。本発明は、そのようなポリペプチド及びその対応する核酸配列を包含する。

ＲＮＡを、ＮＡＮＢＨの臨床像を表している患者から得たプールした血漿単位から単離した。ポリエチレングリコール及び塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムの存在下における遠心によって、このプールされた血漿のウィルス及びウィルス様粒子を濃厚化した。得られたペレットからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと変換し、そのｃＤＮＡをファージ表現ベクターλｇｔｌｌのＥｃｏＲ［部位内ヘクローンした。この組換えバクテリオファージを、Ｅ、　Ｃｏ１１中における増殖によって増幅し、得られたライブラリーを、ＮＡＮＢＨ抗原の存在につき、ＮＡＮＢＨ患者の血漿から導かれた抗体調製物との反応によって免疫スクリーニングした。陽性のクローンｒ２０Ｅ　Ｊを、プラーク増幅及び免疫スクリーニングの連続した３サイクルによって、同定し精製した。

クローン２０ＥのｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列、並びに該挿入体によってコードされた推定アミノ酸配列（以下「２０Ｅポリペプチド」という。）を図２に示す。該ヌクレオチド配列と該アミノ酸配列のいずれも、科学文献又は種々の特許出願に報告されたＨＣＶのヌクレオチド配列に対する如何なる相同性をも示さない。同様に、クローン２０Ｅ　ＤＮＡ又はアミノ酸配列のいずれも、Ａ、Ｂ、又はＤ型肝炎ウィルスの入手しうる配列又は主要なデータベースにリストされているその他の如何なる配列とも、検出可能な相同性を示さない。最後に、クローン２０εのヌクレオチド配列は、制限酵素切断されたヒトゲノムＤＮＡのサザンプロットへのハイブリダイゼーションの欠如によって示されるところでは、ヒト染色体ＤＮＡ中に存しないように思われる。

従って、クローン２０Ｅは、ＮＡＮＢＨの臨床症状を示す患者中の抗体によって認識される一つ又はより多くのエピトープを有する新規のポジペプチドをコードする新規の核酸配列を表す。ヒトのゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションの欠如は、クローン２０Ｂの挿入体によって表された該核酸配列が、ＨＣＶ以外の外部の感染因子のゲノムの一部を表しているということを示唆している。そのようなものとして、該因子は、ヒトにおけるＮＡＮＢＨの発生へ追加の寄与因子を表すであろう。

２０Ｂポリペプチドの推定アミノ酸配列の長さくアミノ酸２６個）を考えると、一つより多くのＮＡＮＢＨ特異的エピトープが該ポリペプチド中に表されているということはありそうにない。２０Ｅポリペプチド中に表された該一つ又はより多くのエピトープの、潜在的可能性のある免疫診断的用途を更に研究するために、該挿入体を発現プラスミド中へサブクローンし、Ｅ、　Ｃｏ１１中でグルタチオン−３−）ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させた。該ＧＳＴＳクーーン２０Ｅ融合タンパク質を精製し、ウェスタンプロットによって、追加の対照及びＮＡＮＢＨ患者からの血清に対する免疫反応性について試験した。

ウェスタンプロット手順については、ポリアクリルアミドゲル中における電気泳動的サイズ分画に続いて、ＧＳＴ−クローン２０Ｅ融合タンパク質を固体支持体（フッ化ポリビニリデン膜）上に固定化した。結合させたタンパク質を、次いで、該固定化させたタンパク質に対する如何なる２０Ｂポリペプチド特異的（抗２０Ｅ）抗体の結合をも許容する条件下にて、試験血清と反応させた。抗２０Ｂ抗体の結合を、酵素標識シグナル抗体によって検出した。該シグナル抗体は、アルカリ性ホスファターゼを接合させたヤギ抗ヒトＩｇＧ　＋１ｇＭよりなるものであった。アルカリ性ホスファターゼの適当な色素原性基質との反応は、次いで、個々の患者試験サンプル中の抗２０Ｅ抗体の存在又は不存在の視覚的指標を提供した。この免疫診断的方式において、陽性試験は、固定化されたＧＳＴ−クローン２０Ｅ融合タンパク質とシグナル抗体との間に挟まれた、患者の抗２０Ｅポリペプチド抗体の存在を示す。抗２０Ｂポリペプチド抗体の不存在（陰性試験）においては、抗原抗体シグナル抗体複合体は形成されず、バックグラウンドを超える色素原性反応は検出されない。

以下に提示した実施例において示したように、２０Ｅポリペプチド中に表された該−の又はより多くのエピトープは、ＮＡＮＢＨに対する明白な診断的有用性を有する。すなわち、慢性ＮＡＮＢＨの患者の１５．５％及び他の形態のＮＡＮＢＨの患者（急性の、散発性の、及びドナーＮＡＮＢＨと関係づけられるものを含む）の２４．３％が、２０Ｅポリペプチドと反応する検出可能な抗体を有していた。対照的に、ランダムな供血者７１人中の１人（１，４％）のみが、そのような検出可能な抗２０Ｅ抗体を存していた。

抗２０εポリペプチド状態への患者の血清変化への時間的推移を決定するために、ウェスタンプロット・イムノアッセイ手順を、３人のＮＡＮＢＩ（患者の連続的採血を表す血清サンプルに対して追加的に適用した。これらの３つの血清パネルは、抗ＨＣＶ抗体についても、商業的に入手できるＨＣＶ　ＥＬ［ＳＡキットを用いて試験した。連続的採血パネルの各々は、抗ＨＣＶ状態への変化に相当する変化の日付を以て抗２０Ｅポリペプチド状態への血清変化を示した。相当はするものの、抗２０Ｂポリペプチド状態及び抗ＨＣＶ状態への変化の日付は、これら３つのパネルの２つにおいて同一ではなかった。

これらのイムノアッセイの結果は、ＮＡＮＢ肝炎疾患のための特異的な非ＨＣＶマーカーとしての、クローン２０Ｂ核酸及びポリペプチドの免疫学的有用性を明瞭に示している。従って、この２０Ｅポリペプチドは、ＮＡＮＢＨを診断する少なくとも１個のエピトープを有している。ここに開示した結果に基づいて、２０Ｂポリペプチドの一つ又はより多くのＮＡＮＢＨ診断エピトープの免疫診断的有用性は、供血者の一般的な集団からのランダムな供血者についてよりもＮＡＮＢＨ患者について少なくとも約１０倍大きいものであるある割合の個体からの血清との、検出可能な非ＨＣＶ免疫反応性として定義できる。抗２０Ｂ及び抗ＨＣＶ状態についての相当する血清変化パラメーターは、ＨＣＶ及びクローン２０Ｂによって表されるある感染因子の同時感染の可能性を示唆している。そこからクローン２０Ｂが単離されたものであるファージライブラリーを構成するために使用された血清プールは、完全にヒト起源のものであり、ＮＡＮＢＨ因子について特に濃厚化されたものとは知られていなかった。すなわち、そのヒト血清プールは、必ずしも［高力価Ｊ血清プールとして分類できるものではなかった。

対照的に、発現スクリーニングによりＨＣＶを最初に単離するために使用されたライブラリーは、実験的に感染させたチンパンジーの高力価血清より得られた。

Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　３５９　（１９８９）。

クローン２０Ｅが、ヒトに又は少なくとも専らチンパンジーだけに制限されたホスト領域を有するある因子から誘導され、それはＨＣＶを発見するために使用された方法によっては検出されなかった、という可能性がある。

この２０２ポリペプチドは、ポリペプチド標的を利用する如何なるイムノアッセイ方式においても有用であろう。そのような方式においては、この２０Ｂポリペプチド、該２０Ｂポリペプチドのフラグメント、又は融合タンパク質のような他の分子に結合した２０Ｂポリペプチド（又はそのフラグメント）は、常磁性微粒子のような固体のマトリックス上に被覆される。この固体のマトリックスへの該ポリペプチドの取り付けは、受動的又は共有結合的被覆方法によるものであってよい。抗２０Ｅポリペプチド抗体の存在下におけるインキュベーション段階に続いて、この結合した抗体２０Ｂポリペプチド複合体は、磁気的分離によって如何なる未反応の抗体からも分離される。

複合体形成した抗２０Ｅ抗体の検出は、ウェスタンプロット方式のために上述したように、アルカリ性ホスファターゼのような「シグナル」酵素を取り付けた抗ヒト抗体抗体との反応によって行うことができる。磁気的分離及び洗浄による該常磁性粒子上の該標識付きの複合体の分離に際して、シグナル発生基質を添加する。測定されるシグナルの量は、サンプル中に存在する抗２０Ｅ抗体の量に直接比例している。

更なる代わりの具体例においては、本発明の２０Ｅポリペプチドを、古典的な酵素免疫抗体法（ＥＬ［ＳＡ）におけるミクロタイタープレートウェルに被覆し、サンプルと共にインキュベートし、洗浄し、酵素を接合した抗ヒト抗血清を添加してもよい。ガラス繊維フィルターもまた、放射状分割クロマトグラフィ一方式における固体基質として利用できる。検出は、慣用的には、適当な基質／色素原を添加しそして得られる生成物を測定することによって実施される。ＥＬＩＳＡの一般的議論については、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｐ、　８４　（１９８２）中のＬａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｐａｒｔ　Ｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを参照のこと。

本発明のポリペプチドに適用できる更なる代わりのアッセイ方式％式％：４３５０　（１９７９）に参照されているウェスタンプロットＷａｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、。

ＦＩＡが無制限に含む。

従って、２０Ｂポリペプチド及びそのフラグメントはまた、ＮＡＮＢＨの予防、改善又は治療のためのワクチンとしての潜在的有用性を有する。下記の実施例４及び５に記述したように、２０Ｅポリペプチドによって表される該一つの又はより多くのエピトープは、特定のＮＡＮＢＨ患者の血清中に存在する抗体と反応することが示された。従って、２０Ｅポリペプチド又はそのフラグメントは、もし必要なら適当ているヒトにおいてＮＡＮＢＨ特異的免疫応答を生じるであろう。

２０Ｉｌ！ポリペプチド又は適当なフラグメントは、単離されたポリペプチドとして又は融合タンパク質の構成成分として、組換えベクターより発現され、又は化学合成により製造することができる。該ポリペプチド又は融合タンパク質は、当業者に知られた薬剤学的に許容できる担体（例えば上記、Ｇｏｌｕｂを参照）に入れて、２０Ｂポリペプチドにより表された病因的因子に対して向けられた免疫応答を誘導するために、ヒトに投与できる。

該２０Ｅポリペプチドはまた、既知の手順を使用して、受身免疫化　。

療法の成分として機能することのできる材料を産生ずるためにも使用できる。例えば、２０Ｂポリペプチド又はそのフラグメントは、２０日ポリペプチドによって表される因子に対して向けられたポリクローナルな又はモノクローナルな抗体を創り出すのに用いることができる。そのような抗体又はその免疫反応性の部分は、薬剤学的に許容できる担体に入れて患者の血流中に直接注射することによって、２０Ｂ因子に対する免疫を与えるために使用できる。受身免疫の原理は、注入された抗体が、患者の内因性の免疫システムとは独立に、病原性因子と結合してその不活性化及び除去を促進するということにある。受身免疫は、少なくとも広い範囲の病原因子に対する一時的な免疫を付与するのに有効であることが見出されている。例えば、モノクローナル抗体による受身免疫は、数種のフラビウイルスに対する抵抗を付与した（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（Ｌ、　Ｌａ５ｋｅｙ編）、　ｐ、１１−２０　（１９８８））。

同様に、ポリクローナルな抗体による受身免疫は、猿の免疫不全ウィルス及び２型ヒト免疫不全ウイルスに対する抵抗を付与した（Ｐｕｔｋｏｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３５２：　４３６　（１９９１））。

ポリペプチド出発材料によってポリクローナル及びモノクローナルな抗体を製造するための方法は、科学文献において十分に確立されている。例えば、２０Ｂポリペプチドで免疫された被験者のイムノグロブリン画分は、固相に結合した２０Ｂポリペプチドを含むカラム上においてアフィニティー精製できる。これは、２０Ｂポリペプチドに対して向けられたポリクローナルな抗体の精製された調製物を提供するであろう。同様に、２０Ｅポリペプチドは、２０Ｂポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を創り出すめに使用することができる。そのようなハイブリドーマは、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：　１２８１　（１９８６）に記述された周知の方法を用いて創り出し、そして分泌されたモノクローナル抗体を単離、精製することができる。

クローン２０Ｅの開示された核酸配列はまた、核酸標的を利用する種々のアッセイ方式において有用であろう。クローン２０Ｂの核酸配列は、例えば、患者の血清又は組織中の２０Ｅ関連核酸の存在を検出するためのプローブとして使用することができる。クローン２０［Ｅ配列又はそのフラグメントを、適当な放射性標識（例えば、′２Ｐ）又は適当な非放射性標識（例えば、ビオチン）で標識し、そして患者の血清又は体液からの、増幅した又は増幅していない核酸とハイブリダイゼーションさせる。患者の血清又は身体組織中の核酸の増幅のためには、当業者に知られた如何なる増幅システムも使用できる。例えば、開示されたクローン２０Ｅ配列に基づくプライマーを合成し、血清又は組織から抽出したＤＮＡ（又はＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ）を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用できる。ＰＣＲを行うに際しての種々の段階は、Ｍｕｌｌｉｓ等の米国特許第４，６８３、２０２号及び第４．６８３．１９５号に記述されている。代わりに、Ｇｕａｔｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　１８７４　（１９９０）に記述されているような自己支持配列複製（３ＳＲ）が、血清又は組織中のＲＮＡ標的配列を増幅するために使用できる。３ＳＲにおいては、ＲＮＡ配列が、最初にファージプロモーターを含有する相同なｃＤＮＡを合成することによって増幅される。（反応混合物中におけるリボヌクレアーゼＨ活性の存在のための）　ＲＮＡ −ｃＤＮＡ二本鎖のうちのＲＮＡ鎖の消化、及びＤＮＡ二本鎖を形成するための、第１のｃＤＮＡから離れた第２のＤ’ＮＡ鎖の合成に続いて、そのＤＮＡ二本鎖はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写される。次いで転写物は、そのようなより多くのｃＤＮＡの合成のために基質として使用され、そして転写及び上述の段階の更なる繰り返しが行われる。別のＲＮＡを生み出す増幅方法は、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）として知られており、Ｇｉｎｇｅｒａｓ等によってＷｏ　８８０６１７において最初に開示され、またＷｏ　８８０７２９においても開示されている。３ＳＲとは異なって、ＴＡＳは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のうちＲＮＡ鎖を消化するための外因性リボヌクレアーゼＨ活性が存在しないことから、変性による鎖の分離を必要とする。ＴＡＳは、次々と繰り返されるｃＤＮＡ合成が交互に繰り返される変性を必要としているという点においては、表面的にはＰＣＲに類似している増幅された又は増幅されていない核酸へのハイブリダイゼーションは、１ｎｓｉｔｕ（例えば、組織学的組織切片上において）又は抽出された核酸によって達成でき、液体シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、又は非放射性標識を検出するための適当な技術によって検出することができる。核酸ハイブリダイゼーショｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）を参照のこと。図２Ａに開示された配列に対応するＲＮＡ配列は、当業者に入手できる手順で製造でき、そして適当な状況の下においてＲＮＡプローブとして使用できるということは理解されなければならない。

クローン２０Ｅの全配列、またその標的核酸と検出可能なハイブリッドを作ることのできるいずれの適当な診断的フラグメントも、上述のような核酸ハイブリダイゼーションのために使用できる。同様に、クローン２０Ｅ配列は、突然変異的変化を受けているクローン２０Ｅ関連ＮＡＮＢＨ因子の検出において有用な一群のプローブを提供するよう、標準の位置特異的突然変異導入法又は他の技術（上記、Ｓａｍｂｏｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）によって変化させることができるということを理解しなければならない。例えば、ＲＮＡウィルスの多くが超可変であることが知られており、そのような変異体の最適な検出に適合させたクローン２０８関連配列の提供のために、上に参照したような既知の方法を使用することが必要であろう。一般に、低度乃至中等度に厳格な洗浄条件のもとにおいて（すなわち、完全にマツチした２０Ｅ−２０Ｅハイブリツドの計算された融点Ｔｍより２０℃乃至３０℃下という温度と塩類濃度との組み合わせの下において；　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｌｏｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）；上記、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌを参照のこと）、開示したクローン２０Ｂ配列にハイブリダイゼーションすることの可能な如何なる核酸配列も、クローン２０Ｅによって表される因子のための診断的プローブとしての潜在的な有用性を有するであろう。

同様な仕方で、開示したクローン２０８核酸配列は、コードされたアミノ酸配列を変化させることなく、遺伝コードの縮重に従って種々のコドンの第３の位置において変化させることができる。他方、アミノ酸配列の僅かな変更（例えば、置換、付加又は削除等の）は、２０ε因子のアッセイにおけるそのような変更させられたポリペプチドの免疫診断的有用性を破壊する程までには開示した２０Ｅポリペプチドによって表される該−の又はより多くのエピトープが変化しないため、認められるほどの影響をアッセイ性能に与えないということを強調しなければならない。そのようなものとして、構造中にそのような僅かな変化を有するポリペプチド及び対応するエピトープは、開示したクローン２０Ｂ核酸配列によってコードされるポリペプチド及びエピトープに厳格な相同性を有するポリペプチド及びエピトープに、実質的に類似又は均等であると考えられる。

開示したクローン２０Ｅ核酸配列に対応するゲノム配列に並ぶゲノム配列を表す追加の核酸配列は、標準の手順を用いて直ちに得ることができる。そのような配列は、２０Ｅ配列に対して５”又は３゛のいずれでも、開示したクローン２０Ｅ核酸配列の診断的有用性を高め又は核酸プローブとして別個の利用性を有する。

加えて、そのような配列は、開示した２０Ｅポリペプチドの診断的有用性を高めるアミノ酸配列をコードすることができるか、又は独立した免疫診断的利用性を有する追加のＮＡＮＢＨエピトープをコードすることができる。そのような並ぶ核酸配列を同定し単離する方法（染色体「クローリング（ｃｒａｗｌ　ｉｎｇ）　Ｊ又は「ウオーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）　Ｊ　）は、当業者によく知られている。並ぶ配列を単離するための種々の手順の概説については、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、を参照のこと。例えば、上記において参照しそして以下に示した実施例に記述したλｇｔｌｌライブラリーは、開示したクローン２０Ｅ配列の５°又は３゛末端分に特異的なオリゴヌクレオチドプローブによって再スクリーニングできる。そのように、最初に単離されたクローン２０Ｅと重複するクローンが単離でき、それは開示したクローン２０Ｂ配列に並ぶ核酸配列を含むであろう。代わりとして、開示したクローン２０Ｅ配列に基づくオリゴヌクレオチドは、それから追加の並ぶクローンが単離できるものである新しいｃＤＮＡライブラリーを創り出すためのプライマーとして使用できる。

開示した２０Ｅ核酸配列は、下記の実施例において記述するようにファージ及びプラスミドベクターの両方においてクローニングした。該２０Ｅポリペプチドは、Ｅ、　Ｃｏ１１　（例えば他の原核ホスト、酵母及び哺乳類細胞のような真核ホスト）においてそのようなベクターから発現でき、やはり当業者に利用できる（同上のＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）。

サブクローニング及び／又はクローン２０Ｂまたは関連配列の発現のために使用できるベクターとしては、その中にクローン２０Ｅによって表されるようなりＮＡ配列が、挿入配列の最適な転写及び翻訳のために必要な如何なる他の要素とも一緒に挿入できる、如何なるベクターも含まれる。そのようなベクターは、上記の一つ又はより多くのホスト細胞タイプに移転され複製されることができる。本発明において有用なベクターは、次の特徴の幾つか又は全てを有することが好ましい。すなわち、（１）長期間にわたりホスト細胞中において安定に維持されること；（２）所望のホスト細胞中において、高いコピー数で増殖されること；（３）挿入体の転写を促進することのできる配列を有すること：（４）薬物耐性のような選択可能な特性をコードする配列を有すること；及び（５）転写を終了させることのできる配列を有すること。発現のためには、ベクターは少な（とも一つのプロモーター、少なくとも一つのＳｈｉｎｅ−Ｄｅ１ｇａｒｎｏ配列〔リポソーム結合部位、５ｈｉｎｅ　ａｎｄ　Ｄｅｌｇａｒｎｏ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：　３４　（１９７５）　）又は同様の配列及び開始コドン、少なくとも一つの終始コドン、及び少なくとも一つの、分泌リーダーをコードする配列又はシグナル配列を含むことが好ましい。クローン２０Ｅ関連配列の転写及び／又は翻訳に必要な如何なる他の要素も、入手可能な科学文献に記載された方法を使用して該ベクターに加えることができる。真核及び原核ホストに適合させたベクター中の挿入体配列のクローニング及び発現のための一般的アプローチ及び多（の実施例が、同上のＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌ、、第１乃至４章、８．９．１６及び１７章に与えられている。

酵母ベクターは、例えばＢｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：　８０６　（１９８７）に記述されているような酵母の人工的染色体ベクターを含む。

開示したクローン２０Ｅ核酸配列は、古典的なコンセンサス・グリコシレージョン部位の如何なるものをも示していない。このことは、真核及び他のホスト細胞から発現された２０Ｅポリペプチドが、開示された２０Ｂポリペプチドの特徴的な機能的エピトープ特性を有していなければならなことを示している。従って、特有のグリコシレージョンパターンを必要とする種々のタンパク質において問題となるような適当なホスト細胞に関する非予測性は、２０Ｅポリペプチド配列及び関連配列に関しては要因とはならない。

代わりの各具体例においては、クローン２０Ｂ核酸配列及びそのフラグメントの双方とも、並びに２０Ｅポリペプチド及びそのフラグメントは、周知の手順を用いて化学的に合成することができる。核酸）を参照のこと。Ｍｉｌｌｉｇｅｎ− Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　９６００ペプチド合成装置のような商業的に入手できる自動化されたポリペプチド合成装置によって、所望の配列のポリペプチドが、化学的に合成できる。

本発明は今や以下の実施例を参照して詳細に記述されるが、それらの実施例が本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

実施例１クローン２０Ｅの単離及びＤＮＡ特徴づけＮＡＮＢＰＴＨ患者のプールした血漿から調製されたｃＤＮＡライブラリの免疫スクリーニングに際して、ＮＡＮＢＰＴＨ患者からの血清と反応するファージクローン（２０ε）を、次の方法を用いて同定した：段階１：ＮＡＮＢ肝炎の臨床像を呈している固体からの血漿単位を低速遠心によって透明化してフィブリン除去し、次いでプールした。ポリエチレングリコール４０００　（ＰＥＧ）を、４０　ｇ凡の濃度に該透明化した血漿に加え、氷上で３０分間攪拌することによって溶解した。懸濁液を４°Ｃにて７０００　Ｘ　ｇで２０分間遠心し、ペレットを０．５％クエン酸ナトリウムを含有する０、５％のＮａＣ１の１０乃至３０ｍＬ中に再懸濁させたー再懸濁させたペレットを、４℃にて２時間インキュベートし、次いで４°Ｃにて３６００　Ｘ　ｇで２０分間遠心した。得られたペレットより、次いでＲＮＡを抽出した。

段階２　：　ＰＥＧ／ＮａＣｌペレットから得たＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄＳａｃｃｈｉ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２：　１５６　（１９８７）のようにして、イソチオシアン酸グアニジニウムによって、次いで、フェノール：クロロホルムによって抽出した。ウィルスの核酸を、イソプロパツール及びエタノールで数回沈殿させた。ｃＤＮＡへの変換は、メチル水銀水酸化物で変性させ次いで市販のキット（Ｃ−ｃｌｏｎｅ　Ｉｆ、　Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）を用いて逆転写することによって達成した。二本鎖ｃＤＮＡを、Ｓｔヌクレアーゼ及びＥｅｏＲｌ　メチラーゼで処理し、モしてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによってプラント・エンドした。ＥｃｏＲＥ　リンカ−の取り付けの後、ｃＤＮＡをλｇｔｌｌ腕（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲーションし、そしてファージヘッド（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄ：　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に封入した。得られたファージライブラリーは、約１０００万個のクローンを表し、それらのうち約６６％が挿入体を含んでいた。

段階３：Ｅ、Ｃｏ１１株Ｙ１０９０Ｒ−の培養物１００ｍＬを、５０１１　ｇ／ｍＬのアンピシリン、０．２　％Ｗ／Ｖのマルトース及び１０ｍＭのＭｇ５Ｏａを含有するＬＢブイヨンよりなる培地中において、６００ｎｍにおいて０．５の光学濃度まで増殖させた。細菌を次いで遠心によりペレット化し、９．２ｍＬの氷冷のｉ　０ｍＭのＭｇＳＯ４中に再懸濁させた。

３００μＬの各ＳＭ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４，１００ｍＭのＮａＣ１゜１０ｍＭのＭｇＳＯ４，ｗ／ｖゼラチン）中に５００００プラ一ク形成単位を表すバクテリオファージの懸濁液を、上で調製した細菌懸濁液の各４５０μＬと混合し、３７°Ｃにて１５０　ｒｐｍで１５分間攪拌した。次いで管を４７℃に加温し、ファージを有する細菌の容管に９ｍＬのトップアガロース（５Ｏａｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢブイヨン中０．７５％Ｗ／Ｖ）を加えた。これらの管を、次いで、アンピシリン（５Ｏａｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天の直径１５０ｍｍのプレートの表面上に注ぎ、固まらせ、そして倒立配置で４２°Ｃにてインキュベートした。約３時間のインキュベーションの後、ファージプラークが見えるようになった。次いで、プレートを、予め１０ｍＭのイソプロピル千オーβ−ガラクトシド（ＢＲＬ）に浸しそして乾燥させておいた直径１３７　ｍｍのニトロセルロースフィルターで覆った。プレートを更に３時間３７°Ｃにてインキュベートし、そして膜の方向を、膜及び細菌学的培地を、インクをつけた針で数回穿刺することによって記した。次いで、膜をプレートから取り除き、蒸留水で洗浄し、そして脇において乾燥させた。乾いたフィルターを、次いで、Ｉ　ＸＴＢＳ　（０，ＩＭ　）リス、ｐＨ７，４，０，５Ｍ　ＮａＣ１゜０．１％ｗ／ｖ　ＮａＮｘ）中の脱脂粉乳の２％Ｗ／Ｖ溶液中、室温にて１５乃至６０分間インキュベートした。

段階４：ＮＡＮＢ肝炎に罹患した疑いのある３例の個体からの血漿（各１０ｍＬ）をプールし、そして次の通りにして細菌分解物に予め浸漬した：　細菌細胞のペレット（４Ｌの培養物から作った）をＡＰＶＧａｕｌｉｎプレス中で８０００ｐｓｉにて３回ホモジナイズすることにより、Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｙ１０９０Ｒ− 分解物を調製した。分解物タンパク質（１２０ｍｇ）を、１０ｍＬの洗浄し、活性化させた５ｅｐｈａｒｏｓｅ−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、メーカーの指示内容に従って結合させた。結合させた分解物を、４つの等しい部分に分割した。第１の部分を、５ｍＬのＯ８１％ＳＤＳで１０分間処理し、続いて各３０ｍＬのＩＸＴＢＳで３回洗浄した（カラムＡ）。カラムＢは、ＳＤＳ処理していない残りの結合した分解物よりなる。免疫スクリーニングのためのプールした血漿を、１０ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＢＲＬ）を含有するＩＸＴＢＳ中の可溶性のＥ、　Ｃｏ１１　ＹＩ０９９Ｒ−分解物（３０ｍｇ／ｍＬタンパク質）　１２ｍＬに加えた。混合物を室温にて１時間揺すり、次いで７１００Ｘｇにて１０分間遠心した。上澄を上記のカラムＡに通し、溶出液を上記のカラムＢに２回通した。最終の溶出液（約４５ｍＬ）を、次いで、可溶性のＥ、　Ｃｏ１１分解物（３０ｍｇタンパク質／ｍＬ）の追加の１１２ｍＬと共に室温にて３０分間インキュベートした。混合物を７１００Ｘｇにて１０分間遠心し、４０ｍしの上澄（ｌｏｍＬの無処理のプールした血漿と等価である）を、ＩＸＴＢＳ中の２％Ｗ／Ｖ脱脂粉乳の９６０ｍＬで希釈した。

段階５：　段階３からの膜を、乳／ＴＢＳ溶液を除去するために吸引し、段階４からの処理された抗体２０［１１Ｌを各フィルターに添加した。緩やかに揺すりつつ、膜を抗体溶液と共に室温にて終夜インキュベートした。抗体溶液を、次いで、吸引により除去し、膜をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を６回交換して３０分間洗浄した。アルカリ性ホスファターゼを接合させたヤギ抗ヒトＩｇＧ／［ｇＭ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　［ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）　を、脱脂粉乳２％を含有するＩＸＴＢＳで１　：　３５００に希釈した。膜をこの希釈した二次的抗体懸濁液の各２０ｍＬ中で室温にて２．５時間インキュベートし、そして次いでＩ　ＸＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ　２０を６回交換して洗浄した。

最終洗浄に続いて、膜を５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ９，５の溶液に１０分間浸漬した。基質溶液（６６μＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍ）及び塩化ニトロブルーテトラゾリウム〔７０％ＤＭＦ中７５ｍｇ／ｍＬ　）　８８μＬを含有する５９０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ９，５２０ｍＬ／膜）をフィルターに加え、そして反応性のプラークが黒くなるまで（２乃至７分）インキュベートした。１％Ｖ／Ｖ氷酢酸溶液中での５分間の洗浄によって反応を停止させ、続いて水洗した。

直径約１ｍｍの黒く染まる、しばしば「ドーナツ」状の外観を呈する円として反応性のプラークを同定した。２０Ｅとして同定された一つのクローンは、ＮＡＮＢＨ患者からのプールした血清に反応することが見出された。膜を細菌学的プレートとぴったり合わせることによってこのバクテリオファージのプラークを採り、プレートからのアガロースのプラグをパスツールピペットの広い先端を用いて除去した。プラグ中のファージを、５０μＬのクロロホルムを含有するＳＭ緩衝液の１ｍＬ中で４°Ｃにて終夜インキュベーションすることによって溶出させた。バクテリオファージクローンを、本実施例で上述した通りの免疫スクリーニングを連続して３回行うことによって濃厚化しそして精製した。

精製されたクローン及び野性型のλｇｔｌｌを、プレート当たり５００プラ一ク形成単位の濃度にて別々にプレートにまき、本実施例にて上述した通りのＮＡＮＢＩ（のプールした血清と反応させた。これらのファージプラークの、現れた免疫染色を図１に示す。精製されたファージの形におけるクローン２０Ｅを、寄託番号　でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託した。

実施例２クローン２０ＥのＤＮＡ及びコードされたアミノ酸配列ファージクローン２０Ｂに含まれた組換え挿入体のＤＮＡ配列を決定するために、次の段階を実施した。

段階ｌ：　免疫スクリーニングによって選択したファージクローン２０Ｅからの該組換えＤＮＡ挿入体を、λｇｔｌｌのＥｃｏＲＩクローニング部位に並ぶブライｖ−ＬＧａ：５°−ＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ丁ＣＡＧＴＡ−３° （配列番号：Ｉ）　、ＬＧ２：　５−ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣ−３’　（配列番号：２）を用いてＰＣＲによって増幅し、その酵素によって切断し、プラスミドｐＵｃｌＱ中にクローンし、次いで配列決定のためにＭ１３ｍｐ１９　ＲＦ　ＤＮＡ中にサブクローンした。挿入体の単鎖のＤＮＡ　（ｓｓＤＮＡ）配列を、市販のキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０．　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）によって与えられたプロトコールに従って、ユニバーサル・プライマー及び修飾したＴ７　ＤＮＡポリメラーゼを用いて決定した。遺伝子発現のためにプラスミドベクター中にクローンされた挿入体（下記の実施例４を参照のこと）は、２０Ｂ免疫反応性をもたらす該挿入体の配向を決定するために、アルカリによって変性させた後に配列決定した。

上記の方法によって決定されたクローン２０εの組換えＤＮＡ配列、及びそれによってコードされた推定アミノ酸配列は、下記の図２に再現されている。該配列は、古典的なＮ−結合した又は〇−結合したグリコシレージョン部位をなにも示さない。

このＤＮＡ及びそのコードされたタンパク質配列の分析は、入手可能な科学文献中に又は種々の特許出願中に報告されているＨＣＶに関連した配列との、検出可能なレベルの相同性は示さない。同様にクローン２０ＨのＤＮＡ又はアミノ酸配列のいずれも、Ａ、Ｂ、又はＤ型肝炎ウィルスの入手しつる配列との、上記のＡｒｉｍａ等の論文及び特許出願に公表された配列との、又は１９９１年１０月８日に検索したところによればＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータベースに入れられている他のあらゆる配列との、検出可能な相同性は示さない。

実施例３ヒトＤＮＡとクローン２０Ｅとの関連性クローン２０Ｅとして同定されたＤＮＡ配列がヒトのゲノム内に含まれているか否かを決定するために、直接ＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリダイゼーションを次の通りに実施した。

段階ｌ・　商業的ベンダー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）から入手したヒト胎盤ＤＮＡの１０μｇの量を、ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ又はＢａｍＨｉ制限酵素で消化した。消化したＤＮＡサンプルを、次いで０．７％アガロースゲル中において２０Ｖて電気泳動した。サイズで分離されたＤＮＡフラグメントを、メーカー（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ−ＬＫＢ）の指示内容に従って真空プロッティング・システムを使用してゲルから０ｎｃｏｒ　５ＵＲＥ　ＢＬＯＴ膜へ移し替えた段階２：　単一コピーのヒト遺伝子のための陽性対照として、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子のエキソン１４の一つのフラグメントを、０．５μｇのヒト胎盤ＤＮＡから、下記のオリゴヌクレオチドブライマー、（Ａ３７Ｇ）：　５’−ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡ−３’　（配列番号：３）　、（Ｔ３９Ｔ）：　５’−ＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＴ−３’　（配列番号＝４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅した。

約４６０塩基対の増幅されたバンドを単離し、次いでＨｉｎｄ　［［ｌ及びＥｃｏＲＩて消化した。消化されたＤＮＡを、）ｆｉｎｄ　ＩＩＩ／　ＥｃｏＲ［消化ｐＵｃ１９プラスミド中にサブクローンし、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の一部としてＤＮＡ配列の同一性を確認した。上述の精製したチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子フラグメントを、つないだＤＮＡを形成するために、次の方法で自己ライゲーションした。すなわち、Ｈｉｎｄ　［［及びＥｃｏＲ［制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、遺伝子フラグメントを１００μｇのｐＵｃ１９プラスミドから遊離させ、そして２％アガロースゲル中における電気泳動によってプラスミドＤＮＡから分離した。

Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：　６１５　（１９７９）の方法を用いてゲルからＤＮＡフラグメントを溶出した。

溶出したＤＮＡを、エタノール沈殿によって濃縮し、分光光度法によって定量し、５００ｎｇ量を、つないだ遺伝子フラグメントを形成するために、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及び標準の方法を用いてライゲーションした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、上記（１９８９））。同様に、ｐＵｃ１９中の２０８配列を、ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出しそしてつないだ。放射性プローブを創り出すために、つないだＤＮＡを、Ｅ、　Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント及びα−２１ｐ標識ｄＡＴＰを使用してニック翻訳によって別々に標識した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、上記（１９８９））。遺伝子フラグメントをつなぐことは、ニック翻訳（すなわち高い比活性の放射性ＤＮＡプローブを産生ずるための好ましい方法）のための基質になるに十分のサイズのＤＮＡ基質を提供するために必要であった。

段階３：　消化されたヒトＤＮＡを含む膜を、膜の販売人（Ｏｎｃｏｒ）によって示唆されている溶液（Ｈｙｂｒｉｓｏｌ　１）を用いて予備ハイブリダイゼーションしそしてハイブリダイゼーションした。ＤＮＡプローブを、ハイブリダイゼーション溶液１［ＯＬ当たり毎分ｌＸｌ０’カウントの濃度となるまで、プラスチックバッグ内に収容された適当な膜に加えた。プロット及びプローブを、攪拌しながら４５℃にて終夜インキュベートした。

最終洗浄を５７°Ｃにて行った以外は、メーカーの指示内容に従ってプロットを洗浄した。乾燥したプロットを、２枚のＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増強スクリーンの間のＫｏｄａｋ　Ｘ−ｏｍａｔ　ＡＲ診断フィルムに、−７０°Ｃにて１６時間曝した。メーカーの指示内容に従ってフィルムを現像し、それを図３に示す。

実施例４対照及びＮＡＮＢＨ血清との２０Ｅポリペプチドの反応クローン２０日挿入体を含んだプラスミドｐＵｃ１９をＥｃｏＲＩで消化し、２０ＥフラグメントをプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔ変異体中にサブクローンした（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｎｓｏｎ、　Ｇｅｎｅ　６７：　３１　（１９８Ｂ））　ｏこの変異体（ｐＧＥＸ−２Ｔａと名づけだ）は、ＢａｍＨＴ制限エンドヌクレアーゼでｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドを開き、突き出た末端をＥ、　Ｃｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントの作用によって充填し、モして鈍端を一緒にライゲーションすることによって構成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

上記（１９８９））。クローン２０Ｅによってコードされるペプチドを、前述の方法に従って、Ｅ、　Ｃｏ１１株ＤＨ５α中において、グルタチオン−３−１ランスフエラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質としてプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔａから発現させた（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、上記（１９８８））。クローした。

ＧＳＴ融合タンパク質は、ウェスタンプロット試験（以下を参照）によってλｇｔｌｌ−クローン２０Ｅファージを単離するために最初に使用した血清と免疫反応性であった。修飾されたベクターは、λｇｔｌｌから単離された挿入体遺伝子からイン・フレームのタンパク質発現産物を産生するとは期待されないであろうという点において、この結果は驚くへきであった。この仕事の過程においてλｇｔｌｌから単離された他の挿入体は、この配列に関して融合リーダーのＥｃｏＲｌ挿入部位との不正確な配列のため、ｐＧＥＸ−２Ｔａにおいてタンパク質としては発現できなかった。これらの結果は、クローン２０８配列が、λｇｔ１１中におけるその免疫原的発現が元のλｇｔｌｌ−クローン２０Ｅファージ中における異常な配列の並びのためであったという点において、異常であったということを示唆している。この異常な配列の並びは、分子の５゛末端にある２つのＥｃｏＲＩ　リンカ−のためであったのかも知れないが、配列の並びの正確な性質は決定されていない。ＧＳＴ−り３：　１６７　（１９９０）の方法によって精製した。グルタチオン−３−トランスフェラーゼを、２０Ｂ挿入体を欠いた未修飾のｐＧＥＸ−２Ｔを含んだ細菌培養物から同様に精製した。

ｐＧＥＸグルタチオン−８−）ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）　２０Ｅウ工スタンプロツト条片の調製は、Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ不連続緩衝剤系を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を実施することにより、２段階で達成した（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、）　２２７：　６８０　（１９７０））。このゲルは、１２％の分離ゲル（ｐＨ８，８）及び４．５％の積み重ねゲル（ｐＨ６，８）よりなり、２％のＳＯ３，０，１２５Ｍのトリス、　ｐＨ６，８、１０％のグリセロール、１％の２−メルカプトエタノール及び０．０２％のピロニン（ｐｙｒｏｎｉｎ）　Ｙ追跡色素中で、精製したＧＳＴ−２０８抗原を適用することによって電気泳動し、水浴中で５分間煮沸した。サンプルは、２Ｘ１２８μしく各２．７μｇ）の部分量として２つの準備ウェル（各々６４ｍｍ幅）に適用し、追跡色素がゲルの底に到達するまで一定電流で電気泳動した。

ＧＳＴ−２０Ｂの見かけの分子量は、隣接する５ｍｍの幅で流したｒａｉｎｂ。

Ｗ分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）の電気泳動の移動性に対する分子量の対数の標準プロットからの外挿によって推定し、そして融合タンパク質の予想分子量と同一であることが見出された。それら分離されたタンパク質を、タンク装置（Ｈ。

中において、フッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｎｅｗ　Ｂｅｄｆｏｒｄ。

（ＩＢＳ：　Ｂａｘｔｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に溶かした５％脱脂粉乳の溶液中でブロックした。膜を短時間ＩＢＳ中で濯ぎ、３ｍｍ　Ｘ１２０ｍｍ片へと切断し、直ちに使用するか又は−２０°Ｃにて貯蔵した。

ウェスタンプロット片を、等張緩衝食塩水中の５％脱脂粉乳の各２ｍＬを含んだインキュベーション・トレー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の溝に置いた。

ＧＳＴ−反応性抗体を予め吸収させるため、対照及び試験標本（２０μＬ）を、２０Ｅ挿入体を欠いた精製したｐＧＥＸ　ＧＳＴ（７）１００　μｇ　（５０μ Ｌ−１００μＬ）と共に１５分間予備インキュベーションした。

処理した標本を、次いで、谷溝に直接に添加し、穏やかに攪拌しつつ室温にて終夜インキュベートした。インキュベーションの後、各条片を、０．０１％のＮａＮ５を含有する、０．０５Ｍのトリス、３ＭのＮａＣ１゜ｐＨ８，０の５ｍＬで５分間４回洗浄し、続いて、ＩＢＳのみを含有する洗浄液５ｍＬで２回更に洗浄した。各片を、ＩＢＳ　５％脱脂粉乳溶液（１：３５００）中において、アルカリ性ホスファターゼを接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ　＋［ｇＭ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　［ｍｍｕｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、　ＰＡ）と共に２時間インキュベートした。次いで、各条片を［ＢＳｏ、３％Ｔｗｅｅｎ−２０の５ｍＬで５分間３回洗浄した。一つの反応トレーからの各条片（２５条片まで）を、平底プラスチック箱（１９ｘ　１６ｃｍ）に移し、０．０５Ｍ　）リス、ｐＨ９，５，０，０５％ＮａＮｉ　（基質緩衝液）で５分間２回洗浄した。

各条片の現像は、Ｂｌａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３６：　１７５　（１９８４）に記述されているようにして、基質緩衝液中においてニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート系で達成し、暗所においてプロッティング紙上にて風乾させた。非常に反応性の強い、反応性の弱いそして陰性の対照を、各標本群と共に流した。臨床標本の反応性は、免疫スクリーニングプールにおいて使用した血清の一つ（実施例１）と共に展開した対照ウェスタンプロットの強度に比較して評価した。この血清は、クローン２０Ｅフアージプラークに対して試験したところ、該プール中の２つの反応性血清のうち弱い方であった。反応性のウェスタンプロットは、対照血清と比較したとき、２０Ｅ−特異的バンドの等しい又はより強い染色を有するものとして判定された。これらの実験の結果を下記の表１に示す。

表１血清とのクローン２０Ｅ融合タンパク質の反応集団　反応性ランダムな供血者　１／７１　（１，４％）慢性ＮＡＮＢＨ１Ｂ／１１６　（１５，５％）他のＮＡＮＢＨ９／３７　（２４，３％）表１の説明：　ウェスタンプロットの移転物を臨床標本と共にインキュベートし、クローン２０Ｅ融合タンパク質バンド（分子量　３２０００）に対して反応性又は非反応性として記録した。反応性は、全てのウェスタンプロット試験において、使用した対照血清に比較して表現されている。該血清は、プラークリフト法によってクローン２０Ｅを発見するのに使用した元のプール血清の一構成成分であり、該プラークリフドア・ンセイにおける２つのプール血清のうち弱い方を表す。反応性のサンプルは、対照血清に比して染色密度の等しい又はより大きいサンプルであると判定した。

合衆国、英国及び日本にいる研究者からの臨床サンプルを、慢性ＮＡＮＯ疾患か、又は他のＮＡＮＢ疾患（急性、散発性及び供血者関係）かの何れかとして分類した。ランダムな供血者は、合衆国の集団からのものであった。

実施例５ＮＡＮＢＨ連続採血パネルとの２０Ｅポリペプチドの反応ＮＡＮＢＨ患者が臨床的疾患に際して又はその後のいずれにおいて抗２０Ｅへと血清変化するのかを決定するために、３名のＮＡＮＢＨ患者の連続的採血を表す血清サンプルを、グルタチオン−５−ｈランスフェラーゼ／クローン２０Ｂ融合タンパク質に対するウェスタンプロットによりアッセイした。これらの血清サンプルを処理し、実施例４に記述したようにしてアッセイした。血清サンプルは、商業的ベンダー（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、）から入手したが、それは市販の試験（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　［口ｃ、）によって検出したように、これらの患者を、ＮＡＮＢＨ疾患の後に抗ＨＣＶ　Ｃ−１００タンパク質へと変化していると確認した。３つの血清パネルを、商業的に入手したＨＣＶ　８ＬＩＳＡキツトを用いて抗ＨＣＶ抗体について試験した。これらの実験の結果を図４．５及び６に示す。連続採血パネルの各々は、抗ＨＣＶ状態への変化に相当する変化の日付を以て、抗２０Ｆ、ポリペプチド状態への血清変化を示した。相当はするものの、抗２０Ｅポリペプチド状態へ及び抗ＨＣＶ状態への変化の日付は、これら３つのパネルのうちの２つにおいて同一ではなかった。すなわち、ある例では、抗２０Ｂ状態への血清変化は、抗ＨＣＶ状態への血清変化の一採血期間後に起こり（図５）、第２の例では、抗ＨＣＶ状態への血清変化は（図６）前記の詳細な説明は、本発明のよりよい理解のためにのみ提示したものであり、何らかの修正は添付の請求の範囲の精神及び範囲から外れることなく、当業者に明らかであろうことから、そこから無用な限定を読み取ってはならない。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：　ライアン、テレンス、イーサイード、パドルキーゼルバーグ、マーク、ケーバイルン、ロバート、イースチーヴンス、ブリシラ、ダブり二− 有為　暉勝トッド、ジョン、ニー（ｉｉ）発明の名称、　肝炎疾患の診断において有用なりＮＡ配列及びコード化されたポリペプチド（ｉｉｉ）　配列の数：　７（ｉｖ）連絡住所：（Ａ）住所：　バクスター、ダイアグノスチックス、インコーホレイテッド（Ｂ）通り：　バクスターパークウェイ１、ＤＦ２−２Ｅ（Ｃ）市：　ディヤフィールド（Ｄ）州：　イリノイ州（Ｅ）国：　アメリカ合衆国（Ｆ）Ｚ［’：　６００１５（Ｖ）コンピューター読み取り形式：（Ａ）媒体タイプ：　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）／７トウエア：　Ｐａｔｅｎｔ［ｎ　リリース番号１．０、パージョン番号１．２５（ｖｉ）本出願データ：（Ａ）出願番号二　合衆国（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人情報：（Ａ）氏名：　バルタ、ケント（Ｂ）登録番号：２９，０４２（Ｃ）参照／ドケット番号：　ＰＡ−４１７１（ｉｘ）！気通信情報：（Ａ）を話：　７０８／９４８−３３０８（Ｂ）テレファックス：　７０８／９４８−２６４２（２）配列番号ｌについての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝　２３塩基対（Ｂ）壓：　核酸（Ｃ）鎖の数：　未知（Ｄ）トポロジｍ：　未知（ｉｉ）配列の種類：　他の核酸、合成オリゴヌクレオチド（ｘｉ）配列の記述：　配列番号＝１＝ＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧ　ＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡ　ＧＴＡ　２３（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝　２３塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）鎖の数：　未知（Ｄ）トポロジー：　未知（ｉｉ）配列の種類：　他の核酸、合成オリゴヌクレオチド（ｘｉ）配列の記述：　配列番号：２：ＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡ　ＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧ　ＣＴＣ２３（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　３４塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）鎖の数二　未知（Ｄ）トポロジｍ：　未知（ｉｉ）配列の種類：　他の核酸、合成オリゴヌクレオチド（ｘｉ）配列の記述：　配列番号：３：ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧ　ＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴ　ＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡ　ＧＡＣＡ　３４（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　４０塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）鎖の数、　未知（Ｄ）トポロジー：　未知（１１）配列の種類：　他の核酸、合成オリゴヌクレオチド（ｘｉ）配列の記述コ　配列番号：４：ＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧ　ＡＧＣＴＡＴＧＣＣＴ　ＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＴ　４０（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　７８塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）鎖の数：　二本鎖（Ｄ）トポロジー：　未知（ｉｉ）配列の種類：　ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記述：　配列番号：５：ＡＡＴＴＣＣＧＧＧＡ　ＡＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＧ　ＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡ　４０ＡＡＧＣＧＣＣＴＣＡ　ＡＣＧＴＴＣＴＧＴＴ　ＴＴＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣ７８（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　７８塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）鎖の数：　二本鎖（Ｄ）トポロジｍ：　未知（ｉｉ）配列の種類：　ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記述・　配列番号＝６＝ＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＡ　ＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧ　ＡＧＧＣＧＣＴＴＴＧ　４０ＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧ　ＣＡＡＡＡＣＣＴＧＡ　ＣＡＣＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＴＴ　７８（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　２６アミノ酸（Ｂ）型：　アミノ酸（Ｃ）鎖の数：　未知（Ｄ）トポロジー：　未知（ｉｉ）配列の種類二　ペプチド（ｘｉ）配列の記述：　配列番号＝７・Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ１５１゜Ａｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ＋５　２０　２５Ｆｉｇ、　ＩＡＦｉｇ、ＩＢＦｉｇ、４）ＩＣＶ　Ｃ−１００条片番号　採血日付　２Ｏ２反応”　ＥＬＩＳＡ反応性−６＋＋７　−４−ＧＳＴ７２０Ｅ融合Ｆｉｇ、　５ −−一−−一一−−一一鴫一−ＧＳＴ／２０Ｅ融合Ｆｉｇ、　６喰一一一一一一一　−１−−ＧＳＴ／２０Ｅ融合フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３− ４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　８３１０− ２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）ＣＯ７Ｋ　９９：００（７２）発明者　キーゼルバーグ、マーク、ケーアメリカ合衆国０２０４８マサチューセッツ、マンスフイールド、ディアパスレーン　６３（７２）発明者　バイルン、ロバート、イーアメリカ合衆国６００８９イリノイ、バッファローグローブ、デヴオンシャーロードＩ（７２）発明者　スティーヴンス、プリシラ、ウィルキンスアメリカ合衆国６０２０１イリノイ、工ヴアンストン、ライブラリーブレイス　６１９（７２）発明者　有為　暉勝鹿児島市平之町５−１−４０３（７２）発明者　トッド、ジョン、ニーアメリカ合衆国９４５４９カリフオルニア、ラフアイエツト、オーチャツトロード　１０９６

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列よりなる、精製され及び単離されたＤＮＡ分子。
２．前記ＤＮＡ配列が、配列表において配列番号：５によって定義された該ＤＮＡ配列よりなるものである、請求項１に記載の精製され及び単離されたＤＮＡ分子。
３．前記ＤＮＡ配列が、配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列よりなるものである、請求項１に記載の精製され及び単離されたＤＮＡ分子。
４．配列表において配列番号：６によって定義された該アミノ酸配列中のＮＡＮＢＨ診断的エピトープに実質的に類似であるエピトープを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列よりなる、精製され及び単離されたＤＮＡ分子。
５．低度乃至中等度に厳格な洗浄条件下において、配列表において配列番号：５によって定義されたＤＮＡ配列、及び配列表において配列番号：５によって定義された該ＤＡＮ配列に相補的なＤＮＡ配列よりなる群より選ばれたＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションできる核酸配列よりなる、精製され及び単離された核酸。
６．前記核酸配列がＤＮＡ配列よりなり、該ＤＮＡ配列が、配列表において配列番号：５によって定義された該ＤＮＡ配列、及び配列表において配列番号：５によって定義された該ＤＡＮ配列に相補的なＤＮＡ配列よりなる群より選ばれるものである、請求項５に記載の精製され及び単離された核酸。
７．前記核酸配列がＲＮＡ配列よりなるものである、請求項５に記載の精製され及び単離された核酸。
８．配列表において配列番号：５によって定義された該ＤＮＡ配列に対応する該ゲノム配列に並ぶゲノム配列に、低度乃至中等度に厳格な洗浄条件下においてハイブリダイゼーションできる核酸配列よりなる、精製され及び単離された核酸。
９．配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するアミノ酸配列よりなるポリペプチド。
１０．配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチド中のＮＡＮＢＨ診断的エピトープに実質的に類似のエピトープを有するアミノ酸配列よりなるポリペプチド。
１１．配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドのアミノ酸配列よりなるポリペプチド。
１２．請求項１に記載の該ＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
１３．請求項４に記載の該ＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
１４．請求項５に記載の該核酸配列を含んでなるベクター。
１５．請求項８に記載の該核酸配列を含んでなるベクター。
１６．請求項１２、１３、１４又は１５に記載の該ベクターによって形質転換されたホスト細胞。
１７．前記ホスト細胞が原核細胞である、請求項１６に記載のホスト細胞。
１８．前記ホスト細胞が真核細胞である、請求項１６に記載のホスト細胞。
１９．配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドの製造のための方法であって、請求項１６に記載の形質転換されたホスト細胞を前記ポリペプチドの発現に適した条件下に培養し、そして該ポリペプチドを回収することよりなるものである方法。
２０．配列表において配列番号６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、前記ポリペプチドの化学合成よりなるものである方法。
２１．ＮＡＮＢＨを診断する方法であって、患者からの血清を、配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの診断的有用性を有するポリペプチドと接触させ、そして前記血清が前記ポリペプチドと免疫反応する成分を含有するか否かを判定することよりなるものである方法。
２２．輸血用の血液をスクリーニングする方法であって、前記血液から血清を単離し、該血清を、配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドと接触させ、該血清が該ポリペプチドと免疫反応する成分を含むか否かを判定し、そして該判定に基づいて前記血液の分類及び処理を行うことよりなるものである方法。
２３．人の身体成分中のＮＡＮＢＨ因子のゲノムの存在を検出するための方法であって、前記ヒトの身体成分の増幅させた又は増幅させていない核酸を、請求項５に記載の核酸を含んでなるプローブと、該プローブ及び前記ゲノムのハイブリダイゼーションを促進する条件下に接触させ、そして該プローブが該ヒトの身体成分の該核酸にハイブリダイゼーシヨンするか否かを判定することよりなるものである方法。
２４．ＮＡＮＢＨの予防、改善又は治療のためのワクチンであって、配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体よりなるものであるワクチン。
２５．精製され及び単離されたポリペプチドであって、抗体の抗原結合部位を含んでなり、該抗原結合部位が、配列表において配列番号：６によって定義された該ポリペプチド中のＮＡＮＢＨ診断的エピトープに実質的に類似のエピトープに特異性を有するものである、ポリペプチド。
２６．前記ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のポリペプチド。
２７．ＮＡＮＢＨに対する受身免疫のための組成物であって、請求項２４に記載のポリペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体を含んでなるものである組成物。