CN1080957A - 适用于诊断肝炎病的dna序列和编码多肽 - Google Patents
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Abstract
分离出的新cDNA克隆20E,其特征为它编码
一个以前未知的,由带非甲非乙肝炎(NANBH)的特
定的患者的血清中的抗体识别的多肽抗原。在丙型
肝炎病毒(HCV)的基因组中没有该核酸序列。在人
基因组中也没有该核酸序列。资料表明,相当于克隆
20E的RNA序列被包含在一个外部感染因子的基
因组中而不是HCV,因此可以代表一个附加的病原
因子,或者说是人类患者中NANBH流行的散播因
子。因此20E核酸和相应的多肽及其不同的变异体
在各种针对预防和诊断NANBH的方法中是有用
的。
Description
本发明涉及一种DNA序列和编码多肽,其中编码多肽表示一种可由带非甲非乙(NonA NonB)肝炎的某些患者体内的抗体特异性认别的抗原。具体说来,本发明涉及在丙型肝炎(hepatitis C)病毒的基因组中没有的核酸序列和编码多肽。可将本发明的核酸和编码多肽用于非甲非乙肝炎的各种检测。
有关对甲型肝炎(Hepatitis A)和乙型肝炎(Hepatitis B)病毒特异和敏感的免疫诊断检测方法的发展导致鉴别出数种被统称之为非甲非乙型肝炎(NANBH或NANB肝炎)的综合症(由Hollinger综述的,Non-A Non B Hepatitis.In:Fields and Knipe,eds.Virology,2nd Ed.New York;Raven Press,pp2239-73,1990)。一种综合症已明显地与输血或其他经皮下处理有关,称其为非甲非乙输血后肝炎(Non-A Non B Post-Transfusion Hepatitis)(NANBPTH)。另一综合症流行学上与粪便-口污染有关,称之为肠非甲非乙肝炎。由于未认别出感染途径,而称第三种综合症为散发性NANBH。分子病毒学领域的应用技术被用来鉴别一种与NANBPTH有关的新的病毒因子(丙型肝炎病毒)(Kuo et al.,Science 244:362(1989)),以及一种与肠NANBH有关的新的病毒因子(E型肝炎病毒)(Reyes et al.,Science 247:133(1990))。
人们已经进行过与NANBPTH传染有关的,来自浓缩的血液产品或血浆的类似病毒的颗粒的生物物理和生物化学特征描述。这些研究表明,存在直径为25-40nm的包封病毒颗粒,若用有机溶剂处理,其感染性消除(Bradley et al.Gastroenterology 88:773(1985)),另外也单独观察到直径平均27nm的非包封类似病毒,或与上述的包封颗粒相联合(Bradley et al.J.Med.Virol.(1979))。使用交叉刺激研究说明不止一种类型的病毒因子可以引起NANBPTH(Bradley et al.,J.Med.Virol.6:185(1980);Hollinger et al.,J.Infect.Dis.142:400(1980);Yoshizawa et al.,Gastroenterology 81:107(1981))。
已经表明在受NANBPTH感染的黑猩猩和人血浆中发现的RNA分子克隆,存在与包封黄热病病毒或鼠疫病毒的基因组结构相似的约10Kb的病毒基因组(Houghton et al.,EPO申请No.88310922.5(1988);Houghton et al.,EPO申请No.90302866.0(1990);Arima和Fukai,EPO申请No.89309261.9(1989);Choo et al.,Science 244:359(1989);Okamoto et al.,Japan J.Exp.Med.60:167(1990);Kato et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:9524(1990)),并参见Miller and Purcell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2057(1990)。称这种新病毒类型为丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)(HCV),且最后在约60-80%的NANBPTH患者中发现了抗该病毒编码蛋白质的抗体(Alter et al.,New Engl.J.Med.321:1494(1989);Esteban et al.,New Engl.J.Med.323:1107(1990)。Maeno et al.,Nucl.Acid.Res.18:2685(1990))。还没有研究出清楚说明HCV为NANBPTH根原与Koch's假设一致的感染性数据,然而,可以得出一个相关的论点:许多NANBPTH的引起与HCV感染有关。
虽然已经广泛地接受用HCV作为一种诊断NANBPTH的有力标记物,但仍不清楚是否其它病毒因子也能引起这种综合症,以及在被认为是散发NANBH的情形中,HCV起什么作用。包括本发明人之一的(T.A.)的几个研究人员已经分辨出了编码与来自NANBPTH患者的血清反应的多肽的cDNA序列,该cDNA序列在HCV和其变异体的已知序列中没有(Arima et al.,Gastroenterology Jpn.24:540(1989);Arima et al.,Gastroenterology Jpn.24:545(1989);Arima et al.,Gastroenterology Jpn.24:685(1989);Arima et al.,Gastroenterology Jpn.25:218(1990);Arima和Fukai,EPO申请No.89309261.9(1989))。这些cDNA明显地不由人基因组编码,因此对肝炎病态不具宿主特异性应答。虽然已经确立了它们在诊断中的效用,但仍不清楚它们的来源和与病程的关系。
申请人从NANBH患者的血浆成分制备核酸。通过物理和化学方法,使这些成分富集病毒和类似病毒颗粒。将提取的核酸转变成双链互补DNA(cDNA)并将其导入到λ噬菌体的衍生物中,然后筛选这些含有来自NANBH患者的重组DNA的λ噬菌体,生产能与NANBH患者的血液所含的抗体反应的重组编码蛋白质。
发现称作20E的重组噬菌体包含编码多肽序列的重组DNA插入序列,该多肽序列能与NANB肝炎患者中得到的特定血清发生特异性反应。该多肽抗原检测存在于几个NANB肝炎患者血液中的抗体,并看来在该疾病的检测和筛选中有效用。克隆20E的核苷酸序列和它编码的多肽与被认为引起大多数NANB肝炎病例的病毒(即HCV)无关。另外,看来在人染色体DNA中不含有克隆20E的核苷酸序列。以后的研究结果表明克隆20E包含在与NANB肝炎而不是丙型肝炎病毒相连系的一个外部感染因子的染色体中,因此,它可代表在人类患者中传播NANB肝炎的附加的病原因子或促进因子。
本发明另一方面,申请人描述了各种检测患者样品中抗-20E多肽抗体和20E-相关的核酸的免疫诊断和探针检测方法。通过在重组噬菌体或重组质粒载体相容的宿主细胞中表达或通过化学合成来生产上述的20E多肽。将抗由克隆20E表示的因子的保护性疫苗配成包括一种或多种在20E多肽中代表的免疫诊断抗原决定基的组合物。此外,用本领域技术人员已知的技术很容易生产直接抗一种或多种20E多肽的免疫诊断抗原决定基的多克隆或单克隆抗体。上述抗体或其活性片段被用作抗由克隆20E代表的因子的被动免疫试剂。另外,位于本发明描述的那些DNA序列侧面的DNA序列将在诊断NANBH和其它疾病中有效用。用标准技术可以容易地分离出这些附加序列得出克隆20E序列。
图1:
(A)从含有用野生型λgt11克隆20E感染的大肠杆菌的细菌盘中揭下的,并与患NANB肝炎患者处采集的血浆反应的膜。通过生色酶反应检测与膜结合的抗体,得到一个暗点。
(B)从含有用野生型λgt11感染的大肠杆菌的细菌盘中揭下的并与如图1(A)中所述的同样的血浆反应的膜。
图2:
(A)在λgt11噬菌体克隆20E中发现的重组插入片段的DNA序列。
(B)在λgt11噬菌体克隆20E中发现的重组插入片段的推测氨基酸序列。
图3:
(A)用人酪氨酸羟化酶基因的外显子14连状结合的450bp片段探测的BamHI-消化的人胎盘DNA的Southern转移。
(B)用代表克隆20E序列DNA的链状结合的90bp片段探测的HindⅢ(道1),EcoRI(道2),和BamHI(道3)消化的人胎盘DNA的Southern转移。在相同的凝胶中电泳该图(B)中的DNA,并将其转移到与图3(A)样品相同的膜上。
图4:
(A)与从Serologicals,Inc购买的来自患者02190D(NANB肝炎)的系列血清样品反应的纯化谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白质的Western印迹。星号代表可通过ELISA(Ortho Diagnostics,Inc.)检测的抗-HCV抗体第一个变成为可检测的那份血样。
(B)Western印迹免疫活性比较:经纯化的谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白与上述患者的抗-HCV ELISA反应活性(Ortho Diagnostics,Inc.)。
图5:
(A)与从Serologicals,Inc.购买的来自患者20830D(NANB肝炎)的系列血清样品反应的纯化谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白质的Western印迹。星号代表可通过ELISA(Ortho Diagnostics,Inc.)检测的抗-HCV抗体第一个变成为可检测的那份血样。
(B)Western印迹免疫活性比较:纯化谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白质与上述患者的抗-HCV ELISA反应活性(Ortho Diagnostics,Inc.)。
图6:
(A)与从Serologicals,Inc.购买的患者00269B(NANB肝炎)的一系列血清样品反应的纯化谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白质的Western印迹。星号代表可通过ELISA(Ortho Diagnostics,Inc.)检测的抗-HCV抗体第一个变成为可检测的那份血样。
(B)Western印迹免疫活性比较:纯化谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E蛋白质与上述患者的抗-HCV ELISA反应活性(Ortho Diagnostics,Inc.)(N.D=未做)。
有NANBH诊断效用的多肽以及所代表的对任何其它描述的NANBH没有可检测关系的核酸和氨基酸序列代表着超过现有技术的显著进步。上述的多肽以及相应的核酸对开发一种完全预防和诊断NANBH方法的不懈努力极有价值。本发明包括上述多肽和其相应的核酸序列。
从表现NANBH临床症状的一些患者中得到的汇集血浆单位分离出RNA,在聚乙二醇和氯化钠/柠檬酸钠存在下,通过离心处理使该汇集血浆富集病毒和类似病毒的颗粒。从得到的沉淀中提取RNA并将其转变成cDNA,并将该cDNA克隆到噬菌体表达载体λgt11的EcoRI位点。在大肠杆菌中生长扩增重组噬菌体,通过与NANBH患者的血浆衍生的抗体制剂反应,免疫筛选所得的文库以确定NANBH抗原的存在,通过连续三轮噬菌斑扩散和免疫筛选鉴别并纯化阳性克隆,“20E”。
在图2中给出了克隆20E的cDNA插入段的核苷酸序列,以及推断出的由该插入段编码的氨基酸序列(后文称其为“20E多肽”)。该核苷酸序列或氨基酸序列都未表现出与科学文献中或各种专利申请中报告的HCV的核苷酸序列有任何同源性。克隆20E DNA或氨基酸序列与甲、乙、或丁型肝炎病毒的可获得序列,或按主要数据编入目录中的其它序列都不表现出任何可检测出的同源性。结果,正如与限制性的人基因组DNA的Southern印迹不产生杂交所表明的一样,克隆20E的核苷酸序列看来不存在于人染色体DNA中。
因此,克隆20E代表一种编码新多肽的新核酸序列,该新多肽有一个或多个由表现NANBH临床症状的患者的抗体识别的抗原决定基。与人基因组DNA不产生可检测杂交说明由克隆20E的cDNA插入段代表的核酸序列代表外部感染因子基因组部份而不是HCV。因此,该因子可以表示一种引起人类NANBH的附加促进因素。
得到的推测的20E多肽的氨基酸序列的长度(26个氨基酸),使得在该多肽中不大可能有多于一个或两个NANBH-特异性抗原决定簇。为了进一步研究在20E多肽中代表的一个或多个抗原决定簇的潜在免疫诊断效用,将插入段亚克隆到表达质粒中并在大肠杆菌中将其表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白质。纯化GST-克隆20E融合蛋白,并通过Western印迹检测其对来自附加对照和NANBH患者的血清的免疫反应活性。
Western印迹程序是,将GST-克隆20E融合蛋白固定在固相载体(聚二氟乙烯膜)上用聚丙烯酰胺凝胶进行按大小分级的电泳。然后在能使任何20E多肽特异性(抗-20E)抗体与固定蛋白结合的条件下,使结合的蛋白质与检测的血清反应。用酶标记的信号抗体检测抗-20E抗体的结合。该信号抗体含有碱性磷酸酶共轭的山羊抗-人IgG+IgM。与一种对碱性磷酸酶适当的生色底物反应以提供在特定的患者检测样品中存在或不存在抗20E抗体的可见指示剂。在该免疫诊断模式中,阳性检测结果说明存在夹在固定的GST-克隆20E融合蛋白和信号抗体之间的患者的抗-20E多肽抗体。在没有抗20E多肽抗体的情况下(阴性检测结果),没有形成抗原-抗体-信号抗体复合物,并在上述背景上没有检测到生色反应。
正如下列提供的实施例说明的,20E多肽中代表的一个或多个抗原决定簇有对NANBH的标记诊断效用。因此,15.5%的慢性NANBH患者和24.3%其它形式NANBH(包括急性,散发的和供体相关的NANBH)患者有与20E多肽反应的可检测抗体。相反,71个人中仅1个(1.4%)随机供血者有上述可检测的抗-20E抗体。
为了确定患者血清转变成抗-20E多肽状态的时间过程,将Western印迹免疫检测程序附加于代表三个NANBH患者一系列采血所得的血清样品。用市场上买到的HCV ELISA药盒也可检测这三组血清的抗-HCV抗体。每组系列采集血样均表现出以转变成抗-HCV状态差不多的转变时间完成抗-20E多肽状态血清转变。虽然差不多,但在三组中有两组,有关抗-20E多肽状态和抗-HCV状态转变时间是不同的。
这些免疫检测结果清楚地说明克隆20E核酸和多肽作为对NANB肝炎病特异性非-HCV标记的免疫诊断效用。因此,20E多肽有至少一个诊断NANBH的抗原决定簇。根据本文公开的结果,可以将20E多肽的NANBH-诊断抗原决定簇(一个或多个)的免疫诊断效用定义为:来自NANBH患者血清中的可检测非-HCV免疫反应活性以个体百分比计,比来自普通人群的随机供血者的血清可检测性至少高约十倍。有关抗-20E和抗-HCV状态差不多的血清转变参数说明一种可能的HCV和由克隆20E代表的感染因子的同时感染。用于构建分离克隆20E的噬菌体文库的血清汇集样完全来源于人,并未被告之其对NANBH因子特别加以富集。就是说,不一定将该人血清汇集样分类为“高-滴定度”血清汇集样。相反通过表达筛选用于原始分离HCV的文库是从实验感染的黑猩猩的高滴定度血清中得到的(Choo et al.,Scieuce 244:359(1989))。可能克隆20E是从限于人或至少排除黑猩猩的宿主范围的因子中衍生而来的,用发现HCV的方法检测不到该因子。
在任何使用多肽靶的免疫检测模式中,20E多肽都是有用的。在该模式中,将20E多肽,20E多肽片段,或与另一分子耦合的20E多肽(或其片段)例如融合蛋白,涂复于固相基质如顺磁微颗粒上。可以用钝性的或共价的涂复方法将多肽连接到固相基质上。在抗-20E多肽抗体存在的情况下,经保温阶段,用磁分离法从任何未反应的抗体中分离出结合的抗体-20E多肽复合体。与连有信号酶(如碱性磷酸酶)的抗人抗抗体反应,进行复合抗-20E抗体的检测(正如上面Western印迹模式所述)。当用磁分离法将顺磁颗粒上标记的复合物分开并洗涤后,加入产生信号的底物。测量到的信号量与样品中存在的抗-20E抗体量成正比。
在另一修改实施方案中,可以将本发明的20E多肽按经典酶连免疫吸附检测(ELISA)法涂复于微滴平盘孔上,与样品一起培养,洗涤并加入酶-共轭的抗人抗血清。按径向分配层析法,也可以用玻璃纤维滤器作为固相基质。检测按常规进行,加入适当的底物/生色剂并测量所得的产物。有关ELISA的一般讨论参见Langone et al.,Immunological Techniques,Part D Immunoassay.In:Methods in Enzymology,P.84(1982)。
适用于本发明多肽的其它可替换检测方法包括(但不限于)如上文所述的Western印迹法并参见Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:4350(1979);放射免疫检测法(Walsh et al.,J.Infect.Dis.21:550(1970));竞争检测法(Diamandis,Clin.Biochem.21:139(1988));非竞争检测法(Crook et al.,J.Gen.Uirol.46:29(1980));免疫沉淀法(Tojo et al.,Clin.Chem.34:2423(1988));点印迹法(Jahn et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1684(1984));和PCFIA(Jolley et al.,J.Immunol.Meth.67:21(1984))。
20E多肽和其片段也有作为预防、改善或治疗NANBH的疫苗的潜在效用。如在下文实施例4或5中记载的,20E多肽代表的抗原决定簇显示出能与某些NANBH患者血清中存在的抗体反应。因此,很可能20E多肽或其片段,如果需要,与适当的载体大分子耦合[参见Golub,E.S.Immunology:A Synthesis(1987)]将在用其免疫的人中产生NANBH-特异性免疫应答。可以从重组载体中表达该20E多肽或其适当片段或由化学方法合成生产,使其成为分离多肽或融合蛋白的成分。为了引发直接抗由20E多肽代表的病原因子的免疫应答,可以与本领域专业人员已知的药物学上可接受的载体(参见,Golub上文)结合,给人施用该多肽或融合蛋白。
用已知方法,也可以用20E多肽产生能起被动免疫治疗成份作用的物质。例如,可以用20E多肽或其片段生产直接抗由20E多肽代表的因子的多克隆或单克隆抗体。直接将其混入药物学上可接受的载体中注射到患者的血液中,上述抗体,或其免疫反应活性部份可将免疫性赋予20E因子。被动免疫的基本原理是所注射的抗体(不依赖于患者的内源性免疫系统)结合于病源因子上有利于失活和去除致病因子。已经发现被动免疫对很多疾病因子来说至少赋予暂时免疫是有效的。例如,单克隆抗体的被动免疫具有对几种黄热病病毒抗性[Schlesinger et al.,Technological Advance in VaccineDevelopment(L.Laskey,ed.)Page 11-20(1988)]。相似地,多克隆抗体的被动免疫具有对猿免疫缺陷病毒类型2的抗性[Putkonen et al.,Nature 352:436(1991)]。
用多肽为起始物质生产多克隆和单克隆抗体的方法在科学文献中多有记载。例如,可在含结合到固相上的20E多肽的柱上亲和纯化用20E多肽免疫的主体的免疫球蛋白部分,提供直接抗20E多肽的多克隆抗体的纯化制剂。同样,可以用20E多肽生产分泌直接抗20E多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。用描述过的已知方法,如Kohler,Science 233:1281(1986),可以生产该杂交瘤,并分离和提纯分泌的单克隆抗体。
公开的克隆20E的核酸序列也将用于各种用核酸靶的检测模式中。如,可以用克隆20E核酸序列作为探针检测患者血清或组织中克隆20E-相关的核酸的存在。用适当的放射性标记(如,32P)或用适当的非放射性标记(如,生物素)来标记克隆20E序列,或其片段,并将其与来自患者血清或身体组织的扩增或未扩增的核酸杂交。为将患者血清或身体组织中的核酸扩增,可以使用本领域专业人员已知的任何扩增系统。例如,可以合成以公开的克隆20E序列为基础的引物并将其用于多聚酶链反应(PCR)以扩增从血清或组织中提取的DNA(或从RNA衍生的cDNA)。在Mullis等人的U.S.专利Nos.4,683,202和4,683,195中描述了完成PCR的各步骤。可以用Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874(1990)中描述的自我维持序列复制(3SR)扩增在血清或组织中的RNA靶序列。在3SR中,首先合成含噬菌体启动子的同源cDNA来扩增RNA序列,接着消化RNA-cDNA双链的RNA链(由于在反应混合物中存在RNAase H活性),并合成长于第一个cDNA的第二个DNA链以形成DNA双链,用DNA依赖性RNA多聚酶转录该DNA双链。然后用转录产物作为底物合成更多的这类cDNA,接着转录并重复上述步骤。另一种产生RNA的扩增方法叫做转录基础的扩增系统(TAS),首先由Gingeras等人在WO 880617和WO 880729中公开的。与3SR不同,由于没有外源性RNAase H活性存在以消化RNA-DNA双链的RNA链,TAS需要通过变性进行链分离。就cDNA合成的连续循环需要变性交替循环而言,TAS表面上类似PCR。
可以在原位(如,在组织学组织切片上)或以提取核酸完成与扩增的或非扩增的核酸杂交,并用液体闪烁计数,放射自显影,或检测非放射性标记的适当技术来检测。有关核酸杂交技术的综述参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd.Ed)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)。据信可以用本领域专业人员可获得的方法生产相应于图2A中公开的序列的RNA序列,并在适当的情况下将其用作RNA探针。
按上面所述,可将与靶核酸能形成可检测杂交的完整克隆20E序列或其任何适当诊断片段用于核酸杂交。同样可知,可以用标准的位点特异性诱变方法或其它技术(参见,Sambrook et al.,上文)很容易地改变克隆20E序列以便提供一组用于检测已经诱变变异的克隆20E-相关的NANBH因子的探针。例如,已知许多RNA病毒是高度可变的,必需用上述参考文献已知方法来提供适于上述变异体最佳检测的克隆20E-相关序列。一般在低到中等严紧度洗涤条件下[即,在同时考虑温度和盐浓度的情况下,计算的较好匹配的20E-20E杂交的解链温度(Tm)大约在20℃-30℃以下;参见Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1982);Sambrook et al.,上文]能与所公开的克隆20E序列杂交的任何核酸序列均具有用作克隆20E代表的因子的诊断探针的潜在效用。
在类似的方法中,根据遗传密码的简并性,公开的20E核酸序列可以在各密码子第三位上改变而不改变其编码的氨基酸序列。另一方面,应强调,在氨基酸序列中的小变化(如取代,增加或缺失)对检测结果影响不明显,因为公开的20E多肽代表的抗原决定簇(一个或多个)没有被改变到在对20E因子的检测中,破坏上述所改变的多肽的免疫诊断效用的程度。因此,认为在结构上有上述小改变的多肽和相应的抗原决定簇本质上是与公开的克隆20E核酸序列编码的多肽和抗原决定簇相似,或等同的。
用标准方法很容易得到位于相当于公开的克隆20E核酸序列的基因组序列两侧的代表基因组序列的其它核酸序列。这样的序列,无论在20E序列的5′或3′,均可以增强公开的克隆20E核酸序列的诊断效用,或者作为核酸探针可有分离效用。另外,上述序列可以编码增强公开的20E多肽诊断效用的氨基酸序列,或者可以编码其它有独立免疫诊断效用的NANBH抗原决定簇。鉴别并分离上述侧核酸序列的方法(染色体“爬行”或“走动”)是本领域专业人员熟知的。有关综述分离侧面序列的各种方法,参见Sambrook等人上述文献。例如,可以用公开的克隆20E序列的5′或3′末端部分特异性寡核苷酸探针再筛选上述提及的并在下文实施例中描述的λgt11文库。因此,可以分离与原始分离克隆20E重叠的克隆,它将含在公开的克隆20E序列侧面的核酸序列。此外,可以将以公开的克隆20E序列为基础的寡核苷酸用作引物以生产可从其中分离其它侧面克隆的新cDNA文库。
如下列实施例所述,将公开的20E核酸序列克隆在噬菌体和质粒载体中,在大肠杆菌(如,其它原核宿主,酵母和其它真核宿主如哺乳动物细胞)中,从上述载体表达20E多肽,对本领域技术人员来说也是可行的(Sambrook et al.,上文)。
可用于亚克隆和/或表达克隆20E或相关序列的载体包括这样一些载体,即在该载体中,DNA序列(如由克隆20E代表的)可以被插入任何能使得插入序列达到最佳转录和转译必需的其它元素。上述载体可被转移到上述的一个或多个宿主细胞类型中并在其中复制。优选在本发明所用的载体具有某些或全部下列特征:(1)扩展期间可在宿主细胞中稳定保持;(2)在所需的宿主细胞中以高拷贝数增殖;(3)有能启动插入序列转录的序列;(4)有编码可选择特征如药物抗性的序列;和(5)有能终止转录的序列。为能表达,优选的载体包括至少一个启动子,至少一个Shine-Delgarno序列[核糖体结合位点;Shine and Delgarno,Nature 254:34(1975)]或类似序列和引发密码子,至少一个终止密码子,和至少一个编码分泌前导序列或信号序列的序列。用科学文献中描述的方法可以将任何对克隆20E相关序列的转录和/或转译必需的元素加到载体中。在Sambrook等人上文,第1-4,8,9,16和17章中提供了在适宜于真核和原核宿主的载体中克隆并表达插入序列的一般方法和大量的实例。酵母载体可包括如Burke等人在Science 236:806(1987)中描述的酵母人工染色体载体。
公开的克隆20E核酸序列显示出没有经典的一致糖基化位点。这说明从真核和其它宿主细胞表达的20E多肽应该有公开的20E多肽的功能抗原决定簇特征。因此,有关适当宿主细胞(正如需要特异糖基化特征的各种蛋白所遇到的情形)的不可预料性不应是与20E多肽序列和其相关序列有关的一个因素。
在另外的实施方案中,可以用已知方法化学合成克隆20E核酸序列和其片段,以及20E多肽和其片段。有关核酸化学合成的综述参见Narang,Tetrahedron 39:3(1983)和Itakura et al.,Ann.Rev.Biochem.53:323(1984))。可以用市场上购买的自动肽合成器如Milligen-Biosearch Model 9600 Peptide Synthesizers化学合成所需序列的多肽。
将用下列有关的实施例详细描述本发明,但其不应构成对本发明范围的限制。
实施例1
克隆20E的分离和DNA特征描述
在从NANBPTH患者汇集血浆中制备的cDNA文库的免疫筛选中,用下列方法鉴别能与NANBPTH患者血清反应的噬菌体克隆(20E):
步骤1:通过低速离心澄清来自出现NANB肝炎临床症状的个体的血浆单位以除去血纤维蛋白并将其汇集在一起。以40克/升的浓度将聚乙二醇4000(PEG)加到澄清的血浆中,并在冰上搅拌溶解30分钟。在4℃以7000×g将悬浮液离心20分钟,并将沉淀再悬浮于含0.5%柠檬酸钠的10-30ml 0.5%NaCl中。在4℃将再悬浮的沉淀培养2小时,然后在4℃以3600×g离心20分钟。然后从所得的沉淀中提取RNA。
步骤2:用异硫氰酸鈲,接着用Chomczynski和Sacchi,Anal.Biochem.162:156(1987)描述的酚:氯仿,从PEG/NACl沉淀提取RNA。用异丙醇和乙醇将病毒核酸沉淀几次。用氢氧化甲基汞变性,接着用商业药盒(C-Clone Ⅱ Clontech)反转录来完成转变成cDNA的过程。用S1-核酸酶和EcoRI甲基化酶处理双链cDNAs,并用T4DNA多聚酶切成平整末端。用EcoRI接头连接后,将cDNA连接到λgt11臂(Stratagene)中,并将其包装入噬菌体头(Gigapack Ⅱ Gold;Stratagene)。所得的噬菌体文库代表约1千万个克隆,约66%含插入片段。
步骤3:将100ml大肠杆菌菌株Y1090R-培养物在由LB液体培养基组成的培养基中长至600nm波长处光密度为0.5,该LB液体培养基含50μg/ml氨苄青霉素,0.2%W/V麦芽糖和10mM MgSO4。离心沉淀细菌,并将其再悬浮于9.2ml的冰冷却10mM MgSO4中。
将各300μl SM缓冲液(50mM Tris-HCl PH7.4,100mM NaCl,10mM MgSO4W/V明胶)中的代表50,000噬菌斑形成单位的噬菌体悬浮液与各450μl上面制备的细菌悬浮液混合,并将其在37℃,150rpm搅拌15分钟。然后将各试管加热到47℃,并将9ml高质量琼脂(在含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中0.75%W/V)加到各个含噬菌体的细菌试管中。然后将这些试管中物倒入直径为150mm,含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平盘表面上,使其凝固,并在42℃倒置培养。培养约3小时后,出现可见噬菌体斑。然后用已预先在10mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(BRL)中浸过的直径为137mm的硝化纤维素滤膜覆盖该培养盘,并使其干燥。在37℃将培养平盘再培养3小时,用沾墨水的针刺穿膜和菌学培养基数次来标记膜取向。然后从培养平盘上除去膜,用蒸馏水洗涤,并放置一旁干燥。然后在室温下将干燥的滤膜放在1×TBS(0.1M Tris PH7.4,0.5M NaCl,0.1%W/V NaN3)中的2%W/V脱脂奶粉的溶液中15-60分钟培养。
步骤4:从三个怀疑患有NANB肝炎的个体中汇集血浆(各10ml),并按如下说明将其预吸附到细菌溶菌产物中:以8000psi在APV Gaulin挤压器中,将细菌细胞沉淀(从4升培养物中得到的)均浆处理3个回合制备大肠杆菌Y1090R-溶菌产物。按制造商的说明将溶菌蛋白(120mg)与10ml洗涤过的,活化Sepaharose-4B(Pharmacia)偶合。将偶合的溶菌产物分成两等份,用5ml 0.1%SDS将第一份处理10分钟,接着每次用30ml×TBS洗涤3次(柱A)。柱B由未用SDS处理的其余偶合溶菌产物组成。将用于免疫筛选的汇集血浆加到1×TBS中的12ml溶解的大肠杆菌Y1099R-溶菌产物(30mg/ml蛋白)中,该1×TBS含10mM EDTA和2mM苯基甲基磺酰氟(BRL)。在室温下将混和物振荡1小时,然后在7100×g离心10分钟。使上清液通过上文描述的柱A,并将洗脱液两次通过上述柱B。在室温下,将最后一次洗脱液(约45ml)与另外112ml溶解的大肠杆菌溶菌产物(30mg蛋白/ml)一起培养30分钟。将混合物以7100×g离心10分钟。用TBS中的960ml 2%W/V脱脂奶粉稀释40ml上清液(等于10ml未处理的汇集血浆)。
步骤5:将步骤3的膜抽吸处理除去牛奶/TBS溶液,并将20ml步骤4的处理过的抗体加到各滤膜上。将膜与抗体溶液在室温下轻轻振动接着过夜。然后抽吸除去抗体溶液,用TBS/Tween溶液更换6次洗涤膜30分钟。在含2%脱脂奶粉的1×TBS中以1∶3500稀释碱性磷酸酶共轭的山羊抗-人IgG/IgM(Jackson Immunoresearch)。在室温下,将各膜在各20ml的上述稀释二级抗体上清液中培养2.5小时,然后用1×TBS/Tweew 20更换6次洗涤。在最后一次洗涤后,将膜在50mM Tris-HCl PH9.5中浸10分钟。将基质溶液(含66μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对-甲苯胺盐[在DMF中50mg/ml]和88μl氯化氮蓝四唑[在70%DMF中75mg/ml]的PH9.5的590mM Tris-HCl,每膜20ml)加到滤膜上,并培养直到反应活性噬菌斑变暗(2-7分钟)为止。用1%V/V冰乙酸溶液洗涤5分钟接着用水漂洗而中止反应。
反应活性噬菌斑识别出为直径约1mm的黑色污迹圆圈,通常象“炸面包圈”样子。发现称为20E的克隆与NANBH患者汇集血清反应。用与膜匹配的菌学培养盘检出噬菌体噬菌斑,用Pasteur吸管的宽末端从培养平盘中除去琼脂糖块。在含50μl氯仿的1ml SM缓冲液中于4℃过液培养而洗脱块中的噬菌体。用本实施例上文所述的三次连续的免疫筛选循环富集并纯化噬菌体克隆。
将纯化的克隆和野生型λgt11分别以每平盘500菌斑形成单位的密度铺于平盘上,并使其与本实施例上文所述的NANBH采集的血清反应。图1中表示这些噬菌体噬菌斑的免疫染色显影。纯化噬菌体形式的克隆20E保藏于美国典型培养物收集中心(ATCC保藏号:No.)。
实施例2
克隆20E的DNA和编码的氨基酸序列
进行下列步骤以确定在噬菌体克隆20E中所含的重组插入片段的DNA序列:
步骤1:将由免疫筛选选择的噬菌体克隆20E的重组DNA插入片段,用位于λgt11的EcoRI克隆位点侧面的引物L Ga:5′-ACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTA-3′(SEQ ID NO:1),LG2:5′-GGTAATGGTAGCGACCGGCGCTC-3′(SEQ ID NO:2)通过PCR来扩增,用该酶将其裂解,克隆到质粒pUc19中,然后亚克隆到M13mp 19RF DNA中而定序。根据商业药盒(Sequenase 2.0,United States Biochemical)提供的方法,用通用引物和修饰的T7DNA多聚酶确定插入片段的单链DNA(ssDNA)序列。通过碱变性后,测定克隆到质粒载体中的用于基因表达(参见下文实施例4)的插入片段的序列,以便确定带给20E免疫反应活性的插入片段的取向。
下文图2复制由上述方法确定的克隆20E的重组DNA序列,和由它编码的推测氨基酸序列。序列中没有经典的N-结合的或O-结合的糖基化作用位点。
对该DNA和其编码的蛋白质序列分析表明,它们与现有科学文献或各种专利申请中报道的有关HCV的序列之间没有可检测水平的同源性。该克隆20E DNA或氨基酸序列与甲乙,或丁型肝炎病毒的现有序列,与上文Arima等人的文章和专利申请中公开的序列,或与1991,10,8检索Gen Bank和EMBL数据库中的任何其它序列之间也都不具可检测到的同源性。
实施例3
克隆20E与人DNA的相关度
为了确定是否在人基因组中含被鉴定为克隆20E的DNA序列,按如下方法进行直接DNA∶DNA杂交:
步骤1:用EcoRI,HindⅢ或BamH Ⅰ限制酶消化从市场(Clontech)购买的10微克人胎盘DNA。然后在20V,0.7%琼脂糖凝胶中电泳消化的DNA样品。按制造商(Pharmacia-LKB)的说明,用真空印迹系统,将按大小分离的DNA片段从凝胶上转移到Oncor SURE BLOT膜上。
步骤2:用下列寡核苷酸引物:(A37G):5′-AATAAGCTTGTGACGGTGATTGGGGCAGCAGACA-3′(SEQ ID NO:3),(T39T):5′-TAAGAATTCGAGCTATGCCTCACGCCATCCAGCGCCCCTT-3′(SEQ ID NO:4)从0.5μg人胎盘DNA,经多聚酶链反应技术扩增酪氨酸羟化酶基因的外显子14的片段,作为对单拷贝人基因的阳性对照。
分离出一个约460个碱基对的扩增带,然后用HindⅢ和EcoRI将其消化。将消化的DNA亚克隆到HindⅢ/EcoRI消化的pUc19质粒中,DNA测序确认它是酪氨酸羟化酶基因的一部分。经下列方法将上述纯化的酪氨酸羟化酶基因自我连接以形成连成一串的DNA:用HindⅢ和EcoRI限制核酸内切酶消化,从100μg pUC19质粒中释放出基因片段,并在2%琼脂糖凝胶中电泳从质粒DNA中将其分离。
用Vogelstein和Gillespie,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:615(1979)的方法从凝胶中洗脱DNA片段。采用乙醇沉淀法浓缩洗脱的DNA,并用分光光度方法定量,用T4DNA连接酶和标准方法[Sambrook et al.,上文(1989)]将500ng的量相连形成连成一串的基因片段。同样,将pUC19中的20E序列切成EcoRI片段并将其连成一串。用大肠杆菌DNA多聚酶的Klenow片段和α-32P标记的dATP借助缺口转译分别标记连成串的DNA形成放射性探针[Sambrook et al.,上文(1989)]。基因片段连成一串对于提供欲作为缺口转译底物的足够长的DNA底物(产生高度特异性反应活性的放射性DNA探针的优选方法)是必需的。
步骤3:用膜批发商(Oncor)建议的溶液(Hybrisol 1)将含消化的人DNA的膜进行预杂交和杂交。将DNA探针加到塑料袋中所含适当的膜中,其浓度为每分钟、每毫升杂交溶液中计数为1×106。在45℃过夜搅拌培养印迹和探针。
除最后一次洗涤在57℃完成外,按制造商的说明洗涤印迹。在-70℃将干燥印迹于两个Dupont Cronex增强屏之间的Kodak Xomat AR诊断胶片上曝光16小时。按制造商的说明将胶片显影,示于图3。
实施例4
20E多肽与对照样和NANBH血清样的反应
用EcoRI消化含克隆20E插入片段的质粒pUC19,并将20E片段亚克隆到质粒载体pGEX-2T的变异体中[Smith and Johnson,Gene 67:31(1988)]。用BamHI限制核酸内切酶消化打开质粒pGEX-2T,以大肠杆菌DNA多聚酶的Klenow片段作用填充悬垂末端,并将平整末端连接在一起构建该变异体(称作pGEX-2Ta)[Sambrook et al.,上文(1989)]。按上述方法,在大肠杆菌菌株DH5α中,从质粒pGEX-2Ta表达由克隆20E编码的肽,为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白[Smith and Johnson,上文(1988)]。含克隆20E插入片段的质粒pGEX-2Ta保藏在美国典型培养物收集中心(ATCC保藏号No.)
将GST融合蛋白与原用于Western印迹试验分离λgt11-克隆20E噬菌体(见下文)的血清反应。该结果令人惊奇,因为该修饰的载体从分离λgt11插入基因不能产生框架内蛋白表达产物。由于融合前导序列与这些序列的EcoRI插入位点的不正确对应排列,在该加工过程中,从λgt11分离的其它插入片段不能在pGEX-2Ta中表达成蛋白质。这些结果表明,该克隆20E序列是不正常的,即在λgt11中其免疫原表达在于原λgt11-克隆20E噬菌体中不正常的序列对应排列所致。这种不正常的序列对应排列可能由于在分子的5′末端存在两个EcoRI接头,而序列对应排列的准确性质未予确定。用Abath and Simpson,Peptide Res.3:167(1990)的方法纯化GST-克隆20E融合蛋白。同样从不含20E插入片段的未修饰pGEX-2T的细菌培养物中纯化谷胱甘肽-S-转移酶。
用Laemmli不连续缓冲系统[Laemmli Nature(Lond)227:680(1970)],通过十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE),按两步完成pGEX谷胱甘肽-S-转移酶(GST)20E Western印迹带的制备。该凝胶包括12%分离凝胶(PH8.8)和4.5%积层凝胶(PH6.8)。将纯化的GST-20E抗原上样,在水浴中煮沸5分钟的2%SDS,0.125M Tris PH6.8,10%甘油,1%2-巯基乙醇和0.02%焦宁Y显迹染料中电泳,将样品分成2×128μl等分(每份2.7μg),放到两个预备井(各64mm宽)中,并以恒定流电泳直到显迹染料到达凝胶的底部。
从分子量的对数对相邻5mm泳道上移动的彩色分子重量标记(Amersham Corp.Arlington Heights,IL)的电泳迁移率标准图外推,估计出GST-20E的表观分子量,发现等于预计的融合蛋白分子量。在罐装置(Hoeffer,San Francisco,CA)中,将分离开的蛋白质电转移到Towbin等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350(1979)]描述的置于Tris-甘氨酸系统中的二氟聚乙烯膜(Millipore,New Bedford,MA)上。转移后,如Johnson等人[Gene Anal.Tech.1:3(1984)]所述将该膜封闭于等渗缓冲盐水(IBS;Baxter Scientific Products)的5%脱脂奶粉溶液中。在IBS中简单地漂洗该膜,切成3mm×120mm的条,然后要么立刻使用,要么在-20℃贮存。将Western印迹条放在各含5%脱脂奶粉的2ml等渗缓冲盐水的培养容器(Bio-Rad Laboratories)的沟槽中。用无20E插入片段的100μg(50μl-100μl)纯化的pGEX GST将对照样和检试(20μl)样预培养15分钟预吸收GST-反应抗体。
将处理过的样品直接加到上述各槽中并在室温下过夜轻轻搅拌培养。培养后,用含0.01%NaN3的5ml 0.05MTris 3M NaCl PH8.0将各条洗四次持续5分钟,接着用只含IBS的溶液5ml再洗涤2次。然后在IBS5%脱脂奶粉溶液(1∶3500)中将上述条与碱性磷酸酶共轭的山羊抗人IgG+IgM(Jackson Immunoresearch,Westgrove,PA)一起培养2小时。接着,用5ml IBS 0.3%Tween-20将上述条洗涤3次5分钟。将来自一个反应容器的条(多至25条)转移到一个平底塑料盒(19×16cm)中,并用0.05M Tris PH9.5,0.05%NaH3(底物缓冲液)洗涤两次5分钟。
用Blake等人[Anal.Biochem.136:175(1984)]描述的于底物缓冲液中用氮蓝四唑鎓/5-溴-4-氯-吲哚磷酸盐系统将上述条显影,并在暗室中于印迹纸上空气中干燥。用各组样品进行强反应活性,弱反应活性和阴性对照对比试验。用以免疫筛选池中所使用的血清之一(实施例1)显影的对照Western印迹的相对强度来评估临床样品的反应活性。就检测的抗克隆20E噬菌体噬菌斑来说,该血清是该池中两个具反应活性血清之中较弱的一个。当与对照的血清相比时,鉴定为具反应活性的Western印迹有等于或大于20E特异性带的显色强度。在下表1中给出了这些实验的结果。
表1
克隆20E融合蛋白与血清的反应
人群 反应活性
随机供血者1/17 (1.4%)
慢性NANBH 18/116 (15.5%)
其它NANBH 9/37 (24.%3)
对表1的说明:将Western印迹转移物与临床样品一起培养,并评估与克隆20E融合蛋白带(M.W.32,000)反应或不反应。反应活性表示为全部Western印迹检测中所用的对照血清的相对值。该血清是由噬菌斑生成发现克隆20E所用的原汇集血清的成分,噬菌斑-寿命检测中,代表两个汇集血清中反应活性较弱者。判断为具反应活性的样品是在着色密度上等于或大于对照血清的。
将来自美国、英国、和日本的调查者的临床样品分成慢性NANB疾病,或其它NANB疾病(包括急性,散发性,和供体相关性的)。随机供血者来自美国人群。
实施例5
20E多肽与NANBH系列血样的反应
为确定是在临床患病期间还是在其后NANBH患者血清转换成抗-20E,使用对谷胱甘肽-S-转移酶/克隆20E融合蛋白的Western印迹来检测代表3个NANBH患者的系列血样的血清样品。按实施例4中所述处理并检测这些血清样品。血清样品从市场购买(Serologicals,Inc.),经一种商业检测法(Ortho Diagnostic System,Inc.)对所买样品进行检测表明,这些患者是NANBH病后转变为抗-HCV C-100蛋白的。用市场上购买的HCVELISA药盒,检测这三组血清样品的抗-HCV抗体。在图4,5,和6中提供这些实验结果。每组系列血样表现出血清转变成抗-20E多肽状况与转换成抗-HCV状况其转换日期是差不多的。虽然差不多,但三组样品的两组中,有关抗-20E多肽状态和抗-HCV状态的转变日期是不同的。即在一病例中,血清转换为抗-20E状态日期滞后于血清转换为抗-HCV状态一个取样期(图5);而在第二病例中,是血清转换为抗-HCV状态滞后(图6)。
上文的详细描述仅供更好地理解本发明,不背离所附权利要求的精神和范围的一些改变对本领域专业人员来说是显而易见的,所以不应理解为对本发明的限制。
序列目录
(1)一般资料:
(ⅰ)申请人:Ryan,Terence E
Saeed,Badr
Kieselburg,Mark K
Byrne,Robert E
Stevens,Priscilla W
Arima,Terukatsu
Todd,John A
(ⅱ)发明题目:适用于诊断肝炎病患的DNA序列和编码肽
(ⅲ)序列数目:7
(ⅳ)有关地址:
(A)收信人:Baxter Diagnositics Inc.
(B)街道:One Baxter Parkway,DF2-2E
(C)城市:Deerfield
(D)州:Illinois
(E)国家:美国
(F)邮政编码:60015
(ⅴ)计算机可读形式:
(A)介质类型:Floppy盘
(B)计算机:IBM PC兼容的
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release #1.0,Version #1.25
(ⅵ)该申请的资料:
(A)申请号:US
(B)申请日:
(C)分类号:
(ⅲ)代理人/代理资料:
(A)名字:Barta,Kent
(B)登记号:29,042
(C)查询/备审案卷号:PA-4171
(ⅸ)通讯情报:
(A)电话:708/948-3308
(B)传真:708/948-2642
(2)SEQ ID NO:1的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:23个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:未知
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:其它核酸,合成的寡核苷酸
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:1:
ACGACTCCTG GAGCCCGTCA GTA
(2)SEQ ID NO:2的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:23个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:未知
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:其它核酸,合成的寡核苷酸
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:2:
GGTAATGGTA GCGACCGGCG CTC
(2)SEQ ID NO:3的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:34个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:未知
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:其它核酸,合成的寡核苷酸
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:3:
AATAAGCTTG TGACGGTGAT TGGGGCAGCA GACA
(2)SEQ ID NO:4的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:40个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:未知
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:其它核酸,合成的寡核苷酸
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:4:
TAAGAATTCG AGCTATGCCT CACGCCATCC AGCGCCCCTT
(2)SEQ ID NO:5的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:78个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:双链
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:cDNA,对基因组RNA互补
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:5:
AATTCCGGGA AGGTAGTGTC AGGTTTTGCG CCCACGCACA
AAGCGCCTCA ACGTTCTGTT TTTGCACCGC CGGAATTC
(2)SEQ ID NO:6的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:78个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:双链
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:cDNA,对基因组RNA互补
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:6:
GAATTCCGGC GGTGCAAAAA CAGAACGTTG AGGCGCTTTG
TGCGTGGGCG CAAAACCTGA CACTACCTTC CCGGAATT
(2)SEQ ID NO:7的资料:
(ⅰ)序列特征:
(A)长度:26个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:未知
(D)拓扑结构:未知
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:7:
Asn Ser Giy Lys Val Val Ser Gly Phe Ala Pro Thr His Lys
1 5 10
Ala Pro Gln Arg Ser Val Phe Ala Pro Pro Glu Phe
15 20 25
Claims (27)
1、一种纯化和分离的DNA分子,包含编码具有多肽免疫诊断效用的多肽的DNA序列,该序列在序列表中定义为SEQ ID NO∶6。
2、权利要求1的纯化和分离DNA分子,其中所述的DNA序列包含在序列表中由SEQ ID NO:5所定义的DNA序列。
3、权利要求1的纯化和分离DNA分子,其中,所述的DNA序列包含编码多肽的DNA序列,该序列在序列表中定义为SEQ ID NO:6。
4、一种纯化和分离的DNA分子,包含编码一个在氨基酸序列中具有一个与NANBH-诊断抗原决定簇基本相似的抗原决定簇的多肽的DNA序列,该序列在序列表中定义为SEQ ID NO:6。
5、一种纯化和分离的核酸,包含一个在低到中度严紧性洗涤条件下,可与一个DNA分子杂交的核酸序列,所述的DNA分子选自下列一组序列:
在序列表中由SEQ ID NO:5所定义的DNA序列;和
一个与在序列表中由SEQ ID NO:5所定义的DNA序列互补的DNA序列。
6、权利要求5的纯化和分离的核酸,其中,所述的核酸序列包含一个DNA序列,所述的DNA序列选自下列一组序列:
在序列表中由SEQ ID NO:5所定义的DNA序列;和
与在序列表中由SEQ ID NO:5所定义的DNA序列互补的DNA序列。
7、权利要求5的纯化和分离的核酸,其中,所述的核酸序列包含一个RNA序列。
8、一种纯化和分离的核酸,包含在低到中度严紧性洗涤条件下可与一个基因组序列杂交的核酸序列,该基因组序列位于相应的在序列表中由SEQ ID NO:5定义的DNA序列的基因组序列的侧面。
9、一种多肽,包含具有多肽诊断效用的氨基酸序列,在序列表中由SEQ ID NO:6定义。
10、一种多肽,包含具有基本上相似于NANBH多肽中的诊断抗原决定簇的抗原决定簇的氨基酸序列,在序列表中由SEQ ID NO:6定义。
11、一种多肽,包含在序列表中定义为SEQ ID NO:6的多肽的氨基酸序列。
12、一种包含权利要求1的DNA序列的载体。
13、一种包含权利要求4的DNA序列的载体。
14、一种包含权利要求5的核酸序列的载体。
15、一种包含权利要求8的核酸序列的载体。
16、一种用权利要求12,13,14或15的载体转化的宿主细胞。
17、权利要求16的宿主细胞,其中所述的宿主细胞是一种原核细胞。
18、权利要求16的宿主细胞,其中所述的宿主细胞是一种真核细胞。
19、一种制备一种多肽的方法,该多肽具有在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的多肽的免疫诊断效用,该方法包括:
在适于所述多肽表达的条件下,培养权利要求16的转化的宿主细胞;和回收所述的多肽。
20、一种制备一种多肽的方法,该多肽具有在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的多肽的免疫诊断效用,该方法包括:
化学合成所述的多肽。
21、一种诊断NANBH的方法包括:
用具有在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的多肽的免疫诊断效用的多肽与来自患者的血清接触;并
确定所述血清是否包括能与所述多肽发生免疫反应的成分。
22、一种筛选输血血液的方法包括:
从所述的血液中分离血清;
用具有在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的多肽的免疫诊断效用的多肽与所述的血清接触;
确定所述的血清是否包括能与所述多肽发生免疫反应的成分;和以上述测定为基础将所述血液分类和处理。
23、一种在人体组织中检测NANBH因子的基因组存在的方法,包括:
将人体组织的扩增或未扩增的核酸与包含权利要求5的核酸的探针,在能启动所述探针与所述基因组杂交的条件下接触;和
确定所述的探针是否与所述人体组织的所述核酸杂交。
24、一种预防,改善或治疗NANBH的疫苗,包含一种具有在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的多肽的免疫诊断效用的多肽,和一种药物学上可接受的载体。
25、一种纯化和分离的多肽,所述多肽包含一个抗体的抗原结合位点,所述的抗原结合位点具有与在序列表中由SEQ ID NO:6所定义的NANBH多肽中的诊断抗原决定簇基本相似的抗原决定簇特异性。
26、权利要求24的多肽,其中,所述的多肽是一种单克隆抗体。
27、一种对抗NANBH被动免疫的组合物,含有权利要求24的多肽和一种药物学可接受的载体。
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