CN1304453A

CN1304453A - 一株疫苗诱导乙型肝炎病毒株极其应用

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Publication number: CN1304453A
Application number: CN98814200A
Authority: CN
Inventors: 温崇仁; 林玉娇; 梁爱玲; 赵奕; 陈维宁
Original assignee: Government of Singapore
Current assignee: Government of Singapore
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2001-07-18
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: CN1255540C; NO20006457L; TR200003778T2; CA2332173A1; KR20010106128A; MY135991A; AU7795098A; BR9815912A; US7038035B1; PL345203A1; US20070026422A1; MXPA00012724A; EP1086232A1; AU756858B2; BG105065A; AR020092A1; HUP0103258A3; WO1999066047A1; KR100498117B1; NZ508892A

Abstract

本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原－‘S’－145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株,其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏,登记号为P97121504、P97121505和P97121506。本发明还提供编码如下一种多肽的分离核酸以及纯化的肽,其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原,所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同,其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。本发明进一步提供编码如下一种肽的分离核酸及其纯化的肽,其中所说的肽由含有SEQ ID NO:l的527至595核苷酸的核酸分于编码。本发明还提供使用所公开的分离核酸和多肽的各种方法。本发明还提供所说病毒株及其蛋白的各种应用。

Description

一株疫苗诱导的乙型肝炎病毒株及基应用

在整个申请中，各种参考文献在括号内给出。这些出版物的公开内容作为本发明的参考文献在此全文引入，来更全面地描述本发明所属领域的现状。

发明背景

本发明涉及在主要表面抗原中的145位氨基酸残基带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒基因组、它的核苷酸序列、诱导的4种主要蛋白序列、抗原、抗体、检测系统、有效疫苗开发和抗病毒试剂。

乙型肝炎病毒在1963年被首次发现，它是一种非胃肠道传播的人类病毒。虽然这些病毒没有显著的细胞毒性，不会导致大规模的细胞死亡，但它们是一种在世界范围内同时影响成年人和儿童的主要传染病的病因。乙型肝炎表面抗原的存在被作为乙型肝炎病毒携带者的主要检测标记，这些携带者可能具有传播该病毒的危险。相反，抗表面抗原抗体的产生表明了一种免疫应答，这种免疫应答将最终导致康复。目前已经注册的、由Merck Sharpe &Dohme开发的乙型肝炎疫苗能极大地协助这种免疫应答的刺激。这些疫苗含有天然(来自血浆)或重组(从酵母细胞纯化)形式的主要表面抗原，并已经被证实能够安全和有效地中和乙型肝炎病毒。在新加坡，国家规模的主动免疫接种计划已经导致了急性乙型肝炎感染和原发性肝细胞癌发生的明显减少。这种减少反过来又与群体中的免疫力上升相关。

乙型肝炎病毒的主要抗原决定簇是一个跨越23个氨基酸残基的高保守区域，它位于主要表面抗原的124至147位氨基酸。此小区被命名为群特异性决定簇“a”，它在乙型肝炎病毒基因组的所有亚型和分离株中均被发现。其抗原特性似乎来自其假设的双环结构，疫苗诱导的中和抗体就结合该结构。

不同于校对缺陷型逆转录酶在病毒复制过程中引入乙型肝炎病毒基因组的随机突变，疫苗接种后引入的突变主要发生在主要表面抗原的“a”决定簇中。这些突变病毒具有特殊的意义，因为它们显示与中和抗体的亲和力降低，因而能够独立地复制。在这些疫苗逃逸的突变体中，位于主要表面抗原的第2个环的145位氨基酸残基的突变(变甘氨酸为精氨酸)是最显著的，因为它非常稳定，导致“a”决定簇的构象改变，并且已在北美、欧洲、日本和东南亚被广泛报道。例如在新加坡，这些突变体是疫苗接种后最频繁发生的变异体。在41个断缺突变中有12个感染变异体被鉴定为在主要表面抗原的145位氨基酸处有一个精氨酸突变。12个突变体中有一个显示了垂直传播的证据，并且该突变体还与活动性肝病相关。具有重要意义的是，这种突变体某些现已在无症状的成年人群体中发现。

这种复制型的疫苗诱导的突变体的发生以及它能够逃避使用标准试剂的检测是非常严重的事情，因为它已经导致急性乙型肝炎在意大利和新加坡的发展。因此这种形式急切需要开发特殊的检测系统以及有效的预防疫苗和抗病毒试剂。测定这种疫苗诱导的突变病毒的核苷酸序列是达到这些目标的第1步，并且一定会为上述各种开发提供帮助。

发明简述

本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏，登记号为P97121504、P97121505和P97121506。

本发明提供编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

本发明提供一种制备纯化形式的多肽的方法，所产生的纯化多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

本发明提供一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，所说寡核苷酸能够特异性地仅与乙型肝炎病毒的突变病毒株的序列杂交。

本发明提供一种获得针对一种多肽的抗体的方法以及所制备的抗体，其中所说多肽是一种乙型肝炎病毒株的突变主要表面抗原。

本发明提供上述多肽、抗体或核酸的应用，用来测定被试者是否感染了上述病毒株。

本发明还提供一种组合物，该组合物能够刺激或增强针对该多肽的抗体产生。

本发明进一步提供一种鉴定方法，用来鉴定能够治疗和/或预防上述突变病毒株感染的化合物以及含有这种化合物的组合物。

本发明还提供一种组合物，该组合物包含用上述方法鉴定的化合物和一种药学上有效的载体，其中化合物的数量足以有效地治疗或预防该病毒株的感染。

本发明进一步提供组合物的应用，用来治疗感染了这种病毒株的被试者。

本发明还提供组合物的应用，用来防止被试者被这种病毒株感染。

最后，本发明提供一种在体液中筛选这种病毒株的方法。

附图简述

图1：从一个男性11岁新加坡籍儿童分离的人乙型肝炎病毒基因组的4个开放阅读框的结构，该病毒在主要表面抗原的145位氨基酸处带有一个变甘氨酸为精氨酸的突变，该突变用星号标记。主要病毒蛋白：DNA聚合酶、大/中/主要表面抗原、前核心抗原、核心抗原和反式激活蛋白X分别注明为P、PreS 1/PreS 2/S、PreC、C和X。

图2：同一乙型肝炎病毒基因组的克隆和序列测定策略。

图3：从一个11岁儿童分离的人乙型肝炎病毒的完整核苷酸序列，该儿童由携带野生型病毒的母亲在新加坡生育。该儿童已经接受了标准乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)和HB疫苗，并在一年后被该突变株感染。该病毒株在主要表面抗原的145位氨基酸处带有一个突变(变甘氨酸为精氨酸)(SEQID NO:1)。该突变在587-589号核酸处显示。

图4：由图3的核苷酸序列诱导的DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

图5：由图3的核苷酸序列诱导的大表面抗原的氨基酸序列。突变氨基酸残基(变甘氨酸为精氨酸)的号码为319(SEQ ID NO:3)。

图6：由图3的核苷酸序列诱导的核心蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

图7：由图3的核苷酸序列诱导的反式激活蛋白X的氨基酸序列(SEQ IDNO:5)。

图8：相应于DNA聚合酶编码区的起始位点的寡核苷酸序列，位于病毒基因组的2307，并与编码链匹配(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO:6)。

图9：相应于病毒核苷酸序列的250位置并与互补链匹配的寡核苷酸序列(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO:7)。

图10：相应于病毒核苷酸序列的250位置并与编码链匹配的寡核苷酸序列(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO:8)。

图11：相应于DNA聚合酶编码区的终止密码子的寡核苷酸序列，位于病毒基因组的1623，并与互补链匹配(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO:9)。

图12：相应于病毒基因组的1420位置并与编码链匹配的寡核苷酸序列(有义寡核苷酸)(SEQ ID NO:10)。

图13：相应于病毒基因组的2340位置并与互补链匹配的寡核苷酸序列(反义寡核苷酸)(SEQ ID NO:11)。

发明详述

在本发明的整个申请书中，所提到的特殊核苷酸是核酸的编码链上的核苷酸。下面的标准缩写在整个申请书中被用来表示特殊的核苷酸：

C=胞嘧啶 A=腺嘌呤

T=胸嘧啶 G=鸟嘌呤

本发明提供一种乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列，该病毒在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)，所说的核苷酸序列由3215个核苷酸组成(图3)，编码示于图4-7的4个重叠的病毒蛋白。

本发明提供4种主要病毒蛋白的氨基酸序列，它们包括DNA聚合酶、大/中/主要表面抗原、核心抗原和反式激活蛋白X。这些蛋白可用重组技术制备，并用于开发多克隆或单克隆抗体。

本发明还提供一种乙型肝炎病毒诊断系统，该系统使用这里介绍的核苷酸或蛋白序列或抗体，特异性地用于诊断位于主要表面抗原的145位氨基酸残基处的疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)。

本发明提供一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已经保藏，登记号为P97121504、P97121505和P97121506。

本发明还提供编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。在一个特殊的实施方案中，该多肽由被命名为SEQ ID NO:1的核酸序列的155至835位核苷酸编码，具体地说，在位置587-589含有核苷酸“AGA”，取代原来的“GGA”。该核酸可以是DNA或RNA，尤其是cDNA或基因组DNA。

在本发明的另一个实施方案中，多肽具有与被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上一样的氨基酸序列。

本发明进一步提供编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ IDNO:1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。

本发明还提供编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明还提供一种载体，该载体含有编码一种多肽并与RNA转录启动子操纵连接的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

本发明进一步提供一种载体，该载体含有编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ ID NO:1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。

在上面鉴定的两种载体中，载体可含有病毒DNA。

本发明还提供一种制备多肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有上面介绍的载体。

本发明还提供一种制备多肽或肽的方法，该方法包括在允许多肽产生的合适条件下培养上述宿主载体系统，并回收这样产生的多肽。

本发明进一步提供一种获得纯化形式的多肽或肽的方法，该方法包括：(a)将上述载体导入一种合适的宿主细胞；(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并(d)纯化这样回收的多肽。

本发明进一步提供一种纯化的多肽，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。获得该多肽的一条途径是通过上面介绍的方法。

本发明还提供一种纯化的肽，其中该肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。获得该肽的一条途径是通过上面介绍的方法。

本发明还提供一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，它能特异性地与一种核酸分子内的独特核苷酸序列杂交，其中所说核酸分子编码一种多肽，该多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；并且该寡核苷酸不能与编码野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的核酸分子内的任何核苷酸序列杂交。具体地说，该寡核苷酸包含SEQ ID NO:1的527至595位核苷酸。

本发明还提供一种获得针对一种多肽的抗体的方法，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种抗体不能针对野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原，该方法包括：(a)获取纯化形式的多肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化多肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化多肽混合；并(e)确定能够与纯化多肽形成一种复合物的抗体，从而获得针对该多肽的抗体。具体地说，多肽由被命名为SEQ ID NO:1的核酸序列的155至835位核苷酸编码。在另一个实施方案中，多肽具有与被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列。

可以在兔或小鼠中进行上述众所周知的方法。

本发明还提供获得针对一种肽的抗体的方法，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，该方法包括：(a)获取纯化形式的肽；(b)免疫一种能够产生针对纯化肽的抗体的生物；(c)收集所产生的抗体；(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化肽混合；并(e)确定能够与纯化肽形成一种复合物的所产生抗体，从而获得针对该肽的抗体。

可以在兔或小鼠中进行上述众所周知的方法。

本发明还提供用上述方法获得的抗体，特别是单克隆抗体。本发明进一步提供能够检测一种多肽的抗体，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种抗体不能检测野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原，本发明也提供能够检测一种肽的抗体，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明还提供编码一种多肽的分离核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，用来检测被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株感染，其中这种检测包括：(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

一种测定方法是当步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA时，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，其中步骤(b)的测定包括：(ⅰ)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与上述寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ⅱ)分离这样形成的复合物；并(ⅲ)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。

另一个例子是当步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA时，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，其中步骤(b)的测定包括：(ⅰ)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；(ⅱ)将步骤(ⅰ)的氨基酸序列与编码一种多肽的分离核酸的氨基酸序列进行比较，其中所说多肽具有与被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上相同的氨基酸序列，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。一个进一步的例子是，步骤(b)的测定包括(ⅰ)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并(ⅱ)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。

本发明提供能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种测定包括：(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求35的抗体结合，以便确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。

本发明还提供能够检测一种多肽的抗体的应用，所说多肽是一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株的突变主要表面抗原，用来测定被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种测定包括：(a)从被试者中获得一种合适的样品；并(b)测定步骤(a)的样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与抗体结合，以便确定被试者是否被感染。而且，抗体也可以是能够检测一种肽，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

在上述应用中，分离核酸、寡核苷酸或抗体可用一种可检测的标记物标记。可检测标记物的例子包括放射性同位素、荧光素和酶。

在特殊实施方案中，样品包括但不限于血液、组织或血清。

本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括：(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够治疗该病毒株感染的化合物。

本发明还提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括：(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能抑制该多肽，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。

本发明进一步提供包含一种多肽或其衍生物以及一种可药用载体的组合物，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种多肽的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。

实际的有效数量将依赖于多肽的大小、多肽的生物降解性、多肽的生物活性以及多肽的生物利用性。如果多肽不被迅速降解、能够被生物利用并且活性高，有效数量就只需要较小的数量。有效数量对本领域的技术人员来说将是已知的，它也依赖于多肽的形式、多肽的大小以及多肽的生物活性。例如，佐剂的使用可减少所需的多肽数量。本领域的技术人员可进行常规的实验性活性试验来测定生物试验中的生物活性，并因而测定有效数量。

可药用的载体对本领域的技术人员来说是熟知的，它们包括但不限于0.01-0.1M、优选为0.05M的磷酸缓冲液或者0.8％的盐水。此外，这种可药用载体可以是水或非水的溶液、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。非胃肠道型载体包括氯化钠溶液、林格氏葡聚糖、葡聚糖和氯化钠、乳酸化的林格氏液或固定油。静脉载体包括流体和营养补充物、电解质补充物如以林格氏葡聚糖为基础的补充物等等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，举例如抗微生物剂、抗氧化剂、鏊合剂、惰性气体等等。

本发明进一步提供含有一种肽或其衍生物以及一种可药用载体的组合物，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，并且这种肽的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。

本发明进一步提供包含按上述方法鉴定的化合物以及一种可药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗或预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。

本发明提供上述组合物作为治疗和/或预防肝细胞癌的药物的应用。

本发明还提供上面鉴定的组合物用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者的应用。

本发明还提供上面鉴定的组合物用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株感染的应用，包括给予被试者一个有效剂量。

本发明进一步提供在来自被试者的组织和体液中筛选一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原一‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的方法，包括(a)从被试者获得一种合适的体液样品；(b)在步骤(a)的样品中检测一种多肽的存在，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，以便在样品中筛选该病毒株。在本方法的一个实施例中，体液包括血液、血清、或血液或血清的一种核酸样品。

本发明提供一种测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质的方法，包括：(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，因而确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。

本发明还提供上述方法，其中步骤(a)的核酸样品包含编码一种多肽的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且其中步骤(b)的测定包括：(ⅰ)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与上述寡核苷酸接触，以形成一种复合物；(ⅱ)分离这样形成的复合物；并(ⅲ)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。

本发明进一步提供上述方法，其中步骤(a)的核酸样品包含编码一种多肽的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且其中步骤(b)的测定包括：(ⅰ)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；(ⅱ)将步骤(ⅰ)的氨基酸序列与上述分离核酸编码的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。

本发明还提供上述方法，其中步骤(b)的测定包括：(ⅰ)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并(ⅱ)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。

本发明进一步提供上述方法用于测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，包括：(a)从被试者中获得一种合适的样品；并(b)测定步骤(a)的样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与上述抗体结合，以便确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。

本发明提供上述方法，其中寡核苷酸或抗体用一种可检测的标记物标记。

本发明还提供上述方法，其中可检测的标记物是一种放射性同位素、荧光素或酶。

本发明还提供上述方法，其中样品包括血液、组织或血清。

本发明进一步提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗肝细胞癌，该方法包括：(a)在允许多肽与化合物之间结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够治疗肝细胞癌的化合物。

本发明提供一种为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防肝细胞癌，该方法包括：(a)在允许多肽与化合物之间结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够预防肝细胞癌的化合物。

此外，本发明提供一种含有按上述方法鉴定的化合物和一种药用有效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效治疗肝细胞癌。

本发明还提供一种含有按上述方法鉴定的化合物和一种药用有效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效预防肝细胞癌。

本发明进一步提供一种治疗患有肝细胞癌的被试者的方法，包括给予被试者有效剂量的上述组合物。

本发明进一步提供在被试者中预防肝细胞癌的方法，包括给予被试者有效剂量的上述组合物。

本发明还提供一种肝炎疫苗，该疫苗包含乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，该多肽具有的氨基酸序列与乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于该多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

本发明还提供上述疫苗和一种佐剂。

本发明在后面的实验细节章节中说明。这些章节用来协助理解本发明，而不是为了或者不应当被理解为以任何方式限制本发明以及在其之后列出的权利要求。实验细节

在下面介绍的方法中，分离了在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有突变的乙型肝炎病毒，并测定了其核苷酸序列。

血清样品(20/815c)获自一个11岁的儿童，该儿童由携带野生型表面抗原的母亲生育。在出生时，该儿童被检测为表面抗原阴性，并接受了乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)和血浆来源的疫苗的组合治疗。他在一年后被检测为表面抗原阳性，并在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个精氨酸突变。在本发明中，在测定其序列之前，首先抽提病毒DNA。

如下面实施例的介绍，在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个突变的这种乙型肝炎突变病毒的基因组由3215个核苷酸组成，这与相同亚型(adw)的野生型病毒的基因组长度相同。当与野生型病毒比较时，编码主要病毒蛋白的开放阅读框(ORFs)被发现位于相当的位置。突变乙型肝炎病毒基因组的位置1按照野生型的相应位置定义，相应于限制酶切位点EcoRⅠ，该酶切位点在本发明的乙型肝炎病毒中由于核苷酸序列的改变而缺失。

突变病毒基因组的不同ORFs的结构在图1中简要报告，它们的位置如下：

-DNA聚合酶基因从位置2307开始，在位置1623结束，因此它由2523个核苷酸组成，编码843个氨基酸残基；

-大表面抗原基因从位置2848开始，在位置835结束，因此它由1203个核苷酸组成，编码400个氨基酸残基。该大表面抗原与中表面抗原和主要表面抗原重叠，后两者分别从位置3205和155开始。中表面抗原(由281个氨基酸残基组成)和主要表面抗原(由226个氨基酸残基组成)都在与大表面抗原相同的位置结束。

-核心抗原基因从位置1814开始，在位置2452结束，因此它由639个核苷酸组成，编码212个氨基酸残基。

-反式激活蛋白X基因从位置1374开始，在位置1838结束，因此它由465个核苷酸组成，编码154个氨基酸残基。

而且，序列分析已经证实，该突变乙型肝炎病毒属于adw亚型，其标志为在主要表面抗原的位置122和160均为赖氨酸残基。与以前通过直接测序对“a”决定簇的分析一致，在主要表面抗原的145位氨基酸残基处发现了一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)。

与Genbank数据库中登录的野生型乙型肝炎病毒(登录号D00329)相比，该乙型肝炎病毒株的核苷酸序列的同一性为89.4％。本发明的突变乙型肝炎病毒的不同病毒蛋白与相应的野生型蛋白相比，DNA聚合酶(PIR-蛋白鉴定资源登录号P93460)、大表面抗原(PIR登录号A93460)、核心抗原(PIR登录号C93460)和反式激活蛋白X(PIR登录号A31289)的同一性分别为88.3％、87.7％、93.4％和87％。

在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的本发明的乙型肝炎病毒基因组，可以用作原料来设计对突变病毒基因组特异的寡核苷酸。这些寡核苷酸可用作原料来制备高特异性的诊断试剂，用于检测在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变的病毒。

在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的本发明的乙型肝炎病毒基因组，可以用作原料来制备本发明的蛋白，这可通过标准的DNA重组技术表达携带相关编码区的载体来实现，其中所说载体能在一种宿主细胞如大肠杆菌中复制。

本发明的蛋白可用作原料来制备高特异性的诊断试剂，后者能够检测在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变的乙型肝炎病毒。使用已知方法，相同的这些蛋白可用于制备多克隆和单克隆抗体。

多克隆和单克隆抗体可用作原料来制备诊断试剂，用于高特异性检测在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒的抗原。

使用本发明的每种蛋白或带有氨基酸取代的蛋白的检测系统，和使用针对这种蛋白的多克隆或单克隆抗体的检测系统，都可用作在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变的乙型肝炎病毒的高特异性诊断试剂，并且能够有效地从输血用的血液或血液衍生物中检测和筛选出这种病毒。这些蛋白或针对这些蛋白的抗体可用作原料来开发针对这种病毒的预防性和治疗性疫苗。

众所周知，DNA中的一个或多个核苷酸可被其他核苷酸取代而产生相同的蛋白。本发明也涉及编码本发明所报告的蛋白的这种核苷酸改变。同样也众所周知，蛋白序列中的一个或多个氨基酸可被其他同类的氨基酸取代，产生氨基酸序列的类似物，氨基酸的同类物由它们的亲水特征或电荷来定义。涉及氨基酸取代、删除、或通过同构物(与蛋白氨基酸具有非常相似的结构和空间的修饰氨基酸)、氨基酸添加、或同构物添加的任何本发明的蛋白的类似物都可以使用，只要所产生的序列能够激发可识别在主要表面抗原的145位氨基酸突变处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒的抗体。

实施例

在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒的核苷酸序列和诱导的氨基酸序列按如下方式测定：1．病毒DNA的分离

从一份血清样品(20/815c)中分离病毒DNA，该血清样品获自一个11岁的华裔儿童，该儿童由携带野生型表面抗原的母亲生育。尽管在出生时试验结果为阴性，该儿童仍接受了HBIG和血浆来源的疫苗的组合治疗。他在一年后被检测为乙型肝炎病毒表面抗原阳性，“a”决定簇的序列分析表明，在主要抗原的145位氨基酸残基处存在一个疫苗诱导的突变。

所用的分离方法是：

在200ul血清样品中加入400ul的消散缓冲液(Tris-Cl10mM,pH7.4,EDTA 1mM，和十二烷基硫酸钠2％)和25ul的蛋白酶K(20mg/ml)，在65℃孵育3小时。然后用酚/氯仿抽提病毒DNA，并用乙醇沉淀。2．通过聚合酶链反应(PCR)扩增病毒DNA

使用3套重叠的寡核苷酸通过聚合酶链反应(PCR)扩增病毒基因组，这些寡核苷酸根据adw亚型的野生型乙型肝炎病毒设计。包含了各种限制酶切位点来方便PCR产物的克隆。这些寡核苷酸的位置示于图2，并表示如下：

-Flag1(ATAAGCTTATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGA)(SEQ ID NO:6)从DNA聚合酶的编码区的起始位点开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置2307，并且Flag1与编码链匹配(有义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的HindⅢ限制酶切位点。

-Xba3(GAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGA)(SEQ ID NO:7)从的XbaⅠ限制性内切酶位点开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置250，该寡核苷酸与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的XbaⅠ限制酶切位点。

-Xba5(GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT)(SEQ ID NO:8)从XbaⅠ的内切位点开始，与Xba3寡核苷酸在相同的位点，但它与编码链匹配(有义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的XbaⅠ限制酶切位点。

-Common3 (TGAGAATTCTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT)(SEQ ID NO:9)从DNA聚合酶的终止密码子开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置1623，与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的EcoRⅠ限制酶切位点。

-V11(TTTGTTTACGTCCCGT)(SEQ ID NO:10)从X基因的起始位点附近开始，该位点位于病毒核苷酸序列的位置1420，与编码链匹配(有义寡核苷酸)。

-HindⅢADW3(CTAAGCTTAGTTTCCGGAAGTGTTGAT)(SEQ ID NO:11)从DNA聚合酶切的起始位点附近开始，该位点位于位置2340，与互补链匹配(反义寡核苷酸)。划线部分是一个添加的HindⅢ限制酶切位点。

以病毒DNA为模板，在DNA热循环仪(Perkin-Elmer,Cetus)上使用pfu聚合酶(Stratagene,USA)进行35个循环的PCR，每个循环包括94℃的变性温度1.5分钟，53℃的退火温度2分钟，72℃的延伸温度4分钟。使用下列组合的寡核苷酸：Flag1/Xba3、Xba5/Common3和V11/HindⅢADW3分别产生1.2kb、1.4kb和1.1kb的扩增片段。3．病毒DNA扩增片段的克隆

先用HindⅢ和XbaⅠ对来自Flag1/Xba3的病毒DNA扩增片段(1.2kb)进行限制酶消化，然后克隆到用相同限制酶预先处理的BlueScript质粒中。采用XbaⅠ和EcoRⅠ对Xba5/Common3的PCR产物(1.4kb)进行类似的消化，然后克隆到用XbaⅠ和EcoRⅠ预先处理的BlueScript质粒中。另一方面，将带有V11和HindⅢ的扩增的DNA片段(1.1kb)直接克隆到ZeroBlunt质粒中，后者是InvitroGen(USA)开发来用于克隆平末端DNA片段的质粒。4．核苷酸序列的测定

本发明的疫苗诱导的乙型肝炎病毒的核苷酸序列在质粒DNA模板上通过链终止抑制剂进行测定，使用测序酶DNA测序试剂盒(United StatesBiochemical Corp)。为方便测序过程，按照野生型乙型肝炎病毒设计了各种内部寡核苷酸(从V1至V13)，它们的位置示于图2。

根据上述分析，测定了在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒的全长核苷酸序列，如图3所示。所诱导的编码主要病毒蛋白的氨基酸序列示于图4-7：乙型肝炎病毒DNA聚合酶(图4)、大表面抗原(图5)、核心抗原蛋白(图6)和反式激活蛋白X(图7)。

将本发明的病毒序列与GenBank数据库中获得的其他乙型肝炎病毒进行排列比较，就可指出特殊的序列差异，后者又可用来设计DNA探针。然后就可开发一种使用聚合酶链反应(PCR)的检测系统。这种PCR反应将包括寡核苷酸的组合，其中所说的寡核苷酸特异性地针对在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒，这样就允许高特异性地检测这些突变病毒DNA。简而言之，病毒DNA按本发明的介绍抽提，使用特殊寡核苷酸用上面介绍的相似循环条件进行PCR反应，在1％琼脂糖凝胶上回收PCR产物后，分析结果。

按照已知的免疫学方法，可以测定蛋白序列如图4-7的蛋白序列上的决定簇。对这些在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变的乙型肝炎病毒的特异决定簇的测定，将使我们可以使用遗传工程方法合成肽、合成蛋白、制备抗体、开发特异性诊断试剂、开发预防性和治疗性疫苗以及抗病毒试剂。

用于检测针对在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变的乙型肝炎病毒的抗体的检测系统，可以使用聚乙烯微滴定板和夹心法来开发。简而言之，将50ul的浓度为5ug/ml的乙型肝炎病毒(疫苗诱导的突变体)肽分配于微滴定板的每个孔，并在室温孵育过夜进行固定。相似的方法可用于纯化自宿主如大肠杆菌的’s’蛋白。微滴定板的孔用含有0.05％Tween20的生理盐水溶液洗涤5次。为进行过量包被，将100ul含有30％(v/v)的小牛血清和0.05％Tween20的NaCl缓冲液(CS缓冲液)分配于每个孔，在室温孵育30分钟后倾去。

为测定血清中对疫苗诱导的突变乙型肝炎病毒特异的抗体，可以按如下方法进行初次反应，初始反应如下进行将50ul的CS缓冲液和10ul的血清样品分配于每个微板孔，在微板振荡器上在室温下孵育1小时。完成初次反应后，微板孔按上面的介绍洗涤5次。

在第二反应中，将1ng的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG单克隆抗体溶于50ul的小牛血清，并分配于每个微板孔，在微板振荡器上在室温下温育1小时。完成后，孔用相同方式洗涤5次。在每个孔中加入过氧化氢(作为底物)和50ul的邻苯二胺溶液(作为显色剂)，在室温下孵育30分钟后，在每个孔中加入50ul的4M硫酸终止进一步的显色，并在490nm处读吸收值。

本发明使得可以检测疫苗诱导的突变乙型肝炎病毒，特别是在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个突变的乙型肝炎病毒。这种突变乙型肝炎病毒此前逃过了使用传统的以抗体为基础的方法的检测，本发明还提供能够高特异性和敏感性地在感染早期进行检测的检测系统。

此外，这些特征使我们能够对处于疾病早期的病人进行精确的诊断，并且还有助于通过使用一种供体血液的筛选试验高效地除去污染了疫苗诱导的突变乙型肝炎病毒的血液。

本发明的蛋白和它们的抗体可用于开发预防性和治疗性疫苗，以及免疫药物。这些突变病毒的结构基因的序列信息将有助于开发相关蛋白抗原和抗体的检测系统。

抗原-抗体复合物可用已知方法进行检测。特异性单克隆和多克隆抗体可通过用对突变的疫苗诱导的乙型肝炎病毒来说特异的肽或蛋白免疫动物如小鼠和兔来产生。抑制性抗病毒试剂可针对细胞培养物中或体内的这些蛋白和分子进行设计并靶向它们。

本发明以在主要表面抗原的145位氨基酸残基处带有一个疫苗诱导的突变(变甘氨酸为精氨酸)的分离病毒的基因组的研究为基础。本发明使得可以高特异性地检测这些疫苗诱导的突变乙型肝炎病毒，并提供材料如蛋白、多克隆和单克隆抗体用于开发这种检测系统。

我们已经清楚地显示了，在一种哺乳动物表达系统中表达时，本发明报告的突变HBV的主要表面抗原(HBsAg)在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上被检测为一种22kDa的蛋白，而野生型HBsAg被检测为25kDa的蛋白。因为HBsAg上的唯一糖基化位点位于突变的145位置的很近的地方(146位的天冬酰胺)，在位置145处的变甘氨酸为精氨酸的剧烈改变很可能影响了突变HBsAg中糖基化过程。糖基化过程的缺陷又导致了在我们的研究中观察到的较小蛋白。因为蛋白的抗原性受到其糖基化程度的逆向影响，我们预计，本发明中报告的突变HBsAg比野生型HBsAg具有更高的抗原性。这个预计受到使用Hopp和Woods开发的方法进行的结构分析的进一步支持。

我们的血清学研究也表明了野生型HBV携带者和本发明报告的突变HBV的携带者之间的差异。其中一种差异是，血清病毒DNA载量明显较低，用125I杂交试验测量为5pg/ml左右(Abbott Laboratories,USA)。与此明显不同，野生型HBV的DNA载量高得多，超过100pg/ml。此外，抗乙型肝炎表面抗原(抗-HBs)水平在本发明报告的突变HBV中在10 IU/ml时就可以检测到，而这种抗体水平在野生型HBV的携带者中检测不到。

在序列测定过程中，我们发现少数根据野生型HBV序列设计的寡核苷酸(它们每个都比17碱基长)不能与本发明报告的突变病毒DNA杂交。2种这样的寡核苷酸位于基因组的2711-2729和2902-2920位置。因此，我们的结果指出了野生型和突变HBV基因组之间的结构差异。

参考文献1．Oon,C-J.,“新加坡的乙型肝炎病毒：流行病学，预防和控制-监测乙型肝炎计划以及携带者的管理”《J.Royal College Physic.London》(1997)(待发表)。2．Oon,C-J.,“与HBV突变株相关的报道”《J.Royal College Physic.London》(1997)(待发表)。3．Oon,C-J.等，“乙型肝炎表面抗原(HBsAg)突变体及其意义”《新加坡医学年鉴》(1997)(待发表)。4．Oon,C-J.,“乙型肝炎’a’变异体和突变体的分子流行病学：免疫群体中的意义”《JAMA》(1996)12:5-6。5．Goh,K-T,“新加坡的乙型肝炎免疫接种”《柳叶刀》(1996)348:1385-1386。6．Oon,C-J.等，“乙型肝炎表面抗原突变体在儿童中的天然史”《柳叶刀》(1996)348:1524-1525。7．Harrison,T.J.,“乙型肝炎病毒的遗传变异”《欧洲消化肝病杂志》(1996)8:306-311。8．Oon,C-J.等，“乙型肝炎病毒疫苗突变体在新加坡的分子流行病学”《疫苗》(1995)13:699-702。9．Carman,W.等，“病毒遗传变异：乙型肝炎病毒作为一种临床例子”《柳叶刀》(1993)341:349-353。10．Harrison,T.J.,“乙型肝炎病毒的变异体”《Vox Sang》(1992)63:161-167。11．Harrison,T.J.等“一种乙型肝炎病毒疫苗诱导的逃逸突变体的独立出现”《肝病杂志》(1991)13:S105-107。12．Carman,W.F.等，“乙型肝炎病毒的疫苗诱导的逃逸突变体”《柳叶刀》(1990)336:325-329。

序列表(1)一般信息：(ⅰ)发明题目：一株疫苗诱导的乙型肝炎病毒株及其应用(ⅱ)序列数：1(2)SEQ ID NO:1信息：(图3)(ⅰ)序列将征：

(A)长度：3215碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：环形

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CTCCACCACT TTCCACCAAA CTCTTCAAGA TCCCAGAGTC AGGGCCCTGT ACTTTCCTGC 60TGGTGGCTCC AGTTCAGGAA CAGTGAGCCC TGCTCAGAAT ACTGTCTCTG CCATATCGTC 120AATCTTATCG AAGACTGGGG ACCCTGTACC GAACATGGAG AACATCGCAT CAGGACTCCT 180AGGACCCCTG CTCGTGTTAC AGGCGGGGTT TTTCTTGTTG ACAAAAATCC TCACAATACC 240GCAGAGTCTA GACTCGTGGT GGACTTCTCT CAATTTTCTA GGGGGAACAC CCGTGTGTCT 300TGGCCAAAAT TCGCAGTCCC AAATCTCCAG TCACTCACCA ACCTGTTGTC CTCCAATTTG 360TCCTGGTTAT CGCTGGATGT GTCTGCGGCG TTTTATCATC TTCCTCTGCA TCCTGCTGCT 420ATGCCTCATC TTCTTGTTGG TTCTTCTGGA CTATCAAGGT ATGTTGCCCG TTTGTCCTCT 480AATTCCAGGA TCAACAACAA CCAGCACCGG ACCATGCAAA ACCTGCACAA CTCCTGCTCA 540AGGAACCTCT ATGTTTCCCT CATGTTGCTG TACAAAACCT ACGGACAGAA ACTGCACCTG 600TATTCCCATC CCATCATCTT GGGCTTTCGC AAAATACCTA TGGGAGTGGG CCTCAGTCCG 660TTTCTCTTGG CTCAGTTTAC TAGTGCCATT TGTTCAGTGG TTCGTAGGGC TTTCCCCCAC 720TGTCTGGCTT TCAGTTATAT GGATGATGTG GTTTTGGGGG CCAAGTCTGT ACAACATCTT 780GAGTCCCTTT ATGCCGCTGT TACCAATTTT CTTTTGTCTT TGGGTATACA TTTAAACCCT 840CACAAAACAA AAAGATGGGG ATATTCCCTT AACTTCATGG GATATGTCAT TGGGAGTTGG 900GGCACATTGC CACAGGAACA TATTGTACAA AAAATCAAAA TGTGTTTTAG GAAACTTCCT 960GTAAACAGGC CTATTGATTG GAAAGTATGT CAACGAATTG TGGGTCTTTT GGGGTTTGCC 1020GCCCCTTTCA CGCAATGTGG ATATCCTGCT TTAATGCCTT TATATGCATG TATACAAGCA 1080AAACAGGCTT TTACTTTCTC GCAAACTTAC AAGACCTTTC TAAGTAAACA GTATCTGAAC 1140CTTTACCCCG TTGCTCGGCA ACGCCCTGGT CTGTGCCAAG TGTTTGCTGA CGCAACCCCC 1200ACTGGTTGGG GCTTGGCCAT AGGCCATCAG CGCATGCGTG GAACCTTTGT GTCTCCTCTG 1260CCGATCCATA CTGCGGAACT CCTAGCCGCT TGTTTTGCTC GCAGCAGGTC TGGGGCAAAA 1320CTCATCGGGA CTGACAATTC TGTCGTGCTC TCCCGCAAGT ATACATCATT TCCATGGCTG 1380CTAGGCTGTG CTGCCAACTG GATCCTGCGC GGGACGTCCT TTGTTTACGT CCCGTCGGCG 1440CTGAATCCCG CGGACGACCC CTCCCGGGGC CGCTTGGGGC TCTACCGCCC GCTTCTCCGC 1500CTGTTATACC GACCGACCAC GGGGCGCACC TCTCTTTACG CGGACTCCCC GTCTGTGCCT 1560TCTCATCTGC CGGACCGTGT GCACTTCGCT TCACCTCTGC ACGTCGCATG GAGACCACCG 1620TGAACGCCCA CGGGAACCTG CCCAAGGTCT TGCATAAGAG GACTCTTGGA CTTTCAGCAA 1680TGTCAACGAC CGACCTTGAG GCATACTTCA AAGACTGTGT GTTTAATGAG TGGGAGGAGT 1740TGGGGGAGGA GGTTAGGTTA AAGGTCTTTG TACTAGGAGG CTGTAGGCAT AAATTGGTGT 1800GTTCACCATC ACCATGCAAC TTTTTCACCT CTGCCTAATC ATCTCATGTT CATGTCCTAC 1860TGTTCAAGCC TCCAAGCTGT GCCTTGGGTG GCTTTGGGGC ATGGACATTG ACCCGTATAA 1920AGAATTTGGA GCTTCTGTGG AGTTACTCTC TTTTTTGCCT TCTGACTTTT TTCCTTCTAT 1980TCGAGATCTC CTCGACACCG CCTCTGCTCT GTATCGGGAG GCCTTAGAGT CTCCGGAACA 2040TTGTTCACCT CACCATACGG CACTCAGGCA AGCTATTCTG AGTTGGGGTG AGTTAATGAA 2100TCTAGCCACC TGGGTGGGAA GTAATTTGGA AGATCCAGCA TCCAGGGAAT TAGTAGTCAG 2160CTATGTCAAC GTTAATATGG GCCTAAAAAT CAGACAACTA TTGTGGTTTC ACATTTCCTG 2220TCTTACTTTT GGGAGAGAAA CTGTTCTTGA ATATTTGGTG TCTTTTGGAG TGTGGATTCG 2280CACTCCTCCT GCATATAGAC CACCAAATGC CCCTATCTTA TCAACACTTC CGGAAACTAC 2340TGTTGTTAGA CGAAGAGGCA GGTCCCCTAG AAGAAGAACT CCCTCGCCTC GCAGACGAAG 2400GTCTCAATCG CCGCGTCGCA GAAGATCTCA ATCTCGGGAA TCTCAATGTT AGTATTCCTT 2460GGACACATAA GGTGGGAAAC TTTACGGGGC TTTATTCTTC TACGGTACCT TGCTTTAATC 2520CTAAATGGCA AACTCCTTCT TTTCCGGACA TTCATTTGCA GGAGGACATT CTTGATAGAT 2580GTAAGCAATT TGTGGGGCCC CTTACAGTAA ATGAAAACAG GAGACTAAAA TTAATTATGC 2640CTGCTAGGTT TTATCCAAAT GTTACTAAAT ATTTGCCCTT AGATAAAGGG ATCAAACCAT 2700ATTATCCAGA GTATGTAGTT AATCATTACT TCCAGACGCG ACATTATTTA CACACTCTTT 2760GGAAGGCGGG GATCTTATAT AAAAGAGAGT CCACACGTAG CGCCTCATTT TGCGGGTCAC 2820CATATTCTTG GGAACAAGAT CTACAGCATG GGAGGTTGGT CTTCCAAACC TCGAAAAGGC 2880ATGGGGACAA ATCTTTCTGT CCCCAATCCC CTGGGATTCT TCCCCGATCA TCAGTTGGAC 2940CCTGCATTCA AAGCCAACTC AGAAAATCCA GATTGGGACC TCAACCCGCA CAAGGACAAC 3000TGGCCGGACG CCAACAAGGT GGGAGTGGGA GCATTCGGGC CAGGGTTCAC CCCTCCTCAT 3060GGGGGACTGT TGGGGTGGAG CCCTCAGGCT CAGGGCCTAC TCACAACTGT GCCAGCAGCT 3120CCTCCTCCTG CCTCCACCAA TCGGCAGTCA GGAAGGCAGC CTACTCCCTT ATCTCCACCT 3180CTAAGGGACA CTCATCCTCA GGCCATGCAG TGGAA 3215(2)SEQ ID NO:2信息：(图4)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：843个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Glu1 5 10 15Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly

20 25 50Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val

35 40 45Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser

50 55 60Ser Thr Val Pro Cys Phe Asn Pro Lys Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro65 70 75 80Asp Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Leu Asp Arg Cys Lys Gln Phe Val

85 90 95Glu Pro Leu Thr Val Asn Glu Asn Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro

100 105 110Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly

115 120 125Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu Tyr Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr

130 135 140Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg145 150 155 160Glu Ser Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu

165 170 175Gln Asp Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Cln Thr Ser Lys Arg His

180 185 190Gly Asp Lys Ser Phe Cys Pro Glu Ser Pro Gly Ile Leu Pro Arg Ser

195 200 205Ser Val Gly Pro Cys Ile Gln Ser Gln Leu Arg Lys Ser Arg Leu Gly

210 215 220Pro Gln Pro Ala Gln Gly Gln Leu Ala Gly Arg Gln Gln Gly Gly Ser225 230 235 240Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Ser Ser Trp Gly Thr Val Gly

245 250 255Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly Pro Thr His Asn Cys Ala Ser Ser Ser

260 265 270Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser Leu

275 280 285Ile Ser Thr Ser Lys Gly His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu

290 295 300His His Phe Pro Pro Asn Ser Ser Arg Ser Gln Ser Gln Gly Pro Val305 310 315 320Leu Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Glu Pro Cys Ser Glu

325 330 335Tyr Cys Leu Cys His Ile Val Asn Leu Ile Glu Asp Trp Gly Pro Cys

340 345 350Thr Glu His Gly Glu His Arg Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro Ala Arg

355 360 365Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala

370 375 380Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr385 390 395 400Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr

405 410 415Ash Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala

420 425 430Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu

435 440 445Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn

450 455 460Ser Arg Ile Asn Asn Asn Glu His Arg Thr Met Glu Asn Leu His Asn465 470 475 480Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Met Leu Leu Tyr Lys Thr

485 490 495Tyr Gly Gln Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe

500 505 510Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln

515 520 525Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys

530 535 540Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val545 550 555 560Gln His Leu Glu Ser Leu Tyr Ala Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser

565 570 575Leu Gly Ile His Leu ASn Pro His Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser

580 585 590Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln

595 600 605Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Met Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val

610 615 620Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu625 630 635 640Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro

645 650 655Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lye Gln Ala Phe Thr Phe Ser Gln Thr

660 665 670Tyr Lys Thr Phe Leu Ser Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala

675 680 685Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Glu Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr

690 695 700Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val705 710 715 720Ser Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala

725 730 735Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val

740 745 750Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala

755 760 765Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu

770 775 780Asn Pro Ala Asp Asp Pro ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro785 790 795 800Leu Leu Arg Leu Leu Tyr Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr

805 810 815Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe

820 825 830Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro

835 840(2)SEQ ID NO:3信息：(图5)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：400个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

20 25 30Ala Phe Lye Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His

35 40 45Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly

50 55 60Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln65 70 75 80Ala Gln Gly Leu Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

85 90 95Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu

100 105 110Arg Asp Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

115 120 125Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Ala Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

130 135 140Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Ser Pro Ala Gln Asn Thr Val Ser Ala145 150 155 160Ile Ser Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val Pro Asn Met Glu

165 170 175Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly

180 185 190Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser

195 200 205Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Pro Thr Val Cys Leu Gly

210 215 220Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro225 230 235 240Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile

245 250 255Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu

260 265 270Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr

275 280 285Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly

290 295 300Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Arg Asn305 310 315 320Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu

325 330 335Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro

340 345 350Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val

355 360 365Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser

370 375 380Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile385 390 395 400(2)SEQ ID NO:4信息：(图6)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：212个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile

20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu

35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser

50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Ser Trp Gly Glu Leu Met Asn

85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu

100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln

115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cye Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val

130 135 140Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr

165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro

180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg

195 200 205Glu Ser Gln Cys

210(2)SEQ ID NO:5信息：(图7)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：154个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu1 5 10 15Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly

20 25 30Pro Leu Gly Ala Leu Pro Pro Ala Ser Pro Pro Val Ile Pro Thr Asp

35 40 45His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser

50 55 60Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu65 70 75 80Thr Thr Val Asn Ala His Gly Asn Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg

85 90 95Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe

100 105 110Lys Asp Cys Val Phe Asn Glu Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Val Arg

115 120 125Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser

130 135 140Pro Ser Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala145 150(2)SEQ ID NO:6信息：(图8)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：35碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:ATAAGCTTATG CCCCTATCTT ATCAACACTT CCGGA(2)SEQ ID NO:7信息：(图9)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:GAGTCTAGAC TCTGCGGTAT TGTGA(2)SEQ ID NO:8信息：(图10)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:GAGTCTAGAC TCGTGGTGGA CTTCT(2)SEQ ID NO:9信息：(图11)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:TGAGAATTCT CAGGGTGGTC TCCATGCGAC GT(2)SEQ ID NO:10信息：(图12)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：16碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:TTTGTTTACG TCCCGT(2)SEQ ID NO:11信息：(图13)(ⅰ)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线形(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:CTAAGCTTAG TTTCCGGAAG TGTTGAT

Claims

1．一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒分离株，其所组成的病毒基因组已于1997年12月15日在欧洲细胞培养物保藏中心保藏，登记号为P97121504、P97121505和P97121506。

2．编码如下一种多肽的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

3．权利要求2的分离核酸，其中所说多肽由被命名为SEQ ID NO:1的核酸序列155至835位核苷酸编码。

4．权利要求3的分离核酸，在位置587-589含有核苷酸“AGA”。

5．权利要求2的分离核酸，其中核酸是DNA。

6．权利要求2的分离核酸，其中核酸是RNA。

7．权利要求5的分离核酸，其中核酸是cDNA。

8．权利要求5的分离核酸，其中核酸是基因组DNA。

9．权利要求2的分离核酸，其中多肽具有与被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上一样的氨基酸序列。

10．编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽由含有SEQ ID NO:1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。

11．编码一种肽的分离核酸，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

12．如下一种载体，该载体含有编码一种多肽并与RNA转录启动子操纵连接的分离核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

13．含有编码一种肽的分离核酸的载体，其中所说的肽由含有SEQ ID NO:1的527至595位核苷酸的核酸分子编码。

14．权利要求12或13的载体，其中载体含有病毒DNA。

15．用于制备多肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有权利要求12的载体。

16．用于制备多肽的宿主载体系统，该系统在一种合适的宿主中含有权利要求13的载体。

17．一种制备多肽的方法，该方法包括在允许多肽产生的合适条件下生成权利要求15的宿主载体系统，并回收这样产生的多肽。

18．一种制备肽的方法，该方法包括在允许多肽产生的合适条件下生成权利要求16的宿主载体系统，并回收这样产生的多肽。

19．一种获得纯化形式的多肽的方法，该方法包括：

(a)将权利要求12的载体导入一种合适的宿主细胞；

(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；

(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并

(d)纯化这样回收的多肽。

20．一种获得纯化形式的多肽的方法，该方法包括：

(a)将权利要求13的载体导入一种合适的宿主细胞；

(b)培养所产生的宿主细胞，来产生该多肽；

(c)回收步骤(b)中产生的多肽；并

(d)纯化这样回收的多肽。

21．一种纯化的多肽，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

22．用权利要求19的方法获得的一种纯化的多肽。

23．一种纯化的肽，其中该肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

24．用权利要求20的方法获得的一种纯化的肽。

25．一种至少为15个核苷酸的寡核苷酸，它能特异性地与一种核酸分子内的独特核苷酸序列杂交，其中所说核酸分子编码一种多肽，该多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；并且该寡核苷酸不能与编码野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的核酸分子内的任何核苷酸序列杂交。

26．权利要求25的寡核苷酸，它包含SEQ ID N0:1的527至595位核苷酸。

27．获得针对一种多肽的抗体的方法，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种抗体不能针对野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原，该方法包括：

(a)获取纯化形式的多肽；

(b)免疫一种能够产生针对纯化多肽的抗体的生物；

(c)收集所产生的抗体；

(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化多肽结合；

(e)确定能够与纯化多肽形成一种复合物的所产生抗体，从而获得针对该多肽的抗体。

28．权利要求27的方法，其中多肽由被命名为SEQ ID NO:1的核酸序列的155至835位核苷酸编码。

29．权利要求27的方法，其中多肽具有与被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的174至400位氨基酸残基基本上一样的氨基酸序列。

30．权利要求27的方法，其中生物包括兔或小鼠。

31．获得针对一种肽的抗体的方法，其中所说的肽具有包含被命名为SEQID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，该方法包括：

(a)获取纯化形式的肽；

(b)免疫一种能够产生针对纯化肽的抗体的生物；

(c)收集所产生的抗体；

(d)在能够形成一种复合物的条件下将产生的抗体与纯化肽结合；并

(e)确定能够与纯化肽形成一种复合物的抗体，从而获得针对该肽的抗体。

32．权利要求31的方法，其中生物包括兔或小鼠。

33．权利要求27或31中获得的抗体。

34．权利要求33的抗体的单克隆抗体。

35．能够检测一种多肽的抗体，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种抗体不能检测野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原。

36．能够检测一种肽的抗体，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列。

37．编码一种多肽的核酸的应用，其中多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，用来检测被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种检测包括：

(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并

(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

38．权利要求37的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，其中步骤(b)的测定包括：

(ⅰ)在允许mRNA与寡核苷酸结合的条件下将mRNA与权利要求25的寡核苷酸接触，以形成一种复合物；

(ⅱ)分离这样形成的复合物；并

(ⅲ)鉴定分离复合物中的mRNA，从而测定mRNA是否为或来自编码该多肽的核酸。

39．权利要求37的应用，其中步骤(a)的核酸样品包含对应于编码一种多肽的DNA的转录物的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，其中步骤(b)的测定包括：

(ⅰ)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；并

(ⅱ )将步骤(ⅰ)的氨基酸序列与权利要求9的分离核酸编码的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。

40．权利要求37的应用，其中步骤(b)的测定包括：

(ⅰ)扩增存在于步骤(a)的样品中的核酸；并

(ⅱ)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。

41．能够检测一种多肽的抗体的应用，所说多肽是一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的突变主要表面抗原，用来测定被试者是否被一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株感染，其中这种测定包括：

(a)从被试者中获得一种合适的样品；并

(b)测定步骤(a)的样品是否为或来自编码一种多肽的核酸，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求35或36中的抗体结合，以便确定被试者是否被感染。

42．权利要求37、38或41的应用，其中分离核酸、寡核苷酸或抗体用一种可检测的标记物标记。

43．权利要求42的应用，其中可检测标记物是放射性同位素、荧光素或酶。

44．权利要求37的应用，其中样品包括血液、组织或血清。

45．为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括：

(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；

(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并

(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够治疗该病毒株感染的化合物。

46．为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染，该方法包括：

(a)在允许多肽与化合物结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不伺，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；

(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并

(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够预防该病毒株感染的化合物。

47．包含一种多肽或其衍生物以及一种可接受的药用载体的组合物，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且这种多肽衍生物的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。

48．含有一种肽或其衍生物以及一种可接受的药用载体的组合物，其中所说的肽具有包含被命名为SEQ ID NO:3的氨基酸序列的298至320位氨基酸残基的氨基酸序列，并且这种肽衍生物的数量能够有效地在被试者中刺激或增强抗体产生。

49．包含按权利要求45的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地治疗一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。

50．包含按权利要求46的方法鉴定的化合物以及一种有效的药用载体的组合物，其中化合物的数量能够有效地预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。

51．权利要求47或48的组合物的应用，用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者。

52．权利要求45的组合物的应用，用于治疗感染了一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的被试者。

53．权利要求47或48的组合物的应用，用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。

54．权利要求46的组合物的应用，用于在被试者中预防一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的感染。

55．在来自被试者的体液中筛选一种被命名为人乙型肝炎病毒表面抗原-‘S’-145新加坡株(变甘氨酸为精氨酸)的乙型肝炎病毒株的方法，包括：

(a)从被试者获得一种合适的体液样品；

(b)在步骤(a)的样品中检测一种多肽的存在，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，以便在样品中筛选该病毒株。

56．权利要求55的方法，其中体液包括血液、血清、或血液或血清的一种核酸样品。

57．能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种测定包括：

(a)从被试者中获得一种合适的核酸样品；并

(b)测定步骤(a)的核酸样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求35的抗体结合，以便确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。

58．权利要求57的方法，其中步骤(a)的核酸样品包含编码一种多肽的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且其中步骤(b)的测定包括：

(ⅱ)分离这样形成的复合物；并

59．权利要求57的方法，其中步骤(a)的核酸样品包含编码一种多肽的mRNA，所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，并且其中步骤(b)的测定包括：

(ⅰ)在合适条件下翻译mRNA，以获得氨基酸序列；并

(ⅱ)将步骤(ⅰ)的氨基酸序列与权利要求9的分离核酸编码的氨基酸序列进行比较，从而测定核酸样品是否为或来自一种编码该多肽的核酸。

60．权利要求57的方法，其中步骤(b)的测定包括：

(ⅰ)扩增步骤(a)的样品中存在的核酸；并

(ⅱ)在所产生的扩增核酸中检测多肽的存在。

61．能识别一种多肽的抗体的应用，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，用来测定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质，其中这种测定包括：

(a)从被试者中获得一种合适的样品；并

(b)测定步骤(a)的样品是否为或来自编码一种多肽的核酸分子，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸，这通过下述方法完成，在合适条件下将样品与权利要求36的抗体结合，以便确定被试者是否具有肝细胞癌的易感体质。

62．权利要求58、59或61的方法，其中寡核苷酸或抗体用一种可检测的标记物标记。

63．权利要求62的方法，其中可检测标记物是放射性同位素、荧光素或酶。

64．权利要求57的方法，其中样品包括血液、组织或血清。

65．为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够治疗肝细胞癌，该方法包括：

(a)在允许多肽与化合物之间结合的条件下将多肽与化合物接触，其中所说多肽是乙型肝炎病毒株的一种突变的主要表面抗原，所说多肽具有的氨基酸序列与野生型乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于所说多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸；

(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并

(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够治疗肝细胞癌的化合物。

66．为药物生产而鉴定化合物的方法，所说的药物能够预防肝细胞癌，该方法包括：

(b)检测化合物与该多肽的特异性结合；并

(c)测定该化合物是否能与该多肽结合，以便鉴定一种能够预防肝细胞癌的化合物。

67．含有按权利要求65的方法鉴定的化合物和一种药用有效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效治疗肝细胞癌。

68．含有按权利要求66的方法鉴定的化合物和一种药用有效载体的组合物，其中化合物的数量能够有效预防肝细胞癌。

69．权利要求47或48的组合物的应用，用作治疗肝细胞癌的药物。

70．权利要求67的组合物的应用，用作治疗肝细胞癌的药物。

71．权利要求47或48的组合物的应用，用作预防肝细胞癌的药物。

72．权利要求67的组合物的应用，用作预防肝细胞癌的药物。

73．一种肝炎疫苗，该疫苗包含乙型肝炎病毒株的一种突变形式的主要表面抗原，该多肽具有的氨基酸序列与乙型肝炎病毒的主要表面抗原的氨基酸序列不同，其差异在于该多肽在位置145的氨基酸是精氨酸而不是甘氨酸。

74．权利要求73的疫苗，进一步包含一种佐剂。